CN1080763C - 被检物质的活性测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了阻断或促进活性型血液凝固第XII因子生成的被检物质的活性沉淀方法。该方法是在被检物质存在下,在动物血浆中添加血液凝固第XII因子活性剂使血液凝固第XII因子的活性化反应开始后,使该反应停止,定量测定上述反应中生成的活性型血液凝固第XII因子。本发明方法在筛选与血液凝固系、线溶系有关的药剂和血浆血管舒缓剂有关的药剂,例如血压调整剂、抗炎症剂、镇痛剂、抗应变性剂等各种药剂方面是非常有用的。
Description
本发明涉及相对于活性型血液凝固第XII因子生成的被检物质的活性测定方法,更详细地说,本发明涉及对血液凝固第XII因子的生成起阻断或促进作用的物质的活性测定方法。
称之为哈格曼(八-ケマン)因子的血液凝固第XII因子(以下简称FXII),是内因系血液凝固的连锁反应系中最初活化的因子。活化了的血液凝固第XII因子(活性型血液凝固第XII因子,以下简称为FXIIα)将血液凝固第XI因子活性化,进行以下图3(1)中示出的内因系血液凝固的一系列反应,最终生成不溶性的血纤维蛋白从而完成内因系血液凝固反应。
溶解这种血纤维蛋白块的一系列机制是线溶系,还已知FXIIα与线溶系的初期相有关系。即如图3(2)中所示,是线溶系主角的血纤维蛋白溶酶作为惰性的血纤维蛋白溶酶原存在于血浆中,而FXI-Iα是使血纤维蛋白溶酶原活化的催化剂之一。如此生成的血纤维蛋白溶酶将凝固的血纤维蛋白分解的反应是线溶系的最终阶段。
此外,FXII的活性化也是血浆血管舒缓素,激肽系的开始阶段。该血浆血管舒缓素·激肽系,被认为是通过在生物体内由于伤害和侵害刺激使FXII活化而引起一系列的酶反应糸。即如图3(3)中所示,活化了的FXIIα,同样对血浆中存在的血浆血管舒缓素起作用,将它转变成活性型酶的血浆血管舒缓素,然后该血浆血管舒缓素对血浆中的高分子激肽原(以下简称HK)起作用,从而使血管舒缓激肽游离。
作为血管舒缓素,激肽系生成产物的血管舒缓激肽等激肽类,除了具有随末梢血管扩张的降压、血管透过性亢进、平滑肌的收缩或弛缓、疼痛、发炎、白血球的游走、来自副肾皮质的儿茶酚胺的游离作用等各种生理活性外,还已知可作为包含变应性反应的急性炎症的介体,在生体内存在的意义很大。
因此,FXIIα在内因系血液凝固系、线溶系及血浆血管舒缓素·激肽系的开始阶段是非常重要的因子,对FXIIα的生成带来影响的物质不仅可以期待作为血液凝固,线溶领域中的药剂,而且在血浆血管舒缓素·激肽系中游离的血管舒缓激肽具有上述各种生理活性,因此也有可能作为抗炎症剂、镇痛剂、抗变应性剂来使用。
因此,确立对作为内因系血液凝固系、线溶系及血浆血管舒缓素·激肽系起始因子的FXIIα的生成进行阻断或促进的物质的作用活性能简便迅速而且正确的测定方法,对了解上述生物体机能的调整方面所起的作用,或在研制药剂方面都是非常有效的手段。
本发明的目的在于提供一种在试验管内简便迅速而且正确地测定阻断或促进与生体内各种生理反应相关的FXIIα的生成的被检物质活性的测定方法。
也就是说,本发明的被检物质的活性测定方法的特征是,在被检物质存在下,在动物血浆中添加血液凝固第XII因子活化剂使血浆凝固第XII因子的活化反应开始后,使该反应停止,定量测定上述反应中生成的活性型血液凝固第XII因子。
在本发明测定方法中可以使用的动物血浆,只要是具有血液凝固系及血浆血管舒缓素·激肽系的任何一种动物血浆都行,例如人的血浆,或家畜或实验动物血浆如牛、羊、猪、马、山羊、猿猴、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、大白鼠或小鼠的血浆都可以利用,优选使用人的血浆。
这些血浆,可以采用惯用方法调制成的,例如可以采用柠檬酸存在下采血之后经离心分离而得到的加柠檬酸血浆等。此外,还可使用通常方法制得的冻结干燥血浆等制品。调制成的动物血浆可以直接使用,或者是根据控制反应速度等所希望的程度经适当稀释后使用。
作为FXII活化剂,只要是具有FXII活化作用的物质都可以使用,例如玻璃、高岭土、硅藻土制品、骨胶原、高胱氨酸、尿酸钠、血小板和其它细胞的膜等细胞成分,纤连蛋白、鞣花酸、槲皮黄酮,芦丁、硫酸化糖脂质、蛋白多糖、粘多糖、硬脂酸钠、硫酸葡聚糖、硫酸直链淀粉、角叉菜胶以及使FXII限定分解而活化的蛋白酶等,可将它们单独使用或适宜组合使用,这些FXII活化剂的使用浓度可以适宜地调整。
由动物血浆,FXII活化剂和被检物质组成的溶液的混合反应,内因性的抑制剂很难起作用,而且为了便于控制反应的进行,最好是在0℃-4℃进行。反应时的pH可以适宜地设定,但例如在使用人血浆的情况下,最好是在pH7.0-9.0时进行反应。此外,为了设定最适宜的反应条件,还可在反应系中适宜添加氯化钠等盐类和锌离子等金属离子,此外也可添加本技术领域中惯用的添加剂、助剂等。
反应时间,可以根据动物血浆的量,FXII活化剂及被检物质的浓度或反应液的pH值等适宜地设定,但是如果FXIIα的生成量达到饱和,则不能正确地评价被检物质的作用,因此,最好设定在FXIIα的生成量达到饱和之前,即反应时间和生成的FXIIα之间是明确的正的对应关系,例如为便于评价最好设定在成直线的比例关系等时间内。
作为用于停止上述反应的方法,如果使用例如多利凝等FXII活性阻断剂及特异阻断血浆血管舒缓素的阻断剂,优选是对FXIIα无实质性影响的血浆血管舒缓素阻断剂,如SBTI(Soy BeanTrypsin Inhibitor;来源于大豆的胰蛋白酶抑制剂)等,就可以很好地对使用相对于FXIIα的基质并以FXIIα的酶活性作为指标而生成的FXIIα进行定量测定。这些阻断剂的浓度,可以在不给FXIIα活性带实质性影响的浓度范围内适宜的设定。
在血浆血管舒缓素·激肽系中,通过生成的血浆血管舒缓素来促进FXIIα生成的反馈机制是已知的,但是相对于不通过这种反馈机制的纯粹FXII活性反应而引起的FXIIα生成的被检物质活性也可用本发明方法测定。这种情况下可采用如下措施,即在FXII活化之前预先在反应系中添加上述SBTI等血浆血管舒缓素的特异阻断剂,或者,从欠缺前血管舒缓素的血浆或正常血浆中去除血浆前血管舒缓素,使之惰性化,然后将血浆前血管舒缓素实质上呈欠缺状态的血浆作为动物血浆使用。
对已生成的FXIIα的定量测定,可按照惯用的方法进行。例如可采用利用FXIIα的酶活性,用相对于FXIIα的基质进行测定的方法,除了血浆前血管舒缓素、血液凝固第XI因子或血纤维蛋白溶酶等天然基质外,使用D-Pro-Phe-Arg-pNA、D-Leu-Gly-Arg-pNA等发色合成基质和Boc-Glu(OBz)一Gly-Arg-MCA、Boc-Gln-Gly-Arg-MCA等萤光合成基质等的方法是简便的并且经常使用。除了上述使用基质的测定法外,还可以利用采用放射免疫测定法(RIA)和酶免疫测定法(EIA)等免疫学的测定法,色谱法等的定量分析法。
在以下实施例中更详细地说明本发明,但以下实施例仅仅是用于说明本发明的实例,并不具有限定的意义。
实施例
在由稀释的人血浆、规定量的被检物质(被检药)以及含90mnMNaCl的25mM三盐酸缓冲液(pH8)组成的溶液中,添加葡聚糖硫酸使其最终浓度为2ug/ml混合之,然后在冰水中培养15分钟,接着在反应液中添加多利凝和SBTI使其最终浓度分别为200μg/ml,40μg/ml。将该反应液,于三盐酸缓冲液(pH8)中,与1mMD-Pro-Phe-Arg-pNA一起在30℃下培养30分钟、添加柠檬酸使反应停止,以3000rpm经10分钟离心分离后,测定所得上清液在405nm处的吸光度(相当于FXIIα生成量)。
图1中示出,在上述反应中对培养时间进行种种变化时的吸光度的变化情况。图中,横轴表示培养时间(分),纵轴表示在405nm处的吸光度。图1中,培养时间直到17分钟左右,FXIIα随时间的生成大致成直线地增加,因此培养时间最好设在0-17分钟之间。
图2中示出,使用本发明的测定方法,测定用作镇痛剂和抗应变性剂的4种被检药(吲哚美辛、凯托洛芬、氨基比林和凯托替芬)的FXIIα生成阻断活性的测定结果。图中,横轴表示被检药浓度(mM),纵轴表示FXIIα生成阻断率(%)。
FXIIα在内因系血液凝固系、线溶系及血浆血管舒缓素·激肽系开始阶段中起非常重要的作用,因此,可以测定具有阻断或促进FXIIα生成这种作用的被检物质活性的本发明方法,用于筛选与血液凝固,线溶系有关的药剂和血浆血管舒缓素·激肽系有关的药剂,例如血压调整剂、抗炎症剂、镇痛剂、抗应变性剂等各种药剂方面是极有用的。
而且,本发明的测定方法,还可以通过抑制相对于FXIIα生成的血浆血管舒缓素的反馈机制,筛选仅与作为内因系血液凝固系、线溶系、血浆血管舒缓素·激肽系中反应开始阶段的FXII的活化阶段相关连的药剂,因此,可以根据明确而具体的作用机制筛选药剂,对开发各种新药起很大作用。
以下简单说明附图
图1示出,本发明的测定方法中,在各段不同培养时间内的吸光度变化。
图2示出,使用本发明的活性测定方法,对各种被检药的FXIIα生成阻断性的测定结果。
图3示出,说明与FXIIα相关的生物体内调节机制。
Claims (4)
1.被检物质的测定方法,其特征是,被检物质存在下,在动物血浆中添加血液凝固第XII因子活化剂使血液凝固第XII因子的活化反应开始后,使反应停止,定量测定上述反应中生成的活性型血液凝固第XII因子。
2.根据权利要求1的测定方法,其特征是,在活性型血液凝固第XII因子的生成量达到饱和之前,停止该活性型血液凝固第XII因子的生成。
3.根据权利要求1或2的测定方法,其特征是,使用相对于活性型血液凝固第XII因子的基质来定量生成的活性型血液凝固第XII因子。
4.根据权利要求3的测定方法,其特征是,使用相对于活性型血液凝固第XII因子的合成基质,来定量生成的活性型血液凝固第XII因子。
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