CN108138179B

CN108138179B - 包含免疫刺激性寡核苷酸的组合

Info

Publication number: CN108138179B
Application number: CN201680059686.9A
Authority: CN
Inventors: M·施罗夫; M·施密特; K·卡普; A·祖洛
Original assignee: Gilead Sciences Inc
Current assignee: Gilead Sciences Inc
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2036-09-09
Also published as: KR102411799B1; HK1257273A1; WO2017042336A1; US10487333B2; CN108138179A; CA2997319C; US10604760B2; EP3347468A1; RU2766693C2; JP2021059566A; PT3347468T; ES2905891T3; US11578331B2; JP2022060368A; IL257921B; JP7436535B2; LU92821B1; RU2018108353A3; IL257921A; US20180251767A1

Abstract

本发明涉及组合及其用于治疗疾病的用途。本公开内容提供了选自PD1、PD‑L1、OX40、TIM‑3、LAG3、CD137(4‑1BB)的所谓T细胞调节剂和非编码免疫调节DNA的组合。

Description

包含免疫刺激性寡核苷酸的组合

技术领域

本发明涉及组合及其用于治疗疾病的用途。

背景技术

术语“免疫疗法”定义了通过刺激、诱导、增强或压制免疫应答的疾病治疗。免疫疗法的策略是对抗疾病，如癌症、传染病、过敏和哮喘。

可用于免疫疗法中的各种活性剂，所谓的免疫调节剂是已知的。大多数已建立的免疫调节剂属于小分子或核酸，其中许多与toll样受体系统相互作用。大多数已知的免疫修饰短DNA序列含有未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤基序(CG基序)，其已由Krieg等人(Nature1995 374:6522 546-549)描述。与原核生物或病毒相比，未甲基化的CG基序的出现在真核生物的基因组中基本上被压制。因此，含有这种基序的DNA分子已进化为天然的“危险信号”，并且触发免疫系统对抗原核生物或病毒病原体。这可以通过使用这样的序列与免疫疗法来治疗或预防传染病而在治疗或预防上使用。近年来，特别的重点已放在这种免疫调节剂在癌症治疗中的用途，其目的是活化患者自身的免疫系统以对抗肿瘤。

包含未甲基化的CG基序的DNA构建体能够通过强烈刺激先天性免疫系统的效应细胞(包括树突状细胞、巨噬细胞、天然杀伤(NK)和NKT细胞)而引发相当的生理效应。未甲基化的CG基序通过先天性免疫模式识别受体Toll样受体(TLR)9检测。虽然确切的识别机制尚未完全理解，但已在揭示潜在途径方面取得了重大进展(A.Krieg,Nat.Rev.Drug Disc.,5:471-484,2006)。

假定在将含有未甲基化的CG的DNA构建体与受体结合后，在响应细胞中活化多重信号级联。通过特征性表面分子的上调和细胞因子的分泌，诱导具有占优势的Th1模式的适应性免疫。这样的构建体可以与例如抗体、化学疗法或放射疗法、疫苗或细胞因子组合使用。过敏性疾病和哮喘主要是Th2介导的。通过增加Th1/Th2的比率，Th2介导的应答减弱，并且从而可以治疗或预防这些类型的疾病。

取决于细胞类型，不受TLR-9途径调节的表面分子包括例如CD40、CD69、CD80、CD86或CD169。细胞因子的分泌增强也是不同细胞类型的特征；细胞因子包括例如巨噬细胞炎性蛋白质(MIP)-1α、MIP-1β、白介素(IL)-6、IL-8、干扰素(IFN)-α、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IFN-γ、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1或IFN-γ诱导的10kDa蛋白质(IP-10)。

为了预防或治疗疾病，疫苗接种已被证明是非常有效的方法。为了确保强烈且持久的免疫应答，能够刺激抗原呈递细胞例如树突状细胞的佐剂通常连同抗原一起施用，并且为了此目的TLR9激动剂已显示为有力的免疫刺激剂。

临床前和正在进行的临床研究支持使用TLR-9激动剂作为免疫调节剂和/或佐剂，并且通过增强体液应答和细胞应答两者来证明其抗肿瘤效应。

不依赖于未甲基化的CG基序通过其影响或调节免疫应答的潜在机制的任何解释，开发了通过使用这些基序用于调节免疫系统的许多方法。WO 1998/018810公开了当含有未甲基化的CG基序的免疫刺激序列是单链的部分时，它们甚至更有效。然而，由于单链核酸的快速降解，施用开链单链DNA分子是不实际的。因而，开发了用于保护包含未甲基化的CG基序的单链或双链DNA构建体的不同方法。

为了实现针对通过DNA核酸酶降解的抗性，核酸聚合物主链中的磷酸二酯键通常被修饰为硫代磷酸酯。除了这种受硫代磷酸酯保护的核酸的略微更少的刺激活性之外，过去几年内的临床试验显示硫代磷酸酯保护的毒性排除或严重限制了这种核酸在药物组合物或药剂中的任何用途。

从四类具有不同免疫调节谱的已知活化剂中，除了两个以外的所有成员都包含线性DNA分子。EP 1 196 178中公开了一个例外。该文件公开了短的脱氧核糖核酸分子，其包含完全由天然DNA组成的CG基序(“dSLIM”)的部分单链、哑铃形、共价闭合的核苷酸残基序列。根据EP 1 196 178的公开内容，CG基序位于所公开分子的双链茎的两个末端处的单链环内或双链茎内。单链发夹环保护双链茎免受通过细胞内或细胞外的DNA核酸酶的降解。GB1402847.6公开了利用不同序列的略微类似的哑铃结构。

WO2012/085291中公开了线性寡核苷酸的另一个例外。该文件教导了包含以L-构型的核苷酸的DNA构建体。根据WO 2012/085291中公开的数据，以L-构型的核苷酸数目及其在DNA构建体内的位置影响DNA构建体的免疫刺激能力。仅包含以L-构型的核苷酸的DNA构建体例如不能有效刺激免疫系统。

文件WO2010/039137公开了作为TLR介导的疾病的拮抗剂的免疫调节性寡核苷酸，其在侧接免疫刺激性基序的序列中和/或在其为免疫刺激性但用于修饰的寡核苷酸基序中具有一种或多种化学修饰。因此，WO2010/039137所公开的寡核苷酸的意图是压制由TLR引起的免疫应答。

WO 2005/042018描述了新的所谓的C类CpG寡核苷酸，其中c类寡核苷酸的特征在于一般定位于分子的5'末端或3'末端处或附近的CpG序列，以及一般定位于分子的另一个末端处或附近的富含GC的回文基序。该文件公开了c类DNA的回文序列的变体。

文件WO2015/124614公开了共价闭合的DNA构建体、药物组合物和疫苗及其用于调节免疫系统的用途，其中所述DNA构建体包含特定的DNA序列。

细胞免疫应答的强烈刺激使得影响调节回路成为可能，并且如果没有这种干预，患者中将不出现令人满意的免疫活性。这包括诱导对“弱”抗原的应答，即在MHC-I呈递内非活化，例如来自在肿瘤疾病中经常出现的染色体易位或突变癌基因的断点肽(Melief CJ,Kast WM；T-cell immunotherapy of cancer；Res Immunol 1991Jun-Aug；142(5-6):425-9；also:Pasternak G,Hochhaus A,Schultheis B,Hehlmann R；Chronic myelogenousleukemia:molecular and cellular aspects；J Cancer Res Clin Oncol 1998；124(12):643-60)。还可能期望破坏对自身抗原的耐受性，例如在恶性黑素瘤的肿瘤细胞中表达且以MHC-I表示的酪氨酸酶或酪氨酸羟化酶。(Weber LW,Bowne WB,Wolchok JD,Srinivasan R,Qin J,Moroi Y,Clynes R,Song P,Lewis JJ,Houghton AN；Tumor immunity andautoimmunity induced by immunization with homologous DNA；J Clin Invest 1998Sep 15；102(6):1258-64；Surman DR,Irvine KR,Shulman EP,Allweis TM,Rosenberg SA,Restifo NJ；Generation of polyclonal rabbit antisera to mouse melanomaassociated antigens using gene gun immunization；Immunol Methods；1998May 1；214(1-2):51-62)。

另一个非常重要的方面是ISS在预防性疫苗接种中的佐剂作用以及将现有感染的反应从2型应答重新极化到1型应答的可能性，因此使病原体能够得到控制(Kovarik J，等人CpG oligodeoxynucleotides can circumvent the Th2polarization of neonatalresponses to vaccines but may fail to fully redirect Th2responses establishedby neonatal priming；J Immunol.1999 Feb 1；162(3):1611-7)。已对于大量病原体证实，免疫应答的类型对感染过程或患者的生存能力具有决定性影响。就过敏反应代表2型超调应答而言，ISS预期同样对于这类适应症提供治疗效应。

已观察到，含有CpG的某些序列具有中和ISS诱导的刺激的特征，即这种序列在加入其中时能够压制ISS的刺激效应(Krieg AM,Wu T,Weeratna R,Efler SM,Love-Homan L,Yang L,Yi AK,Short D,Davis HL；Sequence motifs in adenoviral DNA block immuneactivation by stimulatory CpG motifs；Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Oct 13；95(21):12631-6)。没有充分解释描述为中和CpG基序(“CpG-N”)的这些序列基序的效应的潜在机制，此处引用的出版物的作者暗示该效应仅限于阻断通过ISS的刺激。只要通过ISS的免疫诱导的机制没有得到解释，就不能排除这些CpG-N基序也具有其他具有治疗意义的免疫修饰性质的可能性。

存在至少一种人疾病，系统性红斑狼疮，其特征在于患者血清中的抗DNA抗体的确认存在，并且其中怀疑对细菌ISS的反应具有病因学原因(Krieg AM,CpG DNA:apathogenic factor in systemic lupus erythematosus？,J Clin Immunol 1995 Nov；15(6):284-92)。在这些情况和其他适应症中，使用CpG-N基序阻断潜在机制将是有益的。

不依赖于对潜在机制的任何解释，CpG序列用于影响免疫应答的潜力是相当大的，并且已经在该现象以及探究其中涉及感染、肿瘤和免疫缺陷的治疗和预防应用的可能性中生成突然和广泛的科学兴趣。

关于ISS状态的文献(参见例如WO09818810A1，第17页，ll 29-30)，并且这通过所述发明(参见下文)得到证实，当含有CpG的免疫刺激序列作为单链存在时，它们更有效。以免疫修饰为目标施用短的开链单链ISS寡脱氧核苷酸是下一步要采取的合理步骤，并且是用于治疗传染病、肿瘤和自身免疫疾病的众多实验方法的主题。然而，开链单链寡脱氧核苷酸被细胞外和细胞内核酸外切酶非常快速地降解，并且因此非常难以用于体内应用中。与核酸聚合物主链中经修饰的磷酸酯键相比时，所提及的核酸酶展示显著降低的酶促活性；这已导致在其中将单链核酸分子施用于患者的应用中使用手性或非手性形式的磷硫酯(“硫酯”)或还原磷键(膦酸酯)。这些经修饰的化合物可以通过固相合成来产生，但在一定程度上仅通过与常规DNA amidite合成相比明显更复杂的方法。这些化合物从反义研究已知；然而，在反义策略的临床研究中，还证实它们具有相当的副作用，特别是对凝血系统和补体系统(参见例如Sheehan和Lan，Blood 92,1617-1625(1998))。关于使用硫代磷酸衍生物用于ISS的核酸酶保护，还证实当实际有效的那些胞嘧啶-鸟苷残基本身通过活性本身所需的侧翼序列保护时，所述序列展示较少的刺激活性(参见WO 98/18810)。

关于含有CpG的免疫刺激性ISS的使用和生产的教导在WO 98/18810以及其中引用的文件中全面描述。在WO 98/18810中详细描述了保护寡脱氧核苷酸免受外切核酸酶的必要性。呈现了用于解决体内稳定性不足的问题的许多解决方案，然而其明确限于单链线性ODN；提及硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或膦酸酯。在WO 98/18810中记录了通过产生二级结构，特别是茎环来稳定ODN的可能性。在US 5,663,153、US 5,723,335以及US 5,856,462中描述了与免疫刺激序列有关的硫代磷酸酯寡聚物的生产和使用。

US 5,750,669中描述了用于保护单链序列的不同策略。此处寡聚物的末端由通过5'-5'和3'-3'键连接的核苷残基连接，其阻断核酸外切降解。

双重茎环或共价闭合的哑铃形ODN由实验方法已知，其中DNA结合蛋白的结合位点的竞争以及转录因子是研究的焦点(Lim等人1997,Nuc.Acids Res.25,575-581；Blumenfeld等人，Nuc.Acids Res.1993,21,3405-3411)。

人免疫系统的T细胞应答受多种T细胞调节分子调节，以避免健康细胞上的免疫系统的过度活化(Pardoll DM.Nat Rev Cancer.2012；12(4):252-264；Sharma P,Wagner K,Wolchok JD,Allison JP.Nat Rev Cancer.2011；11(11):805-812)。这种T细胞调节分子在本公开内容的上下文中被概括为“T细胞调节剂”，并且包含检查点抑制剂和共刺激剂。肿瘤细胞通常利用这些调节系统来逃避通过免疫系统的检测。免疫系统的检查点的抑制和T细胞系统的共刺激可以增强抗肿瘤免疫应答。免疫检查点的阻断和因此肿瘤特异性T细胞的释放以发挥其针对肿瘤细胞的效应子功能已证实在癌症背景下有效，并且临床试验正在进行((Hodi FS,O’Day SJ,McDermott DF，等人N Engl J Med.2010；363(8):711-723；RobertC,Thomas L,Bondarenko I，等人N Engl J Med.2011；364(26):2517-2526；Wolchok JD,H.Kluger,M.K.Callahan，等人N Engl J Med,369(2013)，第122-133页)。

细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA)-4和程序性细胞死亡(PD)-1代表两个检查点，其迄今为止已作为癌症疗法的靶得到最广泛地研究。CTLA-4是有力的共抑制剂，其已显示在某些癌症中的T细胞表面上异常上调。它降低了响应肿瘤细胞的T细胞应答，并且因此涉及早期T淋巴细胞耐受性。已发现PD-1在某些肿瘤中上调，通过在维持外周T淋巴细胞耐受性中起作用来抑制T细胞功能，以帮助肿瘤逃避免疫系统(Keir ME,Butte MJ,Freeman GJ,Sharpe AH，等人Annu Rev Immunol.2008；26:677–704；Mahoney KM,Freeman GJ,McDermott DF.Clinical Therapeutics 37(4):764-782,2015)。

由美国食品与药物管理局(FDA)在2011年批准的第一种免疫检查点抑制剂是伊匹单抗，其是阻断CTLA-4用于治疗转移性黑素瘤的单克隆抗体。阻断PD-1与其配体之一，PD-L1(也称为B7-H1和CD274)之间的相互作用已报道生成抗肿瘤应答(Pardoll DM.Nat RevCancer.2012；12(4):252-264)。

另一种抑制性分子淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)，即与MHC II类分子结合的CD4同系物，在活化的T细胞、B细胞、NK细胞和肿瘤浸润淋巴细胞上表达，并且被认为通过限制T细胞活化来负调节T细胞扩增(Pardoll DM.Nat Rev Cancer.2012；12(4):252-264；GoldbergMV,Drake CG.Curr Top Microbiol Immunol 2011；344:269-78)。它的阻断加强T细胞增殖并且增强抗肿瘤T细胞应答(Nguyen LT,Nat Rev Immunol,2015)。

此外，T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)，其配体是半乳糖凝集素9(在各种类型的癌症中上调)，也由IFN-分泌辅助T(TH 1)细胞以及树突状细胞、单核细胞和T细胞表达[Ngiow SF,Teng MW,Smyth MJ.Cancer Res.2011；71(21):6567–71]。它抑制T辅助1细胞应答，并且TIM-3抗体增强抗肿瘤免疫性(Anderson AC.Curr Opin Immunol 2012；24:213-6)。当与其配体半乳糖凝集素9结合时，TIM-3诱导TH1细胞死亡(Zhu C,Anderson AC,Schubart A，等人Nat Immunol.2005；6(12):1245–52)。TIM-3缺陷型小鼠的研究提示TIM-3途径抑制TH 1细胞的扩增和效应子功能，并且可能对TH1细胞的耐受性诱导是重要的(Sabatos CA,Chakravarti S,Cha E，等人Nat Immunol.2003；4(11):1102–10)。据报道TIM-3与PD-1一起在肿瘤特异性CD8+T细胞上共表达，并且两种分子的双重阻断显著增强了人T细胞的体外增殖和细胞因子产生。在动物模型中，据报道PD-1和TIM-3的协同阻断增强了抗肿瘤免疫应答和肿瘤排斥(Pardoll DM.Nat Rev Cancer.2012；12(4):252-264)。

B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA/CD272)被鉴定为T细胞上的抑制性受体，并且在肿瘤细胞以及肿瘤相关的内皮细胞上表达的HVEM/TNFRSF14显示为BTLA配体。BTLA表达水平在来自患有黑素瘤的患者的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)上很高，并且在其配体HVEM的存在下，表达BTLA的T细胞受到抑制。BTLA可以抑制肿瘤特异性人CD8⁺T细胞的功能(Paulos CM,June CH.J Clin Invest 2010；120:76-80)。因此，BTLA也可能是肿瘤微环境中T细胞的相关抑制性受体和检查点抑制策略的靶(Pardoll DM.Nat Rev Cancer.2012；12(4):252-264)。

OX40(CD134/TNFRSF4)是TNFR超家族的成员，并且在抗原特异性引发期间由CD4和CD8T细胞表达。CD8和CD4T细胞上OX40的连接促进其存活和扩增。此外，活化OX40加强肿瘤反应效应T细胞的生成且抑制T细胞功能。临床前研究证实用OX40激动剂治疗荷瘤宿主导致几种临床前模型中的肿瘤消退(Linch SN,McNamara MJ,Redmond WL.Front Oncol.20155:34)。

共刺激受体CD137(4-1BB/TNFSF9)对于抗肿瘤淋巴细胞的活化和促炎极化均具有无与伦比的能力。通过CD137/4-1BB受体的共刺激活化T细胞内的多重信号级联，有力地加强T细胞活化。在抗原引发的T淋巴细胞上CD137的刺激增加了肿瘤免疫，并且CD137单一疗法能够介导显著的肿瘤消退以及甚至众多类型的已建立鼠肿瘤的治愈(Bartkowiak T,Curran MA.Front Oncol.2015 5:117)。

基于这种现有技术，本公开内容的目的是提供包含免疫刺激性DNA构建体的有效组合及其作为药剂的用途。

发明内容

关于现有技术，本公开内容的目的是提供与T细胞调节剂结合的分子和以脱氧核糖核苷酸的非编码序列形式的免疫调节DNA构建体的组合。

本公开内容教导了组合，所述组合包含与选自包括PD1、PD-L1、OX40、TIM-3、LAG3、CD137(4-1BB)的分子中的至少一种结合的化学品或分子的组分，用于影响其作为检查点抑制剂或共刺激剂的功能；以及包含至少一个序列基序N¹N²CGN³N⁴的脱氧核糖核酸的非编码序列，其中N是包含A、C、T或G的核苷酸，并且C是脱氧胞苷，G是脱氧鸟苷，A是脱氧腺苷且T是脱氧胸苷。

与T细胞调节剂结合的分子可以是合成或生物制造的蛋白质或肽，如抗体。

本公开内容的组合可以包含对于N¹N²取自GT、GG、GA、AT和AA的元件，以及对于N³N⁴取自CT、TG和TT的元件。

脱氧核糖核酸的非编码序列可以在两侧上都是线性开链的；或在双链部分的一侧上是线性开链的，而在双链的相应另一侧上具有单链发夹；或是脱氧核糖核酸的哑铃形的部分单链的共价闭合链。

该组合可以进一步包含至少三个所述序列基序N¹N²CGN³N⁴。

对于脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列预期它可包含以L-构型的至少一个核苷酸，其中位于脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列的DNA单链的5'-末端和/或3'-末端处的五个末端核苷酸之一可以为L-构型。

本公开内容的组合可以进一步包含脱氧核糖核苷酸的下述非编码序列中的至少一种：

a.GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC(SEQ ID NO：1)；或

b.ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA(SEQ ID NO：2)，或

c.AACGTTCTTCGGGG CGTT(SEQ ID NO：3)，或

d.AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT(SEQID NO：4)。

组合可以进一步包含长度为40至200个核苷酸或48至116个核苷酸的脱氧核糖核酸的非编码序列。

进一步预期序列AACGTTCTTCGGGG CGTT(SEQ ID NO：3)可以是序列CCTAGGGGTTACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCATTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC(SEQ ID NO：5)的部分。

序列基序N¹N²CGN³N⁴可以是脱氧核糖核苷酸的非编码序列的单链区域的部分，其是根据本公开内容的组合的部分。

该组合可以提供以固体、液体或气体形式的两组组分，以最大15mg/kg重量施加。这意指剂量可以适合于应当被施加组合的生物体的重量。

包括同时、交替或相继地提供本公开内容组合中的组分的步骤的方法是本发明的另一个目的。脱氧核糖核酸的非编码序列可以在用于影响T细胞调节剂的化学品或分子之前提供，和反之亦然。

本公开内容的一个进一步目的是所公开的组合作为药剂或用于治疗疾病如癌症、自身免疫疾病和炎症的用途。

所公开的组合中的化合物可以同时、交替或相继地施用，用于治疗癌症、自身免疫疾病和炎症。

所公开的组合用于制造包含可接受的药物盐的药物或药物学制剂(包括疫苗)的用途是本发明的一个进一步目的。药物可以同时、交替或相继释放所公开的组合中的化合物。

最后，本公开内容的组合作为治疗性或预防性疫苗接种中的佐剂的用途是本公开内容的目的。

附图说明

本发明将在附图的基础上进行描述。应理解，附图中描述的本发明的实施例和方面仅是示例，并不以任何方式限制权利要求的保护范围。本发明由权利要求及其等价物限定。本领域技术人员将理解，本发明的一个方面或实施例的特点可以与本发明的其他实施例的一个或多个不同方面的特点组合。它显示：

图1A，B SEQ ID NO：5与抗PD-1的组合的抗肿瘤活性。

图2用选自回忆抗原(recall antigens)的HLA I类限制性T细胞表位的肽在体外刺激人PBMC。

图3A，B SEQ ID NO：5与抗PD-L1的组合的抗肿瘤活性。

图4A，B SEQ ID NO：6与抗PD-1的组合的抗肿瘤活性。

图5用选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位，SEQ ID NO：6和抗PD-的肽在体外刺激人PBMC。

图6A，B SEQ ID NO：7与抗CTLA-4的组合的抗肿瘤活性。

图7A，B SEQ ID NO：7与抗PD-L1的组合的抗肿瘤活性。

图8A-C用选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位，SEQ ID NO：9和抗PD-的肽在体外刺激人PBMC。

图9A，B SEQ ID NO：10与抗PD-1的组合的抗肿瘤活性。

图10A，B SEQ ID NO：10与抗CTLA-4的组合的抗肿瘤活性。

图11用选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位，SEQ ID NO：10和抗PD-的肽在体外刺激人PBMC。

图12用选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位，SEQ ID NO：11和抗PD-1的肽在体外刺激人PBMC。

图13用选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位，EnanDIM362和抗PD-1的肽体外刺激人PBMC。

具体实施方式

本发明提供了与所谓的T细胞调节剂结合的分子和脱氧核糖核酸的非编码序列的组合。

在本公开内容的含义内，线性开链DNA序列被指定为寡核苷酸，缩写为ODN。所述DNA序列可以是单链的或者部分或完全双链的。术语寡核苷酸(oligo)、寡核苷酸(oligonucleotide)和寡脱氧核苷酸是同义使用的，并且不指示相应DNA序列的长度的限制。寡核苷酸的单个组分是核苷酸。

寡核苷酸可以合成制造或者部分或完全由生物来源制备，其中生物来源包括基于遗传的DNA序列制造方法。

L-DNA或以L-构型的核苷酸指包含L-脱氧核糖而不是天然存在的D-脱氧核糖作为糖残基的核苷酸。L-脱氧核糖是D-脱氧核糖的对映体(镜像)。部分或完全由以L-构型的核苷酸组成的寡核苷酸可以是部分或完全单链或双链的；然而，以L-构型的核苷酸不能与以D-构型的核苷酸杂交(Hauser等人，Nucleic Acid Res.2006 34:5101-11)。L-DNA与D-DNA同样可溶和有选择性。然而，L-DNA针对天然存在的酶尤其是外切核酸酶的酶促外切活性具有抗性，所以L-DNA被保护不受细胞内降解(Urata等人，Nucleic Acids Res.1992 20:3325-32)。因此，L-DNA是可非常广泛应用的。

根据本公开内容的“茎”应当理解为在相同寡核苷酸内(其然后为部分自互补的)或在不同寡核苷酸内(其是部分或完全互补的)通过碱基配对形成的DNA双链。分子内碱基配对指定在相同寡核苷酸内的碱基配对，并且不同寡核苷酸之间的碱基配对被称为分子间碱基配对。

在本公开内容的含义内的“环”应当理解为在茎结构内或茎结构的末端处的不成对的单链区域。“发夹”是茎和环的独特组合，当相同寡核苷酸的两个自互补区域杂交以形成在一个末端处具有不成对环的茎时，发夹出现。

核苷酸与之共价或非共价附着的“固相”指(但不限于)柱、基质、珠、玻璃包括改性或官能化玻璃、二氧化硅或基于二氧化硅的材料包括硅和改性硅、塑料(包含聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、丙烯酸酯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯等)、尼龙或硝化纤维素、树脂、多糖、碳以及无机玻璃和塑料。因此，根据本公开内容，微量滴定板也在固相的范围内。

根据本公开内容的免疫调节指免疫刺激和免疫抑制。免疫刺激优先意指刺激免疫系统的效应细胞，以便增殖、迁移、分化或以任何其他形式变得活化。B细胞增殖例如可以通过免疫刺激性寡核苷酸进行诱导而无需共刺激信号(B细胞增殖通常需要来自辅助胸腺细胞的共刺激信号)。

另一方面，免疫抑制应当理解为降低免疫系统的活化或功效。一般有意诱导免疫抑制，以预防例如移植器官的排斥、治疗在骨髓移植后的移植物抗宿主病、或用于治疗自身免疫疾病例如类风湿性关节炎或克罗恩氏病。

在该背景下，免疫调节还可以指通过影响或修饰仍在发展中或成熟的免疫反应，或者通过调节已建立的免疫反应的特征来影响免疫反应的性质或特征。因此，影响在检测点抑制剂的背景下意指压制其抑制效应，并且在共刺激分子的背景下意指将其活化。

术语“癌症”包含待治疗或预防的癌性疾病或肿瘤，其选自乳腺癌、黑素瘤、皮肤赘生物、胃肠肿瘤包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、小肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、肾细胞癌和/或肝转移。

根据本公开内容的自身免疫疾病包含类风湿性关节炎、克罗恩氏病、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化症、格雷夫斯病、重症肌无力、乳糜泻和艾迪生氏病。

在本公开内容的意义内且根据其共同定义，激动剂表示结合另一种分子如受体或配体并且因此活化分子的化学品或分子。与活化的激动剂相反，拮抗剂应当理解为阻断拮抗剂与之结合的分子与相应激动剂的相互作用的化学品或分子。取决于背景，在本发明的理解中的拮抗剂也可以导致过程的活化，因为拮抗剂例如阻断另一种拮抗剂与受体的相互作用。

如本文使用的，术语“药学适用或可接受的盐”包括组合的化合物的盐，其用相对无毒(即药学可接受的)酸或碱制备，取决于在本发明的化合物上发现的特定取代基。例如，如果本发明的化合物含有酸性官能团，则碱加成盐可以通过将这种化合物的中性形式与足够量的所需碱接触而获得，所述碱是纯的或在合适的惰性溶剂中。药学可接受的碱加成盐的非限制性实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐或类似的盐。如果本发明的化合物含有碱性官能团，则酸加成盐可以通过使这些化合物的中性形式与足够量的所需酸接触而获得，所述酸是纯的或在合适的惰性溶剂中。药学可接受的酸加成盐的非限制性实例包括衍生自无机酸的那些，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、磷酸、部分中和的磷酸、硫酸、部分中和的硫酸、氢碘酸或亚磷酸等等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等等。还包括的是氨基酸如精氨酸等等的盐，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等等的盐。本发明的某些具体化合物可以含有碱性官能团和酸性官能团两者，所述官能团允许化合物被转换为碱加成盐或酸加成盐。使盐与碱接触可以再生本发明的化合物或酸的中性形式，并且以常规方式分离母体化合物。化合物的母体形式在某些物理性质方面(例如在极性溶剂中的溶解性)不同于各种盐形式，但是在其他方面盐等价于化合物的母体形式用于本发明的目的。本发明的化合物可以具有手性或不对称碳原子(光学中心)和/或双键。外消旋物、非对映体、几何异构体和各个光学异构体由本发明涵盖。本发明的化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式包括水合形式存在。一般而言，溶剂化形式等价于非溶剂化形式，并且也由本发明涵盖。本发明的化合物另外还可以以多晶形式或无定形形式存在。

由脱氧核糖核苷残基的部分单链、哑铃形、共价闭合链组成的脱氧核糖核酸分子，其含有碱基序列N¹N²CGN³N⁴的一个或多个序列，其中N¹N²是来自GT、GG、GA、AT或AA组的元件，N³N⁴是来自CT或TT组的元件，以及C脱氧胞嘧啶、G脱氧鸟苷、A脱氧腺苷和T脱氧胸苷，与能够结合免疫系统的T细胞调节剂的化学品或分子组合使用，用于人或高等动物中的免疫刺激。

与本公开内容有关的脱氧核糖核酸分子可以具有至多200个核苷酸的长度。特别地，预期长度在48至116个核苷酸之间的序列。

脱氧核糖核酸分子的哑铃形非编码序列可以在它们的单链区域包含碱基序列N¹N²CGN³N⁴。

免疫刺激可以在体外或体内发生。

本公开内容还提供了包含至少一个CpG基序和至少一个以L-构型的核苷酸的线性开链DNA序列。由于部分/完全的L-构型，DNA序列没有外切核酸酶可以接近的5'-末端或3'-末端。在构建体在双链的一个末端上具有单链环的情况下，末端也被保护不受降解。由此，ODN被完全保护免于细胞降解，而无需使用已显示毒性的硫代磷酸酯主链。另外，ODN仅由最小数目的核苷酸组成，这使得它们很小并且由此易于转染到细胞内。

包含至少一个序列基序N¹N²CGN³N⁴的脱氧核糖核酸的非编码序列可以是单链的或者部分或完全双链的。这包括在相同分子内(分子内)或在不同分子内(分子间)或其任何组合的碱基配对。构建体还能够包含至少一个未配对的单链区域。作为一个进一步的实施例，包括发夹结构。由于部分或完全的L-构型，确保构建体的更长半衰期，因为以L-构型的核苷酸不经受降解。

其为单链或者部分或完全双链的至少两个分子可以彼此连接以形成多聚体构建体也在本公开内容的范围内。这些多聚体构建体因此掺入紧密包装在一个分子内的至少与连接配偶体一样多的CpG基序，并且因此预期也引发相当大的免疫应答，作为与T细胞调节剂的组合的部分。所得到的单链或者部分或完全双链多聚体构建体可以是共价闭合的(包含在分子内以L-构型的核苷酸)，或者是开放多聚体构建体(包含在5'-末端和/或3'-末端处以L-构型的核苷酸)，用于保护免受细胞降解。

本公开内容进一步包含在脱氧核糖核酸的非编码序列中的至少一个核苷酸通过官能团的化学修饰，所述脱氧核糖核酸的非编码序列包含至少一个序列基序N¹N²CGN³N⁴，所述官能团选自羧基、胺、酰胺、醛亚胺、缩酮、缩醛、酯、醚、二硫化物、巯基和醛基。这允许DNA构建体通过例如吸附、共价键合或离子键合与选自肽、蛋白质、碳水化合物、抗体、合成分子、聚合物、微射弹、金属颗粒或固相的化合物偶联。

修饰可以为了相应的目的而具体选择。该构建体可以因此用于例如将其他分子穿梭至应答掺入的CpG基序的特定细胞。另外，通过这种修饰能够将构建体与微射弹偶联，所述微射弹可以用于将构建体转移到细胞内。构建体也可以偶联到固相例如微量滴定板。

进行下述实验以研究将脱氧核糖核酸的非编码序列与T细胞调节剂组合的影响。使用包含序列基序N¹N²CGN³N⁴的哑铃形、包含N¹N²CGN³N⁴的脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列进行实验，其中那些构建体包含以L-构型的核苷酸以防止其降解。另外，研究了将T细胞调节剂与包含N¹N²CGN³N⁴的脱氧核糖核酸的非编码序列和SEQ ID NO：4的序列两次组合的效应。

在具有注射的人肿瘤的小鼠模型中使用与PD1、PD-L1、OX40、LAG-3、TIM3和CD137(4-1BB)结合的T细胞调节剂抗体。下文更详细地描述了与对照组相比，在生长期后的疗法对肿瘤生长的作用。

实验将剂量方案与本公开内容组合中的组分的同时、交替或相继施加进行比较。除化合物的定性施加之外，还研究了减少量的T细胞调节剂对于在施加检查点抑制剂而不使用包含N¹N²CGN³N⁴序列基序的非编码DNA序列时实现可比较或甚至更好的结果是否是必要的。

TLR9激动剂与结合T细胞调节剂的分子的组合潜力的体外分析包括使用人PBMC的体外细胞培养系统，用于评估在刺激后它们的T细胞应答。在针对免疫T细胞调节剂(例如PD-1、PD-L1等)和TLR9激动剂(即SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：6)的抗体的存在下，用来自CMV、EBV、流感和破伤风毒素的免疫原性肽的混合物实现PBMC的刺激。

测定了细胞培养上清液中细胞因子(IL-2和IFN-γ)的定量。虽然这种体外细胞培养系统不能反映免疫细胞在体内的复杂相互作用，但它为这些TLR9激动剂组合的优点提供了证据。

附图的详细描述

与小鼠A20肿瘤模型中的抗PD-1或SEQ ID NO：5单一疗法相比，SEQ ID NO：5与抗PD-1的组合显示令人惊讶地极大增加的抗肿瘤效应。

肿瘤生长令人惊讶地通过SEQ ID NO：5和PD-1的组合几乎完全抑制(图1A，B)。9-12只小鼠/组用A20鼠肿瘤细胞进行s.c.接种，并且用SEQ ID NO：5(在第14、16、19、21、23、26、28、30、33和35天时，250μg/施加，i.tu.)、抗PD-1(在第8、11、16和19天时，100μg/施加，i.p.)或两者进行注射。媒介物的注射(i.tu)充当对照。图1A显示了平均肿瘤生长-嵌入，从第18天到第32天的平均肿瘤生长抑制(在第29天时：对于SEQ ID NO：5为46.0％，对于抗PD-1为54.2％，并且对于组合为99.9％)。图1B显示了Kaplan-Meier存活图。

当人外周血单核细胞(PBMC)与抗原肽以及SEQ ID NO：5和抗PD-1的组合一起温育时，在体外证实了图1A，B中所示的SEQ ID NO：5与抗PD-1的协同组合效应。肽选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位(CMV、EBV、Flu＝CEF)，并且与单独的SEQ ID NO：5或抗PD-1注射相比，与SEQ ID NO：5的组合明确地增加了通过PBMC的INF-γ分泌(图2)。肽的最终浓度为1μg/ml/肽，SEQ ID NO：5以3μM的浓度使用，并且抗PD-1的浓度为10μg/ml(n＝4)。分析IFN-γ分泌作为免疫应答的标记；针对在用单独的CEF-肽刺激PBMC后的IFN-γ水平标准化。鼠IgG(10μg/ml)用作抗PD-1的对照。

此外，在小鼠CT26肿瘤模型中，抗PD-L1和SEQ ID NO：5的组合疗法的令人惊讶的有益效应也明确优于SEQ ID NO：5或抗PD-L1单一疗法。肿瘤生长减少(图3A)并且存活增加(图3B)。10只小鼠/组用CT26鼠肿瘤细胞进行s.c.接种，并且用SEQ ID NO：5(在第3、5、7、10、12、14、17、19、21、24和26天时，250μg/施加，s.c.)、抗PD-L1(在第3、5、7、9、11、13、15、17天时，10mg/kg/施加，i.p.)或两者进行注射。媒介物的注射(s.c.)充当对照。图3A显示了平均肿瘤生长-嵌入，从第17天到第27天的平均肿瘤生长抑制(在第20天时：对于lefitolimod为23.0％，对于抗PD-L1无抑制，并且对于组合为39.9％)。图1B显示了Kaplan-Meier存活图。

还研究了施加具有环序列

TCATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTCTT的SEQ ID NO：6的组合效应。

SEQ ID NO：6在小鼠CT26肿瘤模型中连同抗PD-1一起施用。与用单一试剂SEQ IDNO：6或抗PD-1的单一疗法相比，这种组合令人惊讶地显著增强了抗肿瘤效应(图4A，B)。再次，10只小鼠/组用CT26鼠肿瘤细胞进行s.c.接种，并且用SEQ ID NO：6(在第15、17、19、22、24、26、29、31天时，250μg/施加，i.tu.)、抗PD-1(在第3、6、10和13天时，100μg/施加，i.p.)或两者进行注射。媒介物的注射(i.tu)充当对照。图4A显示了平均肿瘤生长-嵌入，从第15天到第29天的平均肿瘤生长抑制(在第23天时：对于SEQ ID NO：6为48.2％，对于抗PD-1无抑制，并且对于组合为75.4)。图1B显示了平均Kaplan-Meier存活图。

图4中显示的结果与具有抗原肽的人PBMC的体外刺激数据一致，也令人惊讶地显示该组合超过化合物的单一使用的益处(图5)。使用具有1μg/ml/肽的最终浓度、选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位(CMV、EBV、Flu＝CEF)的肽，以3μM浓度的SEQ ID NO：6和以10μg/ml的抗PD-1(n＝4)。IFN-γ分泌用作免疫应答的标记；针对在用单独的CEF-肽刺激PMBC后的IFN-γ水平标准化。鼠IgG(10μg/ml)用作抗PD-1的对照。

包含以L-构型的核苷酸的寡核苷酸用于进一步研究中。那些寡核苷酸在指定位置处包含L-核苷酸。DNA分子与核心序列[yTCATTxCGTGACGTGACGTTCzv](y＝2至8G，用1至3个L-脱氧核糖保护或不受保护；x＝3至4A；z＝2至6T，用1至3个L-脱氧核糖保护；v＝A、G、C、T)一起使用。

当与检查点抑制剂组合时，这些含L-核苷酸的分子显示增加的免疫调节和抗肿瘤性质。例如，在小鼠CT26肿瘤模型中SEQ ID NO：7(GGGGTCATT AAAACGTGACGTGACGTTCTTTTT，含有L-脱氧核糖的碱基加下划线)与抗CTLA-4的组合导致与SEQ ID NO：7或抗CTLA-4单一疗法相比，令人惊讶地有效降低的肿瘤生长(图6)。10只小鼠/组用CT26鼠肿瘤细胞进行s.c.接种，并且用SEQ ID NO：7(在第3、5、8、10、12、15、17、19、22、14和26天时，250μg/施加，s.c.)、抗CTLA-4(在第8天时的100μg/施加；在第11和14天时的50μg/施加，i.p.)或两者进行注射。媒介物的注射(s.c.)充当对照。图6A显示了平均肿瘤生长-嵌入，从第15天到第30天的平均肿瘤生长抑制(在第22天时：对于SEQ ID NO：7为19.8％，对于抗PD-1为59.1％，对于组合为65.3％)。图6B显示了Kaplan-Meier存活图。

在小鼠CT26肿瘤模型中，与单一化合物SEQ ID NO：7或抗PD-L1的那种相比，SEQID NO：7与抗PD-L1的组合还显示适度增加的抗肿瘤效应(图7)。10只小鼠/组用CT26鼠肿瘤细胞进行s.c.接种，并且用SEQ ID NO：7(在第3、5、7、10、12、14、17、19、21、24和26天时，s.c.)、抗PD-L1(在第3、5、7、9、11、13、15、17天时，10mg/kg/施加，i.p.)或两者进行注射。媒介物的注射(s.c.)充当对照。图7A显示了平均肿瘤生长-嵌入，从第13天到第27天的平均肿瘤生长抑制(在第20天时：对于SEQ ID NO：7为16.3％，对于抗PD-L1无抑制，对于组合为33.3％)。图7B显示了Kaplan-Meier存活图。

在体外研究中，关于来自用抗原肽刺激的PBMC的IFN-γ分泌，观察到抗PD-1与SEQID NO：7、SEQ ID NO：8(GGGGGGGGTCATTAAAACGTGACGTGACGTTCTTTTT，含有L-脱氧核糖的碱基加下划线)和SEQ ID NO：9(GGGGTCATTAAACGTGACGTGA CGTTCTTTTT，含有L-脱氧核糖的碱基加下划线)的组合的益处(图8)。肽选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位(CMV、EBV、Flu＝CEF；最终浓度1μg/ml/肽)、SEQ ID NO：7(A，n＝12)、SEQ ID NO：8(B，n＝2)、SEQ IDNO：9(C，n＝4)，每种DNA分子以3μM的最终浓度；和抗PD-1(10μg/ml)。分析IFN-γ分泌作为免疫应答的标记；针对在用单独的CEF-肽刺激后的IFN-γ水平标准化。鼠IgG(10μg/ml)用作抗PD-1的对照。

在另一系列实验中，使用DNA分子与核心序列[yTCATTxCGTTCTTCGGGGCGTTCzv](y＝2至8G，用1至3个L-脱氧核糖保护或不受保护；x＝3至4A；z＝2至6T，用1至3个L-脱氧核糖保护；v＝A、G、C、T)。

对于该组也确定了关于免疫调节和抗肿瘤效应的组合效应。作为该组的例子，SEQID NO：10(GGGGTCATTAAACGTTCTTCGGGG CGTTCTTTTT，含有L-脱氧核糖的碱基加下划线)用于研究与抗PD-1的组合。

该组合导致小鼠CT26肿瘤模型中肿瘤生长的显著降低(图9)。10只小鼠/组用CT26鼠肿瘤细胞进行s.c.接种，并且用SEQ ID NO：10(在第3、5、8、10、12、15、17、19、22、14和26天时，200μg/施加，s.c.)、抗PD-L1(在第3、6、10和14天时，200μg/施加，i.p.)或两者进行注射。媒介物的注射(s.c.)充当对照。图9A显示了平均肿瘤生长-嵌入，从第14天到第32天的平均肿瘤生长抑制(在第25天时：对于SEQ ID NO：10为17.8％，对于抗PD-L1为51.9％，对于组合为74.6％)。图9B显示了Kaplan-Meier存活图。

另外，与用单一试剂SEQ ID NO：10或抗CTLA-4的处理相比，SEQ ID NO：10与抗CTLA-4的组合导致小鼠CT26肿瘤模型中降低的肿瘤生长(图10)。10只小鼠/组用CT26鼠肿瘤细胞进行s.c.接种，并且用SEQ ID NO：10(在第3、5、8、10、12、15、17、19、22、14和26天时，200μg/施加，s.c.)、抗CTLA-4(在第8天时的100μg/施加，在第11和14天时的50μg/施加，i.p.)或两者进行注射。媒介物的注射(s.c.)充当对照。图10A显示了平均肿瘤生长-嵌入，从第15天到第30天的平均肿瘤生长抑制(在第22天时：对于SEQ ID NO：10为49.7％，对于抗PD-L1为59.1％，对于组合为70.3％)。图10B显示了Kaplan-Meier存活图。

此外，SEQ ID NO：10和抗PD-1的组合在体外PBMC刺激研究中进行评估，并且显示与单独的SEQ ID NO：10或抗PD-1相比，关于IFN-γ分泌增加的效应(图11)。肽选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位(CMV、EBV、Flu＝CEF；最终浓度1μg/ml/肽)、SEQ ID NO：10(3μM)和抗PD-1(10μg/ml)(n＝5)。IFN-γ分泌的分析充当免疫应答的标记；针对在用单独的CEF-肽刺激后的IFN-γ水平标准化。鼠IgG(10μg/ml)用作抗PD-1的对照。

在进一步的实验中，DNA分子与核心序列[yTCATTxTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGzv](y＝2至8G，用1至3个L-脱氧核糖保护或不受保护；x＝3至4A；z＝2至6T，用1至3个L-脱氧核糖保护；v＝A、G、C、T)一起用于实验中。

SEQ ID NO：11

(GGGGTCATTAAATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTT，含有L-脱氧核糖的碱基加下划线)用作该组的实例。当SEQ ID NO：11在PBMC研究中在体外与抗PD-1结合时，IFN-γ分泌令人惊讶地显著增加，显示与单独的SEQ ID NO：11或抗PD-1相比的改善(图12)。肽选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位(CMV、EBV、Flu＝CEF；最终浓度1μg/ml/肽)、SEQ ID NO：11(3μM)和抗PD-1(10μg/ml)(n＝4)。分析IFN-γ分泌作为免疫应答的标记；针对在用单独的CEF-肽刺激后的IFN-γ水平标准化。鼠IgG(10μg/ml)用作抗PD-1的对照。

最后，DNA分子与核心序列[yACGATCGTCwT](y＝2至8G，用1至3个L-脱氧核糖保护或不受保护；w＝4至12G，用1至3个L-脱氧核糖保护)一起用于测试组合施加的效应。

该组的一个实例是SEQ ID NO：12(GGGGGACGATCGTCGGGGGGT，含有L-脱氧核糖的碱基加下划线)。在使用人PBMC的体外刺激研究中，与单一化合物相比，评估了其与抗PD-1的组合，导致显著增强的免疫应答(图13)。肽选自回忆抗原的HLA I类限制性T细胞表位(CMV、EBV、Flu＝CEF；最终浓度1μg/ml/肽)、SEQ ID NO：12(3μM)和抗PD-1(10μg/ml)(n＝4)。分析IFN-γ分泌作为免疫应答的标记；针对在用单独的CEF-肽刺激后的IFN-γ水平标准化。鼠IgG(10μg/ml)用作抗PD-1的对照。

考虑到上述实验设置以及约20g的小鼠体重，待施加的DNA量位于约12,5mg/kg体重的范围内，使得看起来可行的是最大15mg/kg是获得所示的令人惊讶的结果所必要的。

抗PD-1抗体已以10mg/kg重量施加，使得最大15mg/kg重量看起来也是获得所示的令人惊讶的结果所必要的。

序列表

<110> 莫洛根股份公司

<120> 包含免疫刺激性寡核苷酸的组合

<130> 58 164 K

<150> LU92821

<151> 2015-09-09

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide

<400> 1

gttcctggag acgttcttag gaacgttctc cttgacgttg gagagaac 48

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide

<400> 2

accttccttg tactaacgtt gcctcaagga aggttgatct tcataacgtt gcctagatca 60

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide

<400> 3

aacgttcttc ggggcgtt 18

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide

<400> 4

aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc atcgtcgttt tgtcgttttg tcgttctt 58

<210> 5

<211> 116

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide

<400> 5

cctaggggtt accaccttca ttggaaaacg ttcttcgggg cgttcttagg tggtaacccc 60

taggggttac caccttcatt ggaaaacgtt cttcggggcg ttcttaggtg gtaacc 116

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynuclotide

<400> 6

aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc atcgtcgttt tgtcgttttg tcgttctt 58

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide; Position 31 and 32 in

L-conformation

<400> 7

ggggtcatta aaacgtgacg tgacgttctt ttt 33

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide; Positions 1, 2 and 35 and 36 in

L-conformation

<400> 8

ggggggggtc attaaaacgt gacgtgacgt tcttttt 37

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide; positions 30 and 31 in

L-conformation

<400> 9

ggggtcatta aacgtgacgt gacgttcttt tt 32

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide; positions 32 and 33 in

L-conformation

<400> 10

ggggtcatta aacgttcttc ggggcgttct tttt 34

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide; positions 37 and 38 in

L-conformation

<400> 11

ggggtcatta aatcgtcgtt ttgtcgtttt gtcgttttt 39

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic oligodeoxynucleotide; positions 1, 2 and 19 and 20 in

L-conformation

<400> 12

gggggacgat cgtcgggggg t 21

Claims

1.一种脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列，其选自SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQID NO:9和SEQ ID NO:11。

2.权利要求1的线性开链非编码序列，其为SEQ ID NO:7。

3.权利要求1的线性开链非编码序列，其为SEQ ID NO:8。

4.权利要求1的线性开链非编码序列，其为SEQ ID NO:9。

5.权利要求1的线性开链非编码序列，其为SEQ ID NO:11。

6.一种药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项的脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列和药学上可接受的赋形剂。

7.权利要求6的药物组合物，其还包含PD-1，PD-L1，CTLA4，OX40，TIM-3，LAG3或CD137(4-1BB)抗体。

8.权利要求6的药物组合物，其包含：

(1)PD-L1抗体和序列为SEQ ID NO:7的脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列；

(2)CTLA4抗体和序列为SEQ ID NO:7的脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列；

(3)PD-1抗体和序列为SEQ ID NO:8的脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列；

(4)PD-1抗体和序列为SEQ ID NO:9的脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列；或

(5)PD-1抗体和序列为SEQ ID NO:11的脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列。

9.权利要求6的药物组合物，其包含(a)PD-L1抗体；和(b)序列为SEQ ID NO:7的线性开链非编码序列。

10.权利要求6的药物组合物，其包含(a)CTLA4抗体；和(b)序列为SEQ ID NO:7的线性开链非编码序列。

11.权利要求6至10中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是疫苗。

12.权利要求1-5中任一项的脱氧核糖核酸的线性开链非编码序列或权利要求6的药物组合物在制备用于免疫疗法的药剂中的用途。

13.权利要求12的用途，其中所述药剂还包含PD-1，PD-L1，CTLA4，OX40，TIM-3，LAG3或CD137(4-1BB)抗体。

14.权利要求12所述的用途，其中所述药剂还包含：

15.权利要求12的用途，其中所述药剂还包含：(a)PD-L1抗体；和(b)序列为SEQ ID NO:7的线性开链非编码序列。

16.权利要求12的用途，其中所述药剂还包含：(a)CTLA4抗体；和(b)序列为SEQ ID NO:7的线性开链非编码序列。

17.权利要求12至16中任一项的用途，其中所述药剂是治疗性或预防性疫苗接种中的佐剂。