CN107735492B - 使用活化t细胞治疗癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用由负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)诱导的活化T细胞或PBMC治疗个体中的癌的方法。所述方法还可包括向所述个体施用负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述抗原递呈细胞。所述方法可单独地使用，或与免疫检查点抑制剂联合使用。本发明提供了使用新抗原肽或基于所述个体的所述肿瘤中的突变负荷来为所述个体定制的精确治疗方法。本发明还公开了制备所述活化T细胞的方法、监测所述治疗的方法以及克隆肿瘤特异性T细胞受体的方法。本发明还提供了包含所述活化T细胞的分离的细胞群，以及可用于癌免疫疗法的组合物和试剂盒。

Description

使用活化T细胞治疗癌的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月13日提交的国际申请PCT/CN2015/074227的优先权权益，该国际申请的全部内容以引用方式并入本文。
ASCII文本文件上的序列表的提交
以下有关ASCII文本文件的提交的全部内容以引用方式并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：744852000141SEQLIST.TXT，记录日期：2016年3月11日，大小：7.83KB)。
技术领域
本发明涉及癌免疫疗法的领域。更具体地，本发明提供了使用活化T细胞治疗个体中的癌的方法、组合物和试剂盒。
背景技术
人体拥有复杂的免疫系统保护自身免遭疾病，包括体内恶性肿瘤。因此，激发机体自身免疫力来治疗和预防癌是肿瘤学领域由来已久的理想。对肿瘤的天然免疫应答通常由肿瘤抗原引发，所述肿瘤抗原包括在癌细胞中专一表达的突变蛋白，以及在癌起源组织中过表达但却不能完全被识别为“自身”的肿瘤相关抗原(TAA)。遇到肿瘤抗原的抗原递呈细胞(APC)(尤其是树突细胞(DC))可加工肿瘤抗原并将肿瘤抗原递呈到其细胞表面上。在成熟后，负载有肿瘤抗原的DC可引起对寄宿肿瘤抗原的癌细胞的T细胞应答，该T细胞应答涉及细胞毒性T细胞、辅助T细胞及功能上不同的效应T细胞和记忆T细胞。特别强烈的T细胞应答类型涉及产生细胞毒性T细胞，这些细胞毒性T细胞通过释放细胞因子、酶和细胞毒素或者通过经由细胞-细胞相互作用引发促凋亡信号级联反应来杀灭癌细胞。
癌免疫疗法旨在利用上述过程来治疗癌，但到目前为止成效相当有限。最初的尝试集中于基于特殊抗原肽、全长抗原蛋白或编码肿瘤抗原的病毒载体来开发癌疫苗。进入临床阶段的癌疫苗很少，产生任何引人瞩目的临床结果的癌疫苗更是少之又少。与传统癌疗法诸如化学疗法、放射疗法和手术切除不同，通常，机体对癌免疫疗法治疗(尤其是癌疫苗)的应答大大延迟，因为APC需要时间加工抗原并将抗原递呈到T细胞，并且T细胞也需要时间成熟和引发免疫应答。当患者体内存在肿瘤时，肿瘤中的癌细胞已经有逃脱免疫系统监视的机制。因此，有效的肿瘤疫苗必须能够绕开免疫监视的缺陷以引发强免疫应答。另外，癌疫苗中存在若干瓶颈问题，这些问题防止该方法产生特异且持久的临床疗效。首先，在不同患者间及在同一患者的不同病灶间，癌细胞，即使具有相同组织学类型，在其遗传组成和表达谱方面也是相当异质的--在文献和公共数据库中可找到由近期对癌细胞的新一代测序实验得出的大量遗传数据来充分佐证该现象。因此，特殊癌疫苗治疗中有限数量的一种或多种肿瘤抗原不太可能代表所有患者中的独立肿瘤所特有的抗原谱。其次，由于血清半衰期和生物利用度问题，癌疫苗中的许多抗原部分不能有效负载于APC上。第三，即使当APC被癌疫苗中所含的抗原适当致敏，缺少合适的活化信号和微环境也会导致产生T细胞的错误亚群，尤其是免疫抑制调节性T细胞(TREG)，它们会抑制而非刺激对肿瘤的免疫应答。最后两个问题的起因与以下情况有关：在施用任何癌疫苗后，临床医生完全无法掌控患者对任何癌疫苗的实际应答。
基于细胞的癌免疫治疗方法通过向患者施用在相对限定且受控的条件下制备的免疫介导的细胞或细胞产物，减轻了癌疫苗的上述挑战中的一部分。特别是，基于DC的方法已倍受关注，尤其在2010年4月FDA批准
Figure BDA0001405186940000021
(sipuleucel-T)用于晚期前列腺癌之后。典型的基于DC的免疫治疗方法涉及从癌患者分离DC，使DC离体负载一种肿瘤抗原(或多种肿瘤抗原，包括肿瘤细胞裂解物和总mRNA)，然后将DC施用回患者以引发癌杀伤性T细胞应答。
Figure BDA0001405186940000022
例如包括使患者的外周血单核细胞(PBMC)暴露于融合蛋白(包括偶联到细胞因子(诸如GM-CSF)的肿瘤来源抗原)，然后向患者输注PBMC(可假定含有可将肿瘤来源抗原递呈到T细胞的活化DC)(参见美国专利5,976,546、6,080,409和6,210,662)。在关键的III期试验中(Kantoff PW,Higano CS et al.(2010)“Sipuleucel-Timmunotherapy for castration-resistant prostate cancer.”N J Med 363:411-22(Kantoff PW、Higano CS等人，2010年，“去势难治性前列腺癌的Sipuleucel-T免疫疗法”，《新英格兰医学杂志》，第363卷，第411-422页))，使用融合到GM-CSF(已知会吸引并诱导DC的细胞因子)的前列腺酸性磷酸酶(PAP)(一种前列腺癌相关抗原)的重组蛋白来制备
Figure BDA0001405186940000031
的特定实施方案。虽然与对照组中患者的中值生存期(21.7个月)相比，
Figure BDA0001405186940000032
能够延长实验组中患者的中值生存期(25.8个月)，但临床试验结果并未显示出统计上显著的肿瘤进展延迟或肿瘤尺寸缩小的迹象。更为棘手的是这样的事实：在
Figure BDA0001405186940000033
治疗中，个体患者的生存期似乎不与对融合蛋白或PAP的特异性T细胞应答相关联(Cheever MA,Higano CS(2011)“PROVENGE(Sipuleucel-T)in prostate cancer:the first FDA-approved therapeutic cancer vaccine.”Clin.Cancer Res.17:3520-6(Cheever MA、Higano CS，2011年，“用于前列腺癌的PROVENGE(Sipuleucel-T)：FDA批准的首个治疗性癌疫苗”，《临床癌研究》，第17卷，第3520-3526页)。
基于细胞的免疫治疗方法中的第二种方法称为过继淋巴细胞疗法，其涉及从患者的肿瘤分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，离体扩增TIL，并且在去除患者的天然非骨髓性淋巴细胞之后，将TIL输注回患者。显著的临床应答(包括肿瘤完全消退和较长无病生存期)在过继淋巴细胞疗法对黑素瘤患者的临床应用中已有报道(Restifo NP,Dudley ME,andRosenberg SA.(2012)“Adoptive immunotherapy for cancer:harnessing the T cellresponse.”Nat.Rev.Immunol.12:269-81(Restifo NP、Dudley ME和Rosenberg SA，2012年，“癌的过继免疫疗法：利用T细胞应答”，《自然综述：免疫学》，第12卷，第269-281页))。研究进一步表明，TIL的临床受益与TIL群体中存在的肿瘤特异性T细胞相关联或由所述细胞产生(Robbins PF et al.(2013)“Mining exomic sequencing data to identifymutated antigens recognized by adoptively transferred tumor-reactive Tcells.”Nature Medicine 19:747-752(Robbins PF等人，2013年，“挖掘外显子组测序数据以鉴定由过继转移的肿瘤反应性T细胞识别的突变抗原”，《自然医学》，第19卷，第747-752页)；以及Tran E et al.(2014)“Cancer immunotherapy based on mutation-specificCD4+T cells in a patient with epithelial cancer”Science 344:641-645(Tran E等人，2014年，“在上皮癌患者中基于突变特异性CD4+T细胞的癌免疫疗法”，《科学》，第344卷，第641-645页))。最近，通过改变T细胞-肿瘤相互作用的微环境，具有对某些肿瘤抗原或嵌合抗原受体(CAR-T)具有改性的亲和力的经工程改造的T细胞受体的T细胞进一步扩展了过继淋巴细胞治疗方法的能力。当前过继淋巴细胞治疗方法的主要问题涉及临床试验中严重不良事件(包括CNS毒性)的多次报告，这可能与靶标的不恰当选择(所谓的在靶/脱肿瘤(on-target off tumor)效应)和T细胞群的偏向性增殖(biased expansion)有关。该方法的另一个问题是一些患者中没有持久的应答，因为快速形成了对递呈到所输注的T淋巴细胞上的肿瘤特异性抗原的免疫耐受性，以及癌细胞免疫逃避。
除了升高水平的免疫抑制细胞诸如TREG和MDSC(骨髓来源的抑制性细胞)之外，免疫耐受性和免疫逃避通常还由在肿瘤部位的微环境中与T细胞相互作用的细胞上的检查点分子或共抑制信号介导。一对充分研究的检查点分子涉及T细胞上的免疫抑制性PD-1受体以及APC(诸如DC)、MDSC和癌细胞上的PD-L1配体。PD-L1结合于PD-1会引发抑制促炎性细胞因子(例如，IL-2)产生和细胞毒性T细胞增殖的信号。在许多情形中，PD-L1结合于PD-1会引发细胞毒性T细胞的凋亡。另一方面，PD-1/PD-L1信号传导诱导TREG细胞，这些细胞起到进一步抑制具有肿瘤攻击能力的T细胞的作用。目前若干制药公司依据T细胞检查点的阻滞可有助于克服肿瘤部位中的免疫耐受性和免疫逃避这一理论，开发了抗PD-1、PD-L1和其他检查点分子(诸如T细胞上的CTLA-4)的抗体，作为癌免疫疗法中的不同方法。值得注意的是，检查点阻滞方法的抗肿瘤效应需要体内预先存在肿瘤特异性T细胞(Boussiotis VA(2014)“Somatic mutations and immunotherapy outcome with CTLA-4blockade in melanoma”N.Engl.J.Med.371:2230-2232(Boussiotis VA，2014年，“体细胞突变和黑素瘤中CTLA-4阻滞的免疫疗法结果”，《新英格兰医学杂志》，第371卷，第2230-2232页)；Wolchok JD andChan TA,(2014)“Cancer:antitumor immunity gets a boost”Nature 515:496-498(Wolchok JD和Chan TA，2014年，“癌：抗肿瘤免疫得到提升”，《自然》，第515卷，第496-498页))。
考虑到各种癌免疫治疗方法的前景和挑战，希望提供能结合此前方法的优点同时避免已知缺陷的新癌免疫治疗方法。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公布的专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入本文。
发明内容
本发明提供了使用由负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)诱导的活化T细胞治疗个体中的癌的方法、组合物和试剂盒。
本申请的一个方面提供了治疗个体(诸如人类个体)中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，树突细胞在施用活化T细胞之前(例如，之前约7天至约14天、约14天至约21天或者约7天至约21天)施用。
在根据上述任一方法的一些实施方案中，该方法还包括通过在施用步骤之前将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天或约14天至约21天)。
在根据上述任一方法的一些实施方案中，在共培养之前使T细胞群与免疫检查点抑制剂接触。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂的情况下，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1和CTLA-4的免疫检查点分子的抑制剂。
在根据上述任一方法的一些实施方案中，该方法还包括制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，通过在存在有利于树突细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。
在根据上述任一方法的一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于正接受治疗的个体。
本申请的一个方面提供了制备活化T细胞群的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；以及(c)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从取自个体的PBMC群获得。在一些实施方案中，步骤b)包括在存在有利于树突细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，步骤b)还包括使负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与多种Toll样受体(TLR)激动剂(诸如polyIC、MALP、R848或它们的任意组合)接触，以诱导负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群的成熟。在一些实施方案中，步骤c)还包括使活化T细胞群与多种细胞因子和任选地抗CD3抗体接触，以诱导活化T细胞群的增殖和分化。在一些实施方案中，所述多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。在一些实施方案中，在共培养之前使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂接触。在一些实施方案中，步骤c)包括在存在免疫检查点抑制剂的情况下，将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1和CTLA-4的免疫检查点分子的抑制剂。
还提供了治疗个体(诸如人类个体)中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞群，该活化T细胞群通过前述段落中所述的任一方法的方法制备。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在根据如上所述治疗癌的任一方法的一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞的每次施用之间的间隔为约0.5个月至约5个月(诸如约0.5个月至约2个月)。
在根据如上所述治疗癌的任一方法的一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞以至少约3×109个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞以约1×109至约1×1010个细胞/个体施用。
在根据如上所述治疗癌的任一方法的一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，树突细胞的每次施用之间的间隔为约0.5个月至约5个月(诸如约0.5个月至约2个月)。
在根据如上所述治疗癌的任一方法的一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，树突细胞以约1×106至约5×106个细胞/个体的剂量施用。
本申请的一个方面提供了治疗个体(诸如人类个体)中的癌的方法，该方法包括：a)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及b)向该个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，步骤(a)包括在存在免疫检查点抑制剂的情况下，使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3的免疫检查点分子的抑制剂。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约0.5个月至约5个月(诸如约0.5个月至约2个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，活化PBMC以约1×109至约1×1010个细胞/个体的剂量施用。
在根据上述任一方法的一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽各自为约20至约40个氨基酸长。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种包含MHC-I表位的肽。在一些实施方案中，所述至少一种包含MHC-I表位的肽在N末端、C末端或两末端处还包含位于表位旁侧的附加氨基酸。
在根据上述任一方法的一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种包含MHC-II表位的肽。在一些实施方案中，所述至少一种包含MHC-II表位的肽在N末端、C末端或两末端处还包含位于表位旁侧的附加氨基酸。
在根据上述任一方法的一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽还包括第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包含约10至约20种普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第二组包含约1至约10种癌类型特异性抗原肽。
在根据上述任一方法的一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽。在一些实施方案中，基于取自个体的肿瘤样本的遗传图谱来选择新抗原肽。
在根据如上所述治疗癌的任一方法的一些实施方案中，所述癌选自肝细胞癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、淋巴瘤、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑素瘤以及脑癌。
在根据如上所述治疗癌的任一方法的一些实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1和CTLA-4的免疫检查点分子的抑制剂。
在根据如上所述治疗癌的任一方法的一些实施方案中，基于癌中的突变负荷来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，个体具有癌中的低突变负荷。在一些实施方案中，个体具有一种或多种MHC基因中的低突变负荷。在一些实施方案中，个体具有所述一种或多种MHC基因中的不超过约10个突变。在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因是MHCI类基因。在一些实施方案中，其中所述个体是人类个体，所述一种或多种MHC基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M。在一些实施方案中，个体没有B2M中的突变。在一些实施方案中，个体没有所述一种或多种MHC基因的功能区(诸如前导肽序列、a1结构域、a2结构域或a3结构域)中的突变。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。
在根据如上所述治疗癌的任一方法的一些实施方案中，基于具有癌中的一种或多种新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，个体具有至少5种新抗原。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定癌的新抗原，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来鉴定新抗原。在一些实施方案中，所述测序是癌相关基因的靶向测序。在一些实施方案中，该方法还包括确定新表位对MHC分子的亲和力。在一些实施方案中，该方法还包括确定包含新表位和MHC分子的复合体对T细胞受体的亲和力。在一些实施方案中，MHC分子是MHC I类分子。在一些实施方案中，MHC分子来自个体。
在根据如上所述治疗癌的任一方法的一些实施方案中，该方法还包括在施用活化T细胞或活化PBMC之后监测个体。在一些实施方案中，该监测包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量。在一些实施方案中，该监测包括检测个体中针对所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该治疗方法。
本申请的一个方面提供了克隆肿瘤特异性T细胞受体的方法，该方法包括：(a)使用如上所述治疗癌的任一方法治疗个体；(b)从个体分离T细胞，其中该T细胞特异性地识别所述多种肿瘤抗原肽中的肿瘤抗原肽；以及(c)从该T细胞克隆T细胞受体以提供肿瘤特异性T细胞受体。在一些实施方案中，个体具有针对肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫应答。在一些实施方案中，T细胞分离自个体的PBMC样本。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽是新抗原肽。
还提供了使用如上所述克隆肿瘤特异性T细胞受体的任一方法克隆的肿瘤特异性T细胞受体、包含肿瘤特异性T细胞受体的分离的T细胞，以及治疗个体中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的分离的T细胞。
还提供了通过如上所述任一制备方法的方法制备的分离的细胞(诸如活化T细胞或活化PBMC)群。
本申请的一个方面提供了包含活化T细胞的分离的细胞群，其中小于约1％的活化T细胞是调节性T(TREG)细胞。
在根据上述任一分离的细胞群的一些实施方案中，分离的细胞群包含约0.3％至约0.5％CD4+CD25+Foxp3+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约65％至约75％CD3+CD8+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约16％至约22％的CD3+CD4+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约13％至约15％CD3+CD56+细胞。
在根据上述任一分离的细胞群的一些实施方案中，活化T细胞能够在体内或离体引发对多种肿瘤抗原肽的特异性应答。在一些实施方案中，活化T细胞表达多种促炎分子。在一些实施方案中，所述多种促炎分子包括IFNγ、TNFα、颗粒酶B或穿孔素。
在根据上述任一分离的细胞群的一些实施方案中，活化T细胞没有多种免疫抑制细胞因子的表达或有多种免疫抑制细胞因子的低表达。在一些实施方案中，所述多种免疫抑制细胞因子包括IL-10或IL-4。
在根据上述任一分离的细胞群的一些实施方案中，小于约5％的活化T细胞表达免疫抑制性分子PD-1。
在根据上述任一分离的细胞群的一些实施方案中，分离的细胞群中至少约90％的细胞是活化T细胞。
本申请的一个方面提供了包含至少10种肿瘤抗原肽的组合物，其中所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-35的表位。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽选自图2C中的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含一种或多种由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素(Survivin)、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
还提供了包含如上所述任一组合物(诸如分离的细胞群或肿瘤抗原肽组合物)的试剂盒、药物和制品。
通过随后的具体实施方式和所附权利要求书，本发明的这些和其他方面和优点将变得显而易见。应当理解，本文所述的各种实施方案的一种、一些或所有特性可组合形成本发明的其他实施方案。
附图说明
图1描绘了MASCT方法的两个优选实施方案，包括DC和T细胞制备步骤的时序及基于特殊细胞的组合物的一次或多次施用。时间线下方的箭头指示施用步骤。
图2A至图2C描绘了实施例1中所述的示例性MASCT方法的细胞制备过程。图2A是示出了MASCT方法的优选实施方案的细胞制备过程的示意图。图2B示出了用于HCC患者中的MASCT治疗的、负载于DC中的HCC抗原肽库的示例性组成。一些肿瘤抗原肽已在癌免疫疗法的临床试验中使用；有关此类DC疫苗、过继细胞转移(ACT)和肽疫苗的参考文献包括在内。OC：卵巢癌；BC：乳腺癌；PC：胰腺癌；LC：肺癌；RCC：肾癌；HCC：肝细胞癌。图2C示出了HCC肽库中所含的表位的列表。
图3示出了iDC对肿瘤抗原肽的细胞摄取。人类单核细胞来源的iDC用生存素的荧光标记肽(左边第二列，2.5μg/ml)冲击处理2小时，然后用DAPI(左边第一列)和
Figure BDA0001405186940000111
(右边第二列)进行标记以分别鉴定细胞核和溶酶体。用共聚焦显微术(Leica TCSST5)记录荧光图像，标尺为7.5μm，并且这些图像代表四个独立实验。
图4A至图4B示出了实施例1中制备的成熟DC的表征。图4A示出了在用TLR激动剂诱导成熟之前(灰色峰)和之后(黑色峰)DC的流式细胞术结果。用于在流式细胞术实验中分离细胞的抗体所靶向的分子标记物在每个色谱图上方示出。具有高表达水平(在标记范围内)的每种分子标记物的DC的百分比在每个分图内指出。结果表明，大多数成熟DC表现出细胞表面表达特征以使细胞毒性T细胞活化。这些DC表达MHC II类分子及共刺激信号传导配体CD86、CD80和CD83以及成熟受体CCR7，但CD14的表达水平较低，其通常在未成熟DC中表达。图4B示出了实施例1中制备的成熟DC的细胞因子分泌水平。正如对功能性成熟DC所预期的，DC分泌高水平的促炎性细胞因子IL-12，但分泌低水平的免疫抑制细胞因子IL-10。
图5A至图5E示出了实施例1中制备的活化T细胞的表征。图5A基于使用台盼蓝拒染法的细胞计数示出了14至17天之后的T细胞增殖。示出了取自10名患者的样本的中值。图5B示出了共培养物中的T细胞亚群的百分比，指示出了活化T细胞之中极低水平的TREG细胞(CD4+CD25+Foxp3+，0.4％±0.1％)。图5C示出了饼图，展示了共表达细胞因子(IFNγ和TNFα)和颗粒酶B的T细胞亚群的百分比。示出了每组的五名患者的平均值±测量标准误差(SEM)。三生产者：深灰色；双生产者：浅灰色；单生产者：黑色；非生产者：白色。图5D示出了活化T细胞的三维流式细胞术色谱图，这些活化T细胞由患者的PBMC制备并与经冲击处理的DC共培养，然后用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)进一步刺激约4小时。数据代表五个独立实验。活化T细胞包含较大亚群的CD3+CD8+细胞毒性T细胞、CD3+CD4+辅助T细胞和CD3+CD56+NK T细胞，大多数这些细胞具有较高细胞内产量的促炎性细胞因子(IFNγ和TNFα)和蛋白酶颗粒酶B。图5E示出了用PMA刺激约4小时的、分离自患者的非活化T细胞的三维流式细胞术色谱图。非活化T细胞仅具有低表达水平的IFNγ、TNFα和颗粒酶B。
图6A至图6F示出了实施例1中制备的活化T细胞的分子和功能表征。图6A示出了活化T细胞的各种细胞因子分泌。从HCC患者产生的所得细胞分泌大量IFNγ和TNFα，但分泌很少的乃至不分泌IL10和IL4。示出了6名患者的平均值±SEM。图6B至图6C示出了与健康供体相比，从HCC患者分离的T细胞的CD3+CD8+(图6B)和CD3+CD4+(图6C)亚群表面上的PD-1的表达频率降低。示出了7名患者的表达百分比和统计数值。图6D示出了在离体活化之后T细胞CD3+CD8+亚群中表达PD-1的T细胞的频率降低。图6E示出了在离体活化之后T细胞CD3+CD4+亚群中表达PD-1的T细胞的频率降低。示出了7名患者的表达百分比和统计数值。图6F示出了活化T细胞的HLA(或MHC)限制性细胞毒性。从HLA-A2+患者的PBMC产生的活化T细胞(n＝7，左组)表现出对HCC细胞系HepG2(白色柱条，HLA-A2+)的细胞毒性活性水平大于对HuH-7细胞(斜线条纹柱条(hashed bars)，HLA-A2-)的细胞毒性活性水平，而从HLA-A2-患者的PBMC产生的活化T细胞(n＝7，右组)表现出对这两种细胞系的相似细胞毒性水平。每个细胞裂解实验中效应T细胞(所制备的活化T细胞)与靶细胞(HepG2或HuH-7细胞)的相对比率(E:T比率)为约40:1。
图7A描绘了流程图，示出了如实施例1中所述在MASCT治疗的临床数据的回顾性分析中患者的纳入和排除。
图7B描绘了连续治疗并定期随访的B期(根据巴塞罗那临床肝癌分期标准)HCC患者的回顾性分析的示意图。
图8A示出了在实施例1中分析的对照组中肝细胞癌(B期)患者的特征、治疗和RECIST评价。
图8B示出了在诊断后1年期间仅接受常规疗法的肝细胞癌(B期)患者的特征、治疗和RECIST评价(对照组，n＝17)。
图9A示出了在实施例1中分析的MASCT治疗组中肝细胞癌(B期)患者的特征、治疗和RECIST评价。
图9B示出了在诊断后1年期间接受多次MASCT治疗的肝细胞癌(B期)患者的特征、治疗和RECIST评价(对照组+MASCT，n＝15)。
图10A示出了实施例1中分析的对照组与MASCT治疗组之间的患者比较的总结。
图10B示出了回顾性分析中入选的肝细胞癌(B期)患者的特征。
图11A至图11F描绘了如实施例1中所述一次或多次MASCT治疗之后HCC患者中引发的免疫应答。图11A示出了4名患者在接受3次MASCT治疗之后PBMC中的TREG百分比显著下降。示出了4名患者的表达百分比和统计数值。图11B示出了取自接受MASCT治疗的7名不同HCC患者的PBMC样本中增殖性T细胞的百分比增量。图11C示出了取自接受MASCT治疗的7名不同HCC患者的PBMC样本中产INFγ细胞毒性T细胞(CD8+INFγ+)的百分比增量。图11D示出了取自接受MASCT治疗的HCC患者的PBMC样本的流式细胞术色谱图。这些结果指示产INFγ细胞毒性T细胞(CD8+INFγ+)共表达CD27和CD28，从而表明获得HCC特异性T细胞应答的免疫记忆的高潜能。图11E示出了取自3次MASCT治疗后的HCC患者的CD8+T细胞的IFNγ细胞内产量增加。PBMC分别分离自3次MASCT治疗之前和之后的患者以测量T细胞应答。图11F示出了T细胞的特异性增殖，其中T细胞在MASCT细胞疗法的多次治疗期间在患者体内连续增加。PBMC分别分离自1次和3次MASCT治疗之前和之后的患者。通过EdU(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)染色来测量2名患者的T细胞增殖。在图11B至图11F中，在用HCC抗原肽库(HCC-pep)刺激PBMC之后测量特异性T细胞应答。在用不相关肽库(ir-pep，对照)刺激PBMC之后测量对照应答。通过将特异性应答值归一化为对照应答值来计算所有倍数变化。
图12A至图12D示出了在实施例1中患者中对于HCC抗原肽的特异性免疫应答。经多次MASCT治疗之后的HCC患者中(图12A；n＝6)以及未接受任何MASCT治疗的HCC患者中(图12B；n＝5)对于单独HCC抗原肽的平均特异性免疫应答。图12C示出了在3次MASCT治疗之前(空心柱条)和之后(斜线条纹柱条)一名患者中对于每种HCC抗原肽的特异性免疫应答。图12D示出了在多次MASCT治疗期间(白色柱条：治疗之前；灰色：1次治疗之后；斜线条纹：3次治疗之后)另一名HCC患者中对于每种HCC抗原肽的特异性免疫应答的连续增强。通过ELISPOT计算用单独HCC抗原肽刺激的患者PBMC的IFNγ分泌。结果以与非刺激PBMC相比IFNγ分泌的平均值±SEM倍数变化表示。这些数值指示应答患者/总患者。较高的虚线指示1.5倍增量的截止值。W/O：未刺激。
图13A至图13D示出了接受7次MASCT治疗的转移性宫颈癌患者WJ的临床数据。图13A、图13B和图13D是在2013年12月(在任何MASCT治疗之前)、2014年6月(在10次局部放射疗法治疗、接着3次MASCT治疗之后)以及2014年12月(在总共7次MASCT治疗之后)得出的患者ECT结果。箭头和圆圈指出右骶髂关节骨上的转移部位，示出了对MASCT治疗作出响应而出现转移瘤缩小且无额外转移。图13C示出了在MASCT治疗之后对于宫颈癌抗原肽库(CCpep库)及该库中每种抗原肽的特异性免疫应答。PBMC分离自任何MASCT治疗之前及总共6次MASCT治疗之后的患者，并且用CC pep库及该库内的每种单独抗原肽进行刺激。每列表示MASCT治疗之后患者的PBMC对于每种抗原肽(或CC pep库)的免疫应答水平，如通过相对于MASCT治疗之前患者PBMC的对应应答而言IFNγ(Y轴)的倍数变化所测得的。W/O＝在未用任何抗原肽刺激的情况下的应答。ENV是指采用不相关肽的实验。虚线指示由IFNγ倍数变化测得的未升高的免疫应答的阈值。箭头指向由IFNγ倍数变化测得的引发升高的免疫应答的特异性抗原肽。
图14示出了实施例2中的患者治疗史的总结。
图15示出了用于制备活化T细胞的示例性实验计划的示意图。
图16A示出了使用抗PD-L1抗体和抗CD11c抗体得出的成熟树突细胞的FACS结果。图16B示出了在活化8天之前和之后取自四个不同供体的PBMC样本中的T细胞的PD-1表达水平。
图17A示出了在存在或不存在抗PD-1抗体(纳武单抗)的情况下，经1次或2次抗原肽刺激的共培养样本中肽特异性CD8+T细胞的百分比。图17B示出了在存在或不存在抗PD-1抗体的情况下，经1次或2次抗原肽刺激的共培养样本中功能性肽特异性CD8+T细胞的百分比。图17C示出了在存在或不存在抗PD-1抗体(SHR-1210或纳武单抗)的情况下，经1次或2次抗原肽刺激的共培养样本中肽特异性CD8+T细胞的百分比。图17D示出了在存在或不存在抗PD-1抗体(SHR-1210或纳武单抗)的情况下，经1次或2次抗原肽刺激的共培养样本中肽特异性CD8+T细胞的百分比。
图18示出了用于制备活化T细胞的示例性实验计划的示意图。
图19A示出了在存在或不存在抗PD-1抗体(SHR-1210或纳武单抗)的情况下，经1次抗原肽刺激并培养5天或10天的共培养样本中肽特异性CD8+T细胞的百分比。图19B示出了在存在或不存在抗PD-1抗体(SHR-1210或纳武单抗)的情况下，经1次抗原肽刺激并培养10天或者经2次抗原肽刺激并在第二次刺激之后培养5天的共培养样本中肽特异性CD8+T细胞的百分比。图19C示出了在存在或不存在抗PD-1抗体(SHR-1210或纳武单抗)的情况下，经1次抗原肽刺激并培养10天或者经2次抗原肽刺激并在第二次刺激之后培养5天的共培养样本中功能性肽特异性CD8+T细胞的百分比。
图20A至图20B示出了在存在或不存在抗PD-1抗体(SHR-1210或纳武单抗)的情况下，来自两个不同供体的PBMC的共培养物中随时间推移的总T细胞计数。
图21A至图21B示出了在存在或不存在抗PD-1抗体(SHR-1210或纳武单抗)的情况下，来自两个不同供体的PBMC的共培养物中随时间推移在细胞表面上表达PD-1的细胞的百分比。
图22示出了肿瘤样本中333种癌相关基因的下一代测序(NGS)的统计数据及实施例5的5名患者的临床评价。
图23A至图23B描绘了35份肿瘤样本的DMM分类分析。图23A描绘了最佳拟合分类组数。图23B描绘了35份肿瘤样本的DMM分类图。14份样本被聚类为DMM 1组(红色，在框A中)，并且21份样本被聚类为DMM 0组(绿色，在框B中)。
图24A至图24B描绘了基于每个样本中333种癌基因的突变负荷对35个肿瘤组织样本的聚类分析。图24A示出了基于在333种癌相关基因中每一者中检测到的突变负荷来聚类的35份肿瘤样本的热图，其中标记了癌临床类型、MMR缺陷类型(0：MMR缺陷型，1：MMR健全型)和DMM组。图24B示出了按照与图24A中匹配的相同顺序排序的每个样本的HLA-I基因突变负荷的条形图。黑线标记了HLA-I突变负荷中的6种突变。
图25A至图25B描绘了这两个DMM组内的每个肿瘤组织样本的HLA-I基因突变负荷的统计分析。
图26A至图26E描绘了5个时间点处患者3-HJL的CT扫描。图26A中的CT扫描示出了两个肺叶中的结节病，其中最大的一个具有2cm的直径。图26B示出了2个周期化学疗法之后相似的结节病。图26C示出了在4个周期化学疗法之后肺结节病没有改善。图26D中的CT扫描描绘了在3个周期PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940000161
)与MASCT的联合疗法之后肺结节病尺寸缩小约50％。图26E示出了5个周期PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940000162
)与MASCT的联合疗法之后结节病从两个肺叶消失。
图27A至图27D描绘了4个时间点处患者4-LKS的CT扫描。图27A中的CT扫描指示肿瘤尺寸为约3cm的脑转移瘤。图27B示出了放射疗法之后肿瘤萎缩。图27C中的CT扫描的复查指示肿瘤萎缩和缓解的脑水肿。图27D示出了肿瘤和水肿状态的进一步缓解。
图28示出了使用基于患者肿瘤样本的测序结果预测的新抗原肽以及基于HLA突变状态的预后而进行的示例性精确MASCT的概览流程图。
图29A示出了基于患者肿瘤样本的测序分析获得的患者的候选新抗原。图29B示出了在MASCT治疗之前和之后患者中的循环肿瘤细胞(CTC)的连续监测结果。图29C示出了在患者接受三个周期精确MASCT治疗之后用各种抗原肽攻击取自患者的PBMC得出的ELISPOT结果。
图30A示出了接受MASCT治疗的45名肝细胞癌(HCC)患者的临床特征。
图30B示出了在MASCT治疗之前和之后45名患者的血常规检查的结果。
图30C示出了在MASCT治疗之前和之后45名患者的肝肾功能参数。
图30D示出了在MASCT治疗之前及在5次MASCT治疗过程中8名HCC患者中的ALT和AST水平。
具体实施方式
本发明公开了新型基于细胞的免疫治疗方法，这些方法统称为多抗原特异性细胞疗法(MASCT)，它们可用于治疗多种癌，以及延迟个体中的癌的进展、预防个体中的癌的复发或转移和/或缓解个体中的癌的症状。在一些实施方案中，所述方法利用由负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞(DC)诱导的活化T细胞。T细胞和DC例如可来源于个体自身的外周血单核细胞(PBMC)。可通过使DC(诸如未成熟DC)暴露于包括普通肿瘤抗原肽和任选地癌类型特异性抗原肽的多种肿瘤抗原肽来制备多抗原负载的DC。可通过将T细胞群与多抗原负载的DC共培养来制备活化T细胞。任选地，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂接触。向个体施用活化T细胞，从而可在体内引发对于肿瘤抗原的过继免疫应答。任选地，可向个体施用多抗原负载的DC，以引起对于肿瘤抗原的主动免疫。另选地，提供基于PBMC的MASCT方法，所述方法包括施用活化PBMC。本文所述的任一MASCT方法可单独使用或与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1抑制剂)联合使用，以用于治疗个体中的癌。
本发明还提供了为正接受治疗的个体定制的精确MASCT治疗方法，诸如个体的肿瘤的遗传图谱。例如，可基于个体肿瘤中的突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行MASCT治疗。还可基于个体肿瘤中存在的新抗原数量来选择个体进行MASCT治疗。在一些情况下，可通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来鉴定一种或多种新抗原。新抗原肽可基于个体的新抗原来设计，并掺入到所述多种肿瘤抗原肽中以便向个体提供精确MASCT。在一些实施方案中，在MASCT治疗周期之后监测个体对于每种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答，从而允许基于特异性免疫应答的强度来定制所述多种肿瘤抗原肽以用于未来的MASCT治疗周期。另外，可在MASCT之后从个体克隆肿瘤特异性T细胞受体(TCR)，这些T细胞受体特异性地识别肿瘤抗原肽中的表位并引发强烈特异性免疫应答，它们可用于对个体进行进一步精确免疫疗法。
本文所提供的MASCT(包括基于PBMC的MASCT和精确MASCT)方法和组合物可减轻“背景技术”部分中讨论的此前癌免疫治疗方法所遇到的许多技术问题。例如，通过使DC体外暴露于肿瘤抗原肽库，不同于许多癌疫苗中或
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中的单种肿瘤抗原，大量肿瘤抗原由DC递呈，从而允许对于同一个体或不同个体内的不同抗原表达谱的肿瘤产生更广谱的应答，只要肿瘤共用所述库中的一种或多种特异性肿瘤抗原即可。肿瘤抗原肽库可进一步根据每个个体的具体情况诸如癌类型、病毒感染状态以及对个体抗原肽的应答进行定制，从而在每次治疗中实现最佳疗效。与癌疫苗和基于DC的疗法不同，MASCT治疗方法包括施用活化T细胞，绕过此前免疫疗法的体内T细胞诱导步骤，这通常与因肿瘤细胞造成各种免疫缺陷而使癌患者体内的应答减弱有关；因此，MASCT方法可引发对于癌细胞的强烈、快速且特异性的T细胞应答。此外，活化T细胞具有非常低的TREG水平和PD-1表达，这降低了对癌攻击性T细胞的免疫抑制，从而延迟癌免疫逃避。综上，本发明提供了有效、持久且应用广泛的癌免疫治疗方法，以满足癌患者尚未得到满足的巨大医疗需求，尤其是当前的医护标准治疗无效或不可用时。
定义
除非如下另行定义，否则本文中的术语按照本领域通常所用的方式使用。
如本文所用，“治疗”是用于获得有益或所需的结果(包括临床结果)的方法。对于本发明而言，有益或所需的临床结果包括但不限于下列的一者或多者：减轻由疾病引起的一种或多种症状、削弱疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)、预防或延迟疾病的发生或复发、延迟或延缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(不论是部分还是完全)、降低治疗该疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、提高生活质量和/或延长生存期。“治疗”还涵盖减轻癌的病理后果。本发明的方法设想了这些治疗方面中的任何一者或多者。
术语“个体”或“患者”在本文作为同义词使用，用于描述哺乳动物，包括人类。个体包括但不限于人类、牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、啮齿动物或灵长类。在一些实施方案中，个体是人类。在一些实施方案中，个体罹患疾病，诸如癌。在一些实施方案中，个体需要治疗。
如本文所用，“延迟”癌的发展意指推迟、阻碍、延缓、减慢、稳定和/或延后疾病的发展。该延迟可具有不同的时长，这取决于该疾病的病史和/或正接受治疗的个体。如对于本领域技术人员而言显而易见的，充分的或显著的延迟实际上可涵盖预防，在这种情况下个体不患该疾病。“延迟”癌发展的方法是这样的方法：当与不使用该方法相比时，该方法在给定时间范围内减小疾病发展的可能性并/或在给定时间范围内降低疾病的程度。此类比较通常依据使用统计上显著的个体数量的临床研究。癌发展可使用标准方法检测，这些标准方法包括但不限于计算机轴向断层扫描(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血测试、动脉造影术或活检。发展还可指可能初始无法检测的癌进展，并包括发生、复发和发作。
如本领域所理解，“有效量”是指足以产生所需治疗结果(例如，降低癌的严重程度或持续时间、稳定癌的严重程度或消除癌的一种或多种症状)的组合物(例如，多抗原负载的DC、活化T细胞、活化PMBC或分离的T细胞)、第一疗法、第二疗法或联合疗法的量。对于治疗用途而言，有益或所需的结果包括例如：减轻由疾病引起的一种或多种症状(生化、组织学和/或行为)，包括在疾病发展期间出现的其并发症和中间病理表型；提高罹患疾病的个体的生活质量；降低治疗疾病所需的其他药物的剂量；增强另一种药物的疗效；延迟疾病的进展；和/或延长患者的生存期。
所述方法可在辅助环境(adjuvant setting)中实践。“辅助环境”是指这样的临床环境：其中个体具有增殖性疾病(特别是癌)的病史，并且一般(但不一定)对疗法有应答，所述疗法包括但不限于外科手术(诸如手术切除)、放射疗法和化学疗法。然而，由于他们具有增殖性疾病(诸如癌)的病史，这些个体被视为有疾病发展的风险。“辅助环境”中的治疗或施用是指后续的治疗模式。风险程度(即，当辅助环境中的个体被视为“高风险”或“低风险”时)取决于若干因素，最通常取决于首次治疗时疾病的程度。
本文提供的方法还可在“新辅助环境(neoadjuvant setting)”中实践，即，该方法可在初始/确定性治疗之前实施。在一些实施方案中，个体此前曾接受治疗。在一些实施方案中，个体此前未接受治疗。在一些实施方案中，治疗是一线治疗。
如本文所用，所谓“联合疗法”意指第一药剂与另一种药剂联合施用。“联合”是指除另一种治疗模式之外还施用一种治疗模式，诸如除了向同一个体施用另一种药剂(诸如免疫检查点抑制剂)之外还施用本文所述的活化T细胞或PBMC。因此，“联合”是指在向个体递送另一种治疗模式之前、期间或之后施用一种治疗模式。此类组合被视为单一治疗方案或决策的一部分。
如本文所用，术语“同时施用”意指联合疗法中的第一疗法和第二疗法以不超过约15分钟(诸如不超过约10、5或1分钟中的任一者)的时间间隔施用。当第一疗法和第二疗法同时施用时，第一疗法和第二疗法可包含在同一组合物(例如，包含第一疗法和第二疗法的组合物)中或包含在单独组合物中(例如，第一疗法包含在一种组合物中，而第二疗法包含在另一种组合物中)。
如本文所用，术语“顺序施用”意指联合疗法中的第一疗法和第二疗法以超过约15分钟(诸如超过约20、30、40、50、60或更多分钟中的任一者)的时间间隔施用。可首先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法包含在单独组合物中，这些单独组合物可包含在同一或不同包装或试剂盒中。
如本文所用，术语“并行施用”意指联合疗法中的第一疗法的施用和第二疗法的施用彼此重合。
如本文所用，所谓“药学上可接受的”或“药学上相容的”意指不是生物学或其他方面不合需要的材料，例如，该材料可掺入到向个体施用的药物组合物中而不会造成任何明显的不良生物效应或以有害方式与含有该材料的组合物的任何其他组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选地已符合所要求的毒理学和生产测试的标准，并/或在美国食品与药品管理局制定的Inactive Ingredient Guide(非活性成分指南)中列出。
如本文所用，“不良事件”或“AE”是指个体接受市售药品后或者参与临床试验的个体接受试验或非试验药剂后所发生的任何不利医学事件。AE不一定与个体的治疗有因果关系。因此，AE可以是与药品的使用临时相关联的任何不利且非预期的体征、症状或疾病，而不论它们是否被认为与该药品有关。AE包括但不限于：既往疾病的恶化；既往发作事件或病症的频率或强度的增加；在研究药物施用之后检出或确诊的病症，即使该病症在研究开始之前就已存在；以及在基线状态下存在且在研究开始后恶化的持续迁延性疾病或症状。AE一般不包括：医疗或外科程序(例如，外科手术、内窥镜检查、拔牙或输液)；但是，引起该程序的病症是不良事件；在研究开始时存在或检出的未恶化的既往疾病、病症或实验室异常；出于非与不利医学事件相关的选择性目的而采取的住院治疗或程序(例如，整容或选择性外科手术的住院治疗或者社会照顾/便利需求的入院)；所研究的疾病或与该疾病相关的体征/症状，除非个体的病症比预期更严重；以及研究药物过量，但无任何临床体征或症状。
如本文所用，“严重不良事件”或(SAE)是指任何剂量下的任何不利医学事件，包括但不限于：a)致命的；b)危及生命的(被定义为该事件发生时会引起即时死亡风险)；c)导致永久或重度残废或丧失活动能力；d)需要住院治疗或延长现有住院治疗(例外：在研究期间未恶化的既往病症的选择性治疗的住院治疗不视为不良事件。在住院治疗期间发生的并发症是AE，并且如果并发症延长住院治疗，则该事件是严重的)；e)接受药物治疗的个体的后代出现先天性异常/出生缺陷；或f)未包括在上述定义中但可危害个体或可需要干预以预防上列结果之一的病症，除非与个体的基础疾病明确相关。“缺乏疗效”(疾病进展)不视为AE或SAE。由缺乏疗效引起的体征和症状或临床后遗症在符合AE或SAE定义时应报告。
可使用以下定义，基于目标病灶来评价应答：“完全应答”或“CR”是指所有目标病灶消失；“部分应答”或“PR”是指以基线最长直径总和(SLD)为参照，目标病灶SLD减小至少30％；“疾病稳定”或“SD”是指以开始治疗以来的最小SLD为参照，目标病灶既没有可定性为PR的足够缩小也没有可定性为PD的足够增加；并且“疾病进展”或“PD”是指以开始治疗以来所记录的最小SLD为参照，目标病灶的SLD增加至少20％或者出现一个或多个新病灶。
以下应答评估的定义可用于评价非目标病灶：“完全应答”或“CR”是指所有非目标病灶消失；“疾病稳定”或“SD”是指未定性为CR或PD的一个或多个非目标病灶的存留；并且“疾病进展”或“PD”是指一个或多个现有非目标病灶的“明确进展”或一个或多个新病灶的出现被视为疾病进展(如果仅仅基于一个或多个非目标病灶的进展在特定时间点评估个体的PD，则需要符合额外的标准)。
“无进展生存期”(PFS)指示在治疗期间和之后癌未生长的时长。无进展生存期包括个体经历完全应答或部分应答的时间量，以及个体经历疾病稳定的时间量。
“预测”在本文用来指个体可能有利地或不利地对治疗方案作出应答的可能性。
如本文所用，“在开始治疗时”或“基线”是指在首次暴露于治疗时或之前的时间段。
如本文所用，“样本”是指包含要表征和/或鉴定(例如基于物理、生化、化学、生理和/或遗传特征)的分子的组合物。
如本文所用，“细胞”应理解为不仅是指特定单独细胞，还指这种细胞的子代或潜在子代。因突变或环境影响，某些修饰可能在后续的世代中出现，因此这种子代实际上可能不与其亲本细胞相同，但仍然被包括在本文所用的该术语的范围内。
术语“肽”是指不超过约100个氨基酸的氨基酸聚合物(包括蛋白的片段)，该聚合物可以是直链或支链的，可以包含经修饰的氨基酸，并/或可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖天然或人为修饰过的氨基酸聚合物，包括例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰。还包括在该术语内的是，例如，包含氨基酸的一个或多个类似物(包括，例如非天然氨基酸等)及本领域所知的其他修饰的多肽。本文所述的肽可天然存在，即获自或来源于天然来源(例如，血液)，或可为合成的(例如，化学合成的或通过重组DNA技术合成的)。
如本文所用，“多种肿瘤抗原肽”、“多肿瘤抗原肽”、“肿瘤抗原肽的库”和“肿瘤抗原肽库”可互换使用，是指超过一种肿瘤抗原肽的组合。
如本文所用，“负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞”和“多抗原负载的树突细胞”可互换使用，是指已增强所述多种肿瘤抗原肽之中超过一种肿瘤抗原肽的递呈的树突细胞。同样，“负载有多种肿瘤抗原肽的APC”可与“多抗原负载的APC”互换使用，是指已增强所述多种肿瘤抗原肽之中超过一种肿瘤抗原肽的递呈的抗原加工细胞。
如本文所用，“活化T细胞”是指具有识别至少一种肿瘤抗原肽的T细胞受体的单克隆(例如，编码同一TCR)或多克隆(例如，其中克隆编码不同TCR)T细胞群。活化T细胞可包含T细胞的一种或多种亚型，包括但不限于细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞、γδT细胞、调节性T细胞和记忆T细胞。
如本文所用，“免疫检查点抑制剂”是指抑制或阻断免疫细胞(诸如T细胞或PBMC)或肿瘤细胞上的抑制性免疫检查点分子的分子或试剂(包括抗体)。“免疫检查点分子”包括针对肿瘤细胞上调免疫信号的分子(即，“共刺激分子”)或下调免疫信号的分子(即，“抑制性免疫检查点分子”)。
如本文所用，“突变负荷”是指在细胞(诸如肿瘤细胞)基因组中的一个或多个基因座(诸如基因)处累积的突变总数。这些突变包括但不限于点突变、插入、缺失、移码突变、基因融合和拷贝数变异。这些突变可能会或可能不会不利地影响由该基因座编码的产物的物理/化学特性和/或功能。
如本文所用，“T细胞受体”或“TCR”是指包含细胞外抗原结合结构域的内源或经工程改造的T细胞受体，该细胞外抗原结合结构域结合于MHC分子中界定的特异性抗原表位。TCR可包含TCRα多肽链和TCRβ多肽链。“肿瘤特异性TCR”是指特异性地识别由肿瘤细胞表达的肿瘤抗原的TCR。
如本文所用，术语“HLA”或“人类白细胞抗原”是指编码细胞表面上负责免疫系统调控的MHC(主要组织相容性复合体)蛋白的人类基因。“HLA-I”或“HLA I类”是指人类MHC I类基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G和β2-微球蛋白基因座。“HLA-II”或“HLA II类”是指人类MHC II类基因，包括HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA1、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DM、HLA-DOA和HLA-DOB基因座。
本文所用的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区。在一些实施方案中，本文所述的抗体片段是抗原结合片段。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“特异性地结合于”、“识别”、“特异性地识别”、“靶向”或“对…具有特异性”是指可测量且可重现的相互作用，诸如靶标与抗体、受体与配体或者受体与表位/MHC复合体之间的结合，这可在存在包括生物分子的分子异质群体的情况下确定靶标的存在。例如，结合于或特异性地结合于靶标(其可以是表位)的抗体是与该靶标结合比与其他靶标结合具有更大亲和力(affinity)、亲合力(avidity)、更加容易和/或持续时间更长的抗体。在一个实施方案中，如例如通过放射免疫测定法(RIA)测得，抗体与无关靶标的结合程度小于抗体与靶标的结合的约10％。在某些实施方案中，特异性地结合于抗原肽(或表位)的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性地结合于蛋白上的表位，该表位在不同物种的该蛋白之中是保守的。在另一个实施方案中，特异性结合可包括但不要求专一性结合。
应当理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“由方面和实施方案组成”和/或“基本上由方面和实施方案组成”。
本文提及“约”某个值或参数包括(并描述)指向该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文所用，提及“不”为某个值或参数一般意指并描述“除某值或参数以外”。例如，该方法不用于治疗X类型的癌意指该方法用于治疗除X以外的类型的癌。
如本文及所附权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个(种)”、“或”和“该”包括多个指代物。
MASCT方法
本发明提供了治疗个体中的癌的基于细胞的免疫治疗方法，统称为多抗原特异性细胞疗法(MASCT)。所述方法利用负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC，诸如树突细胞)，以及由多抗原负载的APC诱导的活化T细胞。多抗原负载的APC和活化T细胞两者能够在体内和离体引发肿瘤抗原特异性T细胞应答，包括细胞毒性T细胞和辅助T细胞的应答，以及通过记忆T细胞产生免疫记忆。因此，在MASCT方法的各种实施方案中，可向个体施用多抗原负载的APC(诸如树突细胞)、活化T细胞、APC与T细胞(包括活化PBMC)的共培养物，或它们的任意组合，以治疗癌或肿瘤病症，或预防肿瘤复发、进展或转移。
本发明在一个方面提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞和抗原递呈细胞群来自同一个体。在一些实施方案中，活化T细胞和/或抗原递呈细胞群来自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，抗原递呈细胞群是树突细胞、B细胞或巨噬细胞的群体。在一些实施方案中，抗原递呈细胞是树突细胞。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养来制备活化T细胞，并且其中该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，抗原递呈细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，抗原递呈细胞经皮下施用。在一些实施方案中，抗原递呈细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞和抗原递呈细胞群来自同一个体。在一些实施方案中，活化T细胞和/或抗原递呈细胞群来自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，抗原递呈细胞群是树突细胞、B细胞或巨噬细胞的群体。在一些实施方案中，抗原递呈细胞是树突细胞。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)；以及(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，抗原递呈细胞在活化T细胞施用之前约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)施用。在一些实施方案中，抗原递呈细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞和抗原递呈细胞群来自同一个体。在一些实施方案中，活化T细胞和/或抗原递呈细胞群来自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，抗原递呈细胞群是树突细胞、B细胞或巨噬细胞的群体。在一些实施方案中，抗原递呈细胞是树突细胞。
任何合适的抗原递呈细胞可用于MASCT方法，包括但不限于树突细胞、B细胞和巨噬细胞。在一些实施方案中，抗原递呈细胞是树突细胞。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，通过在施用之前将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞和树突细胞群来自同一个体。在一些实施方案中，活化T细胞和/或树突细胞群来自正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞，并且其中该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，树突细胞在活化T细胞施用之前约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞和树突细胞群来自同一个体。在一些实施方案中，活化T细胞和/或树突细胞群来自正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；以及(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，树突细胞在活化T细胞施用之前约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞和树突细胞群来自同一个体。在一些实施方案中，活化T细胞和/或树突细胞群来自正接受治疗的个体。
除了一个或多个施用步骤之外，MASCT方法的一些实施方案还包括以下细胞制备步骤中的一者或两者：1)制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群；以及2)制备活化T细胞。在一些实施方案中，通过在施用之前将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天、约14天或约21天)。在一些实施方案中，通过使抗原递呈细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞群。在一些实施方案中，在存在有利于抗原递呈细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使抗原递呈细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，在共培养之前使T细胞群与免疫检查点抑制剂接触。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂的情况下，将T细胞群与抗原递呈细胞群共培养。在一些实施方案中，T细胞群和抗原递呈细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群和抗原递呈细胞群来源于正接受治疗的个体。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)将负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群共培养以获得活化T细胞群；以及(b)向个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天、约14天或约21天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)将负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群共培养以获得活化T细胞群；以及(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(b)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群共培养以获得活化T细胞群；以及(c)向个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约10天、约10天至约15天、约15天至约21天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)制备负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(b)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群共培养以获得活化T细胞群；以及(c)向个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)制备负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(b)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群共培养以获得活化T细胞群；以及(c)向个体施用有效量的活化T细胞，其中该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)制备负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(b)向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(c)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群共培养以获得活化T细胞群；以及(d)向个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群获得；以及(d)向个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，PBMC群来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(d)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群获得，并且其中该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，PBMC群和/或树突细胞群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(e)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群获得。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
本文所述的方法适用于治疗各种癌，诸如本文所述的癌，包括选自以下各项的癌：肝细胞癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、淋巴瘤、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑素瘤以及脑癌。所述方法适用于所有阶段的癌，包括早期、晚期和转移癌。在一些实施方案中，癌是实体瘤。在一些实施方案中，癌是液体癌。
在一些实施方案中，与治疗之前同一个体中的对应症状相比或者与未接受该治疗方法的其他个体中的对应症状相比，该方法将与癌相关的一种或多种症状的严重程度降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一百分比。在一些实施方案中，该方法延迟癌的进展。
可通过本文所述方法治疗的癌的示例包括但不限于肾上腺皮质癌、特发性髓样化生、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤(例如，小脑和大脑)、基底细胞癌、胆管癌(例如，肝外)、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑瘤(例如，胶质瘤、脑干胶质瘤、小脑或大脑星形细胞瘤(例如，毛细胞型星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性(恶性)星形细胞瘤)、恶性胶质瘤、室管膜瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视路和下丘脑胶质瘤以及胶质母细胞瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤(例如，胃肠道类癌肿瘤)、原发灶不明转移癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、慢性骨髓增生性疾病、子宫内膜癌(例如，子宫癌)、室管膜瘤、食道癌、尤文氏家族肿瘤、眼癌(例如，眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤(例如，颅外、性腺外、卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、肝细胞(肝)癌(例如，肝癌(hepatic carcinoma)和肝癌(heptoma))、下咽癌、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、喉癌、喉癌、白血病(除T细胞白血病之外)、唇和口腔癌(lip and oralcavity cancer)、口腔癌(oral cancer)、肝癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、淋巴瘤(除T细胞淋巴瘤之外)、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口腔癌(mouth cancer)、多发性内分泌腺瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、口咽癌、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤)、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(小胶质瘤)、肺淋巴管肌瘤病、直肠癌、肾癌、肾盂和输尿管癌(移行细胞癌)、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌(例如，非黑素瘤(例如，鳞状细胞癌)、黑素瘤和梅克尔细胞癌)、小肠癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、结节性硬化、尿道癌、阴道癌、外阴癌、维尔姆斯瘤、与瘢痣病相关的异常血管增生、水肿(诸如与脑肿瘤相关)以及梅格斯综合征。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的肝细胞癌(HCC)的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，该方法还包括在活化T细胞施用之前向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，HCC是早期HCC、非转移性HCC、原发性HCC、晚期HCC、局部晚期HCC、转移性HCC、缓解期HCC或复发性HCC。在一些实施方案中，HCC是局限性可切除的(即，局限于肝中允许手术完全切除的部分的肿瘤)、局限性不可切除的(即，局限性肿瘤可能不可切除，因为涉及到重要的血管结构或因为肝受损)或不可切除的(即，肿瘤累及所有肝叶并/或已扩散而累及其他器官(例如，肺、淋巴结、骨)。在一些实施方案中，根据TNM分类，HCC是I期肿瘤(无血管侵犯的单发肿瘤)、II期肿瘤(有血管侵犯的单发肿瘤或多发肿瘤，全都不大于5cm)、III期肿瘤(任一肿瘤均大于5cm的多发肿瘤，或累及门静脉或肝静脉主分支的肿瘤)、IV期肿瘤(直接侵犯胆囊以外的相邻器官或腹膜脏层穿孔的肿瘤)、N1肿瘤(区域淋巴结转移)或M1肿瘤(远处转移)。在一些实施方案中，根据AJCC(美国癌症联合委员会)分期标准，HCC是Tl、T2、T3或T4期HCC。在一些实施方案中，HCC是肝细胞癌、HCC纤维板层样变体和混合型肝细胞癌-胆管细胞癌中的任何一者。在一些实施方案中，HCC由乙肝病毒(HBV)感染引起。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的肺癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，该方法还包括在活化T细胞施用之前向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。NCSLC的示例包括但不限于大细胞癌(例如，大细胞神经内分泌癌、复合性大细胞神经内分泌癌、基底细胞样癌、淋巴上皮瘤样癌、透明细胞癌以及大细胞癌伴横纹肌样表型)、腺癌(例如，腺泡样、乳头状(例如，细支气管肺泡癌、非粘液性、粘液性、混合性粘液性及非粘液性以及未定类细胞类型)、实性腺癌伴有粘液、腺癌伴混合性亚型、高分化胎儿型腺癌、粘液性(胶质样)腺癌、粘液性囊腺癌、印戒腺癌和透明细胞腺癌)、肺神经内分泌肿瘤以及鳞状细胞癌(例如，乳头状、透明细胞、小细胞和基底细胞样)。在一些实施方案中，根据TNM分类，NSCLC可为T期肿瘤(原发性肿瘤)、N期肿瘤(区域淋巴结)或M期肿瘤(远处转移)。
在一些实施方案中，肺癌是类癌瘤(典型或非典型)、腺鳞癌、圆柱瘤或唾液腺癌(例如，腺样囊性癌或粘液表皮样癌)。在一些实施方案中，肺癌是具有多形性、肉瘤样或肉瘤成分的癌(例如，具有梭形和/或巨细胞的癌、梭形细胞癌、巨细胞癌、癌肉瘤或肺母细胞瘤)。在一些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌(SCLC；也称为燕麦细胞癌)。小细胞肺癌可为局限期、广泛期或复发性小细胞肺癌。在一些实施方案中，个体可为具有疑似或被证明与肺癌相关的基因、遗传突变或多态性(例如，SASH1、LATS1、IGF2R、PARK2、KRAS、PTEN、Kras2、Krag、Pas1、ERCC1、XPD、IL8RA、EGFR、α1-AD、EPHX、MMP1、MMP2、MMP3、MMP12、IL1β、RAS和/或AKT)或者具有与肺癌相关的基因的一个或多个额外拷贝的人类。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的宫颈癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，该方法还包括在活化T细胞施用之前向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，宫颈癌是早期宫颈癌、非转移性宫颈癌、局部晚期宫颈癌、转移性宫颈癌、缓解期宫颈癌、不可切除宫颈癌、辅助环境中的宫颈癌或新辅助环境中的宫颈癌。在一些实施方案中，宫颈癌由人类乳头瘤病毒(HPV)感染引起。在一些实施方案中，根据TNM分类，宫颈癌可为T期肿瘤(原发性肿瘤)、N期肿瘤(区域淋巴结)或M期肿瘤(远处转移)。在一些实施方案中，宫颈癌是0期、I期(Tis、N0、M0)、IA期(T1a、N0、M0)、IB期(T1b、N0、M0)、IIA期(T2a、N0、M0)、IIB期(T2b、N0、M0)、IIIA期(T3a、N0、M0)、IIIB期(T3b、N0、M0，或T1-3、N1、M0)、IVA期(T4、N0、M0)或IVB期(T1-T3、N0-N1、M1)宫颈癌中的任一者。在一些实施方案中，宫颈癌是宫颈鳞状细胞癌、宫颈腺癌或腺鳞癌。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的乳腺癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，该方法还包括在活化T细胞施用之前向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，乳腺癌是早期乳腺癌、非转移性乳腺癌、局部晚期乳腺癌、转移性乳腺癌、激素受体阳性转移性乳腺癌、缓解期乳腺癌、辅助环境中的乳腺癌、导管原位癌(DCIS)、浸润性导管癌(IDC)或新辅助环境中的乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌是激素受体阳性转移性乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌(可为HER2阳性或HER2阴性)是晚期乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌是导管原位癌。在一些实施方案中，个体可为具有与乳腺癌相关的基因、遗传突变或多态性(例如，BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、RAD51、AR、DIRAS3、ERBB2、TP53、AKT、PTEN和/或PI3K)或者具有与乳腺癌相关的基因的一个或多个额外拷贝(例如，HER2基因的一个或多个额外拷贝)的人类。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的胰腺癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，该方法还包括在活化T细胞施用之前向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，胰腺癌包括但不限于浆液性微囊性腺瘤、导管内乳头状粘液瘤、粘液性囊性肿瘤、实性假乳头状肿瘤、胰腺癌、胰腺导管癌或胰母细胞瘤。在一些实施方案中，胰腺癌是早期胰腺癌、非转移性胰腺癌、原发性胰腺癌、切除后胰腺癌、晚期胰腺癌、局部晚期胰腺癌、转移性胰腺癌、不可切除胰腺癌、缓解期胰腺癌、复发性胰腺癌、辅助环境中的胰腺癌或新辅助环境中的胰腺癌中的任一者。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的卵巢癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，该方法还包括在活化T细胞施用之前向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，卵巢癌是卵巢上皮癌。示例性卵巢上皮癌组织学分类包括：浆液性囊瘤(例如，浆液性良性囊腺瘤、存在上皮细胞增殖活性和核异常但没有浸润性的破坏性生长的浆液性囊腺瘤，或浆液性囊腺癌)、粘液性囊瘤(例如，粘液性良性囊腺瘤、存在上皮细胞增殖活性和核异常但没有浸润性的破坏性生长的粘液性囊腺瘤，或粘液性囊腺癌)、子宫内膜样肿瘤(例如，子宫内膜样良性囊肿、存在上皮细胞增殖活性和核异常但没有浸润性的破坏性生长的子宫内膜样肿瘤，或子宫内膜样腺癌)、透明细胞(中肾样)肿瘤(例如，良性透明细胞瘤、存在上皮细胞增殖活性和核异常但没有浸润性的破坏性生长的透明细胞瘤，或透明细胞囊腺癌)、无法归入上述组之一的未分类肿瘤，或其他恶性肿瘤。在各种实施方案中，卵巢上皮癌是I期(例如，IA、IB或IC期)、II期(例如，IIA、IIB或IIC期)、III期(例如，IIIA、IIIB或IIIC期)或IV期。在一些实施方案中，个体可为具有与卵巢癌相关的基因、遗传突变或多态性(例如，BRCA1或BRCA2)或者具有与卵巢癌相关的基因的一个或多个额外拷贝(例如，HER2基因的一个或多个额外拷贝)的人类。在一些实施方案中，卵巢癌是卵巢生殖细胞瘤。示例性组织学亚型包括无性细胞瘤或其他生殖细胞瘤(例如，内胚窦瘤，诸如肝样或肠肿瘤、胚胎性癌、多胚瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤或混合形式肿瘤)。示例性畸胎瘤是未成熟畸胎瘤、成熟畸胎瘤、实体畸胎瘤和囊性畸胎瘤(例如，皮样囊肿，诸如成熟囊性畸胎瘤，和具有恶性转化的皮样囊肿)。一些畸胎瘤是单胚层且高度特化，诸如卵巢甲状腺肿、类癌瘤、卵巢甲状腺肿和类癌瘤或其他(例如，恶性神经外胚层和室管膜瘤)。在一些实施方案中，卵巢生殖细胞瘤是I期(例如，IA、IB或IC期)、II期(例如，IIA、IIB或IIC期)、III期(例如，IIIA、IIIB或IIIC期)或IV期。
在一些实施方案中，本文所述的MASCT方法不适用于患有T细胞起源的癌(诸如T细胞淋巴瘤)的患者。
若干病毒与人类中的癌相关。例如，乙肝病毒(HBV)可造成慢性肝感染，从而增大个体患上肝癌或肝细胞癌(HCC)的机会。人类乳头瘤病毒(HPV)是有超过150种相关病毒的组，它们在感染皮肤或粘膜(诸如口腔、咽喉或阴道)并在其中生长时会造成乳头瘤或疣。已知若干种类型的HPV(包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和6型)会造成宫颈癌。HPV还在诱导或造成生殖器其他癌中起到一定作用，并且与口腔和咽喉的一些癌有关。EB病毒(EBV)是一种能长期感染B淋巴细胞并在B淋巴细胞中保持潜伏的疱疹病毒。EBV感染增大了个体患上鼻咽癌和某些类型生长迅速的淋巴瘤(诸如伯基特淋巴瘤)的风险。EBV还与霍奇金淋巴瘤和一些胃癌病例有关。除了造成癌或增大患上癌的风险之外，病毒感染诸如HBV、HPV和EBV感染还可导致组织或器官损伤，这可增加罹患癌的个体的疾病负担并促使癌进展。
本领域已知的是，可诱导人体对若干癌相关病毒(诸如HBV、HPV和EBV，包括它们的各种亚型)产生有效且特异性的免疫应答，包括细胞毒性T细胞应答。因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的病毒相关癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，病毒是HBV、HPV或EBV。在一些实施方案中，癌是HBV相关的肝细胞癌、HPV相关的宫颈癌或EBV相关的鼻咽癌。
本文所述的方法可用于以下目的中的任何一者或多者：缓解癌的一种或多种症状，延迟癌的进展，缩小癌肿瘤尺寸，破坏(诸如摧毁)癌间质，抑制癌肿瘤生长，延长总生存期，延长无病生存期，延长癌疾病进展时间，预防或延迟癌肿瘤转移，减轻(诸如根除)既往癌肿瘤转移，降低既往癌肿瘤转移的发病率或负担，预防癌的复发，和/或改善癌的临床受益。
APC、T细胞和肿瘤抗原肽
在一些实施方案中，本文所述的方法使用抗原递呈细胞(APC)和活化T细胞。APC是能够活化T细胞的免疫系统细胞。APC包括但不限于某些巨噬细胞、B细胞和树突细胞(DC)。树突细胞是存在于淋巴或非淋巴组织中的形态相似的细胞类型的多样性群体的成员。这些细胞的特征在于它们的独特形态以及表面I类和II类MHC分子的高表达水平，这些MHC分子是将抗原肽递呈到T细胞的蛋白。DC、其他APC和T细胞可分离自或来源于(诸如分化于)多种组织来源，便利的是外周血，诸如来源于外周血的外周血单核细胞(PBMC)。
T细胞或T淋巴细胞在细胞介导免疫中起到重要作用。活化T细胞的每个克隆在表面上表达独特的T细胞受体(TCR)，该受体负责识别与APC上和靶细胞(诸如癌细胞)上的MHC分子结合的抗原。T细胞细分成若干类型，每种类型表达表面蛋白的独特组合且每种类型具有独特功能。
细胞毒性T细胞(TC)参与对肿瘤细胞和其他被感染细胞(诸如被病毒感染的细胞)的免疫应答和破坏。一般来讲，TC细胞通过识别APC或任何靶细胞上I类MHC递呈的抗原来发挥作用。TCR的刺激连同共刺激因子(例如，与APC上的B7结合的T细胞上的CD28，或由辅助T细胞进行的刺激)一起引起TC细胞的活化。然后，活化的TC细胞可增殖并释放细胞毒素，从而摧毁APC或靶细胞(诸如癌细胞)。成熟TC细胞一般表达表面蛋白CD3和CD8。细胞毒性T细胞属于CD3+CD8+T细胞。
辅助T细胞(TH)是通过释放T细胞细胞因子来促进其他免疫细胞活性的T细胞，这些T细胞细胞因子可调节或抑制免疫应答、诱导细胞毒性T细胞并且最大化巨噬细胞的细胞杀伤活性。一般来讲，TH细胞通过识别APC上II类MHC递呈的抗原来发挥作用。成熟TH细胞表达表面蛋白CD3和CD4。辅助T细胞属于CD3+CD4+T细胞。
自然杀伤(NK)T细胞是共同具有T细胞和自然杀伤细胞两者的特性的T细胞异质组。NK T细胞的活化引起促炎性细胞因子、趋化因子和细胞因子的产生。它们表达CD56，这是常表达于自然杀伤细胞上的表面分子。NK T细胞属于CD3+CD56+T细胞。
调节性T细胞(TREG细胞)一般通过提升对自身抗原的耐受性来调节免疫系统，从而限制自身免疫活性。在癌免疫疗法中，TREG促使癌细胞逃避免疫应答。TREG细胞一般表达CD3、CD4、CD7、CD25、CTLA4、GITR、GARP、FOXP3和/或LAP。CD4+CD25+Foxp3+T细胞是一类TREG细胞。
记忆T细胞(Tm)是此前已遇到其特异性抗原并作出应答的T细胞或从活化T细胞分化的T细胞。虽然肿瘤特异性Tm占总T细胞量的较小比例，但它们在人的整个生命期中起着监视肿瘤细胞的关键功能。如果肿瘤特异性Tm遇到表达其特异性肿瘤抗原的肿瘤细胞，则Tm立即活化并克隆扩增。活化并扩增的T细胞分化为效应T细胞以高效地杀伤肿瘤细胞。记忆T细胞对于确立并维持T细胞的长期肿瘤抗原特异性应答很重要。
通常，T细胞的抗原是可被T细胞受体(TCR)识别而引发特异性T细胞应答的蛋白分子或蛋白分子的线性片段。抗原可来源于外源(诸如病毒编码的蛋白)或内源(诸如在细胞内或细胞表面上表达的蛋白)。直接参与与特定TCR的相互作用的抗原的最小片段被称为表位。单种抗原中可存在多种表位，其中每种表位被T细胞的特定克隆所编码的独特TCR识别。
为了被TCR识别，抗原肽或抗原片段可由APC(诸如树突细胞)加工成表位，然后以伸展构象结合于主要组织相容性(MHC)分子内，从而在APC(诸如树突细胞)的表面上形成MHC-肽复合体。人类中的MHC分子也称为人类白细胞抗原(HLA)。MHC提供增大的结合表面以实现TCR与表位之间的强缔合，而表位内的独特氨基酸残基的组合确保TCR与表位之间的相互作用的特异性。基于其结构特征、尤其是结合于对应MHC复合体内的表位的长度，将人类MHC分子分类为两种类型—MHC I类和MHC II类。MHC-I表位是结合于MHC I类分子并由该分子代表的表位。MHC-II表位是结合于MHC II类分子并由该分子代表的表位。MHC-I表位通常为约8至约11个氨基酸长，而MHC-II表位为约13至约17个氨基酸长。由于遗传多态性，在人群之中MHC I类和MHC II类分子存在各种亚型。对APC或靶细胞上的MHC I类或MHC II类分子所递呈的特异性抗原肽作出的T细胞应答称为MHC限制性T细胞应答。
肿瘤抗原肽来源于在癌细胞中过表达、但在正常细胞中具有很少乃至没有表达水平(诸如小于约10、100、1000或5000个拷贝/细胞中的任一水平)的肿瘤抗原蛋白(本文也称为“肿瘤抗原”)。一些肿瘤抗原肽来源于肿瘤特异性抗原(TSA)、分化抗原或过表达的抗原(也称为肿瘤相关抗原或TAA)。一些肿瘤抗原肽来源于仅存在于癌细胞中而不存在于正常细胞中的突变体蛋白抗原。
树突细胞的抗原负载
本发明提供了制备负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群的方法，所述树突细胞群可用于引发个体中的MHC限制性T细胞应答，该方法包括使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触。由该方法制备的树突细胞可用于本文所述的MASCT方法的任何实施方案中，或可用于制备活化T细胞或者树突细胞与T细胞的共培养物，如下一章节中所述。
在制备多抗原负载的树突细胞的方法的一些实施方案中，使树突细胞群与超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任意多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，所述多种肿瘤抗原肽包含选自SEQ ID NO:1-40的至少约1、5、10、15、20、25、30、35或40种中的任意多种表位。在一些实施方案中，使树突细胞群与约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多种中的任意多种肿瘤抗原肽接触，所述肿瘤抗原肽选自图2C和图29A中的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使树突细胞群与约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多种中的任意多种肿瘤抗原肽接触，所述肿瘤抗原肽来源于选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA1、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR的蛋白。
在一些实施方案中，树突细胞是递呈所述多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的成熟树突细胞。由本文所述的任一方法制备的成熟树突细胞可递呈约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任意多种肿瘤抗原肽。与初始树突细胞或尚未负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞相比，多抗原负载的树突细胞可具有超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任意多种肿瘤抗原肽的增强递呈水平。在一些实施方案中，成熟树突细胞具有选自SEQ ID NO:1-40的至少约1、5、10、15、20、25、30、35或40种中的任意多种表位的增强递呈水平。在一些实施方案中，成熟树突细胞具有超过十种肿瘤抗原肽的增强递呈水平。在一些实施方案中，成熟树突细胞具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多种中的任意多种肿瘤抗原肽的增强递呈水平，所述肿瘤抗原肽如图2C和图29A中所示。在一些实施方案中，成熟树突细胞具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多种中的任意多种肿瘤抗原肽的增强递呈水平，所述肿瘤抗原肽来源于选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA1、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR的蛋白。
树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触的示例性实施方案包括将所述多种肿瘤抗原肽冲击到树突细胞群中，诸如未成熟树突细胞，或者包含于或来源于(诸如分化自)PBMC的树突细胞。如本领域已知，冲击是指将细胞诸如树突细胞与含抗原肽的溶液混合的过程，以及任选地随后从该混合物去除抗原肽。树突细胞群可与多种肿瘤抗原肽接触数秒、数分钟或数小时，诸如约30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、5小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、一周、10天或更久中的任一时间。接触步骤中使用的每种肿瘤抗原肽的浓度可为约0.1、0.5、1、2、3、5或10μg/mL中的任一浓度。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽的浓度为约0.1-200μg/mL，包括例如约0.1-0.5、0.5-1、1-10、10-50、50-100、100-150或150-200μg/mL中的任一浓度。
在一些实施方案中，在存在有利于树突细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，可在所述多种肿瘤抗原肽的溶液中加入化合物、材料或组合物，以有利于树突细胞摄取肽。有利于树突细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的化合物、材料或组合物包括但不限于脂质分子以及具有多个带正电的氨基酸的肽。在一些实施方案中，树突细胞群摄取超过约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一百分比的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，群体中超过约50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一百分比的树突细胞摄取至少一种肿瘤抗原肽。
在一些实施方案中，提供了制备负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群的方法，该方法包括使未成熟树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，该方法还包括用多种Toll样受体(TLR)激动剂诱导未成熟树突细胞群的成熟。在一些实施方案中，该方法包括使未成熟树突细胞群与多种TLR激动剂和多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的成熟树突细胞群。示例性TLR激动剂包括但不限于polyIC、MALP和R848。在成熟步骤中可进一步在培养基中加入细胞因子和其他适当的分子。未成熟树突细胞群可由TLR激动剂诱导至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20天中的任一时间以便成熟。在一些实施方案中，未成熟树突细胞群被诱导约8天以便成熟。
树突细胞(诸如未成熟树突细胞)可得自各种来源，包括自体来源，即，来自正接受治疗的个体。树突细胞的方便来源是来自外周血的PBMC。例如，单核细胞(一种白血细胞)在PBMC中很丰富，占总PBMC的约10％-30％。可使用细胞因子诱导单核细胞分化为树突细胞，诸如未成熟树突细胞。在一些实施方案中，通过以下方式制备未成熟树突细胞：获得PBMC群，从PBMC群获得单核细胞群，并且使单核细胞群与多种细胞因子接触以获得未成熟树突细胞群。可用于诱导单核细胞分化的示例性细胞因子包括但不限于GM-CSF和IL-4，且采用本领域已知的条件(诸如浓度、温度、CO2水平等)。PBMC的粘附级分包含PBMC中的大多数单核细胞。在一些实施方案中，使来自PBMC粘附级分的单核细胞与细胞因子接触以获得未成熟树突细胞群。可通过对外周血样本进行离心，或通过使用血浆析离方法从个体采集，来便利地获得PBMC。在一些实施方案中，通过对人类外周血样本的密度梯度离心来获得PBMC群。在一些实施方案中，样本取自接受多抗原负载的树突细胞、活化T细胞或其他使用多抗原负载的树突细胞制备的免疫治疗组合物的个体。
在一些实施方案中，提供了制备负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群的方法，所述树突细胞群可用于引发个体中的MHC限制性T细胞应答，该方法包括以下步骤：从个体获得外周血单核细胞(PBMC)群，从PBMC群获得单核细胞群，从单核细胞群获得树突细胞群，以及使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，提供了制备负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群的方法，所述树突细胞群可用于引发个体中的MHC限制性T细胞应答，该方法包括以下步骤：从个体(诸如该个体)获得PBMC群，从PBMC群获得单核细胞群，使单核细胞群与多种细胞因子(诸如GM-CSF和IL-4)接触以获得未成熟树突细胞群，以及使未成熟树突细胞群与多种TLR激动剂和多种肿瘤抗原肽接触以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。
本发明还提供了由本文所述方法的任一实施方案制备的分离的树突细胞群。在一些实施方案中，分离的树突细胞群能够在体内或离体引发MHC限制性T细胞应答。在一些实施方案中，MHC限制性T细胞应答由MHC I类和MHC II类分子两者介导。在一些实施方案中，分离的树突细胞群能够诱导肿瘤抗原特异性T细胞的分化和增殖。
活化T细胞的制备
本发明中还提供了制备活化T细胞群的方法，所述活化T细胞群可用于治疗个体中的癌，该方法包括将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)群共培养。此前章节中的多抗原负载的树突细胞的任何实施方案可用于制备活化T细胞。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体，诸如患有癌(例如，低到中度癌)的个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群或两者来源于自体来源，即来自接受活化T细胞、多抗原负载的树突细胞或两者的个体。
在一些实施方案中，将T细胞群和负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养至少约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30天中的任一时间。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约7天至约10天、约10天至约15天、约14天至约21天、约10天、14天、16天、18天或21天)。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约10天。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约14天。
本文所述方法的任何实施方案中使用的T细胞群可来源于多种来源。T细胞的方便来源是来自人类外周血的PBMC。T细胞群可分离自PBMC，或另选地，富含T细胞的PBMC群(诸如通过添加T细胞特异性抗体和细胞因子)可用于共培养物中。在一些实施方案中，用于共培养物中的T细胞群从外周血单核细胞(PBMC)的非粘附级分获得。在一些实施方案中，通过对外周血样本进行密度梯度离心来获得PBMC。在一些实施方案中，通过以下方式获得T细胞群：在存在或不存在抗CD3抗体(诸如OKT3)的情况下，将PBMC的非粘附级分与至少一种细胞因子(诸如IL-2)一起培养(该过程在本文称为“维持T细胞”)。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂的情况下培养PBMC的非粘附级分。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3的免疫检查点分子的抑制剂。可将PBMC的非粘附级分培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更久中的任一时间。在一些实施方案中，通过以下方式制备活化T细胞群：获得非粘附PBMC群，并且(诸如在存在至少一种细胞因子(诸如IL-2)和任选地抗CD3抗体及任选地免疫检查点抑制剂的情况下)将非粘附PBMC群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养。
该共培养物还可包括细胞因子和其他化合物，以有利于T细胞的活化、成熟和/或增殖，并且致敏T细胞以便随后分化为记忆T细胞。可用于该步骤中的示例性细胞因子包括但不限于IL-7、IL-15、IL-21等。某些细胞因子可有助于抑制共培养物中活化T细胞群中的TREG百分比。例如，在一些实施方案中，使用高剂量(诸如至少约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200或1500U/ml中的任一剂量)的细胞因子(诸如IL-2)来共培养T细胞群和负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群，以获得具有低百分比TREG细胞的活化T细胞群。
共培养物还可包括一种或多种(诸如1、2、3或更多种中的任意多种)免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，在共培养之前使T细胞群与免疫检查点抑制剂接触。例如，T细胞群可为分离的T细胞或存在于细胞混合物(诸如PBMC的非粘附级分)中的T细胞。在一些实施方案中，在共培养之前使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂接触。在一些实施方案中，使T细胞群或非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂接触至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14天或更多天中的任一时间。在一些实施方案中，使T细胞群或非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂接触约5天至约14天。在一些实施方案中，使PBMC与免疫检查点抑制剂接触约8天。
在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂的情况下，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、BLTA、TIM-3和LAG-3的抑制性检查点分子的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体，诸如纳武单抗(例如，
Figure BDA0001405186940000461
)、派姆单抗(例如，
Figure BDA0001405186940000462
)或SHR-1210。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体，诸如伊匹单抗(例如，
Figure BDA0001405186940000463
)。
可用负载有所述多种肿瘤抗原肽的DC群刺激T细胞群任何次数，诸如1、2、3次或更多次中的任一次数。在一些实施方案中，刺激T细胞群一次。在一些实施方案中，刺激T细胞群至少两次。在一些实施方案中，对于每次刺激而言，将负载有所述多种肿瘤抗原肽的DC群添加到共培养物中。DC群可新鲜制备并用所述多种肿瘤抗原肽冲击处理，或可从为初始刺激做好了准备的一批DC群获得。
因此，提供了制备活化T细胞群的方法，该方法包括：(a)制备负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；以及(b)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群，其中树突细胞群和非粘附PBMC群从取自个体的PBMC群获得。在一些实施方案中，共培养是在存在多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)的情况下进行。在一些实施方案中，共培养是在存在抗CD3抗体(诸如OKT3)和多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)的情况下进行。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该方法还包括从个体获得PBMC群。
在一些实施方案中，提供了制备活化T细胞群的方法，该方法包括：(a)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；以及(c)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从取自个体的PBMC群获得。在一些实施方案中，使负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与多种TLR激动剂接触，以诱导负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群成熟。在一些实施方案中，共培养是在存在多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)的情况下进行。在一些实施方案中，共培养是在存在抗CD3抗体(诸如OKT3)和多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)的情况下进行。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该方法还包括以下步骤中的任一步骤或以下步骤的组合：(i)从个体获得PBMC群；(ii)从PBMC群获得单核细胞群；以及(iii)从PBMC群获得非粘附PBMC群。
在一些实施方案中，提供了制备活化T细胞群的方法，该方法包括从个体获得外周血单核细胞(PBMC)群，从PBMC群获得单核细胞群，(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群，使未成熟树突细胞群与多种Toll样受体(TLR)激动剂和多种肿瘤抗原肽接触以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的成熟树突细胞群，从PBMC群获得非粘附PBMC群，以及在存在多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)、任选地抗CD3抗体(诸如OKT3)和任选地免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂)的情况下将负载有所述多种肿瘤抗原肽的成熟树突细胞群与非粘附PBMC群共培养以获得活化T细胞群。
本发明还提供了由本文所述方法的任何实施方案制备的分离的活化T细胞群。本文还提供了可用于治疗个体中的癌的共培养物，该共培养物包含T细胞群和负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在共培养物的一些实施方案中，T细胞群和负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在共培养物的一些实施方案中，多抗原负载的树突细胞群通过如此前章节中所述的制备方法的任何实施方案制备，诸如将多种肿瘤抗原肽冲击到树突细胞群中，或在存在有利于树突细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物(诸如脂质分子或具有多个带正电的氨基酸的肽)的情况下使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触。本章节中所述分离的活化T细胞群和共培养物可用于MASCT方法的任何实施方案中。本文提供了可用于治疗癌、预防肿瘤进展或转移或者减少癌免疫逃避的免疫治疗组合物，所述免疫治疗组合物包含分离的活化T细胞群或共培养物。分离的活化T细胞群和共培养物还可用于制造治疗癌、预防肿瘤进展或转移或者减少癌免疫逃避的药剂。
本发明的意图在于本文所述用于制备负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群或用于制备活化T细胞群的任何步骤和参数可与本文所述用于MASCT方法的任何步骤和参数相结合，如同每一个组合单独描述一样。
例如，在一些实施方案中，提供了通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备的分离的活化T细胞群。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触(诸如在存在有利于树突细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下)来制备树突细胞群。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂)接触。在一些实施方案中，树突细胞群或T细胞群来自同一来源(诸如接受活化T细胞进行治疗的个体)。
在一些实施方案中，提供了通过以下方式制备的分离的活化T细胞群：(a)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；以及(c)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从取自个体的PBMC群获得。在一些实施方案中，使负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与多种TLR激动剂接触，以诱导负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群成熟。在一些实施方案中，共培养是在存在多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体(诸如OKT3)的情况下进行。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该方法还包括以下步骤中的任一步骤或以下步骤的组合：(i)从个体获得PBMC群；(ii)从PBMC群获得单核细胞群；以及(iii)从PBMC群获得非粘附PBMC群。
基于PBMC的MASCT
MASCT方法的变型(称为基于PBMC的MASCT)直接使用包含APC和T细胞的PBMC，而不分离或衍生APC(诸如树突细胞)或T细胞，以用于治疗个体中的癌。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括使外周血单核细胞(PBMC)群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，在存在有利于PBMC中的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3的抑制剂的情况下，使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，使活化PBMC群与IL-2接触。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
基于PBMC的MASCT方法适用于治疗可通过如此前章节中所述MASCT方法的其他实施方案治疗的任何癌(包括不同类型或阶段)。在基于PBMC的MASCT方法的一些实施方案中，该癌选自肝细胞癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、淋巴瘤、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑素瘤以及脑癌。
在一些实施方案中，PBMC是自体的，即从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，取自个体的外周血具有较低数量的树突细胞或T细胞。在一些实施方案中，使PBMC与细胞因子诸如IL-2、GM-CSF等接触，以在接触步骤同时或之后诱导PBMC中的某些细胞(诸如树突细胞、T细胞或它们的组合)的分化、成熟或增殖。在一些实施方案中，在接触步骤之后去除所述多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使PBMC与所述多种肿瘤抗原肽接触至少约10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、5小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、一周、10天或更久中的任一时间。在一些实施方案中，使PBMC与细胞因子接触至少约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30天中的任一时间。在一些实施方案中，使PBMC与细胞因子接触约14-21天。在一些实施方案中，使PBMC与细胞因子接触约14天。
在上述任何基于PBMC的MASCT方法中，使PBMC与一种或多种免疫检查点抑制剂接触。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂的情况下，使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，使PBMC与免疫检查点抑制剂接触至少约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30天中的任一时间。在一些实施方案中，使PBMC与免疫检查点抑制剂接触约14天至约21天。
与免疫检查点抑制剂联用的联合疗法
本文所述用于治疗癌的方法可用于单一疗法中以及与另一种药剂联用的联合疗法中。例如，本文所述的任何MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法)可与一种或多种(诸如1、2、3、4或更多种)免疫检查点抑制剂的施用相结合。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)任选地向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞；以及(c)向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；(e)向个体施用有效量的活化T细胞，以及(f)向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群获得。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群；(b)向个体施用有效量的活化PBMC；以及(c)向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化PBMC和免疫检查点抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化PBMC和免疫检查点抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，在存在有利于PBMC中的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使PBMC与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，使活化PBMC群进一步与IL-2接触。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3的抑制剂的情况下，使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。示例性抗PD-1抗体包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab、BMS-936559，以及阿特珠单抗、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110和TSR-042。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是纳武单抗(例如，
Figure BDA0001405186940000531
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗(例如，
Figure BDA0001405186940000532
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是SHR-1210。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)任选地向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞；以及(c)向个体施用有效量的PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，PD-1的抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，PD-1的抑制剂选自纳武单抗、派姆单抗和SHR-1210。在一些实施方案中，活化T细胞和PD-1的抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和PD-1的抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；(e)向个体施用有效量的活化T细胞，以及(f)向个体施用有效量的PD-1的抑制剂，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群获得。在一些实施方案中，PD-1的抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，PD-1的抑制剂选自纳武单抗、派姆单抗和SHR-1210。在一些实施方案中，活化T细胞和PD-1的抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和PD-1的抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群；(b)向个体施用有效量的活化PBMC；以及(c)向个体施用有效量的PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，PD-1的抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，PD-1的抑制剂选自纳武单抗、派姆单抗和SHR-1210。在一些实施方案中，活化PBMC和PD-1的抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化PBMC和PD-1的抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，在存在有利于PBMC中的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使PBMC与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，使活化PBMC群进一步与IL-2接触。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂(诸如PD-1的抑制剂)的情况下，使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)任选地向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞；以及(c)向个体施用有效量的派姆单抗(诸如
Figure BDA0001405186940000551
)。在一些实施方案中，活化T细胞和派姆单抗同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和派姆单抗顺序地施用。在一些实施方案中，派姆单抗经静脉内施用(诸如通过输注超过约30分钟)。在一些实施方案中，派姆单抗以约2mg/kg施用。在一些实施方案中，派姆单抗大约每3周施用一次。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；(e)向个体施用有效量的活化T细胞，以及(f)向个体施用有效量的派姆单抗(诸如
Figure BDA0001405186940000561
)，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群获得。在一些实施方案中，活化T细胞和派姆单抗同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和派姆单抗顺序地施用。在一些实施方案中，派姆单抗经静脉内施用(诸如通过输注超过约30分钟)。在一些实施方案中，派姆单抗以约2mg/kg施用。在一些实施方案中，派姆单抗大约每3周施用一次。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群；(b)向个体施用有效量的活化PBMC；以及(c)向个体施用有效量的派姆单抗(诸如
Figure BDA0001405186940000562
)。在一些实施方案中，活化PBMC和派姆单抗同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化PBMC和派姆单抗顺序地施用。在一些实施方案中，派姆单抗经静脉内施用(诸如通过输注超过约30分钟)。在一些实施方案中，派姆单抗以约2mg/kg施用。在一些实施方案中，派姆单抗大约每3周施用一次。在一些实施方案中，在存在有利于PBMC中的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使PBMC与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，使活化PBMC群进一步与IL-2接触。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂(诸如PD-1的抑制剂)的情况下，使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。示例性抗PD-L1抗体包括但不限于KY-1003、MCLA-145、RG7446、BMS935559、MPDL3280A、MEDI4736、Avelumab或STI-A1010。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)任选地向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞；以及(c)向个体施用有效量的PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，PD-L1的抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，活化T细胞和PD-L1的抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和PD-L1的抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-L1的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；(e)向个体施用有效量的活化T细胞，以及(f)向个体施用有效量的PD-L1的抑制剂，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群获得。在一些实施方案中，PD-L1的抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，活化T细胞和PD-L1的抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和PD-L1的抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-L1的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群；(b)向个体施用有效量的活化PBMC；以及(c)向个体施用有效量的PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，PD-L1的抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，活化PBMC和PD-L1的抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化PBMC和PD-L1的抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，在存在有利于PBMC中的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使PBMC与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，使活化PBMC群进一步与IL-2接触。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂(诸如PD-L1的抑制剂)的情况下，使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA-4抗体包括但不限于伊匹单抗、曲美木单抗和KAHR-102。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗(例如，
Figure BDA0001405186940000591
)。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)任选地向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞；以及(c)向个体施用有效量的CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，CTLA-4的抑制剂是抗CTLA-4抗体，诸如伊匹单抗。在一些实施方案中，活化T细胞和CTLA-4的抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和CTLA-4的抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群来源于外周血单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；(e)向个体施用有效量的活化T细胞，以及(f)向个体施用有效量的CTLA-4的抑制剂，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群获得。在一些实施方案中，CTLA-4的抑制剂是抗CTLA-4抗体，诸如伊匹单抗。在一些实施方案中，活化T细胞和CTLA-4的抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化T细胞和CTLA-4的抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天，或约10天)。在一些实施方案中，共培养还包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任意组合)和任选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群；(b)向个体施用有效量的活化PBMC；以及(c)向个体施用有效量的CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，CTLA-4的抑制剂是抗CTLA-4抗体，诸如伊匹单抗。在一些实施方案中，活化PBMC和CTLA-4的抑制剂同时施用，诸如在同一组合物中。在一些实施方案中，活化PBMC和CTLA-4的抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，在存在有利于PBMC中的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使PBMC与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，使活化PBMC群进一步与IL-2接触。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂(诸如CTLA-4的抑制剂)的情况下，使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。
在一些实施方案中，活化T细胞(或活化PBMC)和免疫检查点抑制剂同时施用。在一些实施方案中，活化T细胞(或活化PBMC)和免疫检查点抑制剂在单一组合物中施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂存在于共培养物中。在一些实施方案中，活化T细胞(或活化PBMC)和免疫检查点抑制剂在施用之前(诸如即将施用之前)掺和。在一些实施方案中，活化T细胞(或活化PBMC)和免疫检查点抑制剂经由单独组合物同时施用。
在一些实施方案中，活化T细胞(或活化PBMC)和免疫检查点抑制剂顺序地施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在活化T细胞(或活化PBMC)的施用之前施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在活化T细胞(或活化PBMC)的施用之后施用。
多种肿瘤抗原肽
本文所述的所有MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法)和细胞制备方法使用多种肿瘤抗原肽(包括新抗原肽)来制备可离体和体内引发特异性T细胞应答的APC(诸如树突细胞)和活化T细胞或活化PBMC。
在一些实施方案中，MASCT方法中的每种肿瘤抗原肽包含来自单种蛋白抗原(包括新抗原)的约1、2、3、4、5或10种中的任意多种表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽中的每种肿瘤抗原肽包含至少一种可由T细胞受体识别的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种包含至少2种来自单种蛋白抗原的表位的肿瘤抗原肽。肿瘤抗原肽可为来自含一种或多种表位的蛋白抗原的天然来源肽片段，或者具有一种或多种天然表位序列的经人工设计的肽，其中连接肽可任选地置于相邻表位序列之间。在一些优选实施方案中，相同肿瘤抗原肽中所含的表位来源于相同蛋白抗原。
肿瘤抗原肽(包括新抗原肽)可包含至少一种MHC-I表位、至少一种MHC-II表位，或者一种或多种MHC-I表位和一种或多种MHC-II表位两者。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种包含MHC-I表位的肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种包含MHC-II表位的肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽中的至少一种肿瘤抗原肽包含MHC-I和MHC-II表位两者。
特殊设计策略可应用于肿瘤抗原肽(包括新抗原肽)的序列，以便优化对负载有肿瘤抗原肽的树突细胞的免疫应答。通常，长于精确表位肽的肽可增加肽向抗原递呈细胞(诸如树突细胞)中的摄取。在一些实施方案中，根据携带表位的蛋白的天然序列，在N末端或C末端或两末端延伸MHC-I或MHC-II表位序列以获得延伸的序列，其中该延伸的序列适合于由I类和II类MHC分子递呈，并由不同个体中不同亚型的MHC分子递呈。在一些实施方案中，表位序列在一末端或两末端延伸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个中的任一数量的氨基酸残基，以生成延伸的表位。在一些实施方案中，具有MHC-I或MHC-II表位的肽在N末端、C末端或两末端处还包含位于表位旁侧的附加氨基酸。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽中的每种肿瘤抗原肽为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个中的任一数量的氨基酸长。所述多种肿瘤抗原肽中的不同肿瘤抗原肽可具有相同长度或不同长度。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽各自为约20-40个氨基酸长。
在一些实施方案中，用于设计本申请中的肿瘤抗原肽的一种或多种表位肽的氨基酸序列基于本领域已知或公共数据库诸如肽数据库中可用的序列(van der Bruggen P etal.(2013)“Peptide database:T cell-defined tumor antigens.Cancer Immunity(vander Bruggen P等人，2013年，“肽数据库：T细胞限定的肿瘤抗原”，《癌免疫》)。URL：www.cancerimmunity.org/peptide/)。在一些实施方案中，所述一种或多种表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-35。
在一些实施方案中，使用用于T细胞表位预测的生物信息学工具，基于抗原蛋白(包括新抗原)的序列来预测一种或多种表位肽的氨基酸序列。用于T细胞表位预测的示例性生物信息学工具是本领域已知的，例如参见Yang X.and Yu X.(2009)“An introductionto epitope prediction methods and software”Rev.Med.Virol.19(2):77-96(Yang X.和Yu X.，2009年，“表位预测方法和软件导论”，《医学病毒学评论》，第19卷，第2期，第77-96页)。在一些实施方案中，抗原蛋白的序列是本领域已知的或公共数据库中可用的。在一些实施方案中，通过对正接受治疗的个体的样本(诸如肿瘤样本)进行测序来确定抗原蛋白(包括新抗原)的序列。
本发明设想了来源于本领域已知的任何肿瘤抗原和表位(包括新抗原和新表位)的或者本发明人使用生物信息学工具专门开发或预测的肿瘤抗原肽。
在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽还包括第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，新抗原肽是癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽由第一核心组普通肿瘤抗原肽组成。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽由第一核心组普通肿瘤抗原肽和第二组癌类型特异性抗原肽组成。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽仅由新抗原肽组成。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽、第二组癌类型特异性抗原肽和一种或多种新抗原肽。
第一核心组普通肿瘤抗原肽来源于通常在不同类型的各种癌的表面上表达或过表达的肿瘤抗原。因此，第一核心组普通肿瘤抗原肽可用于制备树突细胞或活化T细胞，这些细胞用于任何MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法)中或者本文所述的其他治疗方法或细胞制备方法中，以治疗具有不同癌类型的个体。例如，在一些实施方案中，第一核心组普通肿瘤抗原肽可用于本文所述用于治疗诸如肺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胶质瘤、食道癌、鼻咽癌、宫颈癌、肾癌或肝细胞癌的各种癌的方法。第一核心组的示例性肿瘤抗原肽包括但不限于来源于hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR和CDCA1的肽。第一核心组可包含来源于超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任意多种肿瘤抗原的肽。第一核心组可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任意多种普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包含超过一种普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包含约10至约20种普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包含具有超过一种选自SEQ ID NO:1-24的表位的普通肿瘤抗原肽。
第二组癌类型特异性抗原肽来源于仅在一个或有限数量的癌类型中表达或过表达的肿瘤抗原。因此，第二组癌类型特异性抗原肽可用于制备树突细胞、活化T细胞，这些细胞用于任何MASCT方法中或者本文所述的其他治疗方法或细胞制备方法中，以治疗具有特定癌类型的个体。用于治疗肝细胞癌(HCC)的示例性癌类型特异性抗原肽包括但不限于来源于AFP和GPC3的肽。在一些实施方案中，一种或多种癌特异性抗原肽是来源于病毒的病毒特异性抗原肽，该病毒在感染个体时可诱发癌，或与个体中的癌发展相关。在一些实施方案中，病毒特异性抗原肽对感染个体的病毒的亚型具有特异性。用于治疗合并感染HBV的HCC患者的示例性病毒特异性抗原肽包括但不限于来源于HBV核心抗原和HBV DNA聚合酶的肽。在一些实施方案中，病毒特异性抗原肽包含至少一种选自SEQ ID NO:31-35的表位。在一些实施方案中，第二组包含来源于HBV抗原的病毒特异性抗原肽，其中所述方法是要治疗个体中的肝细胞癌。在一些实施方案中，第二组包含来源于HPV抗原的病毒特异性抗原肽，其中所述方法是要治疗个体中的宫颈癌。在一些实施方案中，第二组包含来源于EBV抗原的病毒特异性抗原肽，其中所述方法是要治疗个体中的鼻咽癌。第二组癌类型特异性抗原肽可包括来源于超过约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任意多种癌类型特异性抗原的肽。第二组癌类型特异性抗原肽可包括超过约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任意多种癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包含超过一种癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包含约1至约10种癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包含具有至少一种选自SEQ ID NO:25-35的表位的癌类型特异性抗原肽，其中所述癌是肝细胞癌。在一些实施方案中，由癌类型特异性抗原肽靶向的癌的类型基本上选自肝细胞癌、宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌和淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种中的任意多种)新抗原肽。新抗原肽来源于新抗原。新抗原是新近采集并表达的存在于个体(诸如接受癌治疗的个体)的肿瘤细胞中的抗原。在一些实施方案中，新抗原来源于仅存在于癌细胞中而不存在于正常细胞中的突变体蛋白抗原。新抗原可独特地存在于接受癌治疗的个体的肿瘤细胞(诸如所有肿瘤细胞或肿瘤细胞的一部分)中，或存在于具有与正接受治疗的个体相似的癌类型的个体中。在一些实施方案中，新抗原是克隆新抗原。在一些实施方案中，新抗原是亚克隆新抗原。在一些实施方案中，新抗原存在于个体中的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多中的任一百分比的肿瘤细胞中。在一些实施方案中，新抗原肽包含MHC-I限制性新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包含MHC-II限制性新表位。在一些实施方案中，新抗原肽被设计成(例如，通过在N末端和C末端延伸新表位)有利于I类和II类MHC分子两者对新表位的递呈。示例性新抗原肽包括但不限于来源于突变体KRAS(例如，KRASG12A)、PARP4(例如，PARP4T1170I)、MLL3(例如，MLL3C988F)和MTHFR(例如，MTHFRA222V)的新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包含在选自SEQ ID No:41-45的序列中具有点突变的表位。在一些实施方案中，新抗原肽包含选自SEQID NO:36-40的表位。
可基于正接受治疗的个体的一个或多个肿瘤部位的遗传图谱来选择新抗原肽。在一些实施方案中，肿瘤样本的遗传图谱包含全基因组的序列信息。在一些实施方案中，肿瘤样本的遗传图谱包含外显子组的序列信息。在一些实施方案中，肿瘤样本的遗传图谱包含癌相关基因的序列信息。
适用于本发明的新抗原肽可来源于肿瘤细胞中的任何突变体蛋白，诸如由突变体癌相关基因编码的那些蛋白。在一些实施方案中，新抗原肽包含来源于癌相关基因的单种新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包含来源于癌相关基因的超过一种(诸如2种、3种或更多种)新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包含来源于超过一种(诸如2种、3种或更多种)癌相关基因的超过一种(诸如2种、3种或更多种)新表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原包括来源于单种癌相关基因的多种新抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原包括来源于超过一种(诸如2、3、4、5或更多种中的任意多种)癌相关基因的多种新抗原肽。
癌相关基因是过表达的或者仅在癌细胞中表达而不在正常细胞中表达的基因。示例性癌相关基因包括但不限于ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、ALOX12B、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AURKA、AURKB、AXL、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L1、BCL2L12、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BUB1B、CADM2、CARD11、CBL、CBLB、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD58、CD79B、CDC73、CDH1、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK9、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHEK2、CIITA、CREBBP、CRKL、CRLF2、CRTC1、CRTC2、CSF1R、CSF3R、CTNNB1、CUX1、CYLD、DDB2、DDR2、DEPDC5、DICER1、DIS3、DMD、DNMT3A、EED、EGFR、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FAS、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FKBP9、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FUS、GATA3、GATA4、GATA6、GLI1、GLI2、GLI3、GNA11、GNAQ、GNAS、GNB2L1、GPC3、GSTM5、H3F3A、HNF1A、HRAS、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IKZF3、INSIG1、JAK2、JAK3、KCNIP1、KDM5C、KDM6A、KDM6B、KDR、KEAP1、KIT、KRAS、LINC00894、LMO1、LMO2、LMO3、MAP2K1、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MCL1、MDM2、MDM4、MECOM、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MLL(KMT2A)、MLL2(KTM2D)、MPL、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYB、MYBL1、MYC、MYCL1(MYCL)、MYCN、MYD88、NBN、NEGR1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFKBIZ、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NPRL2、NPRL3、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PARK2、PAX5、PBRM1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PHF6、PHOX2B、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PMS1、PMS2、PNRC1、PRAME、PRDM1、PRF1、PRKAR1A、PRKCI、PRKCZ、PRKDC、PRPF40B、PRPF8、PSMD13、PTCH1、PTEN、PTK2、PTPN11、PTPRD、QKI、RAD21、RAF1、RARA、RB1、RBL2、RECQL4、REL、RET、RFWD2、RHEB、RHPN2、ROS1、RPL26、RUNX1、SBDS、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SH2B3、SLITRK6、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMC1A、SMC3、SMO、SOCS1、SOX2、SOX9、SQSTM1、SRC、SRSF2、STAG1、STAG2、STAT3、STAT6、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TCF3、TCF7L1、TCF7L2、TERC、TERT、TET2、TLR4、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VHL、WRN、WT1、XPA、XPC、XPO1、ZNF217、ZNF708以及ZRSR2。
在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包含至少一种(诸如至少约1、5、10、15、20、25、30、35或40种中的任意多种)选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包含至少一种(诸如至少约1、5、10、15、20或24种中的任意多种)选自SEQID NO:1-24的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包含至少一种(诸如约1、2、3、4、5或6种中的任意多种)选自SEQ ID NO:25-30的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包含至少一种(诸如约1、2、3、4或5种中的任意多种)选自SEQ ID NO:31-35的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包含至少一种(诸如约1、2、3、4或5种中的任意多种)选自SEQ ID NO:36-40的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括图2B或图2C中的普通肿瘤抗原肽中的至少一种(诸如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种中的任意多种)。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括图29A中的至少一种(诸如至少约1、2、3、4或5种中的任意多种)新抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括图2B、图2C或图29A中的至少一种(诸如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多种中的任意多种)肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种(诸如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多种中的任意多种)肿瘤抗原肽，每种肿瘤抗原肽包含一种或多种由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-24的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括选自图2B中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括选自图2C中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括图29A中的至少一种新抗原肽。
在一些实施方案中，提供了包含至少10种肿瘤抗原肽的组合物，其中所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，提供了包含至少10种肿瘤抗原肽的组合物，其中所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-24的表位。在一些实施方案中，提供了包含选自图2B中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽的组合物。在一些实施方案中，提供了包含选自图2C和图29A中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽的组合物。在一些实施方案中，提供了包含至少10种肿瘤抗原肽的组合物，每种肿瘤抗原肽包含由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
在一些实施方案中，提供了通过使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触而制备的负载有多种肿瘤抗原肽的分离的树突细胞群，其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，这些肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括选自图2C和图29A中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，每种肿瘤抗原肽包含一种或多种由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
在一些实施方案中，提供了制备活化T细胞群的方法，该方法包括将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养，其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，提供了通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备的分离的活化T细胞群，其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，这些肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括选自图2C和图29A中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，每种肿瘤抗原肽包含一种或多种由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
在一些实施方案中，提供了制备活化T细胞群的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得，并且其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，提供了通过以下方式制备的分离的活化T细胞群：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得，并且其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，这些肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括选自图2C和图29A中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，每种肿瘤抗原肽包含一种或多种由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及向个体施用有效量的活化PBMC，其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3的抑制剂的情况下，使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，这些肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括选自图2C和图29A中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，每种肿瘤抗原肽包含一种或多种由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括任选地向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞，以及向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞，其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、PBMC群或它们的任意组合来源于正接受治疗的个体。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，这些肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括选自图2C和图29A中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，每种肿瘤抗原肽包含一种或多种由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(e)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得，并且其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，这些肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括选自图2C和图29A中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，每种肿瘤抗原肽包含一种或多种由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
精确MASCT
本文还提供了基于正接受治疗的个体的遗传学和治疗应答来为个体定制的精确MASCT方法。可定制上述任何MASCT方法以提供精确MASCT方法。
在一些实施方案中，本文所述的MASCT方法特别适用于特定个体人群，诸如癌(诸如癌细胞全部或亚群)中(诸如在MHC基因中)具有低突变负荷的个体和/或具有一种或多种新抗原的个体。
突变负荷
在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于个体癌中具有较低总突变负荷的个体。在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于个体癌中的癌相关基因中具有低突变负荷的个体。在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于个体癌中的与T细胞应答相关的免疫基因中具有低突变负荷的个体。在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于个体癌中的MHC基因中具有低突变负荷的个体。突变负荷可为所有癌细胞或癌细胞亚群(诸如原发性或转移性肿瘤部位，例如肿瘤活检样本中的细胞)中的突变负荷。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)任选地施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；以及(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞，并且其中个体具有癌中的低突变负荷。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。在一些实施方案中，个体在癌中的一种或多种MHC基因(诸如MHC-I基因)中具有低突变负荷(诸如不超过约10种突变、没有B2M中的突变和/或没有功能区中的突变)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)基于癌中的突变负荷来选择个体进行该方法；(b)任选地施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；以及(c)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。在一些实施方案中，个体在癌中的一种或多种MHC基因(诸如MHC-I基因)中具有低突变负荷(诸如不超过约10种突变、没有B2M中的突变和/或没有功能区中的突变)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)任选地施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；以及(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞，并且其中基于具有癌中的低突变负荷来选择个体进行治疗。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。在一些实施方案中，个体在癌中的一种或多种MHC基因(诸如MHC-I基因)中具有低突变负荷(诸如不超过约10种突变、没有B2M中的突变和/或没有功能区中的突变)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(e)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得，并且其中个体具有癌中的低突变负荷。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。在一些实施方案中，个体在癌中的一种或多种MHC基因(诸如MHC-I基因)中具有低突变负荷(诸如不超过约10种突变、没有B2M中的突变和/或没有功能区中的突变)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)基于癌中的突变负荷来选择个体进行该方法；(b)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(c)(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(d)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(e)(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(f)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。在一些实施方案中，个体在癌中的一种或多种MHC基因(诸如MHC-I基因)中具有低突变负荷(诸如不超过约10种突变、没有B2M中的突变和/或没有功能区中的突变)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)；(b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)，以获得活化T细胞群；以及(e)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得，并且其中基于具有癌中的低突变负荷来选择个体进行治疗。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。在一些实施方案中，个体在癌中的一种或多种MHC基因(诸如MHC-I基因)中具有低突变负荷(诸如不超过约10种突变、没有B2M中的突变和/或没有功能区中的突变)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群；以及(b)向个体施用有效量的活化PBMC，其中个体具有癌中的低突变负荷。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。在一些实施方案中，个体在癌中的一种或多种MHC基因(诸如MHC-I基因)中具有低突变负荷(诸如不超过约10种突变、没有B2M中的突变和/或没有功能区中的突变)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)基于癌中的突变负荷来选择个体进行该方法；(b)(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群；以及(c)向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。在一些实施方案中，个体在癌中的一种或多种MHC基因(诸如MHC-I基因)中具有低突变负荷(诸如不超过约10种突变、没有B2M中的突变和/或没有功能区中的突变)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群；以及(b)向个体施用有效量的活化PBMC，其中基于具有癌中的低突变负荷来选择个体进行治疗。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。在一些实施方案中，个体在癌中的一种或多种MHC基因(诸如MHC-I基因)中具有低突变负荷(诸如不超过约10种突变、没有B2M中的突变和/或没有功能区中的突变)。
在一些实施方案中，一种或多种基因的低突变负荷是在所述一种或多种基因上累积的低突变数。在一些实施方案中，总数不超过约500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5种或更少种中的任意多种突变指示低突变负荷。在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因中的不超过约50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种中的任意多种突变指示所述一种或多种MHC基因的低突变负荷。在一些实施方案中，一种或多种基因的低突变负荷是在所述一种或多种基因(诸如MHC基因)上累积的突变数与所选组的基因(诸如癌相关基因)或全基因组中的突变总数之间的低比率。在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因中的突变数与实施例5中所述的333种癌相关基因的总数之间小于约1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:200或更小中的任一比率的比率指示所述一种或多种MHC基因的低突变负荷。
在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因包括MHC I类基因(或基因座)。在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因包括MHC II类基因(或基因座)。在一些实施方案中，其中所述个体是人类个体，所述一种或多种MHC基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M。
示例性突变包括但不限于缺失、移码、插入、插入缺失、错义突变、无义突变、点突变、拷贝数变异、单核苷酸变异(SNV)、沉默突变、剪接位点突变、剪接变体、基因融合以及易位。在一些实施方案中，MHC基因的拷贝数变异由基因组的结构重排引起，包括染色体或其片段的缺失、重复、倒位和易位。在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因中的突变选自点突变、移码突变、基因融合和拷贝数变异。在一些实施方案中，突变位于MHC基因的蛋白编码区中。在一些实施方案中，突变是非同义突变。在一些实施方案中，突变不是多态性。在一些实施方案中，突变存在于个体的正常细胞中。在一些实施方案中，突变不存在于个体的正常细胞中。在一些实施方案中，突变影响由受影响的基因编码的MHC分子的生理化学或功能特性，诸如稳定性或结合亲和力。在一些实施方案中，突变导致MHC分子中的不可逆缺陷。在一些实施方案中，突变降低MHC分子对T细胞表位和/或T细胞受体的结合亲和力。在一些实施方案中，突变是功能丧失突变。在一些实施方案中，突变导致MHC分子中的可逆缺陷。在一些实施方案中，突变不影响MHC分子对T细胞表位和/或T细胞受体的结合亲和力。在一些实施方案中，突变是体细胞突变。在一些实施方案中，突变是胚系突变。
计入突变负荷的突变可存在于所有癌细胞中或癌细胞亚群中。在一些实施方案中，突变存在于个体中的所有癌细胞中。在一些实施方案中，突变存在于肿瘤部位的所有癌细胞中。在一些实施方案中，突变是克隆的。在一些实施方案中，突变是亚克隆的。在一些实施方案中，突变存在于个体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多中的任一百分比的癌细胞中。
某些MHC基因中和/或所述一种或多种MHC基因的某些结构域或位置中的突变可更深远地影响个体对本文所述MASCT方法的临床应答。例如，HLA分子的前导肽序列、a3结构域(其结合T细胞的CD8辅助受体)、a1肽结合结构域或a2肽结合结构域中可出现功能丧失突变；参见例如Shukla S.et al.Nature Biotechnology 33,1152-1158(2015)(Shukla S.等人，《自然生物技术》，第33卷，第1152-1158页，2015年)，该文献以引用方式并入本文。B2M(β2-巨球蛋白)基因中的突变还可促进肿瘤逃避表型。参见例如Monica B et al.CancerImmunol.Immu.,(2012)61:1359-1371(Monica B等人，《癌免疫学免疫疗法》，2012年，第61卷，第1359-1371页)。在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因的功能区诸如前导肽序列、a1结构域、a2结构域或a3结构域中存在任意数量(诸如1、2、3、4、5或更多)的突变指示高突变负荷。在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因(诸如人类个体中的HLA-A、HLA-B或HLA-C基因)中存在任意数量(诸如1、2、3、4、5或更多)的功能丧失突变指示高突变负荷。在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因中的低突变负荷不包含所述一种或多种MHC基因(诸如HLA-A、HLA-B或HLA-C基因)的功能区中的突变，所述功能区包括前导肽序列、a1结构域(例如，与CD8辅助受体直接接触的残基)、a2结构域和a3结构域(例如，与表位直接接触的残基)。在一些实施方案中，B2M基因中存在任意数量的突变(诸如功能丧失突变)指示高突变负荷。在一些实施方案中，所述一种或多种MHC基因中的低突变负荷不包含B2M基因中的突变。
一种或多种基因(诸如MHC基因)的突变负荷可通过本领域中的任何已知方法确定，包括但不限于基因组DNA测序、外显子组测序或其他使用Sanger测序或下一代测序平台的基于DNA测序的方法；聚合酶链反应测定法；原位杂交测定法；以及DNA微阵列。
在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来确定所述一种或多种MHC基因的突变负荷。在一些实施方案中，测序是下一代测序。在一些实施方案中，测序是全基因组测序。在一些实施方案中，测序是外显子组测序。在一些实施方案中，测序是候选基因诸如癌相关基因加HLA基因的靶向测序。例如，ONCOGXONETM Plus(艾达康公司(AdmeraHealth))可用于以高测序深度对癌相关基因和HLA基因座进行测序。在一些实施方案中，可使用相同测序数据确定所述一种或多种MHC基因的突变负荷并鉴定个体中的新抗原。
在一些实施方案中，肿瘤样本是组织样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是肿瘤活检样本，诸如肿瘤细胞的细针穿刺或腹腔镜检查获得的肿瘤细胞(诸如包括肿瘤间质)。在一些实施方案中，肿瘤样本是新鲜获得的。在一些实施方案中，肿瘤样本是冷冻的。在一些实施方案中，肿瘤样本是甲醛固定石蜡包埋(FFPE)样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是细胞样本。在一些实施方案中，肿瘤样本包含循环转移性癌细胞。在一些实施方案中，通过从血液分选循环肿瘤细胞(CTC)来获得肿瘤样本。在一些实施方案中，从肿瘤样本提取核酸(诸如DNA和/或RNA)以进行测序分析。在一些实施方案中，将肿瘤样本的测序数据与参考样本(诸如取自同一个体的健康组织的样本或健康个体的样本)的测序数据进行比较，以鉴定肿瘤细胞中的突变并确定突变负荷。在一些实施方案中，将肿瘤样本的测序数据与来自基因组数据库的参考序列进行比较，以鉴定肿瘤细胞中的突变并确定突变负荷。
新抗原肽
在一些实施方案中，本文所述的MASCT方法特别适用于治疗具有一种或多种新抗原的个体。本文所述使用所述多种肿瘤抗原肽中的一种或多种新抗原肽的任一MASCT方法还可包括基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法的步骤，和/或以下步骤：(i)鉴定个体的新抗原；以及(ii)将来源于新抗原的新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中以用于MASCT方法。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)鉴定个体的新抗原；(b)将新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位；(c)制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(d)任选地施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(e)将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养；以及(f)向个体施用有效量的活化T细胞，其中个体具有一种或多种新抗原。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法；(b)鉴定个体的新抗原；(c)将新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位；(d)制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(e)任选地施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(f)将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养；以及(g)向个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)鉴定个体的新抗原；(b)将新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位；(c)制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(d)任选地施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(e)将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养；以及(f)向个体施用有效量的活化T细胞，其中基于具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)鉴定个体的新抗原；(b)将新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中，其中新抗原肽包含新抗原中的新表位；(c)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(d)(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(e)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(f)(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(g)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得，并且其中个体具有一种或多种新抗原。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括个体的多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法；(b)鉴定个体的新抗原；(c)将新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中，其中新抗原肽包含新抗原中的新表位；(d)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(e)(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(f)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(g)(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(h)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括个体的多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)鉴定个体的新抗原；(b)将新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中，其中新抗原肽包含新抗原中的新表位；(c)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(d)(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(e)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(f)(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(g)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得，并且其中基于具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括个体的多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)鉴定个体的新抗原；(b)将新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中，其中新抗原肽包含新抗原中的新表位；(c)(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触，以获得活化PBMC群；以及(d)向个体施用有效量的活化PBMC，其中个体具有一种或多种新抗原。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法；(b)鉴定个体的新抗原；(c)将新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中，其中新抗原肽包含新抗原中的新表位；(d)(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触，以获得活化PBMC群；以及(e)向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)鉴定个体的新抗原；(b)将新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中，其中新抗原肽包含新抗原中的新表位；(c)(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触，以获得活化PBMC群；以及(d)向个体施用有效量的活化PBMC，其中基于具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
个体可具有任意数量(诸如至少1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、100或更多种中的任意多种)新抗原，以便受益于使用包括新抗原肽的多种肿瘤抗原肽的MASCT方法。在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于具有至少约4、5、6、7、8、10、15、20、50、100或更多种中的任意多种新抗原的个体。在一些实施方案中，新抗原包含一种或多种新表位。在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于具有至少约4、5、6、7、8、10、15、20、50、100或更多种中的任意多种新表位的个体。在一些实施方案中，T细胞表位是MHC-I限制性表位。在一些实施方案中，与对应野生型T细胞表位相比，新表位具有对个体的MHC分子的更高亲和力。在一些实施方案中，与对应野生型T细胞表位相比，新表位具有对模型T细胞受体的更高亲和力。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是克隆新抗原。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是亚克隆新抗原。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)存在于个体中的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多中的任一百分比的肿瘤细胞中。
新抗原的数量可与其他生物标记物或选择标准相结合，以选择个体进行本文所述的任何MASCT方法。在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于具有癌细胞中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)以及至少约4、5、6、7、8、10或更多种中的任意多种新抗原(诸如具有高亲和力MHC-I限制性新表位的新抗原)的个体。
在一些实施方案中，提供了基于个体癌中的突变负荷和/或个体中的新抗原数量来为个体提供预后的方法，其中该预后预测个体对本文所述任何MASCT方法的临床应答。在一些实施方案中，基于该预后将个体分类为以下三类之一：(1)受益于MHC限制性干预(诸如MASCT治疗)；(2)潜在受益于MHC限制性干预(诸如MASCT治疗)；以及(3)不受益于MHC限制性干预(诸如MASCT治疗)。在一些实施方案中，如果个体没有B2M基因中的突变，没有MHC基因的功能区(诸如前导肽序列、a1结构域、a2结构域或a3结构域)中的突变，具有MHC-I基因(诸如HLA-I A、B和/或C基因)中的不超过2种突变和/或超过5种突变，则个体被预测为受益于MHC限制性干预(诸如MASCT治疗)。在一些实施方案中，如果个体没有B2M基因中的突变，没有MHC基因的功能区(诸如前导肽序列、a1结构域、a2结构域或a3结构域)中的突变，具有MHC-I基因(诸如HLA-I A、B和/或C基因)中的不超过约10种突变和/或不超过5种突变，则个体被预测为潜在受益于MHC限制性干预(诸如MASCT治疗)。在一些实施方案中，如果个体具有B2M中的突变或具有MHC基因(诸如MHC-I基因)中的高突变负荷(诸如至少10种突变)，则个体被预测为不受益于MHC限制性干预(诸如MASCT治疗)。在一些实施方案中，如果个体被预测为受益于或潜在受益于MHC限制性干预(诸如MASCT治疗)，则选择个体进行MASCT方法。
可基于个体的新抗原来设计任意数量(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种中的任意多种)新抗原肽，并掺入所述多种肿瘤抗原肽中以便用于本文所述的任何MASCT方法。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括单种新抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。每种新抗原肽可包含来自个体新抗原的一种或多种新表位。在一些实施方案中，新表位是T细胞表位。基于新抗原来设计新抗原肽的方法在章节“多种肿瘤抗原肽”中有描述。
可使用本领域中的任何已知方法鉴定个体中的新抗原。在一些实施方案中，基于取自个体的肿瘤样本的遗传图谱来鉴定新抗原。每种新抗原包含一种或多种新表位。在一些实施方案中，基于肿瘤样本的遗传图谱来鉴定新抗原中的所述一种或多种新表位。可使用任何已知的遗传图谱分析方法诸如下一代测序(NGS)方法、微阵列或蛋白质组学方法来提供肿瘤样本的遗传图谱。
在一些实施方案中，通过对取自个体的肿瘤样本进行测序来鉴定新抗原。在一些实施方案中，测序是下一代测序。在一些实施方案中，测序是全基因组测序。在一些实施方案中，测序是外显子组测序。在一些实施方案中，测序是候选基因诸如癌相关基因的靶向测序。许多商业NGS癌检测组合例如ONCOGXONETM Plus(艾达康公司(Admera Health))可用于以高测序深度对癌相关基因进行测序。
在一些实施方案中，肿瘤样本是组织样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是肿瘤活检样本，诸如肿瘤细胞的细针穿刺或腹腔镜检查获得的肿瘤细胞(诸如包括肿瘤间质)。在一些实施方案中，肿瘤样本是新鲜获得的。在一些实施方案中，肿瘤样本是冷冻的。在一些实施方案中，肿瘤样本是甲醛固定石蜡包埋(FFPE)样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是细胞样本。在一些实施方案中，肿瘤样本包含循环转移性癌细胞。在一些实施方案中，通过从血液分选循环肿瘤细胞(CTC)来获得肿瘤样本。在一些实施方案中，从肿瘤样本提取核酸(诸如DNA和/或RNA)以进行测序分析。在一些实施方案中，从肿瘤样本提取蛋白以进行测序分析。
在一些实施方案中，将肿瘤样本的遗传图谱与参考样本(诸如取自同一个体的健康组织的样本或健康个体的样本)的遗传图谱进行比较，以鉴定肿瘤细胞中的候选突变体基因。在一些实施方案中，将肿瘤样本的遗传图谱与来自基因组数据库的参考序列进行比较，以鉴定肿瘤细胞中的候选突变体基因。在一些实施方案中，候选突变体基因是癌相关基因。在一些实施方案中，每种候选突变体基因包含一种或多种突变，诸如非同义置换、插入缺失(插入或缺失)或基因融合，从而可产生新抗原。从候选突变中排除常见单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施方案中，从候选突变体蛋白中鉴定新抗原中的新表位。在一些实施方案中，计算机(in silico)预测新表位。用于T细胞表位预测的示例性生物信息学工具是本领域已知的，例如参见Yang X.and Yu X.(2009)“An introduction to epitopeprediction methods and software”Rev.Med.Virol.19(2):77-96(Yang X.和Yu X.，2009年，“表位预测方法和软件导论”，《医学病毒学评论》，第19卷，第2期，第77-96页)。T细胞表位预测算法中考虑的因素包括但不限于个体的MHC亚型、T细胞表位的序列来源生理化学特性、MHC结合基序、蛋白酶体切割模式、抗原加工相关转运体(TAP)转运效率、MHC结合亲和力、肽-MHC稳定性以及T细胞受体结合亲和力。在一些实施方案中，新表位是MHC-I限制性表位。在一些实施方案中，新表位是MHC-II限制性表位。
在一些实施方案中，新表位具有对个体MHC分子的高亲和力。在一些实施方案中，该方法还包括例如由测序数据来确定个体的MHC亚型，以鉴定个体的一种或多种MHC分子。在一些实施方案中，该方法还包括确定新表位对MHC分子(诸如MHC I类分子)的亲和力。在一些实施方案中，该方法包括确定新表位对个体的一种或多种MHC(诸如MHC I类)分子的亲和力。在一些实施方案中，将新表位对个体的一种或多种MHC分子的亲和力与对应野生型表位对个体的所述一种或多种MHC分子的亲和力进行比较。在一些实施方案中，选择新表位，以便与对应野生型表位相比，其具有对个体的所述一种或多种MHC分子(诸如MHC-I分子)的更高(诸如至少约1.5、2、5、10、15、20、25、50、100倍或更多倍中的任一者)亲和力。在一些实施方案中，使用本领域中任何已知的工具或方法来计算机预测MHC结合亲和力。在一些实施方案中，通过实验(诸如使用体外结合测定法)来确定MHC结合亲和力。
在一些实施方案中，该方法还包括确定包含新表位和MHC分子(诸如个体的MHC I类分子)的复合体对T细胞受体的亲和力。在一些实施方案中，将包含新表位和MHC分子的复合体对T细胞受体的亲和力与包含对应野生型表位和MHC分子的复合体对T细胞受体的亲和力进行比较。在一些实施方案中，MHC分子来自个体。在一些实施方案中，T细胞受体位于个体的一个或多个T细胞的表面上。在一些实施方案中，选择新表位，以便与对应野生型表位相比，其在包含新表位和MHC分子的复合体中具有对T细胞受体模型的更高(诸如至少约1.5、2、5、10、15、20、25、50、100倍或更多倍中的任一者)亲和力。在一些实施方案中，使用本领域中任何已知的工具或方法来计算机预测TCR结合亲和力。在一些实施方案中，通过实验(例如通过确定对于新表位的T细胞应答)来确定TCR结合亲和力。
在一些实施方案中，进一步基于肿瘤样本中的新抗原(或新表位)的表达水平来鉴定新抗原(或新表位)。可使用本领域已知的用于定量mRNA或蛋白水平的任何方法(诸如RT-PCR、基于抗体的测定法、质谱法)来确定新抗原(或新表位)的表达水平。在一些实施方案中，由肿瘤样本的测序数据确定新抗原(或新表位)的表达水平。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)以至少约10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、104或更多个拷贝/细胞中的任一水平表达于肿瘤细胞中。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)以与对应野生型蛋白(或对应野生型表位)相比超过约1.5、2、5、10、20、50、100倍或更多倍中的任一者的水平表达于肿瘤细胞中。
在一些实施方案中，通过包括以下各项的步骤来选择或鉴定新抗原肽：(a)对取自个体的肿瘤样本进行测序以鉴定新抗原；(b)鉴定新抗原中的新表位；任选地(c)确定个体的MHC亚型(例如，使用测序数据)以鉴定个体的MHC分子；任选地(d)确定新表位对个体的MHC分子的亲和力；任选地(e)确定包含新表位和MHC分子的复合体对T细胞受体的亲和力；以及(f)获得包含新表位的肽以提供新抗原肽。在一些实施方案中，与包含对应野生型T细胞表位和MHC分子的复合体相比，新表位具有对个体的MHC分子(诸如MHC-I分子)的更高亲和力和/或在包含新表位和MHC分子的复合体中具有对TCR的更高亲和力。在一些实施方案中，根据携带表位的新抗原的天然序列，在N末端或C末端或两末端延伸新表位以获得延伸的序列，其中该延伸的序列适合于由I类和II类MHC分子递呈。本文所述使用一种或多种新抗原肽的任何MASCT方法还可包括新抗原选择/鉴定步骤中的任何一者或多者。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)对取自个体的肿瘤样本进行测序以鉴定新抗原；(b)鉴定新抗原中的新表位；任选地(c)确定个体的MHC亚型(例如，使用测序数据)以鉴定个体的MHC分子；任选地(d)确定新表位对个体的MHC分子的亲和力；任选地(e)确定包含新表位和MHC分子的复合体对T细胞受体的亲和力；(f)将包含新表位的新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中；(g)制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(h)任选地施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(i)将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养；以及(j)向个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)对取自个体的肿瘤样本进行测序以鉴定新抗原；(b)鉴定新抗原中的新表位；任选地(c)确定个体的MHC亚型(例如，使用测序数据)以鉴定个体的MHC分子；任选地(d)确定新表位对个体的MHC分子的亲和力；任选地(e)确定包含新表位和MHC分子的复合体对T细胞受体的亲和力；(f)将包含新表位的新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中；(g)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(h)(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(i)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(j)(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(k)向个体施用有效量的活化T细胞，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从(诸如来自个体的)PBMC群获得，并且其中个体具有一种或多种新抗原。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括个体的多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)对取自个体的肿瘤样本进行测序以鉴定新抗原；(b)鉴定新抗原中的新表位；任选地(c)确定个体的MHC亚型(例如，使用测序数据)以鉴定个体的MHC分子；任选地(d)确定新表位对个体的MHC分子的亲和力；任选地(e)确定包含新表位和MHC分子的复合体对T细胞受体的亲和力；(f)将包含新表位的新抗原肽掺入多种肿瘤抗原肽中；(g)(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)使PBMC群与所述多种肿瘤抗原肽接触，以获得活化PBMC群；以及(h)向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。
MASCT之后的监测
本文所述的任一MASCT方法还可包括个体接受MASCT之后的监测步骤。治疗后监测可有利于调整个体的治疗方案以优化治疗结果。
例如，可基于个体对于多种肿瘤抗原肽中每一者的特异性免疫应答和/或个体对活化T细胞或活化PBMC的临床应答来调节或定制本文所述的多种肿瘤抗原肽，以便提供可用于一次或多次重复MASCT治疗的多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，可从抗原肽库中去除未能引发强烈特异性免疫应答的肿瘤抗原肽，以供将来制备经冲击处理的DC、活化T细胞或活化PBMC。在一些实施方案中，如果个体未对使用某种抗原肽库的MASCT治疗作出应答(诸如具有疾病进展、转移等体征)，则可调节该抗原肽库，或可将新抗原掺入抗原肽库中以用于第二周期的MASCT治疗。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)任选地向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞；以及(c)在施用活化T细胞之后监测个体。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定个体的新抗原(诸如通过对来自个体的肿瘤样本进行测序)，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位。在一些实施方案中，该方法还包括在施用活化T细胞之后监测个体。在一些实施方案中，该监测包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量。在一些实施方案中，该监测包括检测个体中针对所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该方法。
在一些实施方案中，提供了对在患有癌的个体中使用活化T细胞的治疗进行监测的方法，该方法包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量，和/或检测个体中针对多种肿瘤抗原肽每一者的特异性免疫应答，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来获得活化T细胞，并且其中该治疗包括任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞，以及向个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定个体的新抗原(诸如通过对来自个体的肿瘤样本进行测序)，基于新抗原来提供新抗原肽，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该治疗。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；(e)向个体施用有效量的活化T细胞；以及(f)在施用活化T细胞之后监测个体，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群(诸如来自个体)获得。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定个体的新抗原(诸如通过对来自个体的肿瘤样本进行测序)，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位。在一些实施方案中，该方法还包括在施用活化T细胞之后监测个体。在一些实施方案中，该监测包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量。在一些实施方案中，该监测包括检测个体中针对所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该方法。
在一些实施方案中，提供了对在患有癌的个体中使用活化T细胞的治疗进行监测的方法，该方法包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量，和/或检测个体中针对多种肿瘤抗原肽每一者的特异性免疫应答，其中通过包括以下各项的步骤来获得活化T细胞：(a)(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；(b)(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；以及(c)(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群(诸如来自个体)获得；并且其中该治疗包括任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞，以及向个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定个体的新抗原(诸如通过对来自个体的肿瘤样本进行测序)，基于新抗原来提供新抗原肽，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该治疗。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：(a)(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群；(b)向个体施用有效量的活化PBMC；以及(c)在施用活化PBMC之后监测个体。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定个体的新抗原(诸如通过对来自个体的肿瘤样本进行测序)，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位。在一些实施方案中，该方法还包括在施用活化PBMC之后监测个体。在一些实施方案中，该监测包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量。在一些实施方案中，该监测包括检测个体中针对所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该方法。
在一些实施方案中，提供了对在患有癌的个体中使用活化PBMC的治疗进行监测的方法，该方法包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量，和/或检测个体中针对多种肿瘤抗原肽每一者的特异性免疫应答，其中(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)通过使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触来获得活化PBMC，并且其中该治疗包括向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定个体的新抗原(诸如通过对来自个体的肿瘤样本进行测序)，基于新抗原来提供新抗原肽，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该治疗。
对于个体肿瘤抗原肽的特异性免疫应答可使用本领域中任何已知的方法确定，例如通过测量在受到个体肿瘤抗原肽刺激之后由T细胞(或PBMC)释放的细胞毒性因子(诸如穿孔素或颗粒酶B)或细胞因子(诸如IFNγ或TNFα)的水平来确定。可使用基于抗体的测定法(诸如ELISPOT)定量细胞毒性因子或细胞因子(诸如IFNγ)水平。ELISPOT测定法的示例性实施方案在实施例中进行描述。在一些实施方案中，将对肿瘤抗原肽作出应答而从T细胞(或PBMC)释放的细胞因子(诸如IFNγ)水平归一化为参照，诸如基线细胞因子释放水平、或对不相关肽作出应答而从T细胞(或PBMC)释放的非特异性细胞因子水平，从而提供细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值。在一些实施方案中，ELISPOT测定法中超过约1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10或更多中的任一数值的细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值指示对于肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫应答。在一些实施方案中，将在ELISPOT测定法中细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值小于约10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1.2或更小中的任一数值的肿瘤抗原肽从所述多种肿瘤抗原肽中去除，以提供多种定制肿瘤抗原肽供将来MASCT使用。
可由医师通过本领域已知的方法，诸如通过成像方法、验血、生物标记物评估和活检，来评估个体对MASCT方法的临床应答。在一些实施方案中，通过在接受MASCT之前和之后确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量来监测临床应答。在一些实施方案中，CTC已从原发性肿瘤脱落并循环于体液中。在一些实施方案中，CTC已从原发性肿瘤脱落并循环于血流中。在一些实施方案中，CTC是转移的指征。CTC数量可通过本领域已知的多种方法确定，包括但不限于CellSearch方法、Epic Science方法、isoflux和maintrac。在一些实施方案中，确定个体血液样本中的单种CTC(包括CTC的特异性亚型)的数量。在一些实施方案中，在接受MASCT之后个体中每mL血液样本超过约10、20、50、100、150、200、300个或更多个中的任一数量的单种CTC指示增加的转移风险和/或对MASCT的不良临床应答。在一些实施方案中，与在接受MASCT之前相比，在接受MASCT之后个体的增加数量(诸如至少约1.5、2、3、4、5、10倍或更多倍中的任一倍数的增加)的单种CTC指示对MASCT的不良临床应答。在一些实施方案中，确定个体血液样本中的CTC簇的数量。在一些实施方案中，在接受MASCT之后在个体的血液样本中检测到至少约1、5、10、50、100个或更多中任一数量的CTC簇指示增加的转移风险和/或对MASCT的不良临床应答。在一些实施方案中，与在接受MASCT之前相比，在接受MASCT之后个体的增加数量(诸如至少约1.5、2、3、4、5、10倍或更多倍中的任一倍数的增加)的CTC簇指示对MASCT的不良临床应答。
给药和施用方法
一般来讲，可根据个体的体型和身体状况及根据标准药学实践，确定活化T细胞、负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群以及活化PBMC的施用剂量、计划表和途径。示例性施用途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、囊内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内或透皮。在MASCT方法的一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在MASCT方法的一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在基于PBMC的MASCT方法的一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。
向个体施用的细胞的剂量可根据例如待施用的细胞的特定类型、施用途径以及待治疗的癌的特定类型和阶段而有所变化。该量应足以产生所需的应答，诸如对于癌的治疗应答，但没有严重毒性或不良事件。在一些实施方案中，待施用的活化T细胞或树突细胞的量是治疗有效量。在一些实施方案中，细胞(诸如负载多抗原的树突细胞、活化T细胞或活化PBMC)的量是这样的量：与治疗之前同一个体中的对应肿瘤尺寸、癌细胞数量或肿瘤生长速率相比，或与未接受治疗的其他个体中的对应活性相比，足以使肿瘤尺寸缩小、使癌细胞数量减少或使肿瘤生长速率降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一百分比。可使用标准方法测量该效应的大小，诸如采用纯化酶的体外测定法、基于细胞的测定法、动物模型或人体试验。
在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群以至少约1×105、5×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107或5×107个细胞/个体中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群以约1×105-5×105、5×105-1×106、1×106-2×106、2×106-3×106、3×106-4×106、4×106-5×106、5×106-6×106、6×106-7×106、7×106-8×106、8×106-1×108、1×106-3×106、3×106-5×106、5×106-7×106、2×106-4×106、1×106-5×106或5×106-1×107个细胞/个体中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞以至少约1×106个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞以约1×106至约5×106个细胞/个体的剂量施用。
在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群以至少约1×104、5×104、1×105、2×105、4×105、6×105、8×105、1×106、2×106或1×107个细胞/千克中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群以约1×104-5×104、5×104-1×105、1×105-2×105、2×105-4×105、4×105-6×105、6×105-8×105、8×105-1×106、1×106-2×106、2×106-1×107、1×104-1×105、1×105-1×106、1×106-1×107、1×104-1×106、或1×105-1×107个细胞/千克中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞以至少约2×105个细胞/千克的剂量施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞以约2×105至约1×106个细胞/千克的剂量施用。
在一些实施方案中，活化T细胞以至少约1×108、5×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、1.5×1010、2×1010或5×1010个细胞/个体中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞以约1×108至约5×108、约5×108至约9×108、约9×108至约1×109、约1×109至约2×109、约2×109至约3×109、约3×109至约4×109、约4×109至约5×109、约5×109至约6×109、约6×109至约1×1010、约1×109至约3×109、约3×109至约5×109、约5×109至约7×109、约7×109至约1×1010、约1×109至约5×109、约5×109至约1×1010、约3×109至约7×109、约1×1010至约1.5×1010、约1×1010至约2×1010、或约1×109至约1×1010个细胞/个体中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞以至少约3×109个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞以约1×109至约1×1010个细胞/个体的剂量施用。
在一些实施方案中，活化T细胞以至少约1×107、1×108、2×108、4×108、6×108、8×108、1×109、2×109、4×109、6×109、8×109、1×1010个细胞/千克中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞以约1×107至约1×108、约1×108至约2×108、约2×108至约4×108、约4×108至约6×108、约6×108至约8×108、约8×108至约1×109、约1×109至约2×109、约2×109至约4×109、约4×109至约1×1010、约2×108至约6×108、约6×108至约1×109、约1×108至约2×108、约2×108至约2×109、约1×107至约1×108、约1×108至约1×109、约1×109至约1×1010、或约1×107至约1×109个细胞/千克中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞以至少约6×108个细胞/千克的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞以约2×108至约2×109个细胞/千克的剂量施用。
在一些实施方案中，活化PBMC以至少约1×108、5×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、1.5×1010、2×1010或5×1010个细胞/个体中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，活化PBMC以约1×108至约5×108、约5×108至约9×108、约9×108至约1×109、约1×109至约2×109、约2×109至约3×109、约3×109至约4×109、约4×109至约5×109、约5×109至约6×109、约6×109至约1×1010、约1×109至约3×109、约3×109至约5×109、约5×109至约7×109、约7×109至约1×1010、约1×109至约5×109、约5×109至约1×1010、约3×109至约7×109、约1×1010至约1.5×1010、约1×1010至约2×1010、或约1×109至约1×1010个细胞/个体中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，活化PBMC以至少约1×109个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，活化PBMC以约1×109至约1×1010个细胞/个体的剂量施用。
在一些实施方案中，活化PBMC以至少约1×107、1×108、2×108、4×108、6×108、8×108、1×109、2×109、4×109、6×109、8×109、1×1010个细胞/千克中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，活化PBMC以约1×107至约1×108、约1×108至约2×108、约2×108至约4×108、约4×108至约6×108、约6×108至约8×108、约8×108至约1×109、约1×109至约2×109、约2×109至约4×109、约4×109至约1×1010、约2×108至约6×108、约6×108至约1×109、约1×108至约2×108、约2×108至约2×109、约1×107至约1×108、约1×108至约1×109、约1×109至约1×1010、或约1×107至约1×109个细胞/千克中的任一水平的剂量施用。在一些实施方案中，活化PBMC以约2×108至约2×109个细胞/千克的剂量施用。
在一些实施方案中，在施用时，稳定剂或赋形剂(诸如人类白蛋白)与活化T细胞、负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群和/或活化PBMC细胞一起使用。
可根据施用医师的判断，在治疗过程中调整MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法)中的细胞的剂量和给药计划表。在一些实施方案中，在施用负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞之后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或1个月中的任一时间施用活化T细胞。在一些实施方案中，活化T细胞与树突细胞同时施用。在一些实施方案中，在施用树突细胞之后约14-21天施用活化T细胞。在一些示例性实施方案中，在施用树突细胞之后约14天施用活化T细胞。采用示例性施用计划表的MASCT方法的示例性实施方案示于图1和图2A中。
MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)可涉及单次治疗或重复治疗。在一些实施方案中，活化T细胞施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或超过10次中的任意次数。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少3次。在一些实施方案中，树突细胞施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或超过10次中的任意次数。在一些实施方案中，树突细胞施用至少3次。在基于PBMC的MASCT方法的一些实施方案中，活化PBMC施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或超过10次中的任意次数。在基于PBMC的MASCT方法的一些实施方案中，活化PBMC施用至少3次。在一些实施方案中，在重复施用树突细胞、活化T细胞或这两者之前，重复一个或多个细胞(诸如抗原负载树突细胞或活化T细胞)制备步骤。在一些实施方案中，每周一次、2周一次、3周一次、4周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次或每年一次重复MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)。在一些实施方案中，每次施用树突细胞、活化T细胞或PBMC之间的间隔为约1周至2周、2周至1个月、2周至2个月、1个月至2个月、1个月至3个月、3个月至6个月或6个月至一年中的任一时间。在一些实施方案中，每次施用树突细胞、活化T细胞或PBMC之间的间隔为约0.5至约5个月，诸如约2周至约2个月，或约2个月至约5个月。在一些示例性实施方案中，MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)的所有步骤在治疗的最开始6个月期间每月重复一次，在治疗的第二个6个月内每两个月重复一次，并且如果个体具有稳定疾病，则在治疗的最开始12个月之后每半年重复一次。本文所述的MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)的任何实施方案可在重复治疗的整个过程中与MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)的任何其他实施方案相结合。
本文所提供的MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)可用作辅助环境或新辅助环境中的第一疗法、第二疗法、第三疗法或者与本领域已知的其他类型的癌疗法联合的疗法，所述其他类型的癌疗法诸如为化学疗法、外科手术、放射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等。在一些实施方案中，本发明提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括第一疗法，该第一疗法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中T细胞通过与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来活化。在用作第一疗法的方法的一些实施方案中，不存在用于个体的其他经批准的抗癌疗法。在一些实施方案中，MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)用作第二疗法，其中个体此前曾接受切除、射频消融、化学疗法、放射疗法或其他类型的癌疗法。在一些实施方案中，个体已发生疾病进展或不能耐受标准抗癌疗法。在一些实施方案中，个体在接受一次或多次MASCT治疗之前、同时或之后接受其他类型的癌疗法。例如，MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)可在另一种癌疗法(诸如化学疗法、放射、外科手术或它们的组合)之前或之后的数个间隔，所述数个间隔在数分钟、数天、数周到数月的范围内。在一些实施方案中，第一疗法与第二疗法之间的间隔使得MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)和另一种癌疗法(诸如化学疗法、放射、外科手术或它们的组合)的活化T细胞将能够对个体施加有利组合的效应。在一些实施方案中，MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)与另一种癌疗法(诸如化学疗法、放射、外科手术或它们的组合)联合用于治疗个体中的癌。本文所述的联合治疗方法可单独进行或与另一种疗法联合进行，所述另一种疗法诸如为外科手术、放射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、激素疗法、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、化学疗法等。另外，具有发展增殖性疾病的更高风险的个人可接受治疗以抑制和/或延迟疾病的发展。
在一些实施方案中，该方法包括抑制个体中的癌细胞增殖(诸如肿瘤生长)的方法，包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括抑制个体中的癌细胞增殖(诸如肿瘤生长)的方法，包括向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞，以及向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括抑制个体中的癌细胞增殖(诸如肿瘤生长)的方法，包括使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，活化T细胞或PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一百分比)的细胞增殖受到抑制。
在一些实施方案中，该方法包括抑制个体中的肿瘤转移的方法，包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括抑制个体中的肿瘤转移的方法，包括向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞，以及向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括抑制个体中的肿瘤转移的方法，包括使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，活化T细胞或PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)的转移受到抑制。在一些实施方案中，提供了抑制向淋巴结的转移的方法。
在一些实施方案中，该方法包括缩小个体中的肿瘤尺寸的方法，包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括缩小个体中的肿瘤尺寸的方法，包括向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞，以及向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括缩小个体中的肿瘤尺寸的方法，包括使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，活化T细胞或PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，肿瘤尺寸缩小至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一百分比)。
在一些实施方案中，该方法包括延长个体中的癌的无进展生存期的方法，包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括延长个体中的癌的无进展生存期的方法，包括向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞，以及向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括延长个体中的癌的无进展生存期的方法，包括使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，活化T细胞或PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，该方法将疾病进展时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一时间。
在一些实施方案中，该方法包括延长患有癌的个体的生存期的方法，包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括延长患有癌的个体的生存期的方法，包括向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞，以及向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在一些实施方案中，该方法包括延长患有癌的个体的生存期的方法，包括使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，活化T细胞或PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，该方法将疾病进展时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一时间。在一些实施方案中，该方法将个体的生存期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一时间。
在任何所述方法的一些实施方案中，该方法包括减少患有癌的个体中的AE和SAE的方法，包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在任何所述方法的一些实施方案中，该方法包括减少患有癌的个体中的AE和SAE的方法，包括向个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞，以及向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。在任何所述方法的一些实施方案中，该方法包括减少患有癌的个体中的AE和SAE的方法，包括使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，活化T细胞或PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。
在一些实施方案中，该方法能预测和/或引起客观应答(诸如部分应答或完全应答)。在一些实施方案中，该方法能预测和/或引起改善的生活质量。
除了通常与其他癌疗法相关联的常见不良事件之外，一些癌免疫疗法还与免疫相关不良事件(irAE)相关联。IrAE通常在机制上与对于表达于正常、非肿瘤组织中的靶抗原的在靶T细胞毒性(所谓的在靶/脱肿瘤效应)或脱靶效应(诸如破坏自身耐受性或表位交叉反应)相关。IrAE可导致皮肤、胃肠、内分泌、肝、眼、神经系统及其他组织或器官上的严重症状和病症。针对本领域已知的癌免疫治疗方法报告的典型irAE包括致命性免疫介导皮炎、肺炎、结肠炎、淋巴细胞性垂体炎、胰腺炎、淋巴结病、内分泌失调、CNS毒性等。在一些实施方案中，本文所述的MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法)与不良事件(诸如irAE)的低发生率相关联。在一些实施方案中，小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％中的任一百分比的个体经历irAE，诸如2-5级的irAE。
免疫检查点抑制剂
在一些实施方案中，MASCT方法例如在制备活化T细胞或PBMC(诸如在共培养之前和/或期间)中和/或在联合疗法中使用免疫检查点抑制剂。可使用任何已知的免疫检查点抑制剂，包括但不限于本章节中所述的免疫检查点抑制剂。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抑制性免疫检查点分子的天然或经工程改造的配体，包括例如CTLA-4的配体(例如，B7.1、B7.2)、TIM-3的配体(例如，半乳糖凝集素-9)、A2a受体的配体(例如，腺苷、瑞加德松)、LAG-3的配体(例如，MHC I类或MHC II类分子)、BTLA的配体(例如，HVEM、B7-H4)、KIR的配体(例如，MHC I类或MHC II类分子)、PD-1的配体(例如，PD-L1、PD-L2)、IDO的配体(例如，NKTR-218、Indoximod、NLG919)以及CD47的配体(例如，SIRP-α受体)。
免疫检查点抑制剂可具有任何合适的分子形态，包括但不限于小分子、核酸(诸如DNA、RNAi或适配体)、肽或蛋白(诸如抗体)。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是靶向抑制性免疫检查点蛋白的抗体(诸如拮抗剂抗体)，其选自抗CTLA-4(例如，伊匹单抗、曲美木单抗、KAHR-102)、抗TIM-3(例如，F38-2E2、ENUM005)、抗LAG-3(例如，BMS-986016、IMP701、IMP321、C9B7W)、抗KIR(例如，利瑞鲁单抗和IPH2101)、抗PD-1(例如，纳武单抗、Pidilizumab、派姆单抗、BMS-936559、阿特珠单抗、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042)、抗PD-L1(例如，KY-1003(EP20120194977)、MCLA-145、RG7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB0010718C、AUR-012、STI-A1010、PCT/US2001/020964、MPDL3280A、AMP-224、Dapirolizumab pegol(CDP-7657)、MEDI-4920)、抗CD73(例如，AR-42(OSU-HDAC42,HDAC-42,AR42,AR 42,OSU-HDAC 42,OSU-HDAC-42,NSC D736012,HDAC-42,HDAC42,HDAC42,NSCD736012,NSC-D736012)、MEDI-9447)、抗B7-H3(例如，MGA271、DS-5573a、8H9)、抗CD47(例如，CC-90002、TTI-621、VLST-007)、抗BTLA、抗VISTA、抗A2aR、抗B7-1、抗B7-H4、抗CD52(诸如阿仑单抗)、抗IL-10、抗IL-35以及抗TGF-β(诸如Fresolumimab)。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是抗原结合片段，其选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、BiTE、纳米抗体以及全长抗体的其他抗原结合子序列或它们经工程改造的组合。在一些实施方案中，抗体是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性或多特异性抗体。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。示例性抗PD-1抗体包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab、BMS-936559，以及阿特珠单抗、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110和TSR-042。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是纳武单抗(例如，
Figure BDA0001405186940001121
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗(例如，
Figure BDA0001405186940001122
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是SHR-1210。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。示例性抗PD-L1抗体包括但不限于KY-1003、MCLA-145、RG7446、BMS935559、MPDL3280A、MEDI4736、Avelumab或STI-A1010。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA-4抗体包括但不限于伊匹单抗、曲美木单抗和KAHR-102。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗(例如，
Figure BDA0001405186940001131
)。
培养基中的免疫检查点抑制剂的合适浓度包括但不限于至少约1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL或1mg/mL中的任一浓度。在一些实施方案中，培养基中的免疫检查点抑制剂的浓度为约1μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约25μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约50μg/mL至约100μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约200μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约1mg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、或约1μg/mL至约100μg/mL中的任一浓度。
任何上述MASCT方法(包括基于PMBC的MASCT方法和精确MASCT方法)可与一种或多种免疫检查点抑制剂的施用联合应用。免疫检查点抑制剂的示例性施用途径包括但不限于瘤内、膀胱内、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、颅内、胸膜内、皮下和表皮途径，或递送到已知含有此类活癌细胞的淋巴腺、体腔、器官或组织中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂经静脉内施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂通过输注来施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时或更久中的任一时间内输注。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂经由与活化T细胞或活化PBMC相同的施用途径来施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂经由与活化T细胞或活化PBMC不同的施用途径来施用。
免疫检查点抑制剂的合适剂量包括但不限于约1mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、20mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、200mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、750mg/m2、1000mg/m2或更多中的任一剂量。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂的剂量为约1至约5mg/m2、约5至约10mg/m2、约10至约20mg/m2、约20至约50mg/m2、约50至约100mg/m2、约100mg/m2至约200mg/m2、约200至约300mg/m2、约300至约400mg/m2、约400至约500mg/m2、约500至约750mg/m2或约750至约1000mg/m2中的任一剂量。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂的剂量为约1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg或更多中的任一剂量。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂的剂量为约1μg/kg至约5μg/kg、约5μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约0.1mg/kg、约0.1mg/kg至约0.2mg/kg、约0.2mg/kg至约0.3mg/kg、约0.3mg/kg至约0.4mg/kg、约0.4mg/kg至约0.5mg/kg、约0.5mg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约100mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg中的任一剂量。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂每天施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂一周施用至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次或7次(即，每天)中的任一次数。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂每周施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂每周不间断施用；三周中有两周每周施用；四周中有三周每周施用；每两周施用一次；每3周施用一次；每4周施用一次；每6周施用一次；每8周施用一次；每月或每2到12个月施用一次。在一些实施方案中，每次施用之间的间隔小于约6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天中的任一时间。在一些实施方案中，每次施用之间的间隔超过约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月或12个月中的任一时间。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂每3个月施用一次。在一些实施方案中，给药计划表中不存在间断。在一些实施方案中，每次施用之间的间隔不超过约一周。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂采用与活化T细胞或活化PBMC相同的给药计划表来施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂采用与活化T细胞或活化PBMC不同的给药计划表来施用。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在每个MASCT治疗周期中施用。例如，免疫检查点抑制剂可在每个MASCT治疗周期中施用约1、2、3、4、5、6次或更多次中的任一次数。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂并不在每个MASCT治疗周期中都施用。例如，免疫检查点抑制剂可以每1、2、3、4、5个或更多个MASCT治疗周期施用约一次。
免疫检查点抑制剂的施用可在延长时间段，诸如从约一个月直至约七年内进行。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72或84个月中的任一者的时间段内施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂施用单次。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂重复地施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂重复地施用直到疾病进展。
T细胞受体(TCR)
本发明在一个方面还提供了从用本文所述任何MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT和精确MASCT)治疗的个体克隆肿瘤特异性T细胞受体的方法。
因此，在一些实施方案中，提供了克隆肿瘤特异性T细胞受体的方法，该方法包括：(a)任选地向患有癌的个体施用有效量的负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞，(b)向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞；(c)从个体分离T细胞，其中该T细胞特异性地识别所述多种肿瘤抗原肽中的肿瘤抗原肽；以及(d)从该T细胞克隆T细胞受体以提供肿瘤特异性T细胞受体。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群来源于同一个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定个体的新抗原(诸如通过对来自个体的肿瘤样本进行测序)，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位。在一些实施方案中，该方法还包括在施用活化T细胞之后监测个体。在一些实施方案中，该监测包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量。在一些实施方案中，该监测包括检测个体中针对所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该方法。
在一些实施方案中，提供了克隆肿瘤特异性T细胞受体的方法，该方法包括：(a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群(诸如在存在GM-CSF和IL-4的情况下)；(b)(诸如在存在多种Toll样受体(TLR)激动剂的情况下)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(c)任选地向个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)(诸如在存在多种细胞因子和任选地抗CD3抗体的情况下)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；其中单核细胞群和非粘附PBMC群从PBMC群(诸如来自个体)获得；(e)向个体施用有效量的活化T细胞；(f)从个体分离T细胞，其中该T细胞特异性地识别所述多种肿瘤抗原肽中的肿瘤抗原肽；以及(g)从该T细胞克隆T细胞受体以提供肿瘤特异性T细胞受体。在一些实施方案中，树突细胞的施用与活化T细胞的施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天或约14天)。在一些实施方案中，共培养持续约7天至约21天(诸如约7天至约14天，或约14天至约21天)。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞施用至少三次。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定个体的新抗原(诸如通过对来自个体的肿瘤样本进行测序)，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位。在一些实施方案中，该方法还包括在施用活化T细胞之后监测个体。在一些实施方案中，该监测包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量。在一些实施方案中，该监测包括检测个体中针对所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该方法。
在一些实施方案中，提供了克隆肿瘤特异性T细胞受体的方法，该方法包括：(a)(诸如在存在免疫检查点抑制剂的情况下)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，(b)向患有癌的个体施用有效量的PBMC；(c)从个体分离T细胞，其中该T细胞特异性地识别所述多种肿瘤抗原肽中的肿瘤抗原肽；以及(d)从该T细胞克隆T细胞受体以提供肿瘤特异性T细胞受体。在一些实施方案中，活化PBMC施用至少三次。在一些实施方案中，活化PBMC的每次施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，该PBMC群从正接受治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和任选地第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂，诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA或LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，基于具有癌中的低突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原来选择个体进行该治疗方法。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定个体的新抗原(诸如通过对来自个体的肿瘤样本进行测序)，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位。在一些实施方案中，该方法还包括在施用活化PBMC之后监测个体。在一些实施方案中，该监测包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量。在一些实施方案中，该监测包括检测个体中针对所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。在一些实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该方法。
在一些实施方案中，从对MASCT方法作出应答的个体，例如在MASCT之后具有减少的CTC数量或较低CTC数量的个体、具有疾病稳定(SD)、完全应答(CR)或部分应答(PR)的临床评价的个体克隆TCR。在一些实施方案中，从不对MASCT方法作出应答的个体克隆TCR。在一些实施方案中，个体具有针对肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫应答。对于个体肿瘤抗原肽的特异性免疫应答可使用本领域中任何已知的方法确定，例如通过测量在受到个体肿瘤抗原肽刺激之后由T细胞(或PBMC)释放的细胞毒性因子(诸如穿孔素或颗粒酶B)或细胞因子(诸如IFNγ或TNFα)的水平来确定。可使用基于抗体的测定法(诸如ELISPOT)定量细胞毒性因子或细胞因子(诸如IFNγ)水平。在一些实施方案中，将对肿瘤抗原肽作出应答而从T细胞(或PBMC)释放的细胞因子(诸如IFNγ)水平归一化为参照，诸如基线细胞因子释放水平、或对不相关肽作出应答而从T细胞(或PBMC)释放的非特异性细胞因子水平，从而提供细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值。在一些实施方案中，ELISPOT测定法中超过约1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10或更多中的任一数值的细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值指示对于肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫应答。在一些实施方案中，克隆TCR的方法还包括确定个体中(诸如个体的PBMC样本中)的所述多种肿瘤抗原肽中每一者的特异性免疫应答。
可在接受MASCT之后从来自个体的生物样本分离T细胞。在一些实施方案中，在一个周期的MASCT之后从个体获得生物样本。在一些实施方案中，在至少2、3、4、5个或更多个周期中任一周期数的MASCT之后从个体获得生物样本。在一些实施方案中，在接受MASCT后至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、2个月或3个月中的任一时间之后从个体获得生物样本。在一些实施方案中，在接受MASCT后不超过约6个月、3个月、2个月、1个月或更少中的任一时间之后从个体获得生物样本。在一些实施方案中，生物样本是血液样本。在一些实施方案中，生物样本是PBMC样本。在一些实施方案中，生物样本是T细胞样本。在一些实施方案中，生物样本是包含CTL的肿瘤样本。可使用本领域中任何已知的方法，例如通过流式细胞术或离心方法从生物样本分离T细胞。在一些实施方案中，例如通过以下方式，针对其对于所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答来筛选从生物样本获得的多个T细胞：用多聚体(诸如五聚体或dextramers)染色，或确定细胞释放的细胞毒性因子(诸如穿孔素或颗粒酶B)或细胞因子(诸如IFNγ或TNFα)的水平。
T细胞特异性地识别的肿瘤抗原肽可以是来自肿瘤抗原肽库的任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽包含MHC-I限制性表位。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽包含MHC-II限制性表位。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽是普通癌肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽是癌类型特异性肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽是新抗原肽。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽包含来源于CEA或hTERT的表位。
TCR可使用本领域已知的任何方法从T细胞克隆，所述方法包括但不限于采用特异性地退火到TCR可变结构域的引物的PCR方法。在一些实施方案中，使用扩增子拯救多重PCR(或arm-PCR)来克隆肿瘤特异性TCR。参见例如美国专利7,999,092。还可使用从单种T细胞克隆肿瘤抗原特异性TCR的方法来克隆TCR。参见例如E.Kobayashi et al.NatureMedicine 19.11(2013):1542-1546(E.Kobayashi等人，《自然医学》，第19卷，第11期，2013年，第1542-1546页)。在一些实施方案中，对T细胞进行测序以确定TCR基因的序列，从而允许对TCR进行克隆。
在一些实施方案中，将所克隆的TCR进一步掺入表达载体中。在一些实施方案中，将所克隆的TCR进一步转导(诸如通过病毒载体，或通过物理或化学方法)到宿主细胞(诸如T细胞)中以表达TCR。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞。在一些实施方案中，测定表达TCR的宿主细胞对肿瘤抗原肽的特异性免疫应答以便进行验证。在一些实施方案中，宿主细胞来源于细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞是原代细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞。在一些实施方案中，宿主细胞来源于癌患者。
本文还提供了使用本文所述的任何方法克隆的肿瘤特异性TCR。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR经进一步工程改造，以改善TCR的物理/化学特性和/或功能。例如，经工程改造的肿瘤特异性TCR可具有增强的表达水平、改善的稳定性、增强的对MHC-肿瘤特异性抗原肽复合体的结合亲和力和/或增强的信号传导。在一些实施方案中，基于接受使用肿瘤特异性TCR的免疫疗法治疗的个体的MHC亚型，来对肿瘤特异性TCR进行工程改造。在一些实施方案中，该工程改造包括使所克隆的肿瘤特异性TCR的可变区中的一个或多个位置发生突变。在一些实施方案中，该工程改造包括提供融合蛋白，该融合蛋白包含所克隆的肿瘤特异性TCR的一个或多个结构域或片段。
在一些实施方案中，提供了分离的核酸，该核酸编码肿瘤特异性TCR或其组分或衍生物(诸如TCRα链、TCRβ链或经工程改造的肿瘤特异性TCR)。在一些实施方案中，提供了表达载体，该表达载体编码肿瘤特异性TCR或其组分或衍生物(诸如TCRα链、TCRβ链或经工程改造的肿瘤特异性TCR)。在一些实施方案中，提供了分离的宿主细胞，该宿主细胞表达肿瘤特异性TCR或其组分或衍生物(诸如TCRα链、TCRβ链或经工程改造的肿瘤特异性TCR)。
在一些实施方案中，提供了分离的T细胞，该T细胞包含肿瘤特异性TCR或其组分或衍生物(诸如TCRα链、TCRβ链或经工程改造的肿瘤特异性TCR)。在一些实施方案中，分离的T细胞的内源TCR被敲除。在一些实施方案中，分离的T细胞是TCR-T细胞。在一些实施方案中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含分离的T细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，分离的T细胞来源于患有癌的个体。在一些实施方案中，分离的T细胞来源于要用分离的T细胞或其药物组合物治疗的个体。
分离的T细胞或其药物组合物可用于治疗从其克隆肿瘤特异性TCR的个体，或可用于治疗另一个体，诸如同种异体个体、或具有相同MHC基因型和/或在癌细胞上表达相同表位的个体。在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述任何分离的T细胞或其药物组合物。采用包含所克隆的肿瘤特异性TCR的分离的T细胞的免疫疗法可以单独地使用，或与其他治疗，诸如免疫检查点抑制剂、MASCT(包括基于PBMC的MASCT和精确MASCT)、化学疗法、放射、外科手术、靶向疗法等联合使用，以实现所需的临床结果。
活化T细胞
本发明还提供了包含活化T细胞的分离的细胞群，其中小于约1％的活化T细胞是调节性T(TREG)细胞。可通过此前章节中所述的制备活化T细胞群的任何方法，来制备本文所述分离的细胞群。本文所述分离的细胞群可用于在个体中治疗癌、预防肿瘤进展或减少免疫逃避。
本文所述分离的细胞群主要包含活化T细胞。在一些实施方案中，分离群体中至少约90％的细胞是活化T细胞。在一些实施方案中，群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％中的任一百分比的细胞是活化T细胞。在一些实施方案中，分离群体中约50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、95％-98％、50％-70％、60％-80％、90％-99％、50％-80％、80％-99％、50％-90％、60％-90％、70％-99％或50％-99％中的任一百分比的细胞是活化T细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群包含CD4+CD25+Foxp3+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约10％、5％、3％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0.01％中的任一百分比的CD4+CD25+Foxp3+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约5％-10％、3％-5％、1％-3％、0.9％-1％、0.8％-0.9％、0.7％-0.8％、0.6％-0.7％、0.5％-0.6％、0.4％-0.5％、0.3％-0.4％、0.2％-0.3％、0.1％-0.2％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、0.2％-0.6％、0.4％-0.8％、0.3％-0.7％或0.3％-0.5％中的任一百分比的CD4+CD25+Foxp3+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约0.3％至约0.5％CD4+CD25+Foxp3+细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群包含调节性T细胞(TREG)。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约10％、5％、3％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0.01％中的任一百分比的TREG细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约5％-10％、3％-5％、1％-3％、0.9％-1％、0.8％-0.9％、0.7％-0.8％、0.6％-0.7％、0.5％-0.6％、0.4％-0.5％、0.3％-0.4％、0.2％-0.3％、0.1％-0.2％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、0.2％-0.6％、0.4％-0.8％、0.3％-0.7％或0.3％-0.5％中的任一百分比的TREG细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约0.3％至约0.5％TREG细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群包含CD3+CD8+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％中的任一百分比的CD3+CD8+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约50％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、50％-65％、65％-80％、65％-70％或65％-75％中的任一百分比的CD3+CD8+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约65％至约75％CD3+CD8+细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群包含细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％中的任一百分比的细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约50％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、50％-65％、65％-80％、65％-70％或65％-75％中的任一百分比的细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约65％至约75％细胞毒性T细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群包含CD3+CD4+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约10％、13％、16％、18％、20％、22％、25％或30％中的任一百分比的CD3+CD4+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约10％-13％、13％-16％、16％-18％、18％-20％、20％-22％、22％-25％、25％-30％、16％-20％、18％-22％或16％-22％中的任一百分比的CD3+CD4+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约16％至约22％CD3+CD4+细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群包含辅助T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约10％、13％、16％、18％、20％、22％、25％或30％中的任一百分比的辅助T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约10％-13％、13％-16％、16％-18％、18％-20％、20％-22％、22％-25％、25％-30％、16％-20％、18％-22％或16％-22％中的任一百分比的辅助T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约16％至约22％辅助T细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群包含CD3+CD56+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约10％、12％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％或20％中的任一百分比的CD3+CD56+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约10％-12％、12％-13％、13％-13.5％、13.5％-14％、14％-14.5％、14.5％-15％、15％-20％、13％-14％、14％-15％、13.5％-14.5％或13％-15％中的任一百分比的CD3+CD56+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约13％至约15％CD3+CD56+细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群包含自然杀伤(NK)T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约10％、12％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％或20％中的任一百分比的NK T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含小于约10％-12％、12％-13％、13％-13.5％、13.5％-14％、14％-14.5％、14.5％-15％、15％-20％、13％-14％、14％-15％、13.5％-14.5％或13％-15％中的任一百分比的NK T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约13％至约15％NK T细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群包含约0.3％至约0.5％CD4+CD25+Foxp3+细胞、约65％至约75％CD3+CD8+细胞以及约16％至约22％CD3+CD4+细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群包含约0.3％至约TREG细胞、约65％至约75％细胞毒性T细胞以及约16％至约22％辅助T细胞。在一些实施方案中，分离的细胞群还包含记忆T细胞。
在一些实施方案中，分离的细胞群的任何实施方案中的活化T细胞能够在体内或离体引发对多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。在一些实施方案中，活化T细胞能够提高人类个体中针对超过一种肿瘤抗原肽的细胞毒性T细胞活性。在一些实施方案中，活化T细胞的特征在于促炎信号分子的高表达或分泌水平以及免疫抑制细胞因子的低表达或分泌水平。在一些实施方案中，通过以下方式确定表达或分泌水平：将活化T细胞的分子(诸如促炎信号分子或免疫抑制细胞因子)的表达或分泌水平与对照表达或分泌水平进行比较。在一些实施方案中，分子的对照表达或分泌水平是在相同测定条件下测得的该分子在对照T细胞群中的表达或分泌水平。在一些实施方案中，对照T细胞群是由多种不相关肽(诸如不与T细胞受体抗原对应的肽或随机肽)诱导的T细胞群。在一些实施方案中，分子的对照表达或分泌水平是该分子在多个对照T细胞群中的平均或中值表达或分泌水平。在一些实施方案中，活化T细胞中的分子的高表达或分泌水平是对照表达或分泌水平的至少约1.5、2、2.5、3、4、5、10、20、50、100、1000倍或更多倍中的任一倍数。在一些实施方案中，活化T细胞中的分子的低表达或分泌水平小于对照表达或分泌水平的0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.75或0.8倍中的任一倍数。
在一些实施方案中，活化T细胞表达多种促炎分子，诸如IFNγ、TNFα、颗粒酶B、穿孔素或它们的任意组合。在一些实施方案中，活化T细胞没有免疫抑制细胞因子(诸如IL-10和/或IL-4)的表达或有免疫抑制细胞因子的低表达。在一些实施方案中，表达免疫抑制性分子(诸如PD-1)的活化T细胞(诸如CD3+CD4+细胞或CD3+CD8+细胞)的频率较低。在一些实施方案中，表达PD-1的活化T细胞的频率小于约10％、5％、3％、2％或1％中的任一百分比。在某个实施方案中，小于约5％的活化T细胞表达免疫抑制性分子PD-1。
本文所述分离的细胞群可用于在向个体施用时在个体中产生特异性免疫记忆。在一些实施方案中，个体具有记忆T细胞，该记忆T细胞可在分离的细胞群施用后约2周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、12个月或更久中的任一时间之后引发对于多种肿瘤抗原肽的特异性T细胞应答。
本文所述分离的细胞群还可用于在体内改变免疫抑制性信号。在一些实施方案中，当向个体施用时，分离的细胞群降低个体中的T细胞(诸如细胞毒性T细胞或辅助T细胞)上的免疫抑制性分子(诸如PD-1)表达频率。在一些实施方案中，分离的细胞群降低个体中的癌细胞的免疫耐受性或免疫逃避。因此，提供了降低个体的T细胞中的免疫抑制性分子(诸如PD-1)的表达频率的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述分离的细胞群的任何实施方案。本文还提供了包含具有活化T细胞的分离的细胞群的任何实施方案的免疫治疗组合物，以及分离的细胞群的任何实施方案在制造用于治疗个体中的癌的药剂方面的用途。
组合物、试剂盒和制品
本发明还提供了用于本文所述MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT)或细胞(诸如抗原负载DC、活化T细胞或活化PBMC)制备方法的任何实施方案中的肿瘤抗原肽的试剂盒、组合物(诸如药物组合物)和商业批次。
在一些实施方案中，提供了可用于癌免疫疗法的试剂盒，其包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该试剂盒包括超过约10、15、20、25、30、35、40、45或50种中的任一数量的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽和第二组癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包含约10至约20种普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包含不止1种普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包含超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任一数量的普通肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第二组包含约1至约10种癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包含超过约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任一数量的癌类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包含超过约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任一数量的病毒特异性抗原肽。在一些实施方案中，该试剂盒还包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、30、40或50种中的任一数量的新抗原肽。
在一些实施方案中，提供了可用于癌免疫疗法的试剂盒，其包括至少10种肿瘤抗原肽，其中所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。在一些实施方案中，提供了可用于癌免疫疗法的试剂盒，其包括至少10种肿瘤抗原肽，其中所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-24的表位。在一些实施方案中，提供了可用于癌免疫疗法的试剂盒，其包括选自图2B中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，提供了可用于癌免疫疗法的试剂盒，其包括选自图2C和图29A中的肿瘤抗原肽的至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，提供了可用于癌免疫疗法的试剂盒，其包括至少10种肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽来源于选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA1、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR的蛋白。
本领域技术人员可使用来自第一核心组的肿瘤抗原肽的任意组合以及任选地来自第二组的癌类型特异性抗原肽的任意组合和/或新抗原肽来负载树突细胞群，然后可进一步使用该树突细胞群制备可用于治疗个体中的癌的活化T细胞。该试剂盒还可用于基于PBMC的MACT方法、精确MASCT方法或用于从接受MASCT的个体克隆肿瘤特异性TCR。
该试剂盒可包括附加组分，诸如容器、试剂、培养基、细胞因子、缓冲液、抗体等，以有利于执行MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)的任何实施方案或用于从接受MASCT的个体克隆肿瘤特异性TCR的方法。例如，在一些实施方案中，该试剂盒还包括外周血采集与储存设备，该设备可用于采集个体的外周血。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于外周血的密度梯度离心的容器和试剂，该密度梯度离心可用于从人类外周血样本分离PBMC。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于从外周血获得树突细胞的培养基、细胞因子或缓冲液。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于将第一核心组和任选地第二组负载到树突细胞中以获得负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞的培养基、TLR激动剂、试剂和缓冲液。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于将从外周血获得的T细胞与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞共培养的细胞因子、抗CD3抗体、缓冲液、免疫检查点抑制剂或培养基。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于确定癌细胞中的突变负荷(诸如一种或多种MHC基因中)的试剂。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于与MASCT联合的疗法的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于鉴定肿瘤样本中的新抗原(诸如通过测序)的试剂。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于评估对于所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答的ELISPOT测定法。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于克隆肿瘤特异性TCR的试剂。
本发明的试剂盒处于合适的包装中。适当的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软包装(例如，聚酯薄膜或塑料袋)等。该试剂盒可以任选地提供附加组分，诸如缓冲液和说明信息。因此本申请还提供了制品，其包括小瓶(诸如密封的小瓶)、瓶、罐、软包装等。
说明书还可包括与肿瘤抗原肽(和任选地上述附加组分)的使用相关的说明书。在一些实施方案中，该试剂盒还包括说明性手册，诸如描述MASCT方法(包括基于PBMC的MASCT方法和精确MASCT方法)的实施方案、如本文所述的细胞制备方法的实施方案或克隆肿瘤特异性TCR的方法的实施方案的方案的手册。说明书还可包括关于使用试剂盒制备的用于预期治疗的抗原递呈细胞(诸如树突细胞)、活化T细胞和/或活化PBMC的剂量、给药计划表和施用途径的信息。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于选择个体进行MASCT方法的说明书。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于在个体中确定癌细胞的突变负荷和/或确定新抗原的数量的说明书。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于联合施用免疫检查点抑制剂和MASCT的说明书，包括例如关于免疫检查点抑制剂的剂量、给药计划表和施用途径的信息。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于鉴定肿瘤样本中的新抗原(诸如通过测序)的说明书。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于在接受MASCT之后监测个体的说明书。在一些实施方案中，该试剂盒还包括用于克隆肿瘤特异性TCR的说明书。
容器可以是单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，可提供这样的试剂盒，所述试剂盒包括足够的本文所公开的肿瘤抗原肽，可以制备足够的活化T细胞和/或抗原负载树突细胞(诸如树突细胞)以在延长的时间段诸如3周、6周、9周、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、1年或更久中的任一时间内提供个体的有效治疗。
试剂盒还可包括肿瘤抗原肽的多个单位剂量和使用说明书，并且以足以用于在药房(例如，医院药房和配药房)中储存和使用的数量包装。
在一些实施方案中，提供了如本文所述的肿瘤抗原肽群体或试剂盒的商业批次。本文所用的“商业批次”是指至少约10mg的批次大小。在一些实施方案中，批次大小是至少约10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000或10000mg中的任一批次大小。在一些实施方案中，商业批次包括含有本文所述任意组合物(诸如肿瘤抗原肽群体或试剂盒)的多个小瓶。在一些实施方案中，商业批次包括至少约5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、2000、5000或10000个小瓶中的任一数量。例如，每个小瓶包含至少约0.1mg的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽为液体悬液的形式。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽为粉末形式，诸如冻干粉。
还提供了本文所述的任何分离的细胞(诸如树突细胞、活化T细胞、活化PBMC或包含肿瘤特异性TCR的分离的T细胞)群的试剂盒、组合物(诸如药物组合物)和商业批次。
本文所述分离的细胞群可通过以下方式用于药物组合物或制剂中：将所述分离的细胞群与药学上可接受的载体、赋形剂、稳定剂和/或本领域已知的其他用于本文所述治疗方法、施用方法和给药方案的药剂相组合。在一些实施方案中，人类白蛋白用作药学上可接受的载体。
合适的药用载体包括无菌水；盐水；右旋糖；水或盐水中的右旋糖；每摩尔蓖麻油结合约30至约35摩尔环氧乙烷的蓖麻油与环氧乙烷的缩合产物；液体酸；低级烷醇；油，诸如玉米油、花生油、芝麻油等，含有乳化剂，诸如脂肪酸的单或双甘油酯、或磷脂如卵磷脂等；二醇；聚烷二醇；在单独的或与合适分配剂诸如卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯等相结合的助悬剂例如羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚(乙烯吡咯烷酮)等存在下的水性介质。该载体还可包含佐剂，诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂等，以及渗透增强剂。最终形式可为无菌的，并且还能够容易地通过注射装置诸如中空针。通过适当选择溶剂或赋形剂可以实现并保持适当粘度。
本文所述的药物组合物可包括其他药剂、赋形剂或稳定剂以改善组合物的特性。合适的赋形剂和稀释剂的示例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐溶液、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁以及矿物油。在一些实施方案中，药物组合物被配制成具有在约4.5至约9.0范围内的pH，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5或约6.5至约7.0中任一范围的pH范围。在一些实施方案中，还可以通过加入合适的渗透调节剂诸如甘油使得药物组合物与血液等渗。
在一些实施方案中，分离的细胞组合物(诸如药物组合物)适用于向人类施用。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)适用于以肠胃外施用方式向人类施用。适用于肠胃外施用的制剂包括：可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂及使得制剂与预期接受者的血液相容的溶质的水性和非水性等渗无菌注射液，以及可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬液。制剂可以单位剂量或多剂量密封的容器(诸如安瓿和小瓶)提供，并且可以储存在一定条件下，这仅需要在即刻使用之前在本文所述的治疗方法、施用方法和给药方案中加入无菌液体赋形剂(即，水)以便注射。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)包含于单次使用的小瓶(诸如单次使用的密封小瓶)中。在一些实施方案中，每个单次使用的小瓶包含约109个活化T细胞。在一些实施方案中，每个单次使用的小瓶包含足以扩增到约109个活化T细胞的活化T细胞。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)包含于多次使用的小瓶中。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)批量包含于容器中。
还提供了包含本文所述分离的细胞组合物(诸如药物组合物)和制剂的单位剂型。这些单位剂型可以单个或多个单位剂量储存于合适的包装中，并且还可进一步灭菌和密封。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)还包含可用于治疗癌的一种或多种其他化合物(或其药学上可接受的盐)。在各种变型中，药物组合物中的活化T细胞的数量包括在以下范围中的任一范围中：约1×108至约5×108、约5×108至约9×108、约9×108至约1×109、约1×109至约2×109、约2×109至约3×109、约3×109至约4×109、约4×109至约5×109、约5×109至约6×109、约6×109至约1×1010、约1×109至约3×109、约3×109至约5×109、约5×109至约7×109、约7×109至约1×1010、约1×109至约5×109、约5×109至约1×1010、约3×109至约7×109、约1×1010至约1.5×1010、约1×1010至约2×1010、或约1×109至约1×1010个细胞。在一些实施方案中，活化T细胞是包含于组合物中的用于治疗癌的唯一药物活性剂。
在一些实施方案中，提供了包含本文所述任何分离的细胞组合物(诸如药物组合物)的用于治疗癌的剂型(例如，单位剂型)。在一些实施方案中，提供了制品，所述制品包含处于合适包装中的用于本文所述治疗方法、施用方法和给药方案的本文所述组合物(诸如药物组合物)、制剂和单位剂量。用于本文所述组合物(诸如药物组合物)的合适包装是本领域已知的，并且包括例如小瓶(诸如密封的小瓶)、器皿(诸如密封的器皿)、安瓿、瓶、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。这些制品可进一步灭菌和/或密封。
本申请还提供了试剂盒，所述试剂盒包括用于本文所述治疗方法、施用方法和给药方案的分离的细胞群、组合物(诸如药物组合物)、制剂、单位剂量和制品中的任一者。本文所述的试剂盒包括含有活化T细胞的一个或多个容器。
在一些实施方案中，提供了本文所述活化T细胞的商业批次。本文所用的“商业批次”是指至少约1×109个活化T细胞的批次大小。在一些实施方案中，批次大小为至少约1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、5×1010或1×1011个细胞中的任一批次大小。在一些实施方案中，商业批次包括含有本文所述任意组合物(诸如药物组合物)的多个小瓶。在一些实施方案中，商业批次包括至少约5、10、15、20、25、50、75或100个小瓶中的任一数量。例如，每个小瓶包含至少约1×109个活化T细胞。
以下实施例和示例性实施方案旨在纯粹作为本发明的示例，因此不应认为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细说明以举例说明的方式提供，而非以限制的方式提供。
示例性实施方案
实施方案1。在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。
实施方案2。在实施方案1的一些另外实施方案中，该个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。
实施方案3。在实施方案1的一些另外实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。
实施方案4。在实施方案3的一些另外实施方案中，树突细胞在施用活化T细胞之前施用。
实施方案5。在实施方案4的一些另外实施方案中，树突细胞在施用活化T细胞之前约7天至约21天(诸如约7天至约14天或约14天至约21天)施用。
实施方案6。在实施方案1至5中任一项的一些另外实施方案中，该方法还包括通过将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备活化T细胞。
实施方案7。在实施方案6的一些另外实施方案中，将T细胞群与树突细胞群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约14天或约14天至约21天)。
实施方案8。在实施方案1至7中任一项的一些另外实施方案中，在共培养之前使T细胞群与免疫检查点抑制剂接触。
实施方案9。在实施方案1至8中任一项的一些另外实施方案中，在存在免疫检查点抑制剂的情况下，将T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养。
实施方案10。在实施方案8或实施方案9的一些另外实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1和CTLA-4的免疫检查点分子的抑制剂。
实施方案11。在实施方案1至10中任一项的一些另外实施方案中，该方法还包括制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。
实施方案12。在实施方案11的一些另外实施方案中，通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。
实施方案13。在实施方案12的一些另外实施方案中，通过在存在有利于树突细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。
实施方案14。在实施方案1至13中任一项的一些另外实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于同一个体。
实施方案15。在实施方案14的一些另外实施方案中，T细胞群和树突细胞群来源于正接受治疗的个体。
实施方案16。在一些实施方案中，提供了制备活化T细胞群的方法，其中该方法包括：a)诱导单核细胞群分化为树突细胞群；b)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；以及c)将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群，其中单核细胞群和非粘附PBMC群从来自个体的PBMC群获得。
实施方案17。在实施方案16的一些另外实施方案中，步骤b)包括在存在有利于树突细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触。
实施方案18。在实施方案16或实施方案17的一些另外实施方案中，步骤d)还包括使负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与多种Toll样受体(TLR)激动剂接触，以诱导负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群的成熟。
实施方案19。在实施方案16至18中任一项的一些另外实施方案中，步骤f)还包括使活化T细胞群与多种细胞因子接触，以诱导活化T细胞群的增殖和分化。
实施方案20。在实施方案19的一些另外实施方案中，所述多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。
实施方案21。在实施方案16至20中任一项的一些另外实施方案中，在共培养之前使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂接触。
实施方案22。在实施方案16至21中任一项的一些另外实施方案中，步骤c)包括在存在免疫检查点抑制剂的情况下，将负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与非粘附PBMC群共培养。
实施方案23。在实施方案21或实施方案22的一些另外实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1和CTLA-4的免疫检查点分子的抑制剂。
实施方案24。在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的活化T细胞群，该活化T细胞群通过实施方案16至23中所述的任一方法的方法制备。
实施方案25。在实施方案24的一些另外实施方案中，PBMC群从正接受治疗的个体获得。
实施方案26。在实施方案1至15和24至25中任一项的一些另外实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。
实施方案27。在实施方案26的一些另外实施方案中，活化T细胞每次施用之间的间隔为约0.5个月至约5个月。
实施方案28。在实施方案1至15和24至27中任一项的一些另外实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。
实施方案29。在实施方案1至15和24至28中任一项的一些另外实施方案中，活化T细胞以至少约3×109个细胞/个体的剂量施用。
实施方案30。在实施方案29的一些另外实施方案中，活化T细胞以约1×109至约1×1010个细胞/个体施用。
实施方案31。在实施方案2至15和24至30中任一项的一些另外实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞施用至少三次。
实施方案32。在实施方案31的一些另外实施方案中，每次施用树突细胞之间的间隔为约0.5个月至约5个月。
实施方案33。在实施方案2至15和24至32中任一项的一些另外实施方案中，负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。
实施方案34。在实施方案2至15和24至33中任一项的一些另外实施方案中，树突细胞以约1×106至约5×106个细胞/个体的剂量施用。
实施方案35。在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括：a)使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触以获得活化PBMC群，以及b)向个体施用有效量的活化PBMC。
实施方案36。在实施方案35的一些另外实施方案中，步骤(a)包括在存在免疫检查点抑制剂的情况下，使PBMC群与多种肿瘤抗原肽接触。
实施方案37。在实施方案36的一些另外实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1和CTLA-4的免疫检查点分子的抑制剂。
实施方案38。在实施方案35至37中任一项的一些另外实施方案中，活化PBMC施用至少三次。
实施方案39。在实施方案38的一些另外实施方案中，每次施用活化PBMC之间的间隔为约0.5个月至约5个月。
实施方案40。在实施方案35至39中任一项的一些另外实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。
实施方案41。在实施方案35至40中任一项的一些另外实施方案中，活化PBMC以约1×109至约1×1010个细胞/个体的剂量施用。
实施方案42。在实施方案1至41中任一项的一些另外实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽各自为约20至约40个氨基酸长。
实施方案43。在实施方案1至42中任一项的一些另外实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种包含MHC-I表位的肽。
实施方案44。在实施方案1至43中任一项的一些另外实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种包含MHC-II表位的肽。
实施方案45。在实施方案43或实施方案44的一些另外实施方案中，所述至少一种包含MHC-I表位或MHC-II表位的肽在N末端、C末端或这两末端处还包含位于表位旁侧的附加氨基酸。
实施方案46。在实施方案1至45中任一项的一些另外实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽。
实施方案47。在实施方案46的一些另外实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽还包括第二组癌类型特异性抗原肽。
实施方案48。在实施方案46或实施方案47中任一项的一些另外实施方案中，第一核心组包含约10至约20种普通肿瘤抗原肽。
实施方案49。在实施方案47或实施方案48的一些另外实施方案中，第二组包含约1至约10种癌类型特异性抗原肽。
实施方案50。在实施方案1至49中任一项的一些另外实施方案中，所述多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽。
实施方案51。在实施方案50的一些另外实施方案中，基于来自个体的肿瘤样本的遗传图谱来选择新抗原肽。
实施方案52。在实施方案1至15和24至51中任一项的一些另外实施方案中，该癌选自肝细胞癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、淋巴瘤、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑素瘤以及脑癌。
实施方案53。在实施方案1至15和24至52中任一项的一些另外实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。
实施方案54。在实施方案53的一些另外实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1和CTLA-4的免疫检查点分子的抑制剂。
实施方案55。在实施方案1至15和24至54中任一项的一些另外实施方案中，基于癌中的突变负荷来选择个体进行该治疗方法。
实施方案56。在实施方案1至15和24至55中任一项的一些另外实施方案中，个体具有癌中的低突变负荷。
实施方案57。在实施方案56的一些另外实施方案中，个体具有一种或多种MHC基因中的低突变负荷。
实施方案58。在实施方案57的一些另外实施方案中，个体具有所述一种或多种MHC基因中的不超过约10种突变。
实施方案59。在实施方案57或实施方案58的一些另外实施方案中，个体没有B2M中的突变。
实施方案60。在实施方案57至59中任一项的一些另外实施方案中，其中个体没有所述一种或多种MHC基因的功能区中的突变。
实施方案61。在实施方案55至60中任一项的一些另外实施方案中，通过对来自个体的肿瘤样本进行测序来确定癌的突变负荷。
实施方案62。在实施方案1至15和24至61中任一项的一些另外实施方案中，基于具有癌中的一种或多种新抗原来选择个体进行该治疗方法。
实施方案63。在实施方案1至15和24至62中任一项的一些另外实施方案中，个体具有至少5种新抗原。
实施方案64。在实施方案62或实施方案63的一些另外实施方案中，该方法还包括鉴定癌的新抗原，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中该新抗原肽包含新抗原中的新表位。
实施方案65。在实施方案62至64中任一项的一些另外实施方案中，通过对来自个体的肿瘤样本进行测序来鉴定新抗原。
实施方案66。在实施方案65的一些另外实施方案中，所述测序是癌相关基因的靶向测序。
实施方案67。在实施方案64至66中任一项的一些另外实施方案中，该方法还包括确定新表位对MHC分子的亲和力。
实施方案68。在实施方案64至67中任一项的一些另外实施方案中，该方法还包括确定包含新表位和MHC分子的复合体对T细胞受体的亲和力。
实施方案69。在实施方案67或实施方案68的一些另外实施方案中，MHC分子是MHCI类分子。
实施方案70。在实施方案67至69中任一项的一些另外实施方案中，MHC分子来自个体。
实施方案71。在实施方案1至15和24至70中任一项的一些另外实施方案中，该方法还包括在施用活化T细胞或活化PBMC之后监测个体。
实施方案72。在实施方案71的一些另外实施方案中，该监测包括确定个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量。
实施方案73。在实施方案71或实施方案72的一些另外实施方案中，该监测包括检测个体中针对所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。
实施方案74。在实施方案73的一些另外实施方案中，基于该特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。
实施方案75。在实施方案74的一些另外实施方案中，使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复该治疗方法。
实施方案76。在实施方案1至15和24至75中任一项的一些另外实施方案中，个体是人类个体。
实施方案77。在一些实施方案中，提供了克隆肿瘤特异性T细胞受体的方法，该方法包括：(a)使用实施方案1至15和24至76中任一项的方法治疗个体；(b)从个体分离T细胞，其中该T细胞特异性地识别所述多种肿瘤抗原肽中的肿瘤抗原肽；以及(c)从该T细胞克隆T细胞受体以提供肿瘤特异性T细胞受体。
实施方案78。在实施方案77的一些另外实施方案中，个体具有针对肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫应答。
实施方案79。在实施方案77或实施方案78的一些另外实施方案中，T细胞分离自个体的PBMC样本。
实施方案80。在实施方案77至79中任一项的一些另外实施方案中，肿瘤抗原肽是新抗原肽。
实施方案81。在一些实施方案中，提供了使用实施方案77至80中任一项的方法克隆的肿瘤特异性T细胞受体。
实施方案82。在一些实施方案中，提供了包含实施方案81的肿瘤特异性T细胞受体的分离的T细胞。
实施方案83。在一些实施方案中，提供了治疗个体中的癌的方法，该方法包括向个体施用有效量的实施方案82的分离的T细胞。
实施方案84。在一些实施方案中，提供了通过实施方案16至23和42至51中任一项的方法制备的分离的细胞群。
实施方案85。在一些实施方案中，提供了包含活化T细胞的分离的细胞群，其中小于约1％的活化T细胞是调节性T(TREG)细胞。
实施方案86。在实施方案84或实施方案85的一些另外实施方案中，分离的细胞群包含约0.3％至约0.5％CD4+CD25+Foxp3+细胞。
实施方案87。在实施方案84至86中任一项的一些另外实施方案中，分离的细胞群包含约65％至约75％CD3+CD8+细胞。
实施方案88。在实施方案84-87中任一项的一些另外实施方案中，分离的细胞群包含约16％至约22％的CD3+CD4+细胞。
实施方案89。在实施方案84至88中任一项的一些另外实施方案中，分离的细胞群包含约13％至约15％的CD3+CD56+细胞。
实施方案90。在实施方案84至89中任一项的一些另外实施方案中，活化T细胞能够在体内或离体引发对多种肿瘤抗原肽的特异性应答。
实施方案91。在实施方案90的一些另外实施方案中，活化T细胞表达多种促炎分子。
实施方案92。在实施方案91的一些另外实施方案中，所述多种促炎分子包括IFNγ、TNFα、颗粒酶B或穿孔素。
实施方案93。在实施方案84至92中任一项的一些另外实施方案中，活化T细胞没有多种免疫抑制细胞因子的表达或有多种免疫抑制细胞因子的低表达。
实施方案94。在实施方案93的一些另外实施方案中，所述多种免疫抑制细胞因子包括IL-10或IL-4。
实施方案95。在实施方案84至94中任一项的一些另外实施方案中，小于约5％的活化T细胞表达免疫抑制性分子PD-1。
实施方案96。在实施方案84至95中任一项的一些另外实施方案中，分离的细胞群中至少约90％的细胞是活化T细胞。
实施方案97。在一些实施方案中，提供了包含至少10种肿瘤抗原肽的组合物，其中所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO:1-40的表位。
实施方案98。在实施方案56的一些另外实施方案中，所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含一种或多种由癌相关基因编码的表位，所述表位选自hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、RGS5、MMP7、VEGFR、AFP、GPC3、HBVc、HBVp、CDCA、KRAS、PARP4、MLL3和MTHFR。
实施例
本文所述实施例并非旨在表示以下实验是所有或唯一执行的实验。已经尽量确保所使用的数字(例如数量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差与偏差。除非另外指明，否则份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。
实施例1-MASCT在治疗HCC方面的临床和机理研究
简介
肝细胞癌(HCC)是具有高死亡率的癌之一，并且常常在慢性乙肝病毒(HBV)感染的中国患者中发生。虽然当前的医护标准(SOC)诸如切除、肝移植、经导管动脉化疗栓塞(TACE)可改善患者的生存期，但HCC很少被治愈并且具有复发和转移的高风险。在此，我们将MASCT方法应用于罹患HCC且合并HBV感染的一组中国患者。
根据MASCT方法的实施方案从患者的PBMC离体制备经多种肿瘤抗原活化的自体T细胞，并以输注方式向患者施用这些细胞。在采用MASCT策略的情况下，我们从具有相关肿瘤抗原肽的患者的自体T细胞组库选择性地活化并扩增了肿瘤抗原特异性T细胞。这确保了所得的细胞将特异性地识别肿瘤细胞而没有对于健康组织的交叉反应，这是由于这些T细胞已从胸腺的中枢性选择中存活下来，在该中枢性选择中已清除了对宿主有害的所有强自身反应性T细胞。我们发现，活化T细胞引起了HCC特异性T细胞(包括效应T细胞和记忆T细胞)在体内扩增，并且改善了HCC患者的无进展结果。
结果
MASCT的制备过程和特征
MASCT细胞疗法的细胞制备过程示于图2A中。简而言之，使用肿瘤抗原肽库对未成熟树突细胞(iDC)(从分离自患者PBMC的单核细胞分化)进行冲击处理，以在TLR激动剂的帮助下变成成熟DC(mDC)。将来自同一PBMC来源的自体T细胞在细胞因子中维持，然后与如上所述制备的mDC再共培养7-10天。抗原肽库由在HCC患者的癌变肝细胞中过表达的多种肿瘤相关抗原组成。其中一些肿瘤相关抗原已用于临床试验(图2B)(1-15)。HCC抗原肽库包括在许多种肿瘤细胞(包括HCC)中过表达的十种肿瘤相关抗原(TAA)，诸如生存素、NY-ESO-1、癌胚抗原(CEA)等等；以及通常在HCC患者的癌变肝细胞中表达的两种HCC特异性抗原，称为甲胎蛋白(AFP)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)。HBV相关抗原中的两种(称为HBV核心抗原和HBV DNA聚合酶)也包括在肽库中，这是由于中国的HCC患者大多与慢性乙肝病毒(HBV)感染相关联。此外，合成了所述肽中的每一者，这些肽为20-40个氨基酸长并且包含若干此前鉴定的I类和II类HLA分子的T细胞识别表位(图2C)。在GMP条件下化学合成这些肽。
实验表明，肽被iDC有效内化并且主要定位在胞液中(图3)，因此将促进MHC I分子的交叉递呈。在用Toll样受体(TLR)配体刺激之后，mDC展现出完全的免疫功能特性，尤其是对于IL12的高水平分泌而言(图4A至图4B)。
在共培养之后，所得的T细胞已增殖至少45倍，从中值8.9×107个细胞(范围为5×107至1.6×108个细胞)增殖到中值6.2×109个细胞(范围为4.1×109至9×109个细胞；图5A)。所得的细胞几乎完全为CD3+T细胞(95％±1％)，其主要表型为CD3+CD8+(70％±5％)，还有少部分CD3+CD4+(19％±3％)和CD3+CD56+(14％±1％)，但几乎没有CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(TREG，0.4％±0.1％)(图5B)。
所得T细胞的免疫功能
所得T细胞的亚群分析揭示了与从患者分离的非活化T细胞(图5E)相比，CD3+CD8+细胞毒性T细胞的主要亚群中以及CD3+CD4+辅助T细胞和CD3+CD56+NKT细胞的次要亚群中的多功能特性(16)，其特征在于IFNγ、TNFα和颗粒酶B的共表达(图5C、图5D)。促炎性细胞因子诸如IFNγ和TNFα也存在于所得细胞的上清液中，但几乎未检测到免疫抑制细胞因子诸如IL10和IL4(图6A)。其他人(17,18)和我们已检测到与健康供体相比，HCC患者体内有更高频率的在其表面上表达免疫抑制性分子PD-1的T细胞CD3+CD8+和CD3+CD4+亚群，这表明HCC患者体内的T细胞耗竭(图6B至图6C)。然而，可通过刺激已用多种肿瘤抗原冲击处理的DC，而使T细胞的该免疫耐受性状态在CD3+CD8+T细胞亚群(n＝7，p＝0.02)和CD3+CD4+T细胞亚群(n＝7，p<0.01)两者中明显逆转(图6D至图6E)。此外，与HLA-A2-Huh-7细胞相比，从HLA-A2+患者产生的活化T细胞表现出对于HLA-A2+HCC细胞系HepG2的优异细胞毒性活性，这表明HLA限制性杀伤。而从HLA-A2-患者(n＝7)产生的所得T细胞表现出对于HLA-A2+和HLA-A2-HCC细胞系两者的相似细胞毒性活性，这可带来CD3+CD56+NKT细胞所执行的非特异性杀伤(图6F)。
HCC患者体内MASCT诱导的抗原特异性免疫应答
为了调查MASCT治疗是否可带来HCC患者体内免疫环境的改善，我们测量了患者PBMC中的TREG的频率并在施用MASCT三次之后发现这些细胞的显著下调(图11A)。我们还检测了与用不相关肽刺激相比，在用肽库刺激之后针对患者PBMC中的肿瘤抗原的特异性T细胞增殖(图11B)和IFNγ产生(图11C)。我们观察到，与用不相关肽刺激的PBMC相比，在用HCC-抗原肽库刺激之后HCC患者的PBMC(n＝6)中有显著增强的应答(抗原特异性增殖：p＝0.027；抗原特异性IFNγ产生：p＝0.024，图11B和图11C)。产IFNγ的HCC特异性CD8+T细胞还在其表面上共表达CD27和CD28(图11D)，这表明获得免疫记忆表型的高潜能(19,20)。此外，为了调查HCC抗原特异性T细胞增殖和IFNγ产生是否在MASCT治疗期间诱导或增强，我们比较了3次MASCT治疗之前和之后患者的PBMC的这些免疫应答。结果表明，这些HCC特异性T细胞增殖和IFNγ产生是稳健的，并且在多次MASCT治疗之后在患者中检测到逐渐累积的免疫应答(图11E和图11F)。因此，在接受MASCT治疗的患者中，检测到TREG下调和肿瘤特异性T细胞上调两者，这证实了在MASCT治疗之后HCC患者中的免疫环境的改善。
MASCT诱导的对于库中每种抗原肽的免疫应答
为了进一步检查对于库之中每种肿瘤抗原肽的特异性应答，从接受多次MASCT细胞疗法治疗的6名HCC患者(他们都是HBV+)分离PBMC，然后用单独抗原肽进行刺激。通过ELISPOT测定法测量IFNγ的产量。在所有6名患者(HBV+)中都明确引起了对于肿瘤抗原肽的特异性应答，而对于每种抗原肽的特异性免疫应答模式有所不同。大多数患者对CEA(5/6)、HBV核心抗原(5/6)、生存素(4/6)、VEGFR(4/6)、AFP(4/6)、GPC3(4/6)和HBV DNA聚合酶(4/6)作出应答。但更少患者对p53(2/6)、CCDN1(2/6)和MET(1/6)作出应答(图12A)，这可能是由于肿瘤中的抗原表达的多样性以及不同患者体内免疫环境的可变性。然而，在未接受MASCT细胞疗法的患者(n＝5)中观察到极少对于这些肿瘤抗原的免疫应答(图12B)。此外，我们纵向研究了2名HCC(B期)患者在接受MASCT细胞疗法的治疗期间其体内免疫应答的动态变化，并发现对于肿瘤抗原肽的特异性免疫应答逐渐增强，且这2名患者的免疫应答模式不同(图12C、图12D)。我们能够在最后一次MASCT治疗后超过4个月在患者体内检测到T细胞的肿瘤抗原特异性应答(数据未示出)，这表明记忆T细胞确立了长期免疫应答。升高水平的肿瘤抗原特异性T细胞和降低水平的TREG均可引起患者的更好临床结果。
MASCT临床受益的期中分析
为了调查MASCT细胞疗法的临床受益，我们回顾性地研究了HCC患者的癌进展期情形。从2012年起至今，100名患者被诊断为B期HCC(图7A)。在所有患者中，对33名进一步分析，这是由于他们连续治疗了至少1年。其中15名仅接受了HCC的常规治疗，诸如切除、TACE和RFA(图8A)。其他16名患者除了采用医护标准之外，还接受了MASCT细胞疗法。在他们之中，13名患者接受了每1-3个月一次的重复MASCT细胞疗法(≧3)并联用常规治疗(图9A)；未对仅接受单一MASCT细胞疗法的3名患者进一步分析，这是由于他们未遵照重复治疗的方案。在每次治疗期间，输注2-5×107个细胞/kg体重(或至少1×109/人)。未观察到明显的毒性。如果通过计算机断层(CT)扫描将肿瘤检测为复发、生长或转移，则患者被评价为PD(疾病进展)。指示了从诊断到疾病进展的时间和接受的治疗。如果肿瘤未出现进展，则示出在诊断后1年的时间点对患者的评价以及在整个1年期间接受的治疗。从该分析排除两名患者，因为一名患者缺少1年的评价，另一名患者在她的疾病进展之前未接受任何治疗。接受多次MASCT细胞疗法治疗的患者的疾病进展发生率显著下降(p<0.0001)，这是由于仅1名患者(n＝13，PD：7.69％)出现疾病进展(表1)。我们还发现仅接受常规疗法的患者的平均疾病进展时间较短(中值：6个月)，但每名患者接受的治疗的平均数相对较高(11个月，表1和图10A)。此外，单一MASCT细胞疗法无法在该患者队列中改善任何无进展结果(数据未示出)，从而表明HCC患者中归因于MASCT细胞疗法多次治疗的更好临床结果的诱发作用，这可与输注的活化T细胞总量有关。
表1。在诊断后1年期间接受或未接受多次MASCT细胞疗法治疗的肝细胞癌(B期)患 者之间的RECIST评价的比较
Figure BDA0001405186940001421
NA：不可用；NT：未测试；a：通过费舍尔精确检验(双侧)分析；b：通过皮尔逊卡方(双侧)分析
我们的研究首次证实，可在体内强烈地引起T细胞对于肿瘤抗原的特异性应答，并表明MASCT细胞疗法是改善HCC患者免疫功能和临床结果的安全且实用的免疫疗法。
MASCT临床受益的第二次分析
我们回顾性地研究了B期HCC患者的疾病控制率(DCR)，这些患者在2012年之后确诊并且连续治疗(采用或不采用MASCT)并定期随访一年以上(图7B和表2)。通过审阅医疗记录，我们发现十七名患者接受了常规治疗(对照组)，诸如切除、TACE和RFA(射频消融)(图8B)。同时，除常规治疗之外，十五名患者还每2-3个月反复接受了MASCT治疗(≥3)(对照组+MASCT，图9B)。对于这15名患者而言，我们在治疗之前和之后执行了常规验血和血液生化检查。未报告皮疹、疲乏、发烧、腹泻、贫血、血小板减少或任何其他严重副作用，这指示MASCT有良好的耐受性。诊断之后的一年，对照组+MASCT的DCR为80％(15名之中有12名)，包括4名具有总体应答的患者(1名具有CR的患者和3名具有PR的患者)以及8名疾病稳定(SD)的患者。该DCR显著好于(p<0.0001)对照组的DCR(17.65％)，在对照组中17名患者中仅有3名显示出疾病得到控制(表2和图9B)。此外，我们比较了在这两组中均被评价为PD的患者的中值疾病进展时间，并且发现与对照组的时间(6个月)相比，对照组+MASCT的患者的该时间更长(11个月)。与对照组3.71的平均数相比，对照组+MASCT每名患者接受的常规治疗的平均数为2.6(图10B)。这些数据清楚显示MASCT治疗给B期HCC患者带来了临床受益。
表2。在诊断之后1年期间接受了常规疗法且联用(对照组+MASCT)或不联用(对照 组)多次MASCT细胞疗法治疗的B期HCC患者之间的疾病控制率(DCR)的比较。
Figure BDA0001405186940001431
a：通过费舍尔精确检验(双侧)分析；b：通过皮尔逊卡方(双侧)分析
材料与方法
患者
南方医科大学南方医院肝病科的接受了MASCT细胞疗法的HCC患者在治疗之前必须签署患者知情同意书。所有这些患者每1-3个月以5-10×107个细胞/kg体重接受所得T细胞的输注。合格标准包括：年龄介于25岁与80岁之间，东部肿瘤协作组(ECOG)活动状态评分不超过2，预期寿命超过3个月，并且没有严重的心血管疾病、自身免疫疾病或怀孕。
期中分析研究设计
从南方医科大学南方医院肝病科的计算机化数据库审阅HCC患者的医疗记录。该数据库记录了这些患者的临床病理信息，包括有关年龄、性别、肿瘤特征、BCLC阶段、治疗和结果的详情。2012年后在该科室中确诊了100名B期HCC患者。在他们之中，33名患者参与该研究，这是由于他们在该科室中连续治疗了至少1年。在他们之中，未对仅接受一次MASCT细胞疗法的3名患者进一步分析，这是由于他们未遵照重复治疗的方案。根据患者的偏好，将其余患者(n＝30)分配到两个治疗组之一中：组1中的患者仅接受标准疗法，而组2中的患者接受标准治疗且联用多次MASCT细胞疗法治疗。排除组1(n＝13)中的一名患者，这是由于该患者缺少1年的评价。排除组2(n＝15)中的另一名患者，这是由于她在疾病出现进展之前未接受任何治疗。这两组中的患者的特征示于图8A和图9A中。主要终点是调查在一年中出现疾病进展(PD)的患者的比率和疾病进展时间。该研究获得了南方医科大学南方医院伦理委员会的批准。
期中分析中的安全性终点
对于接受了多次MASCT细胞疗法治疗的15名患者而言，我们分别在MASCT细胞疗法治疗之前和之后进行了常规验血和血液生化检查。未检测到炎症相关指标诸如白细胞计数、中性粒细胞计数和淋巴细胞计数存在显著的差异。也未检测到肝功能相关指标，诸如AST、ALT和总胆红素的明显变化。此外，未观察到皮疹、疲乏、发烧、腹泻、贫血和血小板减少。
第二次回顾性分析
在第二次回顾性分析期间，从南方医科大学南方医院肝病中心的计算机化数据库使用患者的医疗记录。该数据库记录了所有患者的临床病理信息，包括年龄、性别、肿瘤特征、阶段、治疗和RECIST评价。我们分析了患者的DCR，这些患者在2012年后被确诊为B期HCC，并且在该中心连续治疗并定期随访至少一年(图7B)。总共有53名患者符合该标准。在他们之中，17名患者接受了SOC但未接受MASCT，并且被分配到对照组。除了常规治疗之外，其他36名B期HCC患者还接受了MASCT。然而，排除了他们之中的21名，这是由于他们未在一年内完成MASCT重复治疗(≥3)的要求。其余15名患者被分配到对照组+MASCT。这两组中的患者的特征示于图8B和图9B中。根据实体瘤的应答评价标准(RECIST v1.1)，依据计算机断层(CT)扫描将患者确定为出现完全应答(CR)、部分应答(PR)、疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)。主要目标是调查在诊断后一年B期HCC患者的疾病控制率。该研究获得了南方医科大学南方医院伦理委员会的批准。
细胞制备
通过在淋巴细胞分离液(挪威奥斯陆的奈科明制药公司(Nycomed Pharma,Oslo,Norway))上的密度梯度离心来获得HCC患者的外周血单核细胞(PBMC)。将粘附单核细胞继续培养在含1000U/mL GM-CSF和500U/mL IL-4的AIM-V培养基中，以分化为未成熟树突细胞(DC)。通过多种肿瘤抗原肽库(1μg/mL/肽)及后续的TLR激动剂对所得的未成熟DC进行冲击处理，以分化为成熟DC。同时，将非粘附PBMC维持在含抗CD3(美国加利福尼亚州圣地亚哥的eBioscience公司(eBioscience,San Diego,CA))和白介素-2(rIL-2；美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物公司(R&D Systems,Minneapolis,MN))的AIM-V培养基中，然后在存在细胞因子的情况下与成熟DC共培养7-14天(诸如7-10天或9-13天)。患者每1-3个月以5-10×107个细胞/kg体重接受所得T细胞的输注。
免疫荧光
将树突细胞(DC)在腔室玻片(美国赛默科技公司(Thermo Scientific,USA))中进行培养，并且用含或不含脂质体包封的FITC标记肽进行冲击处理。2小时后，用DAPI(分子探针公司(Molecular Probes))和LYSOTRACKERTM(分子探针公司(Molecular Probes))标记DC，以分别鉴定细胞核和溶酶体。使用共聚焦激光扫描显微术(TCS SP5II，德国恩斯特·徕茨街的徕卡公司(Leica,Ernst-Leitz-Strasse,Germany))记录荧光图像。
流式细胞术
从BD生物科学事业部(BD Biosciences)获得用于细胞表面染色的抗体(抗人CD3-PE、CD3-FITC、CD8-PerCP、CD8-APC、CD56-PE、NKG2D-APC、CD4-FITC、CD4-PerCP、CD107a-FITC、CD25-APC、CD45RO-FITC、CD27-PerCPCY5.5、CD57-APC、CCR7-PE、PD-1-PE)。还从BD生物科学事业部(BD Biosciences)获得用于单核细胞和树突细胞表面染色的抗体(抗人CD14-APC、CD80-PE、CD83-APC、CD86-FITC、HLA-DR-FITC)。从BD生物科学事业部(BDBiosciences)获得用于细胞内细胞因子染色的抗体(抗人IFN-γ-APC、TNF-α-PECY7、颗粒酶B-FITC、FoxP3-PE)。使用细胞固定/通透液(BD生物科学事业部(BD Biosciences))对细胞进行固定和透化处理，由此执行细胞内细胞因子染色。使用FACS CantoII(BD生物科学事业部(BD Biosciences))流式细胞仪执行流式细胞术，并用Flowjo程序分析数据。
用于细胞因子检测的ELISA
对成熟DC或经培养的T细胞的上清液进行离心以去除颗粒碎片，并且储存在-80℃下直至使用。根据制造商的方案，通过特异性ELISA试剂盒(eBioscience)测定IL-12p70和IL-10。通过Procarta Plex多重免疫测定法(昂飞公司(Affymetrix))检测IFN-γ、TNF-α和IL-4。
功能和细胞毒性研究
将HepG2或Huh7在补充有10％灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、谷丙氨酸二肽、MEM NEAA(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibico公司(Gibico,Carlsbad,CA))的DMEM中进行培养。按照制造商的手册执行细胞毒性测定法。将HepG2或Huh7细胞用D-PBS(英杰公司(Invitrogen))洗涤，并且按一式三份以40:1的效应细胞：靶细胞(E:T)比率，与患者的效应T细胞在96孔圆底板的AIM-V中共培养4小时。细胞毒性表示为裂解后释放的LDH最大值的百分比，并且通过Cytotox 96测定试剂盒(Promega G1780，加拿大)进行测量。
抗原特异性T细胞的增殖测定和IFNγ产生
将来自患者的PBMC接种(1×106个细胞/孔)在含50U/mL IL-2的AIM-V培养基中，并且用10μg/mL肽库刺激3天。为了确定特异性T细胞的增殖百分比，按照Click-iT EdUAlexa Fluor 488流式细胞术测定试剂盒(英杰公司(Invitrogen))中所述的那样执行FACS分析。还通过细胞内细胞因子染色和FACS分析来检测特异性T细胞的IFNγ产生。与10μg/mL不相关肽一起温育的PBMC用作阴性对照。结果表示为按特异性肽组：不相关肽组计算的倍数指数。
ELISPOT测定法
将来自患者的PBMC接种(1×106个细胞/孔)在细胞培养板上不含任何细胞因子的AIM-V培养基中，并且分别用不相关肽、MASCT抗原肽库和单独抗原肽进一步刺激48小时。然后将PBMC转移到96孔ELISPOT测定板(U-CyTech生物科学公司(U-CyTech Biosciences))上进行IFNγ检测。再用肽进一步刺激PBMC 16小时。根据制造商的说明，执行并分析ELISPOT测定法。使用计算机辅助图像分析软件(ChampSpot；赛智公司(Saizhi))确定斑点形成单位数。应答表示为每105个PBMC/孔的斑点形成单位。结果显示为按特异性肽刺激与不相关肽刺激的比率计算的产IFNγ的倍数指数。
讨论
过继细胞疗法(ACT)近来被公认为治疗癌患者的有效替代疗法，尤其适合常规癌疗法诸如外科手术、放射疗法和化学疗法没有治疗效果的患者。虽然肿瘤特异性TIL已成功治疗了转移性黑素瘤患者且有超过50％总体应答[21]，并且抗CD19CAR修饰T细胞在慢性淋巴白血病(CLL)和急性淋巴白血病(ALL)中均展现出异常好的临床受益[22,23]，但采用肿瘤特异性T细胞的ACT仍然面临巨大挑战。在肿瘤环境中，表达特定肿瘤抗原并将该肿瘤抗原递呈到其表面上的肿瘤细胞，可以由特异性地识别该特定肿瘤抗原的表位的肿瘤浸润性T细胞靶向。识别之后，T细胞将释放细胞毒性因子诸如穿孔素和颗粒酶B，以及功能性细胞因子诸如IFNγ和TNFα以裂解肿瘤细胞。然而，该免疫监视机制在癌患者中很可能被关闭。抑制细胞诸如TREG的众多数量、肿瘤特异性TIL的缺乏以及肿瘤细胞中肿瘤抗原表达的丧失全都会造成失效。
在此，我们通过从患者的PBMC离体制备多种肿瘤抗原活化的T淋巴细胞，提出了一种新型且实用的策略MASCT。在MASCT策略中，我们使用长抗原肽，而非肿瘤抗原蛋白或肿瘤裂解物。我们证实了同时用多种肿瘤抗原表位刺激T细胞，可更有效地防止特定肿瘤抗原表达的丧失所引起的肿瘤细胞的免疫逃避。在我们的研究中，在MASCT多次治疗后的不同HCC患者中观察到对于每种肿瘤抗原的特异性T细胞应答的不同模式。这可归因于抗原表达和递呈的多样性以及肿瘤微环境的可变性。该现象还表明需要使用多种抗原来靶向肿瘤细胞，而非单种肿瘤抗原。此外，每种肿瘤抗原肽被设计成包含20-40个氨基酸，这使得能够将I类和II类HLA分子两者递呈到具有不同种类HLA亚型的患者的DC上。实际上，我们通过T细胞增殖测定法和IFNγ刺激测定法两者在不同HCC患者中观察到对于肿瘤抗原的特异性免疫应答，以及在MASCT多次治疗之后患者PBMC中的TREG减少。这些免疫应答在MASCT多次治疗期间逐渐增强，这指示重复治疗可能与更好的临床结果相关。
据报道，世界上有2亿4千万人(包括中国的十分之一人口)受到HBV慢性感染，他们在以后生活中有发展HCC的高风险。由于有效的常规疗法很少，HCC在中国是一种具有高发病率和死亡率的癌。为了设法解决该问题，我们将MASCT应用于HCC患者，以刺激对于肿瘤抗原和HBV相关抗原的特异性T细胞应答，意图通过MASCT与常规疗法的联合治疗来改善患者的临床结果。通过回顾性分析，我们调查了接受多次MASCT治疗之后的B期HCC患者的临床疗效。与对照组相比，在每2-3个月接受一次MASCT治疗并与常规疗法联用的患者组(对照组+MASCT)中一年DCR显著增加(80％相对17.65％)。我们进一步分析了对照组+MASCT中第一年展现出疾病控制的12名患者的诊断后两年的DCR。排除病程短于两年的两名患者后，10名患者中有9名仍展现为疾病控制(数据未示出)。
我们的研究首次证实，T细胞对于肿瘤抗原的特异性应答可由MASCT在体内强烈诱导和增强，并且MASCT治疗是耐受性良好的免疫疗法，可以改善HCC患者的免疫功能和疾病控制。相同原理和方法正经历HCC患者的前瞻性随机化临床试验(NCT02026362)，并且还针对其他肿瘤作了探讨。此外，考虑到在不同种类的癌中抗PD1抗体疗法仅给平均20％患者带来临床受益的事实，我们推测MASCT治疗可与免疫检查点阻滞疗法(诸如抗PD1抗体)联用。80％非应答患者被认为没有足够的已有肿瘤特异性T细胞，无法通过MASCT治疗来拯救。
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实施例2-对接受MASCT治疗的转移性宫颈癌患者的病例研究以及肿瘤特异性T细 胞受体的克隆
宫颈癌是第二种最常见的妇科恶性肿瘤，常常在感染人类乳头瘤病毒(HPV)的患者中发生。宫颈癌的有效治疗(包括外科手术和同步放化疗)可使80％患有早期疾病(I-II期)的妇女得到治愈。然而，血管侵犯、淋巴结清扫不全是预测早期宫颈癌不良预后的最常见因素。通过病理标本确认有血管侵犯的患者更有可能在外科手术后不久的将来发展转移性疾病。在此，我们提出了一种被称为MASCT(多抗原刺激细胞疗法)的免疫疗法，以便使用经多种肿瘤抗原冲击处理的树突细胞(DC)和由这些DC刺激的T淋巴细胞来治疗HPV+转移性宫颈癌患者。
患者WJ，女，在41岁时确诊患有宫颈癌伴血管侵犯，并且人类乳头瘤病毒(HPV)DNA测试呈阳性。该患者接受了治愈性切除和五个月的放化疗。该患者进行了第二次HPV DNA测试，确认血清HPV DNA呈阴性。
在治愈性切除和放化疗之后的大约两年，根据磁共振成像(MRI)和发射计算机断层扫描(ECT)，诊断出患者右骶髂关节骨上有转移肿瘤(图13A)。该患者随后接受了十次局部放射疗法治疗，然后是三次MASCT治疗，每月进行一次。MASCT治疗使用取自该患者自身外周血的PBMC，来制备经18种抗原肽的库冲击处理的树突细胞，这些抗原肽包括12种肿瘤相关抗原肽的核心组，以及来源于HPV病毒蛋白的6种抗原肽的宫颈癌特异性组。简而言之，将取自患者PBMC的单核细胞分化为未成熟DC，然后使用包括肿瘤相关抗原和HPV抗原在内的多种合成肽抗原进行冲击处理。利用TLR配体进一步刺激半成熟DC，使之分化为成熟DC(mDC)。将一半mDC皮下注射到患者体内。使用抗CD3抗体(例如，OKT3)和IL2培养非粘附PBMC，从而制备维持性T细胞。在输注之前，将另一半mDC与维持性T细胞再共培养7-9天。该患者被确认具有HLA-A2血清型(HLA-A0201+)。
在三次MASCT治疗之后，该患者的ECT结果显示右骶髂关节骨转移有所减轻，并且未检测到新的转移(图13B)，这表明了MASCT的积极治疗结果。该患者又接受了四次MASCT治疗，每隔约1个月或2个月进行一次。在总共进行了6次MASCT治疗之后，获取该患者的PBMC样本，并用ELISPOT测定法进行测试，以确定该患者是否具有对抗原肽库及库内每种抗原肽的治疗有效的MHC限制性T细胞应答。ELISPOT结果(图13E)证实增强了对宫颈癌抗原肽库以及肿瘤特异性抗原肽的核心组(诸如hTERT、p53、CEA和RGS5)和肿瘤抗原肽的宫颈癌特异性组(诸如HPV-3和HPV-5)两者内的单独抗原肽的T细胞应答。在总共进行了7次MASCT之后，该患者的ECT表现出右骶髂关节骨转移进一步减轻，并且没有新的转移部位(图13C)，这表明了MASCT治疗方案成功减轻了该患者的肿瘤负荷并且防止了肿瘤进展和进一步转移。
根据该患者的特异性免疫应答，通过保留诱导了特异性应答的应答性肽并去除未诱导特异性应答的非应答性肽，从而对抗原肽库进行定制以提供患者特异性抗原肽库。该患者进一步接受了3个周期的MASCT(本文称为“精确MASCT”)治疗，该MASCT使用患者特异性抗原肽库制备。在三次精确MASCT之后，该患者的ECT显示右骶髂关节骨转移并未发展，并且没有新的转移部位(图13D)。该患者被评估为疾病稳定(SD)。患者特异性抗原肽库进一步提升了特异性应答，如由ELISPOT测定法所证实(图13F)。具体地，若干hTERT肽、p53-1肽、CEA肽和RGS5肽产生了最强的特异性应答。我们正在从该患者中克隆CEA和端粒酶特异性TCR。
根据该患者的特异性免疫应答来进一步调节抗原肽库，并且通过使用进一步调节的肽抗原库的第2次精确MASCT对该患者进行治疗。
该患者的治疗史总结示于图14中。
我们的研究提供MASCT作为安全治疗，该治疗减轻了宫颈癌患者的转移。肿瘤抗原特异性T细胞应答可在MASCT治疗之后在宫颈癌患者中大幅提高，并且在患者特异性抗原选择之后甚至进一步提升。另外，我们的研究提供了一种从癌患者中克隆肿瘤特异性TCR的有前景的方法，这些癌患者在用患者特异性抗原进行免疫治疗之后表现出增强的免疫应答以及临床益处。
实施例3-1/2期MASCT临床试验研究方案的简要说明
标题为“Multiple Antigen Specific Cell Therapy(MASCT)forHepatocellular Carcinoma(HCC)Patients After Radical Resection or RadioFrequency Ablation(RFA)”(用于根治性切除或射频消融(RFA)后的肝细胞癌(HCC)患者的多抗原特异性细胞疗法(MASCT))的1/2期MASCT临床试验研究开始于2013年7月，并且以标识符NCT02026362在在线数据库ClinicalTrials.gov登记。该研究的一些方面的描述可见于https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02026362，这些方面以引用方式并入本文。该临床研究正在进行中。
1/2期MASCT研究是一项1:1随机、开放标签、多中心研究，其目的在于探讨MASCT方法的实施方案在治疗肝细胞癌(HCC)患者方面的安全性和疗效，这些肝细胞癌患者之前接受了治愈性切除(诸如切除或RFA)作为抗HCC疗法。该研究在中国的多个站点开展，包括中国广州的南方医科大学南方医院、中国广州的中山大学附属第三医院、中国广州的中山大学肿瘤防治中心、中国北京的中国人民解放军302医院以及中国福州的福建省肿瘤医院。根据标准预后因素(诸如年龄、性别、之前的治疗方案和临床表现状态)，将患者随机分为对照组和测试组(两组患者人数为1:1)。对照组中的患者接受根据当前医疗实践的医护标准(SOC)，包括保肝治疗以及使用核苷类似物药物对乙肝病毒(HBV)的抗病毒治疗。在中国，HCC与HBV感染高度相关。测试组中的患者接受相同的SOC治疗，并加上MASCT治疗，MASCT治疗涉及施用负载有总共14种抗原(包括hTERT、生存素、p53和CEA)的树突细胞以及由树突细胞诱导的活化T细胞。MASCT治疗每三周重复一次，总共进行三次。这两个研究组中的每名患者将接受为期约9周的治疗，除非患者出现疾病进展或不可耐受的毒性。如果患者在9周之后未出现进展，研究人员可自行决定继续治疗。将对患者进行约2.5年的随访，或者直到所有患者死亡或出现疾病进展，以先发生的为准。
在该研究中，计划入选、治疗和评价大约100名患者。患者必须满足所有以下标准，才有资格进入该研究。
1.患者被诊断为患有肝细胞癌(HCC)；
2.患者在入选之前8周内接受了HCC根治手术；
3.肿瘤数量不超过2个；
4.门静脉主干、肝管第一分支、肝静脉第一分支或下腔静脉中没有癌栓；
5.没有肝门淋巴结转移；
6.没有肝外转移；
7.通过根治手术之后4周内(包括4周)的增强CT或MRI成像确认肿瘤完全切除，在手术切缘处没有残留肿瘤；
8.如果在根治手术之前检测到患者的血清AFP水平升高，则AFP水平应在8周内恢复正常；
9.Child-Pugh评分≤9；
10.ECOG体能状态(ECOG-PS)≤2；
11.预计生存时间超过2年；
12.血液、肝和肾的测试结果满足以下标准：
a.WBC>3×109/L
b.中性粒细胞计数>1.5×109/L
c.血红蛋白≥85g/L
d.血小板计数≥50×109/L
e.PT正常，或延长时间<3s
f.BUN≤上限的1.5倍
g.血清肌酐≤上限的1.5倍
13.根据当地制度和/或大学人体实验委员会要求和/或中央机构审查委员会(IRB)或适用的其他规定，获取并签署患者知情同意书。
满足任何以下标准的患者没有资格进入该研究：
1.已怀孕或处于哺乳期或计划在2年内怀孕的妇女；
2.肝外转移或肝残留肿瘤；
3.门静脉主干、肝管第一分支、肝静脉第一分支或下腔静脉中有癌栓；
4.入选之前的6个月：系统性地连续使用免疫调节剂(诸如干扰素、胸腺素、传统中药)的持续时间长于3个月；
5.入选之前的6个月：系统性地连续使用免疫抑制药物(诸如皮质类固醇药物)的持续时间长于1个月；
6.在入选之前的6个月内接受任何细胞疗法(包括NK、CIK、DC、CTL、干细胞疗法)；
7.HIV抗体或HCV抗体呈阳性；
8.具有免疫缺陷疾病或自身免疫疾病(诸如类风湿性关节炎、血栓闭塞性血管炎、多发性硬化症或糖尿病1型)的病史；
9.在入选之前5年内罹患其他恶性肿瘤(除皮肤癌、局限性前列腺癌或宫颈癌以外)的患者；
10.存在器官衰竭的患者；
11.患有严重精神疾病的患者；
12.在入选之前1年内药物成瘾，包括酗酒；
13.在筛查之前3个月内参与其他临床试验；
14.研究人员认为不适合该研究的其他原因。
该研究的主要目标是证实MASCT加SOC治疗在以下方面优于单独的基础治疗：(1)作为疗效的量度，在2年内肿瘤复发或转移的患者的数量；(2)作为疗效的量度，从手术到2年内肿瘤复发或转移的时间；(3)作为安全性和耐受性的量度，2年内发生不良事件的患者的数量。该研究的次要目标是在以下方面的作用来比较MASCT加基础治疗与单独的基础治疗：(1)HBV标记物，包括HBeAg；(2)血清HBV DNA载量；以及(3)患者的生活质量。将对两个患者组的额外临床终点(诸如总体应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)和疾病稳定率(SDR))进行比较。将使用RECIST标准(v1.1)来评估肿瘤应答和进展。将根据生命体征、临床实验室结果以及根据2009年10月15日NCI CTCAE 4.02版分级的不良事件来评估安全性。
将进行其他探讨MASCT方法实施方案的临床疗效和毒性的临床试验(与HCC中的1/2期MASCT临床试验相似)，以治疗罹患肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、淋巴瘤、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌和脑癌的患者。
实施例4-T细胞活化方案
该实施例比较了使用各种示例性T细胞活化方案制备的细胞毒性T细胞的体外特异性和功能，所述示例性T细胞活化方案包括T细胞共培养的不同持续时间和周期，以及在该共培养期间免疫检查点抑制剂(诸如抗PD-1单克隆抗体)的存在或不存在。
抗PD-1抗体的使用
图15示出了用于制备活化T细胞的实验设置的示意图。在第0天，通过在淋巴细胞分离液(挪威奥斯陆的奈科明制药公司(Nycomed Pharma,Oslo,Norway))上进行密度梯度离心，获得HBV呈阳性的HCC患者的外周血单核细胞(PBMC)。在含1000U/mL GM-CSF和500U/mL IL-4的AIM-V培养基中继续培养粘附单核细胞，以使其分化为未成熟树突细胞(DC)。利用HBV核心抗原肽(5μg/mL)以及TLR激动剂对未成熟DC进行冲击处理，以使其分化为成熟DC。还利用相同抗原肽对PBMC级分进行冲击处理并且固定。同时，将非粘附PBMC维持在含抗CD3(加利福尼亚州圣地亚哥的eBioscience公司(eBioscience,San Diego,CA))和白介素-2(rIL-2；明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物公司(R&D Systems,Minneapolis,MN))的AIM-V培养基中直至第8天，以获得维持性T细胞。然后在存在细胞因子的情况下，将维持性T细胞与单独的成熟DC，或者与抗PD-1抗体(纳武单抗或SHR-1210)或阴性对照IgG4组合的成熟DC从第9天共培养到第13天，从而提供活化T细胞(即，细胞毒性T淋巴细胞或CTL)。在第14天，将固定的经肽冲击处理的PBMC添加到CTL中并共培养5天，以进行T细胞刺激的第二周期。另选地，可在T细胞刺激的第二周期中使用第二批经肽冲击处理的成熟DC，而不使用固定的经肽冲击处理的PBMC。
使用FACS对第8天的经肽冲击处理的成熟DC和T细胞进行分析，以定量分别表达PD-L1或PD-1的亚群。在第13天和第18天，获取来自共培养物的活化T细胞样本，并通过五聚体染色进行测定，然后进行FACS分析。五聚体及其他多聚体(诸如dextramer)染色指示活化T细胞上存在特异性识别MHC-肽复合体的TCR，从而提供活化T细胞的特异性的量度。还使用肿瘤抗原肽库刺激第13天和第18天的活化T细胞，并且通过细胞内细胞因子染色和随后的FACS分析来确定活化T细胞的IFNγ产量。由于IFNγ是通过被肿瘤抗原肽特异性活化的T细胞产生的，所以对IFNγ产量进行测定提供了肽特异性T细胞的细胞毒性功能的量度。
如图16A所示，约89.1％经肽冲击处理的成熟DC表达PD-L1。图16B示出了到第8天为止在取自四个独立供体的PBMC中的所有CD3+T细胞之中PD1+T细胞的百分比显著增加。
当将抗PD1抗体引入T细胞和DC的共培养物中时，与在不含抗PD-1抗体或含阴性对照IgG4的情况下制备的活化T细胞相比，活化T细胞的特异性和功能在体外均显著提高(图17A至图17D)。具体地，与纳武单抗相比，SHR-1210(恒瑞医药公司(Hengrui Medicine))增强了活化T细胞的体外IFNγ产量(图17D)。
刺激的持续时间和数量
图18示出了用于制备活化T细胞的实验设置的示意图。在第0天，通过在淋巴细胞分离液(挪威奥斯陆的奈科明制药公司(Nycomed Pharma,Oslo,Norway))上进行密度梯度离心，获得EBV呈阳性的健康供体的外周血单核细胞(PBMC)。在含1000U/mL GM-CSF和500U/mL IL-4的AIM-V培养基中继续培养粘附单核细胞，以使其分化为未成熟树突细胞(DC)。利用多种肿瘤抗原肽库(1μg/mL/肽)以及TLR激动剂对未成熟DC进行冲击处理，以使其分化为成熟DC。还利用相同肿瘤抗原肽库对PBMC级分进行冲击处理并且固定。同时，将非粘附PBMC维持在含IL2、IL7、IL15和IL21的AIM-V培养基中直至第8天，以获得维持性T细胞。然后在存在细胞因子的情况下，将维持性T细胞与单独的成熟DC，或者与抗PD-1抗体(纳武单抗或SHR-1210)或阴性对照IgG4组合的成熟DC从第9天共培养到第18天，从而提供活化T细胞(即，细胞毒性T淋巴细胞或CTL)。在第14天，将活化T细胞级分与固定的经肽冲击处理的PBMC混合并培养5天，以进行T细胞刺激的第二周期。另选地，可在T细胞刺激的第二周期中使用第二批经肽冲击处理的成熟DC，而不使用固定的经肽冲击处理的PBMC。
在第13天和第18天，获取来自共培养物的活化T细胞样本，并通过五聚体或dextramer染色进行测定，然后进行FACS分析。还使用肿瘤抗原肽库刺激第13天和第18天的活化T细胞，并且通过细胞内细胞因子染色和随后的FACS分析来确定活化T细胞的IFNγ产量。
如图19A所示，与刺激5天相比，刺激10天之后共培养物中存在更高百分比的肽特异性T细胞。在所测试的所有培养条件之中，10天共培养且在存在抗PD1抗体的情况下刺激一次得到了CD8+T细胞的最高特异性和细胞毒性功能，这是由多聚体染色(图19B)和IFNγ产量(图19C)测得的。
对于使用取自两个不同供体的PBMC制成的两种制备物而言，对取自刺激1次的共培养物的第8天、第10天、第13天和第15天的样本中的T细胞的总数进行定量。如图20A至图20B所示，在所测试的所有样本之中，在存在SHR-1210抗PD1抗体的情况下，在第15天取得的共培养物中发现总T细胞的最高数量。
另外，在第0天，在用抗PD1抗体(纳武单抗或SHR-1210)或阴性对照IgG4和PMA处理的非粘附PBMC细胞中，对PD-1表面表达进行定量。用抗PD1抗体处理的PBMC表现出细胞表面上的PD-1表达水平减少，这是预料之中的，因为抗PD1抗体可使表面PD1内在化(图21A至图21B)。
在使用各种制备方案活化的T细胞的上述体外表征的总结中，在PBMC培养物中使用抗PD1单克隆抗体改善了活化的细胞毒性T细胞的特异性和功能。抗PD1单克隆抗体似乎既增强了T细胞在体外的一般增殖，又促进了通常在T细胞表面上表达的PD1分子的内在化。与纳武单抗相比，SHR-1210抗PD1抗体产生了具有更高特异性和功能的活化T细胞。其他免疫检查点抑制剂(诸如抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体)可用于代替抗PD1抗体，来制备具有增强的特异性和细胞毒性功能的活化T细胞。
实施例5-癌精确免疫疗法临床实践病例分析
该实施例描述了一项研究，该研究的目的是使用下一代测序(NGS)评价癌细胞驱动突变和人类白细胞抗原(HLA)I类基因突变负荷，由此预测主要组织相容性复合体(MHC)I类限制性免疫疗法(诸如PD-I抑制剂或多抗原特异性癌疗法(MASCT))的应答率和有效性。
通过对333个癌相关基因进行下一代测序(NGS)并使用RStudio软件中的Dirichlet多项混合程序包进行分类，将35个癌样本聚类为两个亚组。根据每个样本评价HLA-I基因的突变负荷，并根据非同义点突变预测新抗原。使用合并的突变信息来预测35名癌患者对MHC-I限制性免疫疗法的应答。在已经对其样本进行测序和分析的35名患者之中，五名患者接受了PD-1抑制剂单一疗法、MASCT单一疗法或联合疗法。具有高HLA-I基因突变负荷的两名患者(被预测为无应答者)接受了三次以上的PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001581
)和MASCT联合疗法或MASCT单一疗法。这两名患者在临床上被评价为疾病进展(PD)。具有低HLA-I基因突变负荷和更多新抗原的三名患者(被预测为应答者)接受了四次以上的PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001582
)和MASCT联合疗法或MASCT单一疗法。这三名患者中有两名在临床上被评价为部分应答(PR)，一名患者被评价为疾病稳定(SD)。
在接受了MASCT单一疗法或者MASCT与PD-1抑制剂的联合疗法的患者之中，对本实施例中所述的癌相关基因中的突变进行NGS分析成功地预测了对MHC-I限制性免疫疗法的临床应答。该预测方法能够改善用于各个癌患者的疗效和精确免疫疗法。
简介
下一代测序(NGS)可以快速且高通量的方式对肿瘤组织进行测序，从而提供大量的肿瘤组织突变数据。可将生物信息学方法应用于突变数据以获得临床上显著的突变，从而在以下方面为癌患者提供有用信息：1。临床和分子分层；2。合适药物靶标的选择；以及3。MHC-I限制性免疫疗法的有效性的预测。此类信息可为每名患者提供精确干预，并使癌免疫疗法进入精确医疗时代。癌精确免疫疗法(诸如精确免疫细胞疗法、精确免疫药物疗法)有望成为癌精确疗法的重要突破，从而极大提升患者的生活质量，并且延长患者的生存时间(参见例如，Qian Qijun,Mengchao Wu.Precision cancer immunotherapy:From theoryto practice[J].Chin J Cancer Biother,2015,22(2):151-158(钱其军、吴孟超，“精确癌免疫疗法：从理论到实践”[J]，《中国肿瘤生物治疗杂志》，2015年，第22卷，第2期，第151-158页))。
材料与方法
样本来源
对取自35名患者的肿瘤样本进行测序。在这些患者之中，有18名男性，17名女性，年龄为27-88岁，平均年龄为56岁。从这些患者获取肿瘤样本，并将样本用于测序分析，着重对333个OncoGxOneTM癌相关基因和HLA-I基因进行分析。着重对333个癌相关基因进行下一代测序(NGS)，以获得肿瘤组织中的遗传突变信息，诸如点突变、插入缺失、融合、拷贝数变异等。这35名患者中有五名进一步用PD-1抑制剂(Keytruda)单一疗法、MASCT单一疗法或联合疗法进行治疗(图22)。获得患者对所有临床试验的知情同意书。
HLA-I亚分型
将低质量读段和衔接子序列从原始测序数据中去除，然后使用Polysolver分析工具(参见例如，Shukla SA,Rooney MS,Rajasagi M,et al.Comprehensive analysis ofcancer-assoicated somatic mutations in class I HLA genes.NatureBiotechnology,2015,33:1152-1158(Shukla SA、Rooney MS、Rajasagi M等人，“I类HLA基因中的癌相关体细胞突变的综合分析”，《自然生物技术》，2015年，第33卷，第1152-1158页))来预测HLA-I亚分型。
新抗原预测
根据每名患者的HLA-I亚分型结果，采用包括NetMHC 3.4在内的多种算法来分析来自肿瘤组织的333个癌相关基因的点突变基因座的氨基酸序列。预测了突变的氨基酸对患者的对应HLA-I分子的亲和力，比较了野生型与突变体抗原肽之间的亲和力差异，并且选择了亲和力高于野生型的突变体抗原肽。然后使用以上选择的具有对HLA-I分子的高亲和力的突变体抗原肽来预测T细胞受体(TCR)结合亲和力，并且比较野生型与突变体抗原肽之间的TCR结合亲和力差异。对TCR的结合亲和力高于野生型抗原的突变体抗原肽被选择为可诱导免疫应答的预测新抗原。将这些预测新抗原的序列定位到健康个体的整个人类基因组，并且将具有潜在交叉反应的序列的新抗原从库中去除，以便避免临床试验中的不良反应。
统计
1.1使用开源软件RStudio 0.99.473版对点突变基因座的数量、具有点突变的基因的数量、插入缺失基因座的数量、具有插入缺失的基因的数量、融合基因的数量、具有拷贝数变异的基因的数量以及突变的基因座和基因的总数进行分析。利用这些诱变特征，以Dirichlet多项混合(DMM)模型对35个肿瘤样本进行分层分析(参见例如，Holmes IK,Quince C.Harris.Dirichlet Multinomial Mixtures:Generative Models forMicrobial Metagenomics[J].PLoS ONE,2012,7(2):e30126(Holmes IK、QuinceC.Harris，“Dirichlet多项混合模型：微生物宏基因组学的生成模型[J]”，《公共科学图书馆期刊》，2012年，第7卷，第2期，第e30126页))。
1.2根据333个癌相关基因各自的突变负荷，使用“pheatmap”程序包来生成35个肿瘤组织样本的聚类图。向聚类图添加每个肿瘤样本的特征信息，诸如临床试验分组信息、是否存在DNA错配修复(MMR)缺陷的分组信息以及DMM分组信息。
1.3使用Mann-Whitney秩和检验来检验基于RStudio软件得出的每个DMM组中的HLA-I基因突变数的统计学差异，其中p<0.05即为统计上显著。
结果
333个癌相关基因的分层聚类分析
对每个肿瘤样本中的333个癌相关基因的诱变特征数据进行统计分析，这些诱变特征数据包括点突变基因座的数量、具有点突变的基因的数量、插入缺失基因座的数量、具有插入缺失的基因的数量、融合基因的数量、具有拷贝数变异的基因的数量以及突变的基因座和基因的总数，并且使用这些数据来对35个肿瘤组织样本进行DMM分层分析。如图23A所示，35个样本的最佳聚类为两组。每个样本的标记聚类示于图23B中，该图示出了基于最小距离分隔(MDS1)距离的两组成员的有效分隔：14个肿瘤样本被聚类成DMM组1，21个肿瘤样本被聚类成DMM组0。
根据对每个肿瘤样本中333个癌相关基因每一者检测到的点突变的数量、插入缺失基因座的数量以及具有拷贝数变异的基因座的数量，生成35个肿瘤样本的热图，并且对这些样本和基因进行聚类分析。如图24A所示，观察到35个肿瘤样本的两个主要聚类分支。在为每个样本添加临床或分子标签之后，发现聚类结果与癌临床类型的聚类结果不一致：相同癌临床类型的肿瘤样本具有不同诱变谱，而不同癌临床类型的一些肿瘤样本具有相似突变。该研究中观察到的癌分子分类和临床类型之间的差异与其他报道一致(参见例如，Golub TR,Slonim DK,Tamayo P,et al.Molecular classification of cancer:classdiscovery and class prediction by gene expression monitoring[J].Science,1999,286(5439):531-537(Golub TR、Slonim DK、Tamayo P等人，“癌的分子分类：通过基因表达监测进行的分类发现和分类预测[J]”，《科学》，1999年，第286卷，第5439期，第531-537页))。基于MMR缺陷类型的聚类也与热图中所示的聚类结果不一致。但应当注意，DMM组具有与聚类结果相似的分类，仅一个样本表现出DMM分类与聚类之间的不一致(图24A)。
通过测量在每个肿瘤样本中检测到的HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座处的总突变数，并且与热图中的肿瘤组织聚类结果进行比较，观察到这两个DMM组之间的HLA-I基因突变负荷的显著差异(图24B)。
HLA-I基因突变占总突变数的百分比
对HLA-I基因突变数进行进一步分析，结果表明这两个DMM组之间存在统计上显著的差异。DMM组1(红色)中的14个肿瘤样本的HLA-I基因突变负荷显著高于DMM组0(绿色)中的21个肿瘤样本，p值为1.076e-5(图25A)。此外，DMM组1的HLA-I基因突变负荷与总突变负荷的比率显著高于DMM组0(图25A)，这表明HLA-I基因突变可能是DMM组1的癌细胞的关键内部突变。HLA-I基因的高突变负荷可有利于癌细胞逃避免疫监视，从而导致MHC-I限制性免疫疗法可能无效。
35名癌患者中有五名接受了PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001611
)单一疗法、MASCT单一疗法或它们的联合疗法(图22、图25B)。预测具有HLA-I基因高突变负荷的两名患者(DMM组1)对MHC-I限制性免疫疗法无应答。正如预测的那样，在接受PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001612
)和MASCT的联合疗法或者MASCT单一疗法治疗至少3个周期之后，这两名患者在临床上被评价为疾病进展(PD)或无效临床受益应答(CBR)。预测具有HLA-I基因低突变负荷的三名患者(DMM组0)对MHC-I限制性免疫疗法有应答。正如预测的那样，这三名患者中有两名接受PD-1抑制剂(Keytruda)单一疗法或者(Keytruda)和MASCT的联合疗法治疗5个周期，并且在临床上被评价为部分应答(PR)或明显CBR；这三名患者中有一名接受MASCT治疗4个周期，并且在临床上被评价为疾病稳定。
典型患者病例分析
患者ID 1-LQL
患者ID 1-LQL患有肺腺癌，根据聚类分析预测其属于DMM组1。在HLA-I基因座处检测到55个突变，并且这些突变被分类为HLA-I高突变负荷(图22)。预测MHC-I限制性免疫疗法是临床上无效的。
在接受PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001621
)治疗3个周期和MASCT治疗4个周期之后，该患者由于疾病控制无效和胸腔积液而产生呼吸衰竭并死亡。正如聚类分析所预测的那样，该患者在临床上被评价为疾病进展(PD)。
患者ID 2-SJS
患者ID 2-SJS患有食道癌，根据聚类分析预测其属于DMM组1。在HLA-I基因座处检测到8个突变，并且这些突变被分类为HLA-I高突变负荷(图22)，这表明MHC-I限制性免疫疗法无效。
正如聚类分析所预测的那样，在接受MASCT单一疗法3个周期之后，该患者在临床上被评价为疾病进展(PD)。
患者ID 3-HJL
患者ID 3-HJL，女，73岁，患有左肾盂移行细胞癌，伴有朝左肾上腺、左锁骨上淋巴结和纵膈淋巴结及双肺的多发性转移。根据下一代测序(NGS)结果，将该患者聚类成DMM组0，并且在HLA-I基因座处检测到2个突变，这些突变被分类为HLA-I低突变负荷。根据患者的HLA-I亚分型预测了6个新抗原。因此，预测MHC-I限制性免疫疗法使该患者出现有效CBR。
该患者被诊断为患有左肾盂移行细胞癌，并且接受了根治外科手术。2年后发现左肾上腺处发生转移，因此进行了射频消融(RFA)。RFA后的PET-CT扫描显示左锁骨上淋巴结和纵膈淋巴结及双肺处发生多发性转移，最大的肿瘤尺寸为直径约2cm，因此患者开始接受化学疗法。在第四次化学疗法后，CT复查显示化学疗法对癌控制无效(图26A至图26C)。该患者随后接受PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001631
)和MASCT的联合疗法治疗。在进行联合疗法3个周期之后，CT扫描发现肿瘤尺寸缩小约50％(图26D)。在进行PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001632
)和MASCT的联合疗法5个周期之后，CT扫描显示肺部肿瘤消失，纵膈淋巴结处疾病稳定，并且肿大的左锁骨上淋巴结消失。疾病状况在临床上被评价为部分应答(PR，图26E)。临床结果与预测的一样。
患者ID 4-LKS
患者ID 4-LKS，男，61岁，在根治外科手术之后出现IV期中分化左肺腺癌，同时在脑部和纵膈淋巴结处发生转移。根据NGS结果，将该患者聚类成DMM组0，并且在HLA-I基因座处检测到2个突变，这些突变被分类为HLA-I低突变负荷。根据患者的HLA-I亚分型预测了6个新抗原。因此，预测MHC-I限制性免疫疗法使该患者出现有效CBR。
该患者13年前接受了左肺肿瘤的根治外科手术，然后是4个周期的辅助化学疗法和纵膈CT扫描。在复查期间检测到颅内转移瘤，肿瘤尺寸为约3cm(图27A)，并伴有右侧偏瘫。在进行靶向放射(剂量信息不可用)20个周期之后，肿瘤的尺寸缩小(图27B)。该患者随后接受了PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001633
)单一疗法。在进行治疗2个周期之后，CT复查显示颅内肿瘤进一步缩小(图27C)，并且临床症状显示偏瘫侧的肌肉力量逐渐恢复。在接受PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001634
)单一疗法6个周期之后，CT复查表明进一步改善了颅内肿瘤和水肿状态(图27D)，并且临床症状显示偏瘫侧的肌肉力量逐渐恢复且能够执行精细动作。在完成放射疗法以及进行PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001635
)单一疗法6个月之后，该患者在临床上被评价为部分应答(PR)。该临床结果与我们的测序分析所预测的一样。
讨论
在具有“可逆HLA-I缺陷”的患者中，在过继T细胞免疫疗法之后，T细胞可局部分泌IFN-γ并上调HLA-I分子的表达。因此，评估患者在接受过继T细胞免疫疗法之前是否具有“不可逆HLA-I缺陷”具有更重大的临床意义。
根据上述五个肿瘤组织样本得到的测序结果表明，相比于CBR与HLA-I基因突变负荷之间的相关性，接受PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001636
)和/或MASCT之后的CBR与DNA MMR缺陷状态(在MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因座处检测到的突变)之间的相关性更弱。MMR缺陷可能引起癌细胞中的突变率升高，继而在理论上可能产生更多的新抗原。然而，如果这些癌细胞具有HLA-I分子的低表达或无表达，则新抗原无法有效递呈以供免疫细胞识别并触发细胞毒性效应。因此，HLA-I分子能够供癌细胞中的有效新抗原递呈是保证MHC-I限制性免疫疗法有效的要求之一。患者病例1.LQL支持这一假设：虽然肿瘤组织中检测到许多突变(总共检测到3243个突变)，但是由于HLA-I基因突变负荷也相当高，所以PD-1抑制剂(
Figure BDA0001405186940001641
)疗法或MASCT没有显著的临床效果。
由于HLA-I基因具有高多态性，在获得肿瘤组织中的HLA-I基因突变信息之后，需要进一步测试以确定特定基因座处的氨基酸突变是否以及在多大程度上影响HLA-I分子的抗原递呈。在该研究中，开展了统计分析以对癌患者进行分层分析，并且根据每名患者的肿瘤组织中的HLA-I基因突变负荷，将他们聚类成对于MHC-I限制性免疫疗法而言的一个应答组和一个无应答组，从而可测量临床应答与HLA-I基因突变负荷之间的相关性。根据这5项病例研究，具有低HLA-I突变负荷的3名患者表现出对MHC-I限制性免疫疗法的有效CBR，而具有高HLA-I突变负荷的2名患者未表现出对这种疗法的有效CBR。该实施例报告了首例临床发现，即可对患者样本的NGS数据进行生物信息学分析，以根据新抗原数和HLA-I基因突变负荷来提供癌免疫疗法(诸如使用PD-1抑制剂
Figure BDA0001405186940001642
)和过继T细胞疗法(诸如MASCT)的预后，从而为患者提供精确免疫疗法。正在开展样本量更大的临床研究以证实该发现。
实施例6-接受新抗原-MASCT治疗的结直肠癌患者的病例研究
患者XMZ，男，58岁，被诊断为结肠癌并接受了结肠切除术。病理分析显示为II期结肠癌。结肠切除术之后三年，该患者接受了CTC监测，结果显示CTC含量为194个细胞/10mL。该患者接受了三个治疗周期的精确MASCT，如图28中所概述。
简而言之，第一步，使用ONCOGXONETM癌相关基因加HLA检测组合(艾达康医疗公司(Admera Health))对取自患者的肿瘤活检样本进行测序和分析。ONCOGXONETM加HLA检测组合使用Illumina MiSeq或HiSeq测序平台，对特异于癌类型的约150-400个基因(包括HLA基因座)进行测序。使用Agilent SURESELECTTM靶标富集试剂盒富集样本中的靶序列。靶序列区跨越约2-5.4Mb的每个基因座，覆盖所有外显子、UTR和相关内含子区。平均覆盖深度为约100倍。根据测序数据确定基因组变异，包括点突变、插入缺失、重排和拷贝数变异(CNV)。
该患者样本的ONCOGXONETM加HLA分析揭示了患者具有KRAS基因中的G12A点突变，这可能降低患者对用抗EGFR的单克隆抗体(诸如西妥昔单抗或帕尼单抗)进行的治疗的敏感度。该患者具有XRCC1基因的残基Q399处的点突变，这表明对基于铂的化疗药物的应答可能增强。该患者具有MTHFR和TYMS中的突变，这表明对5-FU的应答可能增强。该患者具有CYP2D6中的突变，这表明对他莫昔芬或阿片类镇痛药的应答可能减弱。根据测序结果预测的可能有益药物包括抗PD-1抗体(诸如
Figure BDA0001405186940001651
或
Figure BDA0001405186940001652
)、PD-0332991(帕博西尼)和曲美替尼(诸如
Figure BDA0001405186940001653
)。
另外，根据测序结果得到的HLA亚分型和突变分析揭示了该患者具有HLA-I基因中的两个缺失突变，包括HLA-A基因座中的一个以及HLA-C基因座中的一个。该患者肿瘤样本的HLA-I亚分型和突变负荷结果示于下表3和表4中。该患者HLA基因座的功能分析表明，MHC-I限制性疗法(诸如基于T细胞的疗法)可能对患者有效。
表3.HLA-I亚分型结果
基因座 A1 A2
A 0206 2402
B 1502 5101
C 0302 0801
表4.HLA-I类基因中的突变
基因 染色体 位置 WT 突变 频率 类型 测序深度
HLA-A chr6 29912028 AG A 0.1783 缺失 129
HLA-C chr6 31236715 CG C 0.9429 缺失 245
根据测序分析，发现了四个候选新抗原(图29A)。分别根据新抗原MTHR-A222V和MLL3-C988F设计了两个新的抗原肽。另外，从我们的抗原肽库中选择新抗原肽KRAS_G12V。将16个抗原肽(包括hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1、MET、MUC1、Kras-3、新抗原1+2)纳入抗原肽库中，以用于针对患者乙状结肠肿瘤进行的MASCT治疗。
在使用包含新抗原肽的抗原肽库进行三个周期的精确MASCT治疗之后，该患者的循环肿瘤细胞(CTC)数量减少(图29B)。通过ELISPOT对取自患者的PBMC样本进行测定，以评估抗原特异性T细胞应答。ELISPOT结果(图29C)揭示了该患者的PBMC的T淋巴细胞表现出对于MUC1和新抗原(新抗原1+1、Kras-3)的强烈特异性应答，同时对hTERT、p53、生存素、NY-ESO-1和MET的特异性应答也很显著。抵抗肿瘤新抗原和肿瘤相关抗原的特异性T细胞存在于患者的PBMC中，并且在MASCT治疗过程中增殖。在接受三个周期的MASCT治疗之后，患者表现出精力和体力得以改善，以及体态发生改变(诸如头发和胡须变黑)。
实施例7-接受MASCT治疗的患者的预后和分层
该实施例提出了一种示例性模型，该模型用于根据患者的新抗原数(即，新抗原负荷)和HLA分子突变负荷，来提供对接受MHC限制性疗法，诸如MASCT治疗(包括精确MASCT)的患者的预后和分层。
使用实施例5中所述的方法，确定并分析取自40名癌患者的肿瘤样本中的HLA分子突变负荷和新抗原负荷。如果患者具有以下情况，则预测该患者能够受益于MHC限制性疗法：(1)B2M中没有突变；(2)HLA基因的功能区(诸如前导肽序列、a1结构域、a2结构域或a3结构域)中没有突变；(3)HLA-I A、B或C基因中的突变少于2个；以及(4)新抗原多于5个。如果患者具有以下情况，则预测该患者可能受益于MHC限制性疗法：(1)B2M中没有突变；(2)HLA基因的功能区(诸如前导肽序列、a1结构域、a2结构域或a3结构域)没有的突变；(3)HLA-IA、B或C基因中的突变至少为2个但少于10个；以及(4)新抗原少于5个。如果患者具有以下情况，则预测该患者不能受益于MHC限制性疗法：(1)B2M中的突变为一个或多个；或(2)HLA-IA、B或C基因中的突变为至少10个。9名患者接受了MHC限制性疗法，包括MASCT和/或免疫检查点阻滞治疗。下表5示出了三个预后组中患者的临床应答。
表5.接受MHC限制性疗法的患者的预后
预后组 受益 可能受益 不受益
数量(总计＝40) 17(42.5％) 21(52.5％) 2(5％)
接受MHC限制性疗法 5 3 1
对MHC限制性疗法有应答 4 2 0
对MHC限制性疗法无应答 1 1 1
应答率 80％ 66％ 0％
预后的成功率 80％ NA 100％
实施例8-MASCT在肝细胞癌患者中的安全性
45名肝细胞癌患者接受了MASCT治疗，并且收集了他们的临床数据，包括临床应答、肝肾功能、血常规检查结果和不良反应，并对这些临床数据进行了回顾性分析。这些患者未接受任何其他免疫疗法，并且他们在接受MASCT之前的最近治疗(外科手术、放射疗法、化学疗法)在进行MASCT之前至少一个月或更长时间完成。图30A示出了这45名患者的临床特征。
根据实施例1中所述的方法制备用于MASCT的细胞。简而言之，在第1天从每名患者中分离PBMC，并且将粘附细胞诱导成DC。用14种多抗原肽负载DC，以制备成熟DC(mDC)。在第8天，将少部分mDC皮下注射到患者体内。将取自PBMC样本的非粘附细胞与第7天的其余mDC共培养，并诱导成细胞毒性T细胞(CTL)，然后在第26天静脉输注细胞毒性T细胞。对mDC和CTL进行表征以确保质量控制。在mDC中，CD80+细胞的百分比为98.5±5％，CD83+细胞的百分比为88±10％，CD86+细胞的百分比为98.4±3％，并且HLA-DR+细胞的百分比为98.8±2％。mDC分泌高水平的IL-12(985±312pg/mL)和低水平的IL-10(53±10pg/mL)。在CTL中，CD3+CD8+细胞的百分比为83±10％，并且CD3+CD56+细胞的百分比为24±5％。CTL分泌高水平的IFN-γ(1222±650pg/mL)和低水平的IL-10(6.8±5.0pg/mL)。
所有45名患者在接受MASCT治疗之后具有不同程度改善的临床状况。大多数患者表现出改善的精力、食欲、睡眠和体力。输注活性免疫细胞之后的主要不良事件是中度发烧(2个病例，4.44％)。发烧在输注CTL约1小时后发生，并且在这两个病例中，发烧均未超过38.5℃。患者在休息、饮水和物理降温后恢复正常体温。未观察到其他严重不良事件。
图30B示出了在MASCT治疗之前和最后MASCT治疗之后45名患者的血常规检查的结果。未在任何患者的血常规检查结果中观察到异常。白血细胞(WBC)数(P＝0.0411)和中性粒细胞(Neu)数(P＝0.0015)在MASCT治疗之前和之后表现出显著变化，但在正常范围内，因此不会产生显著的临床影响。血红蛋白(HB)和血小板(PLT)数未表现出统计上显著的变化。使用SPSS 19.0软件，通过t检验进行统计分析。
图30C示出了在MASCT治疗之前和最后MASCT治疗之后45名患者体内的ALT、AST、TBIL、CR和BUN水平。未在任何患者的肝或肾功能中观察到异常。MASCT治疗之前2名患者的数据不可用。AST(p＝0.0198)和TBIL(p＝0.0177)水平在MASCT治疗之后表现出统计上显著的变化，并且ALT也呈现升高的趋势，这具有临床意义。CR和BUN水平在MASCT治疗之后没有统计上显著的变化。
在4-6次MASCT治疗之后，可获得6次访视的肝功能数据(从基线水平到5次MASCT治疗之后)。图30D示出了在5次MASCT治疗过程中10名患者体内的ALT和AST水平的变化。排除水平大幅波动的2名患者，包括接受了肝移植进而使第6次访视时的ALT水平升高至288IU/L的一名患者；以及接受了TACE疗法进而使第6次访视时的水平升高至572IU/L的第二名患者。对患者体内的ALT和AST随时间推移的水平进行比较，发现没有统计上显著的变化。
结果表明MASCT治疗对于HCC患者是安全的。
序列表
<110> SYZ细胞治疗公司(SYZ CELL THERAPY CO.)
<120> 使用活化T细胞治疗癌的方法
<130> 744852000141
<140> 尚未转让
<141> 同此提交
<160> SEQ ID数量：45
<170> FastSEQ for Windows版本4.0
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 长度：9
<212> 类型：PRT
<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
<400> 序列：1
Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu
1 5
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 长度：9
<212> 类型：PRT
<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
<400> 序列：2
Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu
1 5
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<211> 长度：9
<212> 类型：PRT
<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
<400> 序列：3
Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu
1 5
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<211> 长度：9
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<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
<400> 序列：4
Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg
1 5
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<211> 长度：10
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<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
<400> 序列：5
Asp Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val
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<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
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<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
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<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
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1 5 10
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<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
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<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
<400> 序列：32
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<400> 序列：33
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Leu Ile Thr Gln Phe Thr Ser Phe Val
1 5
<210> SEQ ID NO: 45
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<213> 生物体：智人(Homo sapiens)
<400> 序列：45
Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val
1 5

Claims (83)

1.活化T细胞在制备治疗个体中癌的方法中施用的药物中的用途，所述方法包括向所述个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与负载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备所述活化T细胞，所述多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽，其中所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO: 1-40的表位，其中所述至少10种肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO: 1-24的表位，其中所述癌是实体瘤。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述个体此前曾施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。
3.根据权利要求1所述的用途，所述方法还包括向所述个体施用有效量的负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述树突细胞在所述活化T细胞的所述施用之前施用。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述树突细胞在所述活化T细胞的所述施用之前7天至21天施用。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述方法还包括通过将所述T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群共培养来制备所述活化T细胞。
7.根据权利要求6所述的用途，其中将所述T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群共培养7天至21天。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中在所述共培养之前，使所述T细胞群与免疫检查点抑制剂接触。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中在存在免疫检查点抑制剂的情况下，将所述T细胞群与负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群共培养。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3的免疫检查点分子的抑制剂。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3的免疫检查点分子的抑制剂。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述方法还包括制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群。
13.根据权利要求12所述的用途，其中通过使树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群。
14.根据权利要求13所述的用途，其中通过在存在有利于所述树突细胞摄取所述多种肿瘤抗原肽的组合物的情况下，使所述树突细胞群与所述多种肿瘤抗原肽接触来制备负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群。
15.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述T细胞群和所述树突细胞群来源于同一个体。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述T细胞群和所述树突细胞群来源于正接受治疗的所述个体。
17.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中向所述个体施用所述活化T细胞至少三次。
18.根据权利要求17所述的用途，其中每次施用所述活化T细胞之间的间隔为0.5个月至5个月。
19.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述活化T细胞经静脉内施用。
20.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述活化T细胞以至少3×109个细胞/个体的剂量施用。
21.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述活化T细胞以1×109至1×1010个细胞/个体施用。
22.根据权利要求2至5中任一项所述的用途，其中负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞施用至少三次。
23.根据权利要求22所述的用途，其中每次施用所述树突细胞之间的间隔为0.5个月至5个月。
24.根据权利要求2至5中任一项所述的用途，其中负载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞经皮下施用。
25.根据权利要求2至5中任一项所述的用途，其中所述树突细胞以1×106至5×106个细胞/个体的剂量施用。
26.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述至少10种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO: 1-24的表位。
27.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽包含至少14种肿瘤抗原肽，其中所述至少14种肿瘤抗原肽各自包含至少一种选自SEQ ID NO: 1-35的表位。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述至少14种肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO: 1-35的表位。
29.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽中的至少一种包含具有选自SEQ ID NO: 36-38的氨基酸序列的表位。
30.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述癌是肝细胞癌。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述肝细胞癌是B期肝细胞癌。
32.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述癌是宫颈癌。
33.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述癌是结肠直肠癌。
34.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽各自为20至40个氨基酸长。
35.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种包含MHC-I表位的肽。
36.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽包括至少一种包含MHC-II表位的肽。
37.根据权利要求35所述的用途，其中所述至少一种包含MHC-I表位的肽在N末端、C末端或这两末端处还包含位于所述表位旁侧的附加氨基酸。
38.根据权利要求36所述的用途，其中所述至少一种包含MHC-II表位的肽在N末端、C末端或这两末端处还包含位于所述表位旁侧的附加氨基酸。
39.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽包括第一核心组普通肿瘤抗原肽。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽还包括第二组癌类型特异性抗原肽。
41.根据权利要求39所述的用途，其中所述第一核心组包含10至20种普通肿瘤抗原肽。
42.根据权利要求40所述的用途，其中所述第一核心组包含10至20种普通肿瘤抗原肽。
43.根据权利要求40或权利要求42所述的用途，其中所述第二组包含1至10种癌类型特异性抗原肽。
44.根据权利要求42所述的用途，其中所述第二组包含1至10种癌类型特异性抗原肽。
45.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽。
46.根据权利要求45所述的用途，其中基于来自所述个体的肿瘤样本的遗传图谱来选择所述新抗原肽。
47.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽具有预测的氨基酸序列。
48.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽是合成的。
49.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述多种肿瘤抗原肽中每种肿瘤抗原肽的浓度为0.1-200 μg/mL。
50.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述癌选自肝细胞癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、淋巴瘤、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑素瘤以及脑癌。
51.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，所述方法还包括向所述个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA和LAG-3的免疫检查点分子的抑制剂。
53.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中治疗个体中癌的方法包括基于所述癌中的突变负荷来选择所述个体。
54.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述个体具有所述癌中的低突变负荷。
55.根据权利要求54所述的用途，其中所述个体具有一种或多种MHC基因中的低突变负荷。
56.根据权利要求55所述的用途，其中所述个体具有所述一种或多种MHC基因中的不超过10种突变。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的用途，其中所述个体没有B2M中的突变。
58.根据权利要求55或权利要求56所述的用途，其中所述个体没有所述一种或多种MHC基因的功能区中的突变。
59.根据权利要求55所述的用途，其中通过对来自所述个体的肿瘤样本进行测序来确定所述癌的所述突变负荷。
60.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中治疗个体中癌的方法包括基于具有所述癌中的一种或多种新抗原来选择所述个体。
61.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述个体具有至少5种新抗原。
62.根据权利要求60所述的用途，所述方法还包括鉴定所述癌的新抗原，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中所述新抗原肽包含所述新抗原中的新表位。
63.根据权利要求61所述的用途，所述方法还包括鉴定所述癌的新抗原，以及将新抗原肽掺入所述多种肿瘤抗原肽中，其中所述新抗原肽包含所述新抗原中的新表位。
64.根据权利要求60所述的用途，其中通过对来自所述个体的肿瘤样本进行测序来鉴定所述新抗原。
65.根据权利要求64所述的用途，其中所述测序是癌相关基因的靶向测序。
66.根据权利要求62或63所述的用途，所述方法还包括确定所述新表位对MHC分子的亲和力。
67.根据权利要求66所述的用途，所述方法还包括确定包含所述新表位和MHC分子的复合体对T细胞受体的亲和力。
68.根据权利要求66所述的用途，其中所述MHC分子是MHC I类分子。
69.根据权利要求67所述的用途，其中所述MHC分子是MHC I类分子。
70.根据权利要求66所述的用途，其中所述MHC分子来自所述个体。
71.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述方法还包括在所述活化T细胞或活化PBMC的施用之后监测所述个体。
72.根据权利要求71所述的用途，其中所述监测包括确定所述个体中的循环肿瘤细胞(CTC)的数量。
73.根据权利要求71所述的用途，其中所述监测包括检测所述个体中针对所述多种肿瘤抗原肽的特异性免疫应答。
74.根据权利要求73所述的用途，其中基于所述特异性免疫应答来调节所述多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽。
75.根据权利要求74所述的用途，其中使用所述多种定制肿瘤抗原肽重复所述治疗个体中癌的方法。
76.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述个体是人类个体。
77.一种克隆肿瘤特异性T细胞受体的方法，所述方法包括：
(a)从使用权利要求1至76中任一项所述的用途治疗过的个体分离T细胞，其中所述T细胞特异性地识别所述多种肿瘤抗原肽中的肿瘤抗原肽；以及
(b)从所述T细胞克隆T细胞受体以提供所述肿瘤特异性T细胞受体。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述个体具有针对所述肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫应答。
79.根据权利要求77或权利要求78所述的方法，其中所述T细胞分离自所述个体的PBMC样本。
80.根据权利要求77或权利要求78所述的方法，其中所述肿瘤抗原肽是新抗原肽。
81.一种使用权利要求77至80中任一项所述的方法克隆的肿瘤特异性T细胞受体。
82.一种包含权利要求81所述的肿瘤特异性T细胞受体的分离的T细胞。
83.权利要求82所述的分离的T细胞在制备治疗个体中癌的方法中使用的药物中的用途，所述癌是实体瘤。
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