KR20180050309A - 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 배합물 - Google Patents

면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 배합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배합물 및 이의 질병 치료용 용도에 관한 것이다. 본 발명은 PD1, PD-L1, OX40, TIM-3, LAG3, CD137(4-1BB)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 소위 T-세포 조절자 및 비-코딩 면역조절 DNA의 배합물 제공한다.

Description

면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 배합물
본 발명은 배합물 및 이의 질병 치료용 용도에 관한 것이다.
용어 "면역 요법(immunotherapy)"은 면역 반응을 자극, 유도, 증강 또는 억제함으로써 질병을 치료하는 것으로 정의된다. 면역 요법의 전략은 암, 전염병, 알레르기 및 천식과 같은 질병을 퇴치하는 것이다.
면역 요법에서 사용될 수 있는 다양한 활성제, 소위 면역 조절제(immunomodulators)가 공지되어 있다. 대부분의 확립된 면역 조절제는 소분자 또는 핵산에 속하며, 이들 중 다수는 톨 유사 수용체(toll-like receptor) 시스템과 상호작용한다. 가장 잘 알려진 면역 조절(immunomodifying) 쇼트 DNA 서열은 Kryeg et al.(Nature 1995 374: 6522 546-549)에 의해 기술된 비메틸화 시토신 구아닌 모티프(CG motif)를 함유한다. 비메틸화 CG 모티프의 발생은 원핵 생물 또는 바이러스와 비교하여 진핵 생물의 게놈에서 실질적으로 억제된다. 따라서, 이러한 모티프를 함유하는 DNA 분자는 자연적인 "위험 신호(danger signal)"로 진화하고, 원핵 생물 또는 바이러스성 병원체와의 싸움에서 면역 시스템을 유발한다. 이는 면역 요법으로 감염성 질병을 치료하거나 예방하기 위해 이러한 서열을 사용함으로써 치료 적으로 또는 예방적으로 이용될 수 있다. 최근 몇 년간 종양과의 싸움을 위해 환자 자신의 면역 시스템을 활성화시킬 목적으로, 암 치료에 이러한 면역 조절제를 사용하는 것이 강조되었다.
비메틸화된 CG 모티프를 포함하는 DNA 구조물은 수상돌기세포, 대식세포, 내츄럴 킬러(NK) 및 NKT 세포를 포함하는 본래의 면역 시스템의 이펙터 세포를 강하게 자극함으로써 현저한 생리학적 효과를 유도할 수 있다. 비메틸화된 CG 모티프는 본래의 면역 패턴 인식 수용체인 톨 유사 수용체(TLR) 9에 의해 검출된다. 정확한 인식 메커니즘이 아직 완전히 이해되지는 않았지만 근원적 경로를 밝히는 데 상당한 진전이 있었다(A. Krieg, Nat Rev. Drug Disc., 5 : 471-484, 2006).
비메틸화된 CGs를 함유하는 DNA 구조물이 수용체에 바인딩할 때, 반응하는 세포에서 다중 신호 케스케이드가 활성화되는 것으로 추정된다. 특유의 표면 분자의 상향 조절 및 사이토 카인의 분비에 의해, 우세한 Th1 패턴으로 적응 면역이 유도된다. 이러한 구조물은 예를 들어 항체, 화학 요법 또는 방사선 치료, 백신 또는 사이토카인과 조합하여 사용될 수 있다. 알레르기 질환과 천식은 대부분 Th2 매개이다. Th1/Th2의 비율을 증가시킴으로써, Th2 매개 반응이 약화되고 이로 인해 이러한 타입의 질병을 치료하거나 예방할 수 있다.
TLR-9 경로에 의해 조절되지 않는 표면 분자는 예를 들어 세포 타입에 따라 CD40, CD69, CD80, CD86 또는 CD169를 포함한다. 사이토카인의 증가된 분비는 별개의 세포 타입에도 특징적이며; 사이토카인은 예를 들어 마크로파지 염증 단백질(MIP)-1알파, MIP-1베타, 인터루킨(IL)-6, IL-8, 인터페론(IFN)-알파, 종양 괴사 인자(TNF)-알파, IFN-감마, 모노사이트 케모타틱 단백질(MCP)-1 또는 10kDa의 IFN-감마-유도된 단백질(IP-10)을 포함한다.
질병을 예방 또는 치료하기 위해, 백신접종은 매우 효과적인 접근법으로 입증되었다. 강력하고 내구성 있는 면역 반응을 보장하기 위해, 수상돌기세포와 같은 항원제시세포를 자극할 수 있는 보조제(aduvants)는 일반적으로 항원과 함께 투여되며, 그 목적을 위해 TLR9 아고니스트는 강력한 면역 자극제인 것으로 나타났다.
전임상 및 진행중인 임상 연구는 면역 조절제 및/또는 보조제로서의 TLR-9 아고니스트의 사용을 뒷받침하고, 체액성 반응 및 세포성 반응 모두를 증진시킴으로써 항종양 효과를 입증한다.
비메틸화된 CG 모티프가 면역 반응에 영향을 주거나 조절하는 근본적인 메카니즘에 대한 어느 설명과는 무관하게, 이러한 모티프를 사용함으로써 면역 시스템의 조절을 위해 많은 접근이 개발되었다. WO 1998/018810은 비메틸화된 CG 모티프를 함유하는 면역자극 서열이 단일 스트랜드의 일부일 경우 더욱 효과적임을 개시하고 있다. 그러나, 개방-쇄 단일 스트랜드 DNA 분자를 투여하는 것은 단일 스트랜드 핵산의 신속한 분해로 인해 실용적이지 않다. 결과적으로, 비메틸화된 CG 모티프를 포함하는 단일 또는 이중 스트랜드 DNA 구조물의 보호를 위한 다른 방법들이 개발되었다.
DNA 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 저항성을 달성하기 위해, 핵산 폴리머의 백본에서 포스포디에스테르 결합은 종종 포스포로티오에이트로 변형된다. 이러한 포스포로티오에이트-보호된 핵산의 다소 적은 자극 활성 외에도, 지난 수년간의 임상 시험에서, 포스포로티오에이트-보호의 독성은 이러한 핵산을 약학 조성물 또는 약제의 어느 용도로부터 배제하거나 심하게 제한하는 것으로 나타났다.
구별되는 면역조절 프로필을 갖는 공지된 활성제의 4가지 부류로부터, 2개를 제외한 모든 멤버들은 선형 DNA 분자를 포함한다. 한 가지 예외는 EP 1 196 178에 개시되어 있다. 이 문헌에는 전체적으로 천연 DNA로 구성된 CG 모티프("dSLIM")를 포함하는 부분적으로 단일 가닥, 덤벨 형태의 공유결합적으로 폐쇄된 뉴클레오티드 잔기의 서열을 포함하는 짧은 데옥시리보핵산 분자가 개시되어 있다. EP 1 196 178의 개시에 따르면, CG 모티프는 개시된 분자의 이중 스트랜드 줄기의 양쪽 말단에 있는 단일 스트랜드 루프 내에 또는 이중 스트랜드 줄기 내에 위치한다. 단일 스트랜드 헤어핀 루프는 세포 내 또는 외의 DNA 핵산 뉴클레아제에 의한 분해로부터 이중 스트랜드 줄기를 보호한다. GB 1402847.6에는 다른 서열을 이용한 다소 유사한 덤벨 구조가 개시되어 있다.
선형 올리고뉴클레오티드로부터의 또 다른 예외는 WO 2012/085291에 개시되어 있다. 이 문헌은 L-형태의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 구조물을 교시하고 있다. WO 2012/085291에 개시된 데이터에 따르면, L-형태의 뉴클레오티드의 수 및 DNA 구조 내의 이들의 위치는 DNA 구조물의 면역자극 능력에 영향을 미친다. L-형태의 뉴클레오티드만을 포함하는 DNA 구조물은 예를 들어 면역 시스템을 효율적으로 자극하지 못한다.
문헌 WO 2010/039137에는 면역자극 모티프의 측면에 있는 서열에서 및/또는 변형되지 않았으면 면역자극성일 수 있는 올리고뉴클레오티드 모티프에서 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 TLR 매개 질환에 대한 안타고니스트로서 면역 조절 올리고뉴클레오티드가 개시되어 있다. 따라서, WO 2010/039137의 개시된 올리고뉴클레오티드의 의도는 TLR에 의해 야기되는 면역 반응을 억제하는 것이다.
WO 2005/042018에는 새로운 소위 C-클래스 CpG 올리고뉴클레오티드에 대해 기재되어 있으며, 여기서 c-클래스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 분자의 5' 말단 또는 3' 말단에 또는 그 근처에 위치하는 CpG 서열, 및 일반적으로 분자의 다른 말단에 또는 그 근처에 위치하는 GC-풍부 팔린드롬(palindrome) 모티프에 의해 특성화된다. 이 문헌에는 c-클래스 DNA의 팔린드롬 서열의 변이들이 개시되어 있다.
문헌 WO 2015/124614에는 공유결합으로 폐쇄된 DNA 구조물, 약학 조성물 및 백신 및 이들의 면역 시스템의 조절용으로의 용도가 개시되어 있으며, 여기서 DNA 구조물은 특정 DNA 서열을 포함한다.
세포성 면역 반응의 강한 자극은 조절 회로에 영향을 미칠 수 있게 하고, 이러한 개입없이는 환자에게 만족스러운 면역 활성이 일어나지 않을 것이다. 이것은 "약한(weak)" 항원에 대한 반응을 유도하는 것을 포함하는 것으로, 즉 예를 들어 종양 질환에서 종종 발생하는 염색체 전좌 또는 돌연변이된 온코진(oncogenes)에서 브레이크포인트 펩티드와 같은 MHC-I 프리젠테이션 내에서 비활성화를 유도하는 것을 포함한다(Melief CJ, Kast WM; T-cell immunotherapy of cancer; Res Immunol 1991 Jun-Aug;142(5-6):425-9;also: Pasternak G, Hochhaus A, Schultheis B, Hehlmann R; Chronic myelogenous leukemia: molecular and cellular aspects; J Cancer Res Clin Oncol 1998;124(12):643-60). 또한, 악성 흑색종의 종양 세포에서 발현되고 MHC-1에서 나타나는 티로시나제 또는 티로신하이드록실라아제와 같은 자가 항원에 대한 내성(tolerance)을 파괴하는 것이 바람직할 수 있다(Weber LW, Bowne WB, Wolchok JD, Srinivasan R, Qin J, Moroi Y, Clynes R, Song P, Lewis JJ, Houghton AN; Tumor immunity and autoimmunityinduced by immunization with homologous DNA; J Clin Invest 1998 Sep 15;102(6):1258-64; SurmanDR, Irvine KR, Shulman EP, Allweis TM, Rosenberg SA, Restifo NJ; Generation of polyclonal rabbit antisera to mouse melanoma associated antigens using gene gunimmunization; Immunol Methods; 1998 May 1;214(1-2):51-62).
또 다른 매우 중요한 견지는 예방적 백신접종에서의 ISS의 보조 효과뿐만 아니라 타입-2 반응에서 기존 감염의 반응을 타입-1 반응으로 재분극시킬(re-polarizing) 가능성이 있으므로, 이에 따라 병원체를 조절할 수 있는 것이다(Kovarik J, et al. CpG oligodeoxynucleotides can circumvent the Th2 polarization of neonatal responses to vaccines butmay fail to fullyredirect Th2 responses established by neonatal priming; J Immunol. 1999 Feb 1;162(3):1611-7). 다수의 병원체에서 면역 반응의 타입이 감염 과정이나 환자의 생존 능력에 결정적인 영향을 미친다는 것이 입증되었다. 알레르기 반응이 타입-2 오버슛(overshoot) 반응을 나타내는 한, ISS는 이러한 종류의 징후에 대해서도 치료 효과를 제공하는 것으로 기대된다.
CpGs를 함유하는 특정 서열은 ISS-유도된 자극을 중화시키는 특징을 갖는 것으로, 즉 이러한 종류의 서열이 이들에 첨가될 경우 ISS의 자극 효과를 억제할 수 있다는 것이 관찰되었다(Krieg AM, WuT, Weeratna R, Efler SM, Love-Homan L, Yang L, Yi AK, Short D, Davis HL; Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory CpG motifs; Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Oct 13;95(21):12631-6). 중화 CpG 모티프("CpG-N")로 기술된 이러한 서열 모티프의 효과에 대한 근본적인 메카니즘이 완전히 설명되지 않았지만, 여기서 인용된 공개문헌의 저자는 이 효과가 ISS에 의한 자극을 차단하는 것에 국한된다는 것을 암시하고 있다. ISS에 의한 면역 유도 메카니즘이 설명되지 않는 한, 이들 CpG-N 모티프가 또한 치료학적으로 중요한 다른 면역조절 특성들을 가질 가능성을 배제할 수 없다.
환자 혈청에서 항-DNA 항체의 확인된 존재로 특성화되며, 박테리아 ISS에 대한 반응이 병인학적 이유가 있는 것으로 의심되는 적어도 하나의 인간 질병인, 전신성 홍반성 루프스 낭창이 있다(Krieg AM, CpG DNA: a pathogenic factor in systemic lupuserythematosus?, J Clin Immunol 1995 Nov;15(6):284-92). 이러한 경우와 다른 징후에서, CpG-N 모티프를 사용하여 근본적인 메커니즘을 차단하는 것이 유용할 것이다.
근본적인 메카니즘에 대한 어느 설명과는 무관하게, 면역 반응에 영향을 미치는 CpG 서열의 잠재력은 상당하며, 이 현상에서 뿐만 아니라 감염, 종양 및 면역 결핍이 관련된 치료적 및 예방적 적용을 위한 가능성을 탐색하는 데 있어서 갑작스럽고 광범위한 과학적 관심이 생겨났다.
ISS 상태에 관한 문헌(예를 들어, WO09818810A1, 17, 11 29-30 참조)에서 언급되어 있으며, 이는 CpG를 함유하는 면역 자극 서열이 단일 스트랜드로 발생할 경우 더욱 효과적인 것으로 기술된 본 발명에 의해 확인된다(이하 참조). 면역 조절의 목적으로 짧은 개방 쇄 단일 스트랜드 ISS 올리고데옥시뉴클레오티드를 투여하는 것은 다음의 취할 타당한 단계이며, 감염성 질환, 종양 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 수 많은 실험적 접근법의 대상이다. 그러나, 개방 쇄 단일 스트랜드 올리고데옥시뉴클레오티드는 세포 외 및 세포 내 엑소뉴클레아제에 의해 매우 빨리 분해되므로, 생체 내 적용에 사용하기가 매우 어렵다. 상기 언급된 뉴클레아제는 핵산 폴리머의 백본에서 변형된 포스포-에스테르 결합과 비교하여 상당히 감소된 효소 활성을 나타내며; 이것은 단일 스트랜드 핵산 분자가 환자에게 투여되는 적용에 사용되는 키랄 또는 아키랄 형태의 포스포 티오에스테르("티오에이트(thioates)") 또는 환원된(reduced) 포스포 결합(포스포네이트)을 유도하였다. 이들 변형된 화합물들은 고상 합성에 의해 생성될 수 있지만, 고전적인 DNA 아미디트 합성과 비교하여 상당히 보다 복잡한 방법에 의해서만 어느 정도까지 생성될 수있다. 이들 화합물들은 안티센스 연구로부터 알려져 있으나; 안티센스 전략의 임상 연구에서는, 특히 혈액 응고 시스템 및 보체 시스템에 상당한 부작용이 있음이 또한 입증되었다(예를 들어, Sheehan and Lan, Blood 92, 1617-1625(1998) 참조). ISS의 뉴클레아제 보호를 위한 티오포스포릭산 유도체의 사용과 관련하여, 실제로 효과가 있는 시토신-구아노신 잔기가 그 활성 자체에 요구되는 인접 서열에 의해 보호될 경우에 그 서열이 덜 자극적인 활성을 나타내는 것으로 또한 입증되었다(WO 98/18810 참조).
면역자극 ISS 함유 CpGs의 용도 및 생산에 관한 교시는 WO 98/18810 및 그 문헌에 인용된 문헌에 포괄적으로 기재되어 있다. 엑소뉴클레아제로부터 올리고데옥시뉴클레오티드를 보호할 필요성은 WO 98/18810에 상세히 기술되어 있다. 그러나, 단일 선형 ODNs으로 명백하게 제한되는 생체 내 안정성이 부족하다는 문제를 해결하기 위한 많은 해결책이 제시되어 있으며; 이는 티오포스페이트 에스테르, 디티오포스페이트 에스테르 또는 포스포네이트로 구성되는 것으로 언급되어 있다. 2차 구조, 특히 스템-루프(stem-loop)를 생성함으로써 ODN을 안정화시킬 가능성은 WO 98/18810에 기재되어 있다. 면역자극 서열과 관련하여 포스포로티오에이트 올리고머의 생산 및 용도는 US 5,663,153, US 5,723,335 및 US 5,856,462에 기재되어 있다.
단일 스트랜드 서열을 보호하기 위한 다른 전략이 US 5,750,669에 기재되어있다. 여기서, 올리고머의 말단은 엑소뉴클레오리틱 분해(exonucleolytic degradation)을 막는 5'-5'와 3'-3' 결합에 의해 연결된 뉴클레오시드 잔기로 연결된다.
이중 스템-루프 또는 공유결합으로 폐쇄된 덤벨 형태의 ODNs은 DNA 바인딘 단백질뿐만 아니라 전사 인자에 대한 결합 부위에서의 경쟁이 연구의 초점이었던 실험적 접근법으로부터 알려져 있다(Lim et al. 1997, Nuc.Acids Res. 25, 575-581; Blumenfeld et al., Nuc.Acids Res. 1993, 21, 3405-3411).
인간 면역 시스템의 T 세포 반응은 건강한 세포 상의 면역 시스템의 과다 활성화를 피하기 위해 다수의 T 세포 조절 분자에 의해 조절된다(Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252-264; Sharma P, Wagner K, Wolchok JD, Allison JP. Nat Rev Cancer. 2011;11(11):805-812). 이러한 T 세포 조절 분자는 본 개시 내용의 문맥 내에서 "T 세포 조절자(T-cell regulator)"로 요약되며, 체크포인트 억제제 및 공-자극제를 포함한다. 종양 세포는 면역 시스템에 의한 탐지를 피하기 위해 종종 이러한 조절 시스템의 이점을 취한다. 면역 시스템의 체크포인트 및 T 세포 시스템의 공-자극의 억제는 항-종양 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 면역 체크포인트의 봉쇄와 종양 특이적 T 세포의 유리(liberation)는 종양 세포에 대한 이펙터 기능을 발휘하고, 암 세팅(cancer settings)에서 효능이 입증되었으며, 임상 시험이 진행중이다(Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, et al. N Engl J Med. 2010;363(8):711-723; Robert C, Thomas L, Bondarenko I, et al. N Engl J Med. 2011;364(26):2517-2526; Wolchok JD, H. Kluger, M.K. Callahan, et al. N Engl J Med, 369 (2013), pp. 122-133).
세포독성 T-림프구 항원(CTLA)-4 및 프로그램된 세포 사멸(PD)-1은 두 체크포인트를 나타내며, 이는 지금까지 암 치료를 위한 표적으로서 가장 광범위하게 연구되어 왔다. CTLA-4는 특정 암에서 T 세포 표면에서 비정상적으로 상향조절되는 것으로 밝혀진 강력한 공-억제제(co-inhibitor)이다. 이는 종양 세포에 반응하여 T-세포 활성화를 감소시키고, 따라서 초기 T-림프구 내성에 관여한다. PD-1은 말초 T-림프구 내성을 유지하는데 한 역할을 함으로써 종양이 면역 시스템을 회피하도록 돕는 T-세포 기능을 억제하는 특정 종양에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다(Keir ME, ButteMJ, Freeman GJ, Sharpe AH, et al. Annu Rev Immunol. 2008;26:677-704; Mahoney KM, Freeman GJ, McDermott DF. Clinical Therapeutics 37(4): 764-782, 2015).
2011년에 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 승인된 최초의 면역-체크포인트 억제제는 전이성 흑색종의 치료를 위해 CTLA-4를 차단하는 모노클로날 항체인 이필리무밥(ipilimumab)이었다. PD-1과 이의 리간드 중 하나인 PD-L1(B7-H1과 CD274로도 알려짐) 사이의 상호작용을 차단하는 것은 항종양 반응을 발생시카는 것으로 보고되었다(Pardoll DM, Nat Rev Cancer. 2012;12(4): 252-264).
MHC 클래스 II 분자에 바인딩하는 또 다른 억제 분자, 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3), CD 호모로그는 활성화된 T 세포, B 세포, NK 세포 및 종양-침윤 림프구에서 발현되며, T-세포 활성화를 제한함으로써 T-세포 확장을 음성적으로 조절하는 것으로 생각된다(Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252-264; Goldberg MV, Drake CG. CurrTop Microbiol Immunol 2011;344:269-78). 이의 차단은 T 세포 증식을 증가시키고, 항종양 T 세포 반응을 향상시킨다(Nguyen LT, Nat Rev Immunol, 2015).
또한, T-세포 면역글로블린 뮤신-3(TIM-3)(이의 리간드는 갈렉틴 9임)(다양한 타입의 암에서 상향조절됨)은 IFN-분비 헬퍼 T(TH 1) 세포뿐만 아니라 수상돌기세포, 모노사이트 및 T 세포에 의해 발현된다[Ngiow SF, Teng MW, Smyth MJ. Cancer Res. 2011; 71(21):6567-71]. 이는 T 헬퍼 1 세포 반응을 억제하고, TIM-3 항체는 항종양 면역성을 강화시킨다(Anderson AC, Curr Opin Immunol 2012;24:213-6). TIM-3는 이의 리간드인 갈렉틴-9에 바인딩하면, TH 1 세포 사멸을 유도한다 (Zhu C, Anderson AC, Schubart A, et al. Nat Immunol. 2005;6(12):1245-52). TIM-3 결핍 마우스의 연구는 TIM-3 경로가 TH 1 세포의 확장 및 이펙터 기능을 억제하고, TH 1 세포의 내성 유도에 중요할 수 있음을 시사한다(Sabatos CA, Chakravarti S, Cha E, et al. Nat Immunol. 2003; 4(11):1102-10). TIM-3는 또한 종양 특이적 CD8+ T 세포에서 PD-1과 동시 발현되는 것으로 보고되었으며, 두 분자의 이중 차단은 인간 T 세포의 시험관 내 증식 및 사이토카인 생산을 유의적으로 향상시킨다. 동물 모델에서, PD-1과 TIM-3의 코디네이트 차단은 항종양 면역 반응 및 종양 거부를 증가시키는 것으로 보고되었다[0001] (Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252-264).
B-림프구 및 T-림프구 감쇠제(BTLA/CD272)는 T 세포 상의 억제 리셉터로서 확인되었다. 그리고, 종양 세포뿐만 아니라 종양 관련 내피 세포에서 발현되는 HVEM/TNFRSF14는 BTLA 리간드인 것으로 나타났다. BTLA 발현 수준은 흑색종 환자에서의 종양 침윤 림프구(TIL)에서 높으며, BTLA-발현 T 세포는 이의 리간드인 HVEM의 존재 하에서 억제된다. BTLA는 종양-특이적인 인간 CD8+ T 세포의 기능을 억제할 수 있다(Paulos CM, JuneCH. J Clin Invest 2010;120:76-80). 따라서, BTLA는 또한 종양 미세환경(tumourmicroenvironment)에서 T 세포에 대한 관련 억제 리셉터일 수 있으며 체크포인트 억제 전략을 위한 표적이 될 수 있다(Pardoll DM. Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252-264).
OX40(CD134/TNFRSF4)은 TNFR 상과(super-family)의 멤버이며, 항원-특이적 프라이밍 동안 CD4 및 CD8 T 세포에 의해 발현된다. CD8 및 CD4 T 세포에 OX40의 라이게이션은 이의 생존과 확장을 촉진한다. 또한, OX40의 활성화는 종양-반응성 이펙터 T 세포의 생성을 촉진시키고, T 세포 기능을 억제한다. 전임상 연구는 OX40 아고니스트를 가진 종양-보유 숙주의 치료가 몇몇 전임상 모델에서 종양 퇴행을 초래하였음을 입증하였다(Linch SN, McNamara MJ, Redmond WL. Front Oncol. 2015 5:34).
공-자극 리셉터 CD137(4-1BB/TNFSF9)은 항-종양 림프구의 활성화 및 전-염증성 분극화(pro-inflammatory polarization) 모두에 대해 불균등한 수용력(capacity)을 갖는다. CD137/4-1BB 리셉터를 통한 공-자극은 T 세포 내에서 다중 신호전달 케스케이드를 활성화시켜, T 세포 활성화를 강력하게 증가시킨다. 항원-프라이밍된 T 림프구에서 CD137의 자극은 종양 면역성을 증가시키고, CD137 단독 요법은 현저한 종양 퇴행을 매개할 수 있고, 수 많은 타입의 확립된 뮤린 종양의 치료도 가능하다(Bartkowiak T, Curran MA, Front Oncol. 2015 5:117).
이러한 최신 기술에 기초하여, 본 발명의 목적은 면역자극 DNA 구조물 및 이의 의약으로서의 용도를 포함하는 효과적인 배합물을 제공하는 것이다.
종래 기술과 관련하여, 본 발명의 목적은 데옥시리보뉴클레오티드의 비-코딩 서열의 형태로 T-세포 조절자 및 면역조절 DNA 구조물에 바인딩하는 분자의 배합물을 제공하는 것이다.
본 발명은 체크포인트 억제제 또는 공-자극제로서 이의 기능에 영향을 주기 위한 PD1, PD-L1, OX40, TIM-3, LAG3, CD137(4-1BB)을 포함하는 그룹으로부터 선택된 분자들 중 적어도 하나에 바인딩하는 화학물질 또는 분자의 성분들; 및 적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4(여기서, N은 A, C, T 또는 G를 포함하는 뉴클레오티드이고, C는 데옥시시티딘이고, G는 데옥시구아노신이고, A는 데옥시아데노신이고, T는 데옥시티미딘임)를 포함하는 데옥시리보핵산의 비-코딩 서열을 포함하는 배합물을 교시한다.
T 세포 조절자에 바인딩하는 분자는 합성적으로 또는 생물학적으로 제조된 항체와 같은 단백질 또는 펩티드일 수 있다.
본 발명의 배합물은 N1N2에 대해 GT, GG, GA, AT 및 AA의 그룹으로부터 취한 원소, 및 N3N4에 대해 CT, TG 및 TT의 그룹으로부터 취한 원소를 포함할 수 있다.
데옥시리보핵산의 비-코딩 서열은 양측이 선형의 개방-쇄이거나, 이중 스트랜드 부분의 일 측이 선형의 개방-쇄이고, 이중 스트랜드의 각 다른 측 상에 단일 스트랜드 헤어핀을 가지거나, 또는 부분적으로 단일 스트랜드인 덤벨형으로 데옥시리보핵산이 공유결합적으로 폐쇄된 쇄일 수 있다.
상기 배합물은 상기 서열 모티프 N1N2CGN3N4 중 적어도 3개를 더 포함할 수 있다.
이는 데옥시리보핵산의 선형의 개방-쇄 비-코딩 서열을 위한 것으로, L-형태로 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 데옥시리보핵산의 선형의 개방-쇄 비-코딩 서열의 DNA 단일 스트랜드의 5'- 및/또는 3'-말단에 위치한 5개의 터미널 뉴클레오티드 중 하나는 L-형태일 수 있다.
본 발명의 배합물은 하기의 데옥시리보뉴레오티드의 비-코딩 서열 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
a. GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC(SEQ ID NO:1); 또는
b. ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA(SEQ ID NO:2), 또는
c. AACGTTCTTCGGGG CGTT(SEQ ID NO:3), 또는
d. AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT(SEQ ID NO:4).
본 발명의 배합물은 길이가 40 내지 200 뉴클레오티드 또는 48 내지 116 뉴클레오티드인 데옥시리보핵산의 비-코딩 서열을 더 포함할 수 있다.
또한, 서열 AACGTTCTTCGGGG CGTT(SEQ ID NO:3)은 서열 CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC(SEQ ID NO:5)의 일부일 수 있는 것으로 의도된다.
서열 모티프 N1N2CGN3N4는 본 발명에 따른 배합물의 일부인 데옥시리보뉴클레오티드의 비-코딩 서열의 단일 스트랜드의 영역의 일부일 수 있다.
상기 배합물은 고체, 액체 또는 기체 형태로 두 그룹의 성분들을 제공하여 최대 15mg/kg 중량으로 적용될 수 있다. 이는 투여량을 상기 배합물이 적용되어야 하는 유기체의 무게에 맞출 수 있음을 의미한다.
본 발명의 배합물의 성분들을 동시에, 교대로 또는 연속적으로 제공하는 단계를 포함하는 방법이 본 발명의 또 다른 목적이다. 데옥시리보핵산의 비-코딩 서열은 T-세포 조절자에 영향을 미치는 화학 물질 또는 분자 이전에 제공되거나 또는 그 역으로 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 약, 또는 암, 자가면역 질환 및 염증과 같은 질병의 치료를 위한 상기 개시된 배합물의 용도이다.
개시된 배합물의 화합물은 암, 자가면역 질환 및 염증의 치료를 위해 동시에, 교대로 또는 연속적으로 투여될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 백신을 포함하는 약제 또는 약학적 제제의 제조를 위한 개시된 배합물의 용도가 본 발명의 또 다른 목적이다. 약제는 개시된 배합물의 화합물을 동시에, 교대로 또는 연속적으로 방출할 수 있다.
마지막으로, 치료 또는 예방적 백신접종에서 보조제로서의 본 발명의 배합물의 용도가 본 발명의 목적이다.
본 발명은 도면에 기초하여 설명될 것이다. 도면에 설명된 발명의 실시양태 및 측면은 단지 예시적일 뿐이며 어떠한 방식으로도 청구범위의 보호 범위를 제한하지 않는다는 것으로 이해될 것이다. 본 발명은 청구범위 및 그의 등가물에 의해 정의된다. 당업자는 본 발명의 하나의 측면 또는 실시양태의 특징이 본 발명의 다른 실시양태의 다른 측면 또는 측면의 특징과 조합될 수 있음을 이해할 것이다. 이것은 다음과 같다:
도 1a, b: SEQ ID NO: 5와 안티-PD-1의 배합물의 항종양 활성.
도 2: 리콜-항원(recall-antigen)의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프(epitope)로부터 선택된 펩티드로 인간 PBMC의 시험관 내 자극.
도 3a, b: SEQ ID NO: 5와 안티-PD-L1의 배합물의 항종양 활성.
도 4a, b: SEQ ID NO: 6과 안티-PD-1의 배합물의 항종양 활성.
도 5: 리콜-항원의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택된 펩티드, SEQ ID NO: 6 및 안티-PD-로 인간 PBMC의 시험관 내 자극.
도 6a, b: SEQ ID NO: 7과 안티-CTLA-4의 배합물의 항종양 활성.
도 7a, b: SEQ ID NO: 7과 안티-PD-L1의 배합물의 항종양 활성.
도 8a-c: 리콜-항원의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택된 펩티드, SEQ ID NO: 9 및 안티-PD-로 인간 PBMC의 시험관 내 자극.
도 9a, b: SEQ ID NO: 10과 안티-PD-1의 배합물의 항종양 활성.
도 10a, b: SEQ ID NO: 10과 안티-CTLA-4의 배합물의 항종양 활성.
도 11: 리콜-항원의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택된 펩티드, SEQ ID NO: 10 및 안티-PD-로 인간 PBMC의 시험관 내 자극.
도 12: 리콜-항원의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택된 펩티드, SEQ ID NO: 11 및 안티-PD-1로 인간 PBMC의 시험관 내 자극.
도 13: 리콜-항원의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택된 펩티드, EnanDIM362 및 안티-PD-1로 인간 PBMC의 시험관 내 자극.
본 발명은 소위 T-세포 조절자(regulator)에 결합하는 분자와, 데옥시리보핵산의 비코딩 서열의 배합물을 제공한다.
본 발명의 개시내용의 의미 내에는, 선형의 개방된 사슬 DNA 서열(linear open-chained DNA sequence)은 ODN으로 약기되는 올리고뉴클레오티드로서 지정된다. 상기 DNA 서열은 단일 스트랜드, 또는 부분적 또는 완전한 이중 스트랜드일 수 있다. 올리고, 올리고뉴클레오티드 및 올리고데옥시뉴클레오티드라는 용어는 동의어로 사용되며, 상응하는 DNA 서열의 길이의 제한을 나타내지 않는다. 올리고뉴클레오티드의 단일 성분은 뉴클레오티드이다.
올리고는 합성하여 제조되거나, 또는 부분적으로 또는 완전하게는 생물학적 기원일 수 있으며, 여기서 생물학적 기원은 DNA 서열의 유전자-기반 제조방법을 포함한다.
L-DNA 또는 L-입체형태의 뉴클레오티드는, 자연적으로 발생하는 D-데옥시리보스 대신에, 당 잔기로서 L-데옥시리보스를 포함하는 뉴클레오티드를 지칭한다. L-데옥시리보스는 D-데옥시리보스의 거울상 이성질체(거울 이미지)이다. L-입체형태의 뉴클레오티드로 부분적으로 또는 완전하게는 이루어진 올리고뉴클레오티드는, 부분적 또는 완전한 단일 또는 이중 스트랜드일 수 있지만; L-입체형태의 뉴클레오티드는 D-입체형태의 뉴클레오티드로 하이브리드화(hybridize)할 수 없다(하우저(Hauser) 등의 문헌 [Nucleic Acid Res. 2006 34: 5101-11]). L-DNA는 D-DNA와 동일하게 가용적이며 선택적이다. 그러나, L-DNA는 자연적으로 발생하는 효소, 특히 엑소뉴클레아제(exonuclease)에 의해 분해되는 것에 대해 저항적이며, 따라서 L-DNA는 생물학적 분해에 대항하여 보호된다(우라타(Urata) 등의 문헌 [Nucleic Acid Res. 1992 20: 3325-32). 따라서, L-DNA는 매우 광범위하게 적용 가능하다.
본 발명의 개시내용에 따른 "스템(stem)"은, 동일한 올리고뉴클레오티드(이후에, 부분적으로 자기-상보성임) 내에서 또는 다른 올리고뉴클레오티드(이는 부분적으로 또는 완전하게 상보성임) 내에서 염기 쌍짓기에 의해 형성된 DNA 이중 스트랜드으로서 이해되어야 한다. 분자 내(intramolecular) 염기-쌍짓기는 동일한 올리고뉴클레오티드 내의 염기-쌍짓기를 지칭하며, 다른 올리고뉴클레오티드 사이의 염기-쌍짓기는 분자 간(intermolecular) 염기-쌍짓기로서 지칭된다.
본 발명의 개시내용의 의미 내의 "루프(loop)"는 스템 구조체 내 또는 그의 말단에서의 홑 단일 스트랜드 구역으로서 이해되어야 한다. "헤어핀(hairpin)"은, 동일한 올리고뉴클레오티드의 2개의 자기-상보성 구역이 하나의 말단에서 홑 루프를 갖는 스템을 형성하기 위해 하이브리드화하는 경우에 발생하는 스템과 루프의 구별된 조합이다.
뉴클레오티드가 공유결합 또는 비공유결합적으로 부착되는 "고체 상(solid phase)"은, 칼럼(column), 매트릭스(matrix), 비드(bead), 유리, 예컨대 개질된 또는 기능화된 유리, 실리카 또는 실리카계 물질, 예컨대 실리콘 및 개질된 실리콘, 플라스틱(폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 물질과의 공중합체, 아크릴, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 등을 포함함), 나일론 또는 니트로셀룰로오스, 수지, 다당류, 탄소 뿐만 아니라, 무기 유리 및 플라스틱을 지칭하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 미세적정(microtiter) 플레이트도 또한 본 발명의 개시내용에 따른 고체 상의 범위 내에 있다.
본 발명의 개시내용에 따른 면역조절은 면역자극 및 면역억제를 지칭한다. 우선적으로, 면역자극은, 면역계의 효과기 세포들이 증식, 이동, 차별화 또는 임의의 다른 형태로 활성화하도록 자극되는 것을 의미한다. 예컨대, B 세포 증식은, 헬퍼(helper) 흉선림프구(thymocyte)로부터 동시-자극(co-stimulatory) 신호를 일반적으로 필요로 하는, 면역자극의 올리고뉴클레오티드에 의해 동시-자극 신호들 없이 유도될 수 있다.
반면, 면역억제는, 면역계의 활성화 또는 유효성을 감소시키는 것으로 이해되어야 한다. 면역억제는 일반적으로는 예를 들어 이식된 기관의 거부를 방지하기 위해, 골수 이식 후 이식편-숙주(graft-versus-host) 질환을 치료하기 위해, 또는 자가면역 질환, 예를 들어, 류마티스 관절염 또는 크론병(Crohn's disease)의 치료를 위해 의도적으로 유도된다.
이와 관련하여, 면역조절도 또한 여전히 성장 중이거나 또는 성숙 단계인 면역 반응에 영향을 미침으로써 또는 확립된 면역 반응의 특성을 조절함으로써 면역 반응의 속성 또는 특성의 영향을 지칭할 수 있다. 따라서, 영향을 미친다고 하는 것(affecting)은 체크-포인트(checkpoint) 억제제들과 관련하여 이들의 억제 효과를 억제시키는 것을 의미하고, 동시-자극 분자들과 관련하여 이들을 활성화시키는 것을 의미한다.
용어 "암"은, 비제한적으로는, 유방 암종, 흑색종, 피부 신생물, 림프종, 백혈병, 위장 종양, 예컨대 결장 암종, 위 암종, 췌장 암종, 결장암, 소장 암, 난소 암종, 자궁경부 암종, 폐암, 전립선암, 신장세포 암종 및/또는 간 전이를 포함하는 군으로부터 선택되는, 치료 또는 예방되는 암 질환 또는 종양을 포함한다.
본 발명의 개시내용에 따른 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 크론병, 전신계 루푸스(systemic lupus,SLE), 자가면역성 갑상선염, 하시모토 갑상선염(Hashimomto's thyroiditis), 다발성 경화증, 그레이브스병(Graves' disease), 중증근무력증, 복강 질환 및 애디슨병(Addison's disease)을 포함한다.
본 발명의 개시내용의 의미 내 및 그의 통상적인 정의에 따른 아고니스트(agonist)는 수용체 또는 리간드와 같은 다른 분자에 결합하여 분자를 활성화시키는 화학물질 또는 분자를 나타낸다. 활성화되는 아고니스트와 달리, 안타고니스트(antagonist)는 안타고니스트가 아고니스트와 결합하는 분자의 상호작용을 차단하는 화학물질 또는 분자로서 이해되어야 한다. 문맥에 따라, 안타고니스트가 예컨대 수용체와 다른 안타고니스트의 상호작용을 차단하기 때문에, 본 발명의 이해에서의 안타고니스트는 또한 공정의 활성화를 초래할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 적용 가능한 또는 허용 가능한 염(pharmaceutically applicable or acceptable salts)"은 본 발명의 화합물에서 발견되는 특정 치환기들에 따라 상대적으로 무독성인(즉, 약학적으로 허용 가능한) 산 또는 염기로 제조되는 배합된 화합물의 염을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물이 산성 작용기를 함유하는 경우, 염기 부가 염은 이러한 화합물의 중성 형태를 순수하게 또는 적합한 불활성 용매 중에서 충분한 양의 원하는 염기와 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가 염의 비제한적인 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 염기성 작용기를 함유하는 경우, 산 부가 염은 이러한 화합물의 중성 형태를 순수하게 또는 적합한 불활성 용매 중에서 충분한 양의 원하는 산과 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 산 부가 염의 비제한적인 예는 염산, 브롬산, 질산, 탄산, 인산, 부분 중화된 인산, 황산, 부분 중화된 황산, 요오드화 수소산 또는 아인산 등과 같은 무기산 뿐만 아니라, 상대적으로 무독성인 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, 벤조 술폰산, p-톨릴설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄술폰산 등으로부터 유도된 염을 포함할 수 있다. 또한, 아르기닌 등의 아미노산의 염, 및 글루쿠론산 또는 갈락투론산 등의 유기산의 염이 포함된다. 본 발명의 특정한 특정 화합물은, 화합물이 염기 또는 산 부가 염으로 전환될 수 있게 하는, 염기성 및 산성 작용기 모두를 함유 할 수 있다. 염을 염기와 접촉시키는 것은 본 발명의 화합물 또는 산의 중성 형태를 재생시킬 수 있으며, 통상적인 방식으로 모(parent) 화합물을 단리할 수 있다. 화합물의 모 형태는 특정 물리적 성질, 예컨대 극성 용매에서의 용해도에서 다양한 염 형태와 상이하지만, 그렇지 않으면 염은 본 발명의 목적을 위한 화합물의 모 형태와 동등하다. 본 발명의 화합물은 키랄 또는 비대칭 탄소 원자(광학 중심) 및/또는 이중 결합을 가질 수 있다. 라세미체, 부분입체 이성질체, 기하 이성질체 및 개별적인 광학 이성질체가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 화합물은, 수화된 형태를 포함하는, 용매화된 형태뿐만 아니라 비용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화된 형태는 비용매화된 형태와 동등하며, 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 화합물은 또한 다중 결정질 또는 비결정성 형태로 존재할 수 있다.
N1N2이 GT, GG, GA, AT 또는 AA 그룹으로부터 선택된 요소이고, N3N4가 CT 또는 TT 그룹으로부터 선택된 요소이고, C가 데옥시사이티딘이고, G가 데옥시구아노신이고, A가 데옥시아데노신이고, T가 데옥시티미딘인, 염기 서열 N1N2CGN3N4의 하나 이상의 서열을 함유하는, 데옥시리보뉴클레오사이드 잔기들의 부분적으로 단일 스트랜드이고 아령형이고 공유결합적으로 폐쇄된 사슬로 이루어진 데옥시리보핵산 분자는, 인간 또는 고등 동물에서 면역자극을 위한 면역계의 T-세포 조절자를 결합시킬 수 있는 분자 또는 화학물질과 함께 사용된다.
본 발명의 개시내용과 관련된 데옥시리보핵산 분자는 길이 200개 이하의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특히, 길이 48 내지 116개의 뉴클레오티드를 갖는 서열들이 의도된다.
데옥시리보핵산 분자의 아령형 비-코팅 서열은 그들의 단일 스트랜드 구역에서 염기 서열 N1N2CGN3N4를 포함할 수 있다.
면역자극은 시험관 내 또는 생체 내에서 발생할 수 있다.
본 발명의 개시내용은 적어도 하나의 CpG 모티프(motif) 및 L-입체형태의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 선형의 개방된 사슬 DNA 서열를 제공한다. 부분적/완전한 L-입체형태로 인해, DNA 서열은 엑소뉴클레아제(exonuclease)에 접근 가능한 5'- 또는 3' 말단을 갖지 않는다. 구조체가 이중 스트랜드의 하나의 말단에서 단일 스트랜드 루프를 갖지 않는 경우, 상기 말단도 또한 분해에 대항하여 보호된다. 이로 인해, ODN은, 독성인 것으로 나타나는 포스포로티오에이트 주사슬을 필수적으로 사용하지 않고서, 세포 분해에 대항하여 전체적으로 보호된다. 또한, ODN은 오직 그들을 작게 하는 최소 수의 뉴클레오티드로만 이루어지며, 이로 인해 세포 내로의 세포감염이 용이하게 된다.
적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4를 포함하는 데옥시리보핵산의 비-코딩 서열은 단일 스트랜드이거나, 또는 부분적으로 또는 완전하게 이중 스트랜드일 수 있다. 이에는, 동일한 분자 내에서(분자 내) 또는 상이한 분자 내에서(분자 간)의 염기-쌍짓기, 또는 이들의 조합이 포함된다. 또한, 구조체는 하나 이상의 홑 단일 스트랜드 구역을 포함하는 것도 가능하다. 다른 실시양태로서, 헤어핀 구조체가 포함되어 있다. 부분적 또는 완전한 L-입체형태로 인해, 구조체의 더욱 긴 반감기는 L-입체형태의 뉴클레오티드가 분해되지 않은 채로 보장된다.
또한, 본 발명의 개시내용의 범위 내에서, 단일 스트랜드이거나, 또는 부분적으로 또는 완전하게 이중 스트랜드인 2개 이상의 분자는 다량체성(multimeric) 구조체를 형성하기 위해 서로 결찰할 수 있다(ligate). 따라서, 이들 다량체성 구조체는 하나의 분자 내에 적어도 치밀하게 패킹된 결찰 파트너만큼 많은 CpG 모티프를 혼입시키며, 따라서 T-세포 조절자와의 배합물의 일부로서 상당한 면역 반응을 유도할 것으로 기대된다. 생성되는 단일 스트랜드, 또는 부분적으로 또는 완전하게는 이중 스트랜드의 다량체성 구조체는, 분자 내에 L-입체형태의 뉴클레오티드를 포함하여 공유결합적으로 폐쇄될 수 있거나, 또는 세포 분해에 대항하여 보호하기 위해, 5'- 및/또는 3'-말단에서 L-입체형태의 뉴클레오티드를 포함하는 개방된 다량체성 구조체일 수 있다.
개시내용에서는, 카르복실, 아민, 아미드, 알드이민(aldimine), 케탈, 아세탈, 에스테르, 에테르, 디설파이드, 티올 및 알데히드 기를 포함하는 군으로부터 선택되는 작용기로, 적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4를 포함하는 데옥시리보핵산의 비-코딩 서열에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 화학적 개질을 추가로 포함한다. 이는, 펩티드, 단백질, 지질, 소포(vesicle), 미셀(micelle), 탄수화물, 항체, 합성 분자, 고분자, 마이크로 프로젝틸(micro projectile), 금속 입자, 나노 입자 또는 고체 상을 포함하는 군으로부터 선택된 화합물에 대하여 예컨대 흡착, 공유 또는 이온 결합에 의해 DNA 구조체의 커플링을 허용한다.
개질은 각각의 목적을 위해 특별히 선택될 수 있다. 이로 인해, 구조체는 예컨대 혼입되는 CpG 모티프에 대해 반응하는 특이적 세포까지의 다른 분자의 왕복(shuttle)을 위해 사용될 수 있다. 또한, 이러한 변형에 의하면, 구조체를 세포 내에 전달하는 데 사용될 수 있는 마이크로 프로젝틸에 구조체를 커플링시킬 수 있다. 구조체는 또한 고체 상, 예컨대 미세적정(microtiter) 플레이트에 커플링될 수 있다.
하기 기재된 실험은 데옥시리보핵산의 비-코딩 서열을 T-세포 조절자와 배합시키는 영향에 대해 조사하기 위해 수행되었다. 실험은, 서열 모티프 N1N2CGN3N4, N1N2CGN3N4를 포함하는 데옥시리보핵산의 선형의 개방된 사슬 비-코딩 서열을 포함하는 아령형을 사용하여 수행되었으며, 여기서 이들 구조는 이들이 분해되지 않도록 L-입체형태의 뉴클레오티드를 포함한다. 또한, N1N2CGN3N4를 포함하는 데옥시리보핵산의 비-코딩 서열과 그리고 2회로 SEQ ID NO: 4의 서열과 T-세포 조절자를 배합하는 효과가 조사되었다.
PD1, PD-L1, OX40, LAG-3, TIM3 및 CD137(4-1BB)에 결합하는 T-세포 조절자 항체는 인간 종양이 주입된 마우스 모델에서 사용되었다. 성장기 이후의 치료에 대한 효과는 종양의 성장에 대해 이후 컨트롤과 비교하여 더욱 상세하게 기재된다.
실험은 투여 요법(dosage regime)을 본 발명의 개시내용의 배합된 성분의 동시적, 교호적 또는 연속적 적용과 비교한다. 화합물의 정량적 적용에 더하여, 감소된 양의 T-세포 조절자는 N1N2CGN3N4 서열 모티프를 포함하는 비-코딩 DNA 서열없이 체크포인트 억제제를 적용하는데 있어서 동등하거나 더욱 우수한 결과를 얻기 위해 필요한 지를 조사하였다.
T-세포 조절자에 바인딩하는 분자와 TLR9 아고니스트의 배합 포텐셜의 시험관 내 분석은, 자극 후 그들의 T-세포 반응의 평가를 위한 인간 PBMC의 시험관 내 세포 배양 시스템의 사용을 포함한다. PBMC의 자극은 면역학적 T-세포 조절자(예: PD-1, PD-L1 등) 및 TLR9 아고니스트(즉, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6)에 대항하는 항체의 존재 하에서 CMV, EBV, 인플루엔자 및 파상풍 독소(tetanus-toxin)의 면역원성 펩티드의 혼합물로 달성될 것이다.
세포 배양 상청액에서의 사이토카인(IL-2 및 IFN-감마)의 정량을 결정하였다. 이 시험관 내 세포 배양 시스템은 생체 내에서 면역 세포의 복잡한 상호작용을 반영할 수는 없지만, 이러한 TLR9 아고니스트의 배합물의 장점에 대한 증거를 제공한다.
도면의 상세한 설명
SEQ ID NO: 5와 안티-PD-1의 배합물은, 마우스 A20 종양 모델에서 안티-PD-1 또는 SEQ ID NO: 5 단일요법과 비교하여 놀라울 정도로 광범위하게 증가된 항종양 효과를 보였다.
종양 성장은 놀랍게도 SEQ ID NO: 5와 PD-1의 배합물에 의해 거의 완전히 억제되었다(도 1a, b). 그룹 당 9 내지 12 마리의 마우스에는, A20 뮤린(murine) 종양 세포가 s.c. 접종되고, SEQ ID NO: 5(250㎍/적용, i.tu., 14 일, 16 일, 19 일, 21 일, 23 일, 26 일, 28 일, 30 일, 33 일 및 35 일), 안티-PD-1(100 ㎍/적용, i.p., 8 일, 11 일, 16 일 및 19 일), 또는 둘 다가 주사되었다. 비히클(i.tu.)의 주사는 컨트롤로서 사용되었다. 도 1a는 평균 종양 성장-인레이(mean tumor growth - inlay), 18 일부터 32 일까지의 평균 종양 성장 억제(29 일: SEQ ID NO: 5에 대해 46.0 %, 안티-PD-1에 대해 54.2 %, 배합물에 대해 99.9 %)를 나타낸다. 도 1b는 Kaplan-Meier 생존 플롯을 나타낸다.
도 1a, b에 나타낸 안티-PD-1과 SEQ ID NO: 5의 상승적 배합 효과는, 인간 말초 혈액 단핵구(human peripheral blood mononuclear cell)(PBMC)가 항원성 펩티드 및 SEQ ID NO: 5와 안티-PD-1의 배합물과 함께 항온처리된 경우의 시험관 내에서 확인되었다. 펩티드는 리콜 항원(CMV, EBV, Flu = CEF)의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택되었고, SEQ ID NO: 5와의 배합물은 SEQ ID NO: 5 또는 안티-PD-1 단독의 주사와 비교하여 PBMC에 의한 INF-감마 분비를 명백하게 증가시켰다(도 2). 펩티드의 최종 농도는 펩티드 당 1 ㎍/ml이고, SEQ ID NO: 5는 3 μM의 농도로 사용되었고, 안티-PD-1은 10 ㎍/ml로 사용되었다(n = 4). IFN-감마 분비는 면역 반응의 마커(marker)로서 분석되었으며; CEF-펩티드 단독으로 PBMC를 자극한 후에 IFN-감마 수준으로 정규화되었다. 뮤린 IgG(10 ㎍/ml)는 안티-PD-1에 대한 컨트롤로서 사용되었다.
또한, 마우스 CT26 종양 모델에서, 안티-PD-L1과 SEQ ID NO: 5의 배합 요법의 놀라운 유리한 효과는 또한 SEQ ID NO: 5 또는 안티-PD-L1 단일요법보다 크게 탁월하였다. 종양 성장은 감소되었고(도 3A), 생존은 증대되었다(도 3B). 그룹 당 10 마리의 마우스에는, CT26 뮤린 종양 세포가 s.c. 접종되고, SEQ ID NO: 5(250 ㎍/적용, s.c., 3 일, 5 일, 7 일, 10 일, 12 일, 14 일, 17 일, 19 일, 21 일, 24 일 및 26 일), 안티-PD-L1(적용마다 10 mg/kg, s.c., 3 일, 5 일, 7 일, 9 일, 11 일, 13 일, 15 일, 17 일), 또는 둘 다가 주사되었다. 비히클(s.c.) 주사는 컨트롤로서 사용되었다. 도 3A는 평균 종양 성장-인레이, 17 일부터 27 일까지의 평균 종양 성장 억제(20 일: 레피톨리모드(lefitolimod)에 대해 23.0 %, 안티-PD-L1에 대해 억제되지 않고, 배합물에 대해 39.9 %)를 나타낸다. 도 1B는 Kaplan-Meier 생존 플롯을 나타낸다.
루프 서열 TCATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTCTT를 갖는 SEQ ID NO: 6을 적용한 배합 효과가 또한 조사되었다.
SEQ ID NO: 6은 마우스 CT26 종양 모델에서 안티-PD-1과 함께 투여되었다. 이 배합물은 놀랍게도 단일 제제, SEQ ID NO: 6 또는 안티-PD-1를 사용하는 단일요법과 비교하여 항종양 효과를 크게 증대시켰다(도 4a, b). 다시, 그룹 당 10 마리의 마우스에는, CT26 뮤린 종양 세포가 s.c. 접종되고, SEQ ID NO: 6(250 ㎍/적용, i.tu., 15 일, 17 일, 19 일, 22 일, 24 일, 26 일, 29 일, 31 일), 안티-PD-1(100 ㎍/적용, i.p., 3 일, 6 일, 10 일 및 13 일), 또는 둘 다가 주사되었다. 비히클(i.tu.)의 주사가 컨트롤로서 사용되었다. 도 4A는 평균 종양 성장-인레이, 15 일부터 29 일까지의 평균 종양 성장 억제(23 일: SEQ ID NO: 6에 대해 48.2 %, 안티-PD-1에 대해 억제 없고, 배합물에 대해 75.4)를 나타낸다. 도 1B는 평균 Kaplan-Meier 생존 플롯을 나타낸다.
도 4에 제시된 결과는 항원성 펩티드를 사용하는 인간 PBMC의 시험관 내 자극 데이터와 일치하며, 이것은 또한 놀랍게도 화합물의 단일 사용보다 배합물의 장점을 나타낸다(도 5). 펩티드 당 1 ㎍/ml의 최종 농도을 갖는 리콜-항원(CMV, EBV, Flu = CEF)의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택된 펩티드, 3 μM 농도의 SEQ ID NO: 6 및 10 ㎍/ml의 안티-PDD-1(n = 4)이 사용되었다. IFN-감마 분비는 면역 반응의 마커로서 사용되었으며; CEF-펩티드 단독으로 PMBC를 자극한 후 IFN-감마 수준으로 정규화되었다. 뮤린 IgG(10 ㎍/ml)는 안티-PD-1에 대한 컨트롤로서 사용되었다.
L-입체형태의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고는 추가 연구에서 사용되었다. 이들 올리고는 지적된 위치에서 L- 뉴클레오티드를 포함한다. DNA 분자는 코어 서열 [yTCATTxCGTGACGTGACGTTCzv](y = 2 내지 8 G, 1 내지 3 L-데옥시리보스로 보호되거나 그렇지 않음; x = 3 내지 4 A; z = 2 내지 6 T, 1 내지 3 L-데옥시리보스로 보호됨; v = A, G, C, T)과 함께 사용되었다.
이러한 L-뉴클레오티드 포함 분자는 체크 포인트 억제제와 배합되는 경우 면역 조정 및 항종양 성질을 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들면, 마우스 CT26 종양 모델에서 안티-CTLA-4와 SEQ ID NO: 7(GGGGTCATT AAAACGTGACGTGACGTTCTTTTT, 밑줄 친 염기를 함유하는 L-데옥시리보스)의 배합물은 SEQ ID NO: 7 또는 안티-CTLA-4 단일요법과 비교하여 놀랍게 효율적으로 종양 성장을 감소시켰다(도 6). 그룹 당 10 마리의 마우스에는, CT26 뮤린 종양 세포가 s.c. 접종되고, SEQ ID NO: 7(200 ㎍/적용, s.c., 3 일, 5 일, 8 일, 10 일, 12 일, 15 일, 17 일, 19 일, 22 일, 14 일 및 26 일), 안티-CTLA-4(8 일에 100 ㎍/적용, 11 및 14 일에 50 ㎍/적용, i.p.), 또는 둘 다가 주사되었다. 비히클(s.c.)의 주사가 컨트롤로서 제시되었다. 도 6A는 평균 종양 성장-인레이, 15 일부터 30 일까지의 평균 종양 성장 억제(22 일: SEQ ID NO: 7에 대해 19.8 %, 안티-PD-1에 대해 59.1 %, 배합물에 대해 65.3 %). 도 6B는 Kaplan-Meier 생존 플롯을 제시한다.
SEQ ID NO: 7과 안티-PD-L1의 배합물은 마우스 CT26 종양 모델에서 단일 화합물 SEQ ID NO: 7 또는 안티-PD-L1의 것과 비교하여 완만하게 증가된 항종양 효과를 나타냈다(도 7). 그룹 당 10 마리의 마우스에는, CT26 뮤린 종양 세포가 s.c. 접종되고, SEQ ID NO: 7(s.c., 3 일, 5 일, 7 일, 10 일, 12 일, 14 일, 17 일, 19 일, 21 일, 24 일 및 26 일), 안티-PD-L1(적용마다 10 mg/kg, i.p., 3 일, 5 일, 7 일, 9 일, 11 일, 13 일, 15 일, 17 일) 또는 둘 다가 주사되었다. 비히클(s.c.)의 주사가 컨트롤로서 제시되었다. 도 7A는 평균 종양 성장-인레이, 13 일부터 27 일까지의 평균 종양 성장 억제(20 일: SEQ ID NO: 7에 대해 16.3 %, 안티-PD-L1에 대한 억제가 없고, 배합물에 대해 33.3 %). 도 7B는 Kaplan-Meier 생존 플롯을 나타낸다.
시험관 내 연구에서, 안티-PD-1과 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8(GGGGGGGGTCATTAAAACGTGACGTGACGTTCTTTTT, 밑줄 친 염기를 함유하는 L-데옥시리보스) 및 SEQ ID NO: 9(GGGGTCATTAAACGTGACGTGA CGTTCTTTTT, 밑줄 친 염기를 함유하는 L-데옥시리보스)의 배합물의 장점은 항원성 펩티드로 자극된 PBMC로부터의 IFN-감마 분비에 대해 관찰되었다(도 8). 리콜-항원(CMV, EBV, Flu = CEF, 펩티드 당 최종 농도 1 ㎍/ml)의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택된 펩티드, SEQ ID NO: 7(A, n = 12), SEQ ID NO: 8(B, n = 2), SEQ ID NO: 9(C, n = 4), 최종 농도 3μM의 각각의 DNA 분자; 및 안티-PD-1(10 ㎍/ml). 면역 반응의 마커로서의 IFN-감마 분비의 분석; CEF-펩티드 단독으로 자극한 후 IFN-감마 수준으로 정규화되었다. 뮤린 IgG(10 ㎍/ml)는 안티-PD-1에 대한 컨트롤로서 사용되었다.
또 다른 일련의 실험에서, 코어 서열 [yTCATTxCGTTCTTCGGGGCGTTCzv](y = 2 내지 8 G, 1 내지 3 L-데옥시리보스로 보호되거나 그렇지 않음; x = 3 내지 4 A; z = 2 내지 6 T, 1 내지 3 L-데옥시리보스로 보호; v = A, G, C, T)를 갖는 DNA 분자가 사용되었다.
이 그룹에 대해서도 면역 조절 및 항종양 효과에 대한 배합 효과가 확인되었다. 이 그룹의 예로서, SEQ ID NO: 10(GGGGTCATTAAACGTTCTTCGGGG CGTTCTTTTT, 밑줄 친 염기를 함유하는 L-데옥시리보오스)은 안티-PD-1과의 배합물을 조사하는 데 사용되었다.
배합물은 마우스 CT26 종양 모델에서 종양 성장을 크게 감소시켰다(도 9). 그룹 당 10 마리의 마우스에는, CT26 뮤린 종양 세포가 s.c. 접종되고, SEQ ID NO: 10(200 ㎍/적용, s.c., 3 일, 5 일, 8 일, 10 일, 12 일, 15 일, 17 일, 19 일, 22 일, 14 일 및 26 일), 안티-PD-1(200 ㎍/적용, i.p., 3 일, 6 일, 10 일 및 14 일), 또는 둘 다로 주사되었다. 비히클(s.c.)의 주사가 컨트롤로서 제시되었다. 도 9A는 평균 종양 성장-인레이, 14 일부터 32 일까지의 평균 종양 성장 억제(25 일: SEQ ID NO: 10에 대하여 17.8 %, 안티-PD-1에 대하여 51.9 %, 배합물에 대하여 74.6 %)를 나타낸다. 도 9B는 Kaplan-Meier 생존 플롯을 나타낸다.
또한, SEQ ID NO: 10과 안티-CTLA-4의 배합물은 단일 제제, SEQ ID NO: 10 또는 안티-CTLA-4를 사용하는 치료와 비교하여 마우스 CT26 종양 모델에서 감소된 종양 성장을 초래한다(도 10). 그룹 당 10 마리의 마우스에는, CTL26 뮤린 종양 세포가 s.c. 접종되고, SEQ ID NO: 10(200 ㎍/적용, s.c., 3 일, 5 일, 8 일, 10 일, 12 일, 15 일, 17 일, 19 일, 22 일, 14 일 및 26 일), 안티-CTLA-4(100 ㎍/적용, 8 일, 50 ㎍/적용 11 및 14 일, i.p.), 또는 둘 다가 주사되었다. 비히클(s.c.)의 주사가 컨트롤로서 제시되었다. 도 10A는 평균 종양 성장-인레이, 15 일부터 30 일까지의 평균 종양 성장 억제(22 일: SEQ ID NO: 10에 대하여 49.7 %, 안티-PD-1에 대하여 59.1 %, 배합물에 대하여 70.3 %)를 나타낸다. 도 10B는 Kaplan-Meier 생존 플롯을 나타낸다.
또한, SEQ ID NO: 10과 안티-PD-1의 배합물은 시험관 내 PBMC 자극 연구에서 평가되었으며, SEQ ID NO: 10 또는 안티-PD-1 단독과 비교하여 IFN-감마 분비와 관련한 효과가 증가함을 보였다(도 11). 펩티드는 리콜-항원(CMV, EBV, Flu = CEF, 펩티드 당 최종 농도 1 ㎍/ml)의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택되며, SEQ ID NO: 10(3 μM) 및 안티-PD-1(10 ㎍/ml)(n = 5). IFN-감마 분비의 분석은 면역 반응의 마커로서 제시되었다. CEF-펩티드 단독으로 자극한 후 IFN-감마 수준으로 정규화되었다. 뮤린 IgG(10 ㎍/ml)는 안티-PD-1에 대한 컨트롤로서 사용되었다.
추가의 실험에서, 코어 서열 [yTCATTxTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGzv](y = 2 내지 8 G, 1 내지 3 L-데옥시리보스로 보호되거나 그렇지 않음; x = 3 내지 4 A; z = 2 내지 6 T, 1 내지 3 L-데옥시리보스로 보호됨; v = A, G, C, T)를 갖는 DNA 분자가 실험에 사용되었다.
이 그룹에 대한 예로서 SEQ ID NO: 11(GGGGTCATTAAATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTT, 밑줄 친 염기를 함유하는 L-데옥시리보스)이 사용되었다. PBMC 연구에서 SEQ ID NO: 11이 시험관 내에서 안티-PD-1과 배합하였을 때, 놀랍게도 SEQ ID NO: 11 또는 안티-PD-1 단독과 비교하여 IFN-감마 분비가 현저히 증가되는 개선을 보였다(도 12). 리콜-항원(CMV, EBV, Flu = CEF, 펩티드 당 최종 농도 1 ㎍/ml)의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택된 펩티드, SEQ ID NO: 11(3 μM) 및 안티-PD-1(10 ㎍/ml)(n = 4). 면역 반응에 대한 마커로서의 IFN-감마 분비의 분석; CEF-펩티드 단독으로 자극한 후 IFN-감마 수준으로 정규화되었다. 뮤린 IgG(10 ㎍/ml)는 aPD-1의 컨트롤로서 사용되었다.
마지막으로, 코어 서열 [yACGATCGTCwT](y = 2 내지 8 G, 1 내지 3 L-데옥시리보스로 보호되거나 그렇지 않음; w = 4 내지 12 G, 1 내지 3 L-데옥시리보스로 보호됨)를 갖는 DNA 분자는 배합물 적용의 효과를 시험하는 데 사용되었다.
이 그룹의 예는 SEQ ID NO: 12이다(GGGGGACGATCGTCGGGGGGT, 밑줄 친 염기를 함유하는 L-데옥시리보스). 인간 PBMC를 사용하는 시험관 내 자극 연구에서, 안티-PD-1과의 이의 배합물은 단일 화합물과 비교하여 유의하게 증대된 면역 반응을 유도하는 것으로 평가되었다(도 13). 리콜-항원(CMV, EBV, Flu = CEF, 펩티드 당 최종 농도 1 ㎍/ml)의 HLA 클래스 I-제한된 T-세포 에피토프로부터 선택된 펩티드, SEQ ID NO: 12(3 μM) 및 안티-PD-1(10 ㎍/ml)(n = 4). 면역 반응의 마커로서의 IFN-감마 분비의 분석; CEF- 펩티드 단독으로 자극한 후 IFN-감마 수준으로 정규화되었다. 뮤린 IgG(10 ㎍/ml)는 aPD-1에 대한 컨트롤로서 사용되었다.
약 20 g의 마우스의 중량 및 상기 실험 설정을 고려하면, 적용되는 DNA의 양은 약 12.5 mg/kg 중량의 범위에 속하여서, 제시된 놀라운 결과를 얻기 위해서는 최대 15 mg/kg이 필요할 것이다.
안티-PD-1 항체는 10 mg/kg 중량으로 적용되어서, 제시된 놀라운 결과를 얻는 데 있어서 최대 15 mg/kg 중량의 적용이 필요하다고 보인다.
SEQUENCE LISTING <110> MOLOGEN AG <120> COMBINATION COMPRISING IMMUNOSTIMULATORY OLIGONUCLEOTIDES <130> 58 164 K <150> LU92821 <151> 2015-09-09 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide <400> 1 gttcctggag acgttcttag gaacgttctc cttgacgttg gagagaac 48 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide <400> 2 accttccttg tactaacgtt gcctcaagga aggttgatct tcataacgtt gcctagatca 60 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide <400> 3 aacgttcttc ggggcgtt 18 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide <400> 4 aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc atcgtcgttt tgtcgttttg tcgttctt 58 <210> 5 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide <400> 5 cctaggggtt accaccttca ttggaaaacg ttcttcgggg cgttcttagg tggtaacccc 60 taggggttac caccttcatt ggaaaacgtt cttcggggcg ttcttaggtg gtaacc 116 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynuclotide <400> 6 aggtggtaac ccctaggggt taccaccttc atcgtcgttt tgtcgttttg tcgttctt 58 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide; Position 31 and 32 in L-conformation <400> 7 ggggtcatta aaacgtgacg tgacgttctt ttt 33 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide; Positions 1, 2 and 35 and 36 in L-conformation <400> 8 ggggggggtc attaaaacgt gacgtgacgt tcttttt 37 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide; positions 30 and 31 in L-conformation <400> 9 ggggtcatta aacgtgacgt gacgttcttt tt 32 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide; positions 32 and 33 in L-conformation <400> 10 ggggtcatta aacgttcttc ggggcgttct tttt 34 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide; positions 37 and 38 in L-conformation <400> 11 ggggtcatta aatcgtcgtt ttgtcgtttt gtcgttttt 39 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligodeoxynucleotide; positions 1, 2 and 19 and 20 in L-conformation <400> 12 gggggacgat cgtcgggggg t 21

Claims (22)

  1. a. T-세포 조절자로서 이의 기능에 영향을 주기 위한, PD1, PD-L1, OX40, TIM-3, LAG3, CD137(4-1BB)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 분자들 중 적어도 하나에 바인딩하는 화학물질 또는 분자를 포함하는, 제1그룹; 및
    b. 적어도 하나의 서열 모티프 N1N2CGN3N4를 포함하며, 여기서 N은 A, C, T 또는 G를 포함하는 뉴클레오티드이고, C는 데옥시시티딘이고, G는 데옥시구아노신이고, A는 데옥시아데노신이고, T는 데옥시티미딘인, 데옥시리보핵산의 비-코딩 서열을 포함하는 제2그룹
    의 성분들을 포함하는, 배합물.
  2. 제1항에 있어서,
    N1N2는 GT, GG, GA, AT 및 AA의 그룹으로부터 취한 원소이며, 및 N3N4는 CT, TG 및 TT의 그룹으로부터 취한 원소인, 배합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    데옥시리보핵산의 비-코딩 서열은 양측이 선형의 개방-쇄이거나, 이중 스트랜드 부분의 일 측이 선형의 개방-쇄이고, 이중 스트랜드의 각 다른 측 상에 단일 스트랜드 헤어핀을 가지거나, 또는 부분적으로 단일 스트랜드인 덤벨형으로 데옥시리보핵산이 공유결합적으로 폐쇄된 쇄인, 배합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    T-세포 조절자는 면역 시스템의 체크포인트 억제제 및 면역 시스템의 공-자극(co-stimulatory) 분자를 포함하는, 배합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 서열 모티프 N1N2CGN3N4 중 적어도 3개를 포함하는, 배합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    데옥시리보핵산의 선형의 개방-쇄의 비-코딩 서열은 L-형태로 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는, 배합물.
  7. 제6항에 있어서,
    데옥시리보핵산의 선형의 개방-쇄의 비-코딩 서열의 DNA 단일 스트랜드의 5'- 및/또는 3'-말단에 위치한 5개의 터미널 뉴클레오티드 중 하나는 L-형태로 존재하는, 배합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC(SEQ ID NO:1); 또는
    b. ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA(SEQ ID NO:2), 또는
    c. AACGTTCTTCGGGG CGTT(SEQ ID NO:3), 또는
    d. AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT(SEQ ID NO:4)
    의 서열 중 적어도 하나를 포함하는, 배합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    데옥시리보핵산의 비-코딩 서열은 40-200 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 배합물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    제8항의 서열 c)는 서열 CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC(SEQ ID NO:5)의 일부인, 배합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    데옥시리보핵산의 비-코딩 서열은 48-116 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 배합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 서열 모티프 N1N2CGN3N4는 단일 스트랜드 영역의 일부인, 배합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    T-세포 조절자에 바인딩하는 분자는 항체인, 배합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    두 그룹 모두의 성분들은 고체, 액체 또는 기체 형태로 제공되어 최대 15mg/kg 중량으로 적용되는, 배합물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 배합물의 성분들을 동시에, 교대로 또는 연속적으로 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    데옥시리보핵산의 비-코딩 서열은 T-세포 조절자에 영향을 미치기 위한 화학 물질 또는 분자 이전에 제공되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 배합물의 의약으로서 사용하기 위한 용도.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 배합물의 암, 자가면역 질환 및 염증의 치료용 용도.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 배합물의 화합물들은 동시에, 교대로 또는 연속적으로 투여되는 용도.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 배합물의 상기 배합물을 포함하는 약학 조성물의 제조용 용도.
  21. 제19항에 있어서,
    약제는 상기 배합물의 화합물들을 동시에, 교대로 또는 연속적으로 방출시키는 용도.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 배합물의 치료적 또는 예방적 백신접종시 보조제(adjuvant)로서의 용도.
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