CN111936618B - 改良多抗原特异性细胞疗法方法 - Google Patents

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Abstract

本专利申请提供通过将T细胞与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞共培养来制备活化T细胞群的方法。还提供的是使用此类活化T细胞治疗个体中癌症的方法、用于基于细胞的癌症免疫疗法的药物组合物以及试剂盒。

Description

改良多抗原特异性细胞疗法方法
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2018年3月30日提交的国际专利申请号PCT/CN2018/081338的优先权权益，其公开内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本专利申请涉及癌症免疫疗法的领域。更具体而言，本专利申请提供方法、组合物、和试剂盒以用于使用活化T细胞治疗个体中癌症。
背景技术
人体具有精密的免疫系统，以保护自身来抵御疾病。发动身体自身的抗癌免疫力已是肿瘤学上长久以来的理想。肿瘤抗原会引发对肿瘤的天然免疫反应。抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)，尤其是树突细胞(dendritic cell,DC)，可处理并在其细胞表面上呈递肿瘤抗原。成熟之后，载有肿瘤抗原的DC可触发T细胞反应，该T细胞反应涉及细胞毒性T细胞、辅助T细胞、和功能上不同的效应T细胞及记忆T细胞，其对抗表现肿瘤抗原的癌细胞。一种特别强大的T细胞反应类型涉及生产细胞毒性T细胞，其可通过释放细胞因子、酶、和细胞毒素，或通过经由细胞间相互作用诱导促进细胞凋亡的传讯级联反应，来杀死癌细胞。
基于细胞的癌症免疫疗法寻求通过向患者施用免疫媒介细胞来治疗癌症，此类免疫媒介细胞经制备以靶向肿瘤抗原。FDA所批准的
Figure BDA0002710879240000011
(sipuleucel-T)是一种基于DC的疗法，其包括使患者的周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclearcell,PBMC)暴露于融合蛋白，该融合蛋白包括耦合至细胞因子的肿瘤衍生抗原；然后向该患者输注此类PBMC，推测此类PBMC含有可向T细胞呈递该肿瘤衍生抗原的活化DC。参见美国专利号6,210,662。过继性T细胞疗法涉及自患者的肿瘤分离的肿瘤浸润淋巴球(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)，体外扩增此类TIL，且在耗尽患者的天然非骨髓性淋巴球后将此类TIL输注回该患者。参见Restifo NP et al.(2012)Nat.Rev.Immunol.12:269-81。具有经工程改造的T细胞受体的T细胞(TCR-T)或具有嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)是通过修饰T细胞-肿瘤相互作用的微环境，来进一步扩增过继性T细胞疗法方法的能力。最近，多抗原特异性细胞疗法(Multiple Antigen Specific Cell Therapy,“MASCT”)方法已经设计以利用DC及活化T细胞两者的治疗能力，以便为癌症患者提供安全、持久且可定制的治疗。参见国际专利申请公布号WO2016145578A1。
在本文中所参照的所有出版物、专利、专利申请和已公开专利申请的公开内容全文特此以引用方式并入本文中。
发明内容
本专利申请提供制备活化T细胞的方法、和使用此类活化T细胞治疗个体中癌症的方法。
本专利申请的一个方面提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA；以及c)将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，步骤c)包括在共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，该共培养基包含介白素混合物、免疫检查点抑制剂、和抗CD3抗体。在一些实施方案中，步骤c)包括：在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，在该共培养开始后约3至7天(诸如约5天)，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基进一步包含PGE2。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。
本专利申请的一个方面提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及c)在该共培养开始后约3至7天(诸如约5天)，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，步骤a)进一步包括在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含toll样受体(toll-like receptor,TLR)激动剂。在一些实施方案中，该TLR激动剂选自MPLA、聚肌胞苷酸、雷西莫特(resquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)和CL075。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该T细胞群存在于PBMC群中。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，通过诱导来自PBMC的单核细胞群分化来获得该树突细胞群。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该树突细胞群和该T细胞群从相同个体获得。在一些实施方案中，该树突细胞群和该T细胞群衍生自相同个体的PBMC。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该多种肿瘤抗原肽是多种合成肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽不是获自细胞样本。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括(多种)一般肿瘤抗原肽、(多种)癌症类型特异性抗原肽、和/或新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽(例如，由新抗原肽组成)。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括至少约5种(例如，至少约10、20、30、40、或更多种)不同肿瘤抗原肽。
还提供的是一种分离的活化T细胞群，其是使用上述方法中任一者制备。
进一步提供的是一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的此类活化T细胞，此类活化T细胞是使用上述方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，该树突细胞群和该T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，施用载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞至少三次。在一些实施方案中，载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，该个体是人类个体。在一些实施方案中，该癌症是实体肿瘤，诸如肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、或肺癌。
进一步提供的是药物组合物、试剂盒、和制品，其用于上述方法中任一者。
由随后的具体实施方式和随附权利要求书，本发明的这些和其他方面和优点将变得显而易见。应了解的是，本文所述的各种实施方案的一项、一些、或所有性质可经组合以形成本发明的其他实施方案。
附图说明
图1A显示在含有各种toll样受体(TLR)或组合的DC成熟培养基中培养之后的成熟DC上的共刺激分子表现水平。图1B显示成熟DC的细胞因子分泌水平。DC3/4：DC成熟培养基，其包括IL6、TNFα、IL1β、和聚肌胞苷酸；I:INFγ；M:MPLA；P:聚肌胞苷酸；R：雷西莫特；G：嘎德莫特；C:CL075。
图2A显示在含有不同浓度的TLR的DC成熟培养基中培养之后的成熟DC数目。图2B显示成熟DC上的共刺激分子表现水平。图2C显示成熟DC的细胞因子分泌水平。DC3/4：DC成熟培养基，其包括IL6、TNFα、IL1β、和聚肌胞苷酸；I:INFγ；M1：MPLA，低浓度；M2:MPLA，高浓度；R1：雷西莫特，低浓度；R2：雷西莫特，高浓度；G1：嘎德莫特，低浓度；G2：嘎德莫特，高浓度；CL1:CL075，低浓度；CL2:CL075，高浓度。
图3A显示在通过具有不同PGE2浓度的toll样受体(TLR)组合物诱导成熟之后的DC数目。图3B显示经诱导的抗原负载成熟DC上的共刺激分子分泌水平。图3C显示经诱导的抗原负载成熟DC的细胞因子表现水平。DC3/4：DC成熟培养基，其包括IL6、TNFα、IL1β、和聚肌胞苷酸；I:INFγ；M:MPLA；P1:PGE2，低浓度；P2:PGE2，中等浓度；P3:PGE2，高浓度。
图4显示在补充有IL-2或介白素混合物(IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21)的抗原负载成熟DC与T细胞的共培养物中，在肿瘤抗原肽刺激之后分泌IFNγ的肿瘤抗原特异性T细胞的百分比和数目。
图5A显示在各种条件下细胞制剂中的肿瘤抗原特异性T细胞的百分比和数目。CIK：用高浓度IL-2培养的PBMC，且在共培养3天之后添加抗CD3抗体；先前MASCT：用高浓度IL-2的抗原负载DC与PBMC的共培养物，且在共培养3天之后添加抗CD3抗体；1：用抗PD1抗体、介白素混合物(包括高浓度IL-2)的抗原负载DC与PBMC的共培养物，且在共培养3天之后添加抗CD3抗体；2：用抗PD1抗体、介白素混合物(包括高浓度IL-2)的抗原负载DC与PBMC的共培养物，且在共培养5天之后添加抗CD3抗体。
图5B显示在用抗PD1抗体、介白素混合物(包括低浓度或高浓度IL-2)的抗原负载DC与PBMC的共培养物中肿瘤抗原特异性T细胞的百分比和数目，且在共培养5天之后添加抗CD3抗体。
图6A显示使用不同DC制备方法的来自健康捐赠者的经诱导的抗原负载成熟DC的IL-2分泌水平。
图6B显示使用不同DC制备方法的来自癌症患者的经诱导的抗原负载成熟DC的IL-2分泌水平。
图7显示使用不同方法制备的共培养物中生产IFN-γ的肿瘤抗原特异性T细胞的百分比。
图8显示使用先前MASCT规程(“P”)或改良MASCT规程(“I”)制备的活化T细胞的抗肿瘤效应。
图9显示示例性新MASCT治疗的示意性工作流程。此图中所示的新MASCT治疗使用衍生自新抗原和肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)两者的抗原肽。在一些实施方案中，新MASCT治疗使用仅衍生自新抗原的抗原肽池。
图10显示用于设计新抗原肽的示意性工作流程。
图11显示在响应于使用新抗原肽的改良MASCT治疗(“新MASCT”)的八名患者中，对新抗原肽的特异性T细胞反应率。
图12显示来自患者#2的在改良MASCT治疗之前和之后的PBMC的ELISPOT结果。
图13显示来自患者#2的在新MASCT治疗之前和之后的PBMC的ELISPOT结果。
图14显示来自患者#2和患者#5的在新MASCT治疗之前和之后的PBMC的示例性ELISPOT结果。
具体实施方式
本专利申请提供通过将T细胞与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞(DC)共培养来制备活化T细胞的改良方法。在一些实施方案中，该方法使用包含MPLA的DC成熟培养基以诱导抗原负载DC成熟、包括介白素混合物和免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)的共培养基以用于T细胞与抗原负载DC的共培养、和/或抗CD3抗体至共培养物的延迟添加以提供具有增强比例的肿瘤抗原特异性T细胞和减少比例的免疫抑制调节性T细胞(Treg)的活化T细胞。相较于使用如WO2016145578A1所公开的先前报导的多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”或“先前MASCT”)方法的示例性规程者，使用本文所公开的方法，衍生自癌症患者的抗原负载成熟DC的IL-12分泌增加约70倍，而共培养物中的肿瘤抗原特异性T细胞百分比增加约2至4倍。本文所述的用于使用活化T细胞治疗癌症的方法称为“改良MASCT”方法。在患有癌症(包括实体肿瘤)的患者中，改良MASCT方法提供增强的治疗疗效和反应持续时间。
因此，本专利申请的一个方面提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及c)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。
本专利申请的另一个方面提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA；c)将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，从而获得该活化T细胞群。
还提供使用本文所述方法制备的活化T细胞、治疗癌症的方法、组合物、试剂盒、和制品。
I.定义
除非另有定义如下，否则用语在本文中是如所属技术领域中所通常使用般使用。
如本文中所使用，“治疗(treatment/treating)”是获得有益或所欲结果(包括临床结果)的方式。针对本发明的目的，有益或所欲临床结果包括但不限于下列中的一者或多者：减少又一种疾病所导致的症状、消减疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)、预防或延迟疾病的发生或复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的(部分或完全)缓解、降低一或多种治疗疾病所需的其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加生活质量、和/或延长存活。“治疗(treatment)”还涵盖的是癌症病理结果的减少。本发明的方法设想到这些治疗方面中的任一者或多者。
如本文中所使用，“延迟(delaying)”癌症的发展意指推迟、阻碍、减缓、推迟、稳定、和/或延后疾病的发展。此延迟可为不同时间长度，其取决于疾病史和/或正接受治疗的个体。如对于所属领域技术人员而言为明显的，足够或显著的延迟实际上可涵盖预防，因为个体不会发展疾病。“延迟”癌症发展的方法当与未使用该方法比较时，是降低给定时段中疾病发展的可能性和/或降低给定时段中疾病程度的方法。此模拟较一般是基于临床研究、使用统计上显著的个体数。可使用标准方法检测癌症发展，标准方法包括但不限于计算机断层扫描(CAT扫描)、磁共振造影(MRI)、腹部超音波、凝血测试、动脉摄影、或活检。发展也可指最初可能为不可检测的癌症进展，且包括发生、复发和发作。
用语“个体(individual)”、“制品(subject)”、和“患者(patient)”在本文中可互换使用，以描述哺乳动物，包括人类。个体包括但不限于人类、牛、马、猫、犬、啮齿动物、或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人类。在一些实施方案中，个体罹患诸如癌症的疾病。在一些实施方案中，个体需要治疗。
如所属技术领域中所了解，“有效量(effective amount)”是指足以产生所欲治疗成果(例如，降低一或多种癌症症状的严重性或减少其持续时间、稳定一或多种癌症症状的严重性、或消除一或多种癌症症状)的组合物(例如抗原负载DC、或活化T细胞)的量。就治疗用途而言，有益或所欲结果包括例如减少一或多种疾病导致的症状(生物化学、组织学、和/或行为方面)，该症状包括在疾病发展期间呈现的并发症和中间病理表型；增加罹患疾病者的生活质量；降低其他治疗疾病所需药物的剂量；增强另一种药物的效果；延迟疾病的进展；和/或延长患者的存活。
“辅助性治疗(adjuvant setting)”是指其中个体已具有癌症病史且通常(但不一定)已对疗法有反应的临床环境，疗法包括但不限于手术(例如，手术切除)、放射疗法、和化疗。然而，由于其癌症病史，将这些个体视为处于疾病发展的风险。“辅助性治疗(adjuvantsetting)”中的治疗或施用是指后续治疗模式。风险程度(例如，在辅助性治疗中的个体视为“高风险”或“低风险”时)取决于数个因素，最常见的是首次治疗时的疾病程度。
“新辅助性治疗(neoadjuvant setting)”是指其中方法在主要/决定性疗法之前进行的临床环境。
如本文中所使用，“组合疗法(combination therapy)”意指第一药剂与另一种药剂配合施用。“与……配合(in conjunction with)”是指一种治疗型态在除了另一种治疗型态之外下施用，诸如本文所述的活化T细胞在除了另一种药剂(诸如免疫检查点抑制剂)的施用外施用至相同个体。因此，“与……配合”是指一种治疗型态在另一种治疗型态递送至个体之前、期间、或之后施用。将此类组合视为属于单一治疗方案(regimen或regime)的部分。
如本文中所使用，用语“同时施用(simultaneous administration)”意指在组合疗法中的第一疗法和第二疗法是以不多于约15分钟(诸如不多于约10、5、或1分钟中的任一者)的时间间隔施用。当第一疗法和第二疗法是同时施用时，第一疗法和第二疗法可含在相同组合物(例如，包括第一疗法和第二疗法两者的组合物)中或不同组合物(例如，第一疗法在一种组合物中，而第二疗法是含在另一种组合物中)中。
如本文中所使用，用语“依序施用(sequential administration)”意指在组合疗法中的第一疗法和第二疗法是以多于约15分钟(诸如多于约20、30、40、50、60、或更多分钟中的任一者)的时间间隔施用。可先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法可含在不同组合物中，此类不同组合物可含在相同或不同包装或试剂盒中。
如本文中所使用，用语“并行施用(concurrent administration)”意指组合疗法中的第一疗法的施用与第二疗法的施用彼此重迭。
如本文中所使用，以“医药上可接受(pharmaceutically acceptable)”或“药理上相容(pharmacologically compatible)”意指不是在生物或其他方面上非所欲的材料，例如，可将该材料并入施用至个体的药物组合物中，而不会造成任何显著非所欲的生物作用，或以有害方式与含有其的组合物中的任何其他组分相互作用。医药上可接受的载剂或赋形剂优选地已符合所需毒物测试标准和制造测试标准，和/或包括于美国食品药物管理局(U.S.Food and Drug administration)所制作的非活性成分指南(Inactive IngredientGuide)。
如本文中所使用，用语“细胞(cell)”、“细胞系(cell line)”、和“细胞培养物(cell culture)”可互换使用，且所有此类名称皆包括子代。据了解，由于人为或意外的突变，所有子代的DNA含量可能不完全相同。具有与原始细胞相同的功能或生物活性的变体子代包括在内。
用语“肽(peptide)”是指不多于约100个氨基酸的氨基酸聚合物(包括蛋白质的片段)，其可为直链或支链，包括经修饰氨基酸，和/或以非氨基酸间隔。该用语还涵盖经过自然修饰或介入修饰的氨基酸聚合物，其包括例如双硫键形成、醣基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵或修饰。还包括在此用语内的是(例如)含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的肽、以及所属技术领域中已知的其他修饰。本文所述的肽可天然存在，即，获自或衍生自天然来源(例如血液)，或经过合成(例如，经化学合成、或通过重组DNA技术合成)。
如本文中所使用，“多种肿瘤抗原肽(a plurality of tumor antigenpeptides)”、“多种肿瘤抗原肽(multiple tumor antigen peptides)”、“肿瘤抗原肽的池(a pool of tumor antigen peptides)”、和“肿瘤抗原肽池(a tumor antigen peptidespool)”可互换使用，以指二或更多种肿瘤抗原肽的组合。
如本文中所使用，“载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞(dendritic cells loadedwith a plurality of tumor antigen peptides)”和“抗原负载树突细胞(antigen-loaded dendritic cells)”可互换使用，以指在该多种肿瘤抗原肽中具有增强的一或多种肿瘤抗原肽呈现的树突细胞。
如本文中所使用，“活化T细胞(activated T cells)”是指具有识别至少一种肿瘤抗原肽的T细胞受体的单株(例如，编码相同TCR)或多株(例如，具有编码不同TCR的殖株)T细胞的群。活化T细胞可含有一或多种T细胞亚型，其包括但不限于细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、和记忆T细胞。
如本文中所使用，“免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor)”是指抑制或阻断在免疫细胞(诸如T细胞)或肿瘤细胞上的抑制性免疫检查点分子的药剂(包括抗体)。“免疫检查点分子(immune checkpoint molecules)”包括提升对肿瘤细胞的免疫信号的分子(即，“共刺激分子(co-stimulatory molecules)”)、或降低对肿瘤细胞的免疫信号的分子(即，“抑制性免疫检查点分子(inhibitory immune checkpoint molecules)”)。
本文中所使用的用语“抗体(antibody)”是以最广泛的意义使用，且具体涵盖单株抗体(包括全长单株抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要其展现所欲生物活性。
“抗体片段(antibody fragment)”包括完整抗体的部分，优选地包括其抗原结合区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；双价抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；以及自抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文中所使用，用语“特异性结合至(specifically binds to)”、“识别(recognizes)”、“特异性识别(specifically recognizes)”、“靶向(targets)”、或“对……具特异性(specific for)”是指可测量且可再现的相互作用，诸如目标与抗体之间、或受体与配体之间、或受体与表位/MHC复合物之间的结合，其判定在分子(包括生物分子)的异质群体存在下目标的存在。例如，结合至或特异性结合至目标(其可为表位)的抗体是以较大亲合性、结合性、更加容易地、和/或以更长持续时间结合此目标(相较于其结合至其他目标)的抗体。在一个实施方案中，如所测量(例如通过放射免疫检定法(RIA))，抗体与不相关目标的结合程度小于抗体与目标的结合的约10％。在某些实施方案中，特异性结合至抗原肽(或表位)的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合至来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的表位。在另一实施方案中，特异性结合可包括但不需要排他性结合。
据了解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“由……所组成(consisting)”和/或“基本上由……所组成(consisting essentially of)”方面和实施方案。
本文中所提及的“约(about)”一值或参数包括(并描述)关于该值或参数本身的变动。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
本文所使用的用语“约X至Y(about X-Y)”具有与“约X至约Y(about X to aboutY)”相同的意义。
如本文中所使用，提及“不/非(not)”为一值或参数通常意指并描述一值或参数“以外(other than)”。例如，该方法不用于治疗X类型的癌症意指该方法是用于治疗X以外的类型的癌症。
如本文和随附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”和“该(the)”皆包括复数指称，除非上下文另有明确说明。
II.制备活化T细胞的方法
本专利申请提供制备活化T细胞的方法，此类活化T细胞具有增强比例的肿瘤抗原特异性T细胞和/或减少比例的免疫抑制调节性T细胞(Treg)。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞是活化T细胞，此类活化T细胞引发对用于负载DC的肿瘤抗原肽中的一者或多者的特异性反应。检测和定量此类肿瘤抗原特异性T细胞的方法是所属技术领域中已知的，其包括但不限于通过以五聚体和其他多聚体(诸如dextramer)染色进行的检测、或通过经肿瘤抗原肽刺激后的T细胞的IFNγ生产进行的检测。
因此，在一些实施方案中，提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)在初始共培养基中将载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及c)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。
在一些实施方案中，提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及c)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群是获自相同个体。
在一些实施方案中，提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂；(c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及d)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，TLR激动剂选自MPLA、聚肌胞苷酸、雷西莫特、嘎德莫特和CL075。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含PGE2。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群是获自相同个体。
在一些实施方案中，提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA；以及c)将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，步骤c)包括在共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，该共培养基包含介白素混合物、免疫检查点抑制剂、和抗CD3抗体。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基进一步包含PGE2。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于共培养基中。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群是获自相同个体。
在一些实施方案中，提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及d)将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，在该共培养开始时，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，在该共培养开始后，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基进一步包含PGE2。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群是获自相同个体。
在一些实施方案中，提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及d)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基进一步包含PGE2。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群是获自相同个体。
在一些实施方案中，提供一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA、INFγ、和PGE2；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和抗PD-1抗体，该多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21；以及d)在该共培养开始后约3至7天(例如，约5天)，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群是获自相同个体。
还提供的是分离的活化T细胞群和分离的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群，其是使用本文所述的任何方法制备。
树突细胞的抗原负载
制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法使用载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞是新鲜制备。本文所述的改良MASCT方法可包括下列步骤中的一者或多者：(1)自个体获得PBMC；(2)自PBMC获得单核细胞群；(3)诱导该单核细胞群分化为未成熟DC；(4)使未成熟DC与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群；以及(5)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含TLR激动剂(诸如MPLA)。
在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞是通过下列制备：(a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；以及(b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂。示例性TLR激动剂包括但不限于MPLA(单磷酰脂A)、聚肌胞苷酸、雷西莫特(resquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)、和CL075。可将细胞因子和其他适当分子(诸如INFγ和PGE2(前列腺素E2))进一步包括于成熟步骤中的培养基中。
在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞是通过下列制备：(a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；以及(b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA、INFγ、和PGE2。
在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞是通过下列制备：(a)诱导单核细胞群分化为未成熟DC；(b)使未成熟树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；以及(c)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA、INFγ、和PGE2。在一些实施方案中，单核细胞群是获自PBMC。
DC成熟培养基可包含合适浓度的MPLA、INFγ、和/或PGE2。在一些实施方案中，DC成熟培养基以至少约0.5μg/mL的浓度包含MPLA，诸如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更大μg/mL中任一者。在一些实施方案中，DC成熟培养基以约0.5至10、1至5、5至10、或2.5至7.5μg/mL中任一者的浓度包含MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基以至少约100IU/mL的浓度包含INFγ，诸如至少约150、200、250、300、400、500、600、800、1000、或更大IU/mL中任一者。在一些实施方案中，DC成熟培养基以约100至1000、100至250、250至500、500至1000、或250至750IU/mL中任一者的浓度包含INFγ。在一些实施方案中，DC成熟培养基以至少约0.1μg/mL的浓度包含PGE2，诸如至少约0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、或更大μg/mL中任一者。在一些实施方案中，DC成熟培养基以约0.1至0.5、0.1至0.3、0.25至0.5、或0.2至0.4μg/mL中任一者的浓度包含PGE2。
可通过TLR激动剂诱导载有多种肿瘤抗原肽的未成熟树突细胞成熟至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20天中任一者。在一些实施方案中，诱导载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞成熟约8天。
在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是呈递该多种肿瘤抗原肽中的一或多种肿瘤抗原肽的成熟树突细胞。由本文所述的任何方法制备的成熟树突细胞可呈递至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、或更多种中任一者的肿瘤抗原肽。相较于纯真
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树突细胞、或尚未载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞，多抗原负载树突细胞可具有增强的至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、或更多种中任一者的肿瘤抗原肽的呈递水平。在一些实施方案中，成熟树突细胞具有增强的多于10种肿瘤抗原肽的呈递水平。在一些实施方案中，成熟树突细胞具有增强的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多种中任一者的肿瘤抗原肽的呈递水平，该肿瘤抗原肽衍生自选自下列的蛋白质：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、和AFP。
在一些实施方案中，通过将多种肿瘤抗原肽脉冲至树突细胞群中，制备抗原负载树突细胞，此类树突细胞诸如未成熟树突细胞、或含在或衍生(诸如分化)自PBMC的树突细胞。如所属技术领域中已知的，脉冲(pulsing)是指将细胞(诸如树突细胞)与含有抗原肽的溶液混合、和可选地随后自混合物移除抗原肽的程序。可使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触数秒、数分钟、数几小时，诸如约下列中的至少任一者：30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、5小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、一周、10天、或更长。用于接触步骤中的各肿瘤抗原肽的浓度可为至少约0.1、0.5、1、2、3、5、或10μg/mL中任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽的浓度为约0.1至200μg/mL，包括例如约0.1至0.5、0.5至1、1至10、10至50、50至100、100至150、或150至200μg/mL中任一者。
在一些实施方案中，树突细胞群与多种肿瘤抗原肽是在组合物存在下接触，该组合物促进树突细胞摄取多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，化合物、材料、或组合物可包括于多种肿瘤抗原肽的溶液中，以促进树突细胞摄取肽。促进树突细胞摄取多种肿瘤抗原肽的化合物、材料、或组合物包括但不限于脂质分子并具有多个带正电氨基酸的肽。在一些实施方案中，树突细胞群摄取多于约50％、60％、70％、80％、90％、或95％中任一者的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，群中多于约50％、60％、70％、80％、90％、或95％中任一者的树突细胞摄取至少一种肿瘤抗原肽。
树突细胞(诸如未成熟树突细胞)可获自各种来源，包括自体来源，即来自接受治疗的个体。方便的树突细胞来源是来自周边血液的PBMC。例如，单核细胞(一种白血球)是大量存在于PBMC中，其构成约5至30％的总PBMC。可使用细胞因子诱导单核细胞分化为树突细胞，诸如未成熟树突细胞。在一些实施方案中，未成熟树突细胞是通过下列制备：获得PBMC群；自PBMC群获得单核细胞群；以及使单核细胞群与多种细胞因子接触，以获得未成熟树突细胞群。可用于诱导单核细胞分化的示例性细胞因子包括但不限于GM-CSF和IL-4，其中诱导是在所属技术领域中已知的条件(诸如浓度、温度、CO2水平等)下进行。
PBMC的黏附部分含有PBMC中大多数的单核细胞。在一些实施方案中，使来自PBMC黏附部分的单核细胞与细胞因子接触，以获得未成熟树突细胞群。可通过将周边血液样本离心、或使用血球分离(apheresis)方法自个体收集，方便地获得PBMC。在一些实施方案中，通过人类周边血液样本的密度梯度离心来获得PBMC群。在一些实施方案中，样本是来自接受下列者的个体：多抗原负载树突细胞、活化T细胞、或其他使用多抗原负载树突细胞制备的免疫治疗组合物。
本专利申请进一步提供的是一种分离的树突细胞群，其是通过本文所述方法的任何实施方案制备。在一些实施方案中，分离的树突细胞群能够在体内或体外引发MHC限制性T细胞反应。在一些实施方案中，MHC限制性T细胞反应是由MHC I类和MHC II类分子介导。在一些实施方案中，分离的树突细胞群能够诱导肿瘤抗原特异性T细胞分化和增生。
活化T细胞的制备
本文所述的用于制备活化T细胞的方法包括将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群是在共培养基中共培养，该共培养基包含多种细胞因子、免疫检查点抑制剂、和抗CD3抗体。在一些实施方案中，活化T细胞是通过下列制备：(a)在初始共培养基中将载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及(b)将抗CD3抗体添加至共培养物。
在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包含多种细胞因子(在本文中还称为“细胞因子混合物”)。示例性细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、和类似者。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包含IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，细胞因子混合物中的各细胞因子是以至少约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、或更高ng/mL中任一者的浓度存在。在一些实施方案中，细胞因子混合物中的各细胞因子是以约0.1至1、1至5、5至10、10至20、20至30、1至30、1至10、30至50、或1至50ng/mL中任一者的浓度存在。在一些实施方案中，IL-2是以至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000IU/ml中任一者存在于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，IL-2是以约100至500、500至1000、1000至1500、1500至2000、100至2000、500至1500、100至1000、或1000至2000IU/ml中任一者的浓度存在。细胞因子可促进T细胞的活化、成熟、和/或增生，以为T细胞稍后分化为效应T细胞和记忆T细胞作准备，和/或抑制共培养物中活化T细胞群的TREG百分比。
在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包含一或多种(诸如1、2、3、或更多种中任一者)免疫检查点抑制剂。可使用任何已知的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抑制性免疫检查点分子的天然或经工程改造的配体，其包括例如CTLA-4的配体(例如，B7.1、B7.2)、TIM-3的配体(例如，半乳糖凝集素-9)、A2a受体的配体(例如，腺苷、瑞加德松(Regadenoson))、LAG-3的配体(例如，MHC I类或MHC II类分子)、BTLA的配体(例如，HVEM、B7-H4)、KIR的配体(例如，MHC I类或MHC II类分子)、PD-1的配体(例如，PD-L1、PD-L2)、IDO的配体(例如，NKTR-218、因多莫得(Indoximod)、NLG919)、和CD47的配体(例如，SIRPα受体)。
免疫检查点抑制剂可属于任何合适的分子型态，包括但不限于小分子、核酸(诸如DNA、RNAi、或适体)、肽、或蛋白质(诸如抗体)。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是靶向抑制性免疫检查点蛋白的抗体(诸如拮抗剂抗体)，其选自：抗CTLA-4(例如，伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、KAHR-102)、抗TIM-3(例如，F38-2E2、ENUM005)、抗LAG-3(例如，BMS-986016、IMP701、IMP321、C9B7W)、抗KIR(例如，利利单抗(lirilumab)和IPH2101)、抗PD-1(例如，尼沃鲁单抗(nivolumab)、匹利珠单抗(pidilizumab)、派姆单抗(pembrolizuma)、BMS-936559、阿替珠单抗(atezolizumab)、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042)、抗PD-L1(例如，KY-1003(EP20120194977)、MCLA-145、RG7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB0010718C、AUR-012、STI-A1010、PCT/US2001/020964、MPDL3280A、AMP-224、聚乙二醇化达匹珠单抗(dapirolizumab pegol)(CDP-7657)、MEDI-4920)、抗CD73(例如，AR-42(OSU-HDAC42,HDAC-42,AR42,AR 42,OSU-HDAC 42,OSU-HDAC-42,NSCD736012,HDAC-42,HDAC 42,HDAC42,NSCD736012,NSC-D736012)、MEDI-9447)、抗B7-H3(例如，MGA271、DS-5573a、8H9)、抗CD47(例如，CC-90002、TTI-621、VLST-007)、抗BTLA、抗VISTA、抗A2aR、抗B7-1、抗B7-H4、抗CD52(诸如阿仑单抗(alemtuzumab))、抗IL-10、抗IL-35、和抗TGF-β(诸如夫苏木单抗(fresolumimab))。在一些实施方案中，抗体是单株抗体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是选自下列的抗原结合片段：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、BiTE、纳米抗体(nanobody)、和全长抗体的其他抗原结合子序列或其经工程改造的组合。在一些实施方案中，抗体是人类抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。示例性抗PD-1抗体包括但不限于尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、BMS-936559、和阿替珠单抗、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、和TSR-042。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是尼沃鲁单抗(例如
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)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗(例如，/>
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)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是SHR-1210。在一些实施方案中，初始共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21、和抗PD-1抗体(例如，SHR-1210)。
在共培养基(包括初始共培养基)中的免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体)的合适浓度包括但不限于至少约1、2、5、10、15、20、25、或更大μg/mL中任一者。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)是以约1μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约25μg/mL、或约5μg/mL至约20μg/mL中任一者存在于共培养基(包括初始共培养基)中。
抗CD3抗体可在共培养开始时存在于共培养物中，或者在抗原负载树突细胞与T细胞的共培养开始之后被添加至共培养物。在一些实施方案中，抗CD3抗体是包含于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，初始共培养基不包含抗CD3抗体。在一些实施方案中，在共培养开始后约1、2、3、4、5、6、7、或更多天中任一者，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，在共培养开始后约1至7、1至3、3至5、5至7、或3至7天中任一者，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。可使用任何合适的抗CD3抗体，包括但不限于OKT3。
在一些实施方案中，T细胞群和树突细胞群是衍生自相同个体，诸如患有癌症(例如，低至中等级癌症)的个体。在一些实施方案中，T细胞群、树突细胞群、或两者是衍生自自体来源，即衍生自接受活化T细胞、多抗原负载树突细胞、或两者的个体。
在一些实施方案中，将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养至少约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、或30天中任一者。在一些实施方案中，将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约7天至约21天，诸如约7至14、14至21、12至18、10至16、10、14、16、18、或21天中任一者。在一些实施方案中，将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约10天。在一些实施方案中，将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养约14天。
在一些实施方案中，将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群在抗CD3抗体存在下共培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、或更多天中任一者。在一些实施方案中，将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群在抗CD3抗体存在下共培养约1至20、5至15、1至10、或10至20天中任一者。
用于本文所述方法的任何实施方案中的T细胞群可衍生自各种来源。方便的T细胞来源是来自人类周边血液的PBMC。T细胞群可自PBMC分离的，或者替代地，富含T细胞的PBMC群(诸如通过添加T细胞特异性抗体和细胞因子)可用于共培养物中。在一些实施方案中，通过周边血液样本的密度梯度离心来获得PBMC。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，PBMC是用于共培养中。
本专利申请进一步提供的是一种分离的活化T细胞群，其是通过本文所述方法的任何实施方案制备。本文还提供的是一种有用于治疗个体中癌症的共培养物，其包含T细胞群和载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群。在一些实施方案中，T细胞群和载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群是衍生自相同个体，诸如正接受治疗的个体。
本节所述的分离的活化T细胞群和共培养物可用于治疗癌症，诸如实体肿瘤。包含分离的活化T细胞群或共培养物的免疫治疗组合物有用于治疗癌症、预防肿瘤进展或转移、或降低癌症免疫逃脱，且提供于本文中。分离的活化T细胞群和共培养物也可用于制造用于治疗癌症、预防肿瘤进展或转移、或降低癌症免疫逃脱的药剂。
所意欲的是，可将本文所述的用于制备载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群或用于制备活化T细胞群的任何步骤和参数与本文所述的用于改良MASCT方法的任何步骤和参数组合，犹如每一个组合经个别描述。
多种肿瘤抗原肽
本文所述的方法使用多种肿瘤抗原肽以制备树突细胞和活化T细胞(可体外和体内触发特异性T细胞反应)。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是多种合成肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽不是获自细胞样本(诸如裂解细胞组合物)。
在一些实施方案中，各肿瘤抗原肽包括至少约1、2、3、4、5、或10种中任一者的表位，该表位是来自单一蛋白质抗原(包括新抗原)。在一些实施方案中，在多种肿瘤抗原肽中的各肿瘤抗原肽包括至少一种可由T细胞受体识别的表位。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种包括来自单一蛋白质抗原的至少2个表位的肿瘤抗原肽。肿瘤抗原肽可是来自含有一个或多个表位的蛋白质抗原的自然衍生肽片段、或具有一个或多个天然表位序列的人工设计肽，其中连接肽可选地可置于相邻表位序列之间。在一些优选实施方案中，含在相同肿瘤抗原肽中的表位是衍生自相同的蛋白质抗原。
肿瘤抗原肽可含有至少一种MHC-I表位、至少一种MHC-II表位、或(多种)MHC-I表位和(多种)MHC-II表位两者。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种包括MHC-I表位的肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种包括MHC-II表位的肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽中的至少一种肿瘤抗原肽包括MHC-I表位和MHC-II表位两者。
可将特殊设计策略应用于肿瘤抗原肽(包括新抗原肽)的序列，以优化对载有肿瘤抗原肽的树突细胞的免疫反应。一般而言，较确切表位肽为长的肽可增加肽至树突细胞中的摄取。在一些实施方案中，根据具有表位的蛋白质的天然序列，将MHC-I或MHC-II表位序列在N端或C端或两端延伸，以获得延伸序列，其中该延伸序列是适于由I类和II类两者HLA分子呈递、和由不同个体中不同亚型的HLA分子呈递。在一些实施方案中，将表位序列在一端或两端延伸至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个中任一者的氨基酸残基，以产生延伸表位。在一些实施方案中，包括MHC-I或MHC-II表位的肽进一步包括在N端、C端、或两端的侧接表位的附加氨基酸。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽中的各肿瘤抗原肽为至少约7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个中任一者的氨基酸长。多种肿瘤抗原肽中的不同肿瘤抗原肽可具有相同长度或不同长度。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽为各自约20至40个氨基酸长。
在一些实施方案中，本专利申请中用于设计肿瘤抗原肽的一个或多个表位肽的氨基酸序列是基于所属技术领域中已知的序列或可得自公共数据库的序列，公共数据库诸如Peptide Database(Vigneron N.et al.Cancer Immunity,13:15(2013))。
在一些实施方案中，使用用于T细胞表位预测的生物信息工具，基于抗原蛋白的序列，预测一个或多个表位肽的氨基酸序列。用于T细胞表位预测的示例性生物信息工具是所属技术领域中已知的，例如参见Yang X.和Yu X.(2009)的“An introduction to epitopeprediction methods and software”Rev.Med.Virol.19(2):77-96。在一些实施方案中，抗原蛋白的序列为所属技术领域中已知的或可得自公共数据库。在一些实施方案中，通过对正接受治疗的个体的样本(诸如肿瘤样本)进行定序，判定抗原蛋白的序列。
本专利申请设想到衍生自所属技术领域中已知的任何肿瘤抗原和表位(包括新抗原和新表位(neoepitope))的肿瘤抗原肽、或由发明人使用生物信息工具特别开发或预测的肿瘤抗原肽。
在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽进一步包括第二组的癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一或多种新抗原肽。在一些实施方案中，新抗原肽是癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、和第二组的癌症类型特异性抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由新抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽、和一或多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、第二组的癌症类型特异性抗原肽、和一或多种新抗原肽组成。
第一核心组的一般肿瘤抗原肽是衍生自常由各种不同类型癌症过度表现的肿瘤抗原。因此，第一核心组的一般肿瘤抗原肽是有用于制备树突细胞和/或活化T细胞，以用于治疗患有不同癌症类型的个体。例如，在一些实施方案中，第一核心组的一般肿瘤抗原肽是有用于本文所述的用于治疗各种癌症的方法，此类癌症诸如肺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰脏癌、卵巢癌、乳癌、神经胶质瘤、食道癌、鼻咽癌、子宫颈癌、肾癌、或肝细胞癌。第一核心组的示例性肿瘤抗原肽包括但不限于衍生自下列的肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、MMP7、VEGFR(诸如VEGFR1和VEGFR2)、和CDCA1。第一核心组可包括衍生自至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多种中任一者的肿瘤抗原的肽。第一核心组可包括至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多种中任一者的一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包括多于一种一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包括约10至约20种一般肿瘤抗原肽。
第二组的癌症类型特异性抗原肽是衍生自仅在一种或有限数目的癌症类型中过度表现的肿瘤抗原。因此，第二组的癌症类型特异性抗原肽是有用于制备树突细胞和/或活化T细胞，以用于治疗患有特定癌症类型的个体。用于治疗肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的示例性癌症类型特异性抗原肽包括但不限于衍生自SSX、AFP、和GPC3的肽。在一些实施方案中，一或多种癌症特异性抗原肽是衍生自病毒的病毒特异性抗原肽，该病毒可诱导癌症，或者在感染个体时涉及个体内的癌症发展。在一些实施方案中，病毒特异性抗原肽对感染个体的病毒亚型具特异性。用于治疗合并HBV感染的HCC患者的示例性病毒特异性抗原肽包括但不限于衍生自HBV核心抗原(HBcAg)、和HBV DNA聚合酶的肽。在一些实施方案中，第二组包括衍生自HBV抗原的病毒特异性抗原肽，其中该方法是用于治疗个体中的肝细胞癌。在一些实施方案中，第二组包括衍生自HPV抗原的病毒特异性抗原肽，其中该方法是用于治疗个体中的子宫颈癌。在一些实施方案中，第二组包括衍生自EBV抗原的病毒特异性抗原肽，其中该方法是用于治疗个体中的鼻咽癌。第二组的癌症类型特异性抗原肽可包括衍生自至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多种中任一者的癌症类型特异性抗原的肽。第二组癌症类型特异性抗原肽可包括至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多种中任一者的癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包括多于一种癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包括约1至约10种癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，癌症类型特异性抗原肽所靶向的癌症类型选自基本上由下列所组成的群组：肝细胞癌、子宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、乳癌、和淋巴瘤。
在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一或多种(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种中任一者)新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由新抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽，且未包括一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一或多种一般肿瘤抗原肽、和一或多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一或多种一般肿瘤抗原肽、一或多种癌症类型特异性抗原肽、和一或多种新抗原肽。新抗原肽是衍生自新抗原。新抗原是存在于个体(诸如正接受癌症治疗的个体)的肿瘤细胞中的最新取得并表现的抗原。在一些实施方案中，新抗原是衍生自突变蛋白质抗原，此类突变蛋白质抗原仅存在于癌细胞中但不存在于正常细胞中。新抗原可独特地存在于经癌症治疗的个体的肿瘤细胞(诸如所有肿瘤细胞或部分肿瘤细胞)中，或者在患有类似的癌症类型的个体接受治疗时存在于该个体中。在一些实施方案中，新抗原是殖株性(clonal)新抗原。在一些实施方案中，新抗原是次殖株性(subclonal)新抗原。在一些实施方案中，新抗原存在于个体中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中任一者的肿瘤细胞中。在一些实施方案中，新抗原肽包括MHC-I限制性新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包括MHC-II限制性新表位。在一些实施方案中，新抗原肽经设计以促进I类和II类两者MHC分子呈现新表位，例如通过在N端和C端两者延伸新表位。示例性新抗原肽包括但不限于衍生自下列的新表位：突变体KRAS(例如，KRASG12A)、PARP4(例如，PARP4T1170I)、MLL3(例如，MLL3C988F)、和MTHFR(例如，MTHFRA222V)。
可基于正接受治疗的个体的一个或多个肿瘤部位的基因轮廓(genetic profile)选择新抗原肽，且新抗原在正常组织中不会表现。在一些实施方案中，肿瘤样本的基因轮廓包括全长基因组的序列信息。在一些实施方案中，肿瘤样本的基因轮廓包括外显子的序列信息。在一些实施方案中，肿瘤样本的基因轮廓包括癌症相关基因的序列信息。
适用于本专利申请的新抗原肽可衍生自肿瘤细胞中的任何突变蛋白，诸如由突变癌症相关基因编码的突变蛋白。在一些实施方案中，新抗原肽包括衍生自癌症相关基因的单一新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包括衍生自癌症相关基因的多于一种(诸如2、3、或更多种)新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包括衍生自多于一种(诸如2、3、或更多种)癌症相关基因的多于一种(诸如2、3、或更多种)新表位。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原包括衍生自单一癌症相关基因的多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原包括衍生自多于一种(诸如2、3、4、5、或更多种中任一者)癌症相关基因的多种新抗原肽。
癌症相关基因是过度表现于癌细胞中的基因，但此类基因是以低水平表现于正常细胞中。示例性癌症相关基因包括但不限于ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、ALOX12B、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AURKA、AURKB、AXL、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L1、BCL2L12、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BUB1B、CADM2、CARD11、CBL、CBLB、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD58、CD79B、CDC73、CDH1、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK9、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHEK2、CIITA、CREBBP、CRKL、CRLF2、CRTC1、CRTC2、CSF1R、CSF3R、CTNNB1、CUX1、CYLD、DDB2、DDR2、DEPDC5、DICER1、DIS3、DMD、DNMT3A、EED、EGFR、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FAS、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FKBP9、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FUS、GATA3、GATA4、GATA6、GLI1、GLI2、GLI3、GNA11、GNAQ、GNAS、GNB2L1、GPC3、GSTM5、H3F3A、HNF1A、HRAS、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IKZF3、INSIG1、JAK2、JAK3、KCNIP1、KDM5C、KDM6A、KDM6B、KDR、KEAP1、KIT、KRAS、LINC00894、LMO1、LMO2、LMO3、MAP2K1、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MCL1、MDM2、MDM4、MECOM、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MLL(KMT2A)、MLL2(KTM2D)、MPL、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYB、MYBL1、MYC、MYCL1(MYCL)、MYCN、MYD88、NBN、NEGR1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFKBIZ、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NPRL2、NPRL3、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PARK2、PAX5、PBRM1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PHF6、PHOX2B、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PMS1、PMS2、PNRC1、PRAME、PRDM1、PRF1、PRKAR1A、PRKCI、PRKCZ、PRKDC、PRPF40B、PRPF8、PSMD13、PTCH1、PTEN、PTK2、PTPN11、PTPRD、QKI、RAD21、RAF1、RARA、RB1、RBL2、RECQL4、REL、RET、RFWD2、RHEB、RHPN2、ROS1、RPL26、RUNX1、SBDS、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SH2B3、SLITRK6、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMC1A、SMC3、SMO、SOCS1、SOX2、SOX9、SQSTM1、SRC、SRSF2、STAG1、STAG2、STAT3、STAT6、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TCF3、TCF7L1、TCF7L2、TERC、TERT、TET2、TLR4、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VHL、WRN、WT1、XPA、XPC、XPO1、ZNF217、ZNF708、和ZRSR2。
在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种(诸如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多种中任一者)肿瘤抗原肽，其各包括由癌症相关基因编码的一个或多个表位，该癌症相关基因选自：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、和AFP。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、和CDCA1。
在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽存在于组合物中，该组合物具有至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、或更高百分比中任一者的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽的纯度为至少约98％。在一些实施方案中，为了将肿瘤抗原肽脉冲至树突细胞中，多种肿瘤抗原肽于培养基中的溶解度为至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％、或更高中任一者。在一些实施方案中，为了将肿瘤抗原肽脉冲至树突细胞中，多种肿瘤抗原肽的约100％可溶于培养基中。
III.治疗方法
本专利申请提供治疗个体中癌症的基于细胞的免疫治疗方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是使用第II节所述的方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症(例如，实体肿瘤)的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过下列制备：(a)在初始共培养基中将载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及b)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，该树突细胞群和该T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，施用载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞至少三次。在一些实施方案中，载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、和CDCA1。在一些实施方案中，该癌症是选自下列的实体肿瘤：肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、和肺癌。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症(例如，实体肿瘤)的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过下列制备：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA；以及c)将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，步骤c)包括在共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，该共培养基包含介白素混合物、免疫检查点抑制剂、和抗CD3抗体。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基进一步包含PGE2。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于共培养基中。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，树突细胞群和T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，施用载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞至少三次。在一些实施方案中，载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、和CDCA1。在一些实施方案中，该癌症是选自下列的实体肿瘤：肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、和肺癌。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症(例如，实体肿瘤)的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过下列制备：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及c)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，步骤(a)进一步包括在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂选自MPLA、聚肌胞苷酸、雷西莫特、嘎德莫特和CL075。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含PGE2。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，该树突细胞群和该T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，施用载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞至少三次。在一些实施方案中，载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、和CDCA1。在一些实施方案中，该癌症是选自下列的实体肿瘤：肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、和肺癌。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症(例如，实体肿瘤)的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过下列制备：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及d)将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，在该共培养开始时，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，在该共培养开始后，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基进一步包含PGE2。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，该树突细胞群和该T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，施用载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞至少三次。在一些实施方案中，载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、和CDCA1。在一些实施方案中，该癌症是选自下列的实体肿瘤：肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、和肺癌。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症(例如，实体肿瘤)的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过下列制备：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及d)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基进一步包含PGE2。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，该树突细胞群和该T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，施用载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞至少三次。在一些实施方案中，载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、和CDCA1。在一些实施方案中，该癌症是选自下列的实体肿瘤：肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、和肺癌。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症(例如，实体肿瘤)的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过下列制备：a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA、INFγ、和PGE2；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和抗PD-1抗体，该多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21；以及d)在该共培养开始后约3至7天(例如，约5天)，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，该树突细胞群和该T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，施用载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞至少三次。在一些实施方案中，载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、和CDCA1。在一些实施方案中，该癌症是选自下列的实体肿瘤：肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、和肺癌。
除了(多个)施用步骤之外，改良MASCT方法的一些实施方案进一步包括下列细胞制备步骤中的一者或多者：1)自该个体获得PBMC；2)自此类PBMC获得DC群(例如，通过诱导来自此类PBMC的单核细胞群分化)；3)自此类PBMC获得T细胞群；4)制备载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；5)在DC成熟培养基中诱导载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群成熟；6)将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养(包括例如在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养；以及将抗CD3抗体添加至该共培养物)；以及8)将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。
因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症(例如，实体肿瘤)的方法，其包括：(a)自该个体获得PBMC群；(b)自该PBMC群获得树突细胞群；(c)使该树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；(d)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA、INFγ、和PGE2；(e)可选地向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞；(f)自此类PBMC获得T细胞群；(g)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和抗PD-1抗体，该多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21；(h)在该共培养开始后约3至7天(例如，约5天)，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得活化T细胞群；以及(i)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，施用载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞至少三次。在一些实施方案中，载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、和CDCA1。在一些实施方案中，该癌症是选自下列的实体肿瘤：肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、和肺癌。
本文所述方法适用于治疗各种癌症，包括液体和实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自：肝细胞癌、子宫颈癌、膀胱癌、软组织肉瘤、肺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、肾癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、和脑癌。此类方法适用于所有期别的癌症，包括早期、晚期、和转移性癌症。
在一些实施方案中，该方法降低与癌症相关联的一或多种症状的严重性，其差异为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％中任一者，此是相较于相同个体在治疗前的对应症状，或相较于未接受该治疗方法的其他个体的对应症状。在一些实施方案中，该方法延迟癌症的进展。
在一些实施方案中，该方法是用于治疗肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，HCC是早期HCC、非转移性HCC、原发性HCC、晚期HCC、局部晚期HCC、转移性HCC、缓解中HCC、或复发性HCC。在一些实施方案中，HCC是局部可切除的(即，局限于肝脏的一部分而允许完全手术切除的肿瘤)、局部无法切除的(即，因为涉及至关重要的血管结构，或者因为肝脏受损，局部肿瘤可能无法切除)、或无法切除的(即，肿瘤涉及所有肝叶，和/或已扩散而涉及其他器官(例如肺部、淋巴结、骨骼))。在一些实施方案中，根据TNM分类，HCC是第I期肿瘤(单个肿瘤无血管侵犯)、第II期肿瘤(单个肿瘤有血管侵犯，或多个肿瘤皆未大于5cm)、第III期肿瘤(多个肿瘤且任一个大于5cm，或肿瘤涉及门静脉或肝静脉的主要分支)、第IV期肿瘤(肿瘤直接侵犯胆囊以外的邻近器官，或具有内脏腹膜穿孔)、N1肿瘤(区域淋巴结转移)、或M1肿瘤(远处转移)。在一些实施方案中，根据AJCC(美国癌症联合委员会(American JointCommission on Cancer))分期标准，HCC为Tl、T2、T3、或T4期HCC。在一些实施方案中，HCC是肝细胞癌、HCC的纤维板层变体、混合型肝细胞胆管癌(mixed hepatocellularcholangiocarcinoma)中任一者。在一些实施方案中，HCC是由B型肝炎病毒(HBV)感染引起。
在一些实施方案中，该方法是用于治疗肺癌。在一些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NCSLC的示例包括但不限于大细胞癌(例如，大细胞神经内分泌癌、复合型大细胞神经内分泌癌、基底细胞样癌、淋巴上皮瘤样癌、透明细胞癌、和具类横纹肌表型的大细胞癌)、腺癌(例如，腺泡、乳突(例如，细支气管肺泡癌，非黏液性、黏液性、混合型黏液性和非黏液性、和未定型细胞类型)、物理腺癌(具黏液素)、具混合亚型的腺癌、分化良好的胎儿型腺癌、黏液性(胶状)腺癌、黏液性囊腺癌、印环状腺癌、和透明细胞腺癌)、神经内分泌肺部肿瘤、和鳞状细胞癌(例如，乳突、透明细胞、小细胞、和基底细胞样)。在一些实施方案中，根据TNM分类，NSCLC可为T期肿瘤(原发性肿瘤)、N期肿瘤(区域淋巴结)、或M期肿瘤(远处转移)。
在一些实施方案中，肺癌是类癌(典型或非典型)、腺鳞状细胞癌、圆柱瘤、或唾液腺的癌(例如，腺样囊状癌或黏液类上皮癌)。在一些实施方案中，肺癌是具有多形性、肉瘤状、或肉瘤部分的癌(例如，具有梭状细胞和/或巨细胞的癌、梭状细胞癌、巨细胞癌、癌肉瘤、或肺母细胞瘤)。在一些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC；还称为燕麦细胞癌)。小细胞肺癌可为局限期、扩散期、或复发性小细胞肺癌。在一些实施方案中，个体可为符合以下条件的人类：具有怀疑或显示与肺癌相关联的基因、基因突变、或多型性(例如，SASH1、LATS1、IGF2R、PARK2、KRAS、PTEN、Kras2、Krag、Pas1、ERCC1、XPD、IL8RA、EGFR、α1-AD、EPHX、MMP1、MMP2、MMP3、MMP12、IL1β、RAS、和/或AKT)，或者具有一个或多个附加拷贝的与肺癌相关联的基因。
在一些实施方案中，该方法是用于治疗子宫颈癌。在一些实施方案中，子宫颈癌是早期子宫颈癌、非转移性子宫颈癌、局部晚期子宫颈癌、转移性子宫颈癌、缓解中子宫颈癌、无法切除的子宫颈癌、于辅助性治疗中的子宫颈癌、或于新辅助性治疗中的子宫颈癌。在一些实施方案中，子宫颈癌是由人类乳突病毒(HPV)感染引起。在一些实施方案中，根据TNM分类，子宫颈癌可为T期肿瘤(原发性肿瘤)、N期肿瘤(区域淋巴结)、或M期肿瘤(远处转移)。在一些实施方案中，子宫颈癌是下列中任一者：第0期、第I期(Tis、N0、M0)、第IA期(T1a、N0、M0)、第IB期(T1b、N0、M0)、第IIA期(T2a、N0、M0)、第IIB期(T2b、N0、M0)、第IIIA期(T3a、N0、M0)、第IIIB期(T3b、N0、M0，或T1至T3、N1、M0)、第IVA期(T4、N0、M0)、或第IVB期(T1至T3、N0至N1、M1)子宫颈癌。在一些实施方案中，子宫颈癌是子宫颈鳞状细胞癌、子宫颈腺癌、或腺鳞状细胞癌。
在一些实施方案中，该方法是用于治疗乳癌。在一些实施方案中，乳癌是早期乳癌、非转移性乳癌、局部晚期乳癌、转移性乳癌、激素受体阳性转移性乳癌、缓解中乳癌、于辅助性治疗中的乳癌、乳管原位癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)、侵袭性乳管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)、或于新辅助性治疗中的乳癌。在一些实施方案中，乳癌是激素受体阳性转移性乳癌。在一些实施方案中，乳癌(其可为HER2阳性或HER2阴性)是晚期乳癌。在一些实施方案中，乳癌是乳管原位癌。在一些实施方案中，个体可为符合以下条件的人类：具有与乳癌相关联的基因、基因突变、或多型性(例如，BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、RAD51、AR、DIRAS3、ERBB2、TP53、AKT、PTEN、和/或PI3K)，或者具有一个或多个附加拷贝的与乳癌相关联的基因(例如，一个或多个附加拷贝的HER2基因)。
在一些实施方案中，该方法是用于治疗胰脏癌。在一些实施方案中，胰脏癌包括但不限于浆液性微囊性腺瘤、胰管内乳突状黏液性肿瘤、黏液性囊性肿瘤、物理伪乳突状肿瘤、胰脏腺癌、胰管腺癌、或胰母细胞瘤。在一些实施方案中，胰脏癌是早期胰脏癌、非转移性胰脏癌、原发性胰脏癌、经切除的胰脏癌、晚期胰脏癌、局部晚期胰脏癌、转移性胰脏癌、无法切除的胰脏癌、缓解中胰脏癌、复发性胰脏癌、于辅助性治疗中的胰脏癌、或于新辅助性治疗中的胰脏癌中任一者。
在一些实施方案中，该方法是用于治疗卵巢癌。在一些实施方案中，卵巢癌是卵巢上皮细胞癌。示例性卵巢上皮细胞癌组织学分类包括：浆液性囊瘤(例如，浆液性良性囊腺瘤、具上皮细胞增生活性和核异常但无浸润性破坏性生长的浆液性囊腺瘤、或浆液性囊腺癌)、黏液性囊瘤(例如，黏液性良性囊腺瘤、具上皮细胞增生活性和核异常但无浸润性破坏性生长的黏液性囊腺瘤、或黏液性囊腺癌)、子宫内膜样肿瘤(例如，子宫内膜样良性囊肿、具上皮细胞增生活性和核异常但无浸润性破坏性生长的子宫内膜样肿瘤、或子宫内膜样腺癌)、透明细胞(中肾样)肿瘤(例如，良性透明细胞肿瘤、具上皮细胞增生活性和核异常但无浸润性破坏性生长的透明细胞肿瘤、或透明细胞囊腺癌)、无法指派至上述群组中的一者的未分类肿瘤、或其他恶性肿瘤。在各种实施方案中，卵巢上皮细胞癌是第I期(例如，第IA、IB、或IC期)、第II期(例如，第IIA、IIB、或IIC期)、第III期(例如，第IIIA、IIIB、或IIIC期)、或第IV期。在一些实施方案中，个体可为符合以下条件的人类：具有与卵巢癌相关联的基因、基因突变、或多型性(例如，BRCA1或BRCA2)，或者具有一个或多个附加拷贝的与卵巢癌相关联的基因(例如，一个或多个附加拷贝的HER2基因)。在一些实施方案中，卵巢癌是卵巢生殖细胞肿瘤。示例性组织学亚型包括：恶性胚胎瘤或其他生殖细胞肿瘤(例如，内胚窦瘤(诸如肝样或肠肿瘤)、胚胎性癌、多胚瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、或混合型肿瘤)。示例性畸胎瘤是未成熟畸胎瘤、成熟畸胎瘤、物理畸胎瘤、和囊性畸胎瘤(例如，皮样囊肿，诸如成熟囊性畸胎瘤、和具恶性转化的皮样囊肿)。一些畸胎瘤是单胚层且高度特异性的，诸如甲状腺肿样卵巢瘤、类癌、甲状腺肿样卵巢瘤和类癌、或其他者(例如，恶性神经外胚层和室管膜瘤)。在一些实施方案中，卵巢生殖细胞肿瘤是第I期(例如，第IA、IB、或IC期)、第II期(例如，第IIA、IIB、或IIC期)、第III期(例如，第IIIA、IIIB、或IIIC期)、或第IV期。
在一些实施方案中，本文所述的改良MASCT不适用于患有T细胞来源的癌症(诸如T细胞淋巴瘤)的患者。
数种病毒与人类的癌症有关。例如，B型肝炎病毒(HBV)可能引发慢性肝脏感染，而增加个体罹患肝癌、或肝细胞癌(HCC)的可能性。人类乳突病毒(HPV)是具有多于150种相关病毒的群组，当其感染并生长于皮肤或黏膜(诸如口腔、咽喉、或阴道)时，会引起乳突瘤、或疣。已知数种类型的HPV(包括第16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、和6型)会引起子宫颈癌。HPV还在诱导或引起其他生殖器癌症上扮演角色，并与口腔和咽喉的一些癌症相关。艾司坦-巴尔病毒(EBV)是一种疱疹病毒，其长期感染并保持潜伏于B淋巴球中。EBV感染增加个体发展鼻咽癌和某些类型快速生长淋巴瘤(诸如Burkitt氏淋巴瘤)的风险。EBV还与霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)和一些胃癌病例相关。除了引起癌症或增加发展癌症的风险之外，病毒感染(诸如HBV、HPV、和EBV感染)可导致组织或器官损伤，其可能增加罹患癌症的个体的疾病负担，并促成癌症进展。所属技术领域中已知的是，可诱导人体发动有效且特异性免疫反应，此类免疫反应包括对数种癌症相关病毒的细胞毒性T细胞反应，此类病毒诸如HBV、HPV、和EBV(包括其各种亚型)。因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中病毒相关癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞，其中通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养来制备此类活化T细胞，其中该多种肿瘤抗原肽包括衍生自该病毒的一或多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，癌症是HBV相关的肝细胞癌、HPV相关的子宫颈癌、或EBV相关的鼻咽癌。
本文所述方法可用于下列目的中任一者或多者：减轻癌症的一或多种症状、延迟癌症的进展、缩小癌症肿瘤大小、扰乱(诸如破坏)癌症基质、抑制癌症肿瘤生长、延长整体存活、延长无疾病存活、延长至癌症疾病进展的时间、预防或延迟癌症肿瘤转移、减少(诸如根除)先前存在的癌症肿瘤转移、减少先前存在的癌症肿瘤转移的发生率或负担、预防癌症复发、和/或改善癌症的临床效益。
在一些实施方案中，提供一种抑制个体中癌细胞增生(诸如肿瘤生长)的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中任一者)的细胞增生。
在一些实施方案中，提供一种抑制个体中肿瘤转移的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中任一者)的转移。在一些实施方案中，提供抑制转移至淋巴结的方法。
在一些实施方案中，提供一种减小个体中肿瘤大小的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，肿瘤大小减小至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中任一者)。
在一些实施方案中，提供一种延长个体中癌症无进展存活的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，该方法将至疾病进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12周中任一者。
在一些实施方案中，提供一种延长患有癌症的个体的存活的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在一些实施方案中，该方法将至疾病进展的时间延长至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12周中任一者。在一些实施方案中，该方法延长个体存活至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、或24个月中任一者。
在一些实施方案中，提供一种在患有癌症的个体中减少AE和SAE的方法，其包括向该个体施用有效量的活化T细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞。
在一些实施方案中，该方法可预测和/或导致客观反应(诸如部分反应或完全反应)。在一些实施方案中，该方法可预测和/或导致生活质量改善。
除了通常与其他癌症疗法相关联的常见不良事件之外，一些癌症免疫疗法与免疫相关不良事件(immune-related adverse event,irAE)相关联。irAE通常与命中目标(on-target)T细胞毒性或偏离目标(off-target)效应呈机械式相关，该命中目标T细胞毒性对抗表现于正常非肿瘤组织中的目标抗原，即所谓的命中目标偏离肿瘤(on-target off-tumor)效应，该偏离目标效应诸如自身耐受性破坏或表位交叉反应。irAE可导致在下列的严重症状和病况：皮肤、胃肠、内分泌、肝、眼、神经、和其他组织或器官。所属技术领域中已知的针对癌症免疫治疗方法所报导的一般irAE包括：致命免疫介导的皮肤炎、肺炎、结肠炎、淋巴球性垂体炎、胰脏炎、淋巴腺病、内分泌病症、CNS毒性、和类似者。在一些实施方案中，改良MASCT方法与不良事件(诸如irAE)的低发生率相关联。在一些实施方案中，少于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％中任一者的个体经历irAE，诸如第2至5级irAE。
大致上，可根据个体的大小和状况，并根据标准医药实务，判定活化T细胞和载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群的剂量、时程、和施用途径。示例性施用途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、膀胱内(intravesicular)、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内(intrathecal)、或经皮。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞经皮下施用。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。
施用至个体的细胞剂量可根据下列而变化：例如所施用的细胞的具体类型、施用途径、和所治疗的癌症的具体类型和阶段。该量应足以产生所欲反应，诸如对癌症的治疗反应，但没有严重毒性或不良事件。在一些实施方案中，待施用的活化T细胞或树突细胞的量是治疗有效量。在一些实施方案中，细胞(诸如多抗原负载树突细胞、或活化T细胞)的量是足以减小肿瘤大小、减少癌细胞数目、或降低肿瘤生长速率的量，其差异为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％中任一者，此是相较于相同个体在治疗前的对应肿瘤大小、癌细胞数目、或肿瘤生长速率，或相较于未接受治疗的其他个体的对应活性。可使用标准方法来测量此效应的量值，诸如采用纯化酶的体外检定法、基于细胞的检定法、动物模型、或人体试验。
在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×105、5×105、1×106、1.5×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、或5×107个细胞/个体。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群是以约下列中任一者的剂量施用：1×105至5×105、5×105至1×106、1×106至2×106、2×106至3×106、3×106至4×106、4×106至5×106、5×106至6×106、6×106至7×106、7×106至8×106、8×106至1×108、1×106至3×106、3×106至5×106、5×106至7×106、2×106至2×107、5×106至2×107、或1×106至2×107个细胞/个体。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞是以至少约1×106个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞是以约1.5×106至约1.5×107个细胞/个体的剂量施用。
在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×104、2.5×104、5×104、1×105、2×105、2.5×105、4×105、6×105、8×105、1×106、2×106、或1×107个细胞/kg。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群是以约下列中任一者的剂量施用：1×104至5×104、5×104至1×105、1×105至2×105、2×105至4×105、4×105至6×105、6×105至8×105、8×105至1×106、1×106至2×106、2×106至1×107、1×104至1×105、1×105至1×106、1×106至1×107、1×104至1×106、或1×105至1×107个细胞/kg。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞是以至少约2×105个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞是以约2.5×104至约2.5×105个细胞/kg的剂量施用。
在一些实施方案中，活化T细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×108、5×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、1.5×1010、2×1010、或5×1010个细胞/个体。在一些实施方案中，活化T细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、3×109至7×109、1×1010至2×1010、或1×109至1×1010个细胞/个体。在一些实施方案中，活化T细胞是以至少约3×109个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞是以约1×109至约1×1010个细胞/个体的剂量施用。
在一些实施方案中，活化T细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×107、2×107、4×107、6×107、8×107、1×108、2×108、4×108、6×108、8×108、1×109个细胞/kg。在一些实施方案中，活化T细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×107至1×108、1×107至5×107、2×107至4×107、5×107至1×108、1×108至2×108、5×107至1×108、1×108至2×108、2×108至5×108、1×108至1×109、或1×107至1×109个细胞/kg。在一些实施方案中，活化T细胞是以至少约6×107个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞是以约1.5×107至约2×108个细胞/kg的剂量施用。
在一些实施方案中，稳定剂或赋形剂(诸如人类白蛋白)是与活化T细胞、和/或载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞一起使用。
可基于施用医师的判断，在治疗过程中调整改良MASCT方法中细胞的剂量和给药时程。在一些实施方案中，在施用载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞后至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、或28天中任一者，施用活化T细胞。在一些实施方案中，活化T细胞是与树突细胞同时施用。在一些实施方案中，在施用树突细胞后约17至26天，施用活化T细胞。在一些实施方案中，在施用树突细胞后约17天，施用活化T细胞。
改良MASCT方法可包括单一治疗或重复治疗。在一些实施方案中，施用活化T细胞至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10次中任一者。在一些实施方案中，施用活化T细胞至少3次。在一些实施方案中，施用树突细胞至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10次中任一者。在一些实施方案中，施用树突细胞至少3次。在一些实施方案中，在树突细胞、活化T细胞、或两者重复施用之前，重复一个或多个细胞(诸如抗原负载树突细胞或活化T细胞)制备步骤。在一些实施方案中，改良MASCT方法是每周重复一次、2周重复一次、3周重复一次、4周重复一次、每月重复一次、每2个月重复一次、每3个月重复一次、每4个月重复一次、每5个月重复一次、每6个月重复一次、每7个月重复一次、每8个月重复一次、每9个月重复一次、或每年重复一次。在一些实施方案中，树突细胞、或活化T细胞的各施用之间之间隔为约1周至2周、2周至1个月、2周至2个月、1个月至2个月、1个月至3个月、3个月至6个月、或6个月至一年中任一者。在一些实施方案中，树突细胞、或活化T细胞的各施用之间之间隔为约1天至约5个月，诸如约2周至约2个月、或约2个月至约5个月。在一些实施方案中，如果个体具有疾病稳定，则在前6个月治疗期间每月、在第二回6个月治疗期间每两个月、和前12个月治疗后每半年，重复改良MASCT方法的所有步骤一次。在重复治疗全程期间，本文所述的改良MASCT方法的任何实施方案可与该改良MASCT方法的任何其他实施方案组合。
本文提供的改良MASCT方法可用于作为第一疗法、第二疗法、第三疗法、或与所属技术领域中已知的其他类型的癌症疗法的组合疗法，诸如化疗、手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、标靶治疗、冷疗、超音波疗法、光动力疗法、射频烧灼、或类似者，其是于辅助性疗法或新辅助性疗法中。在一些实施方案中，改良MASCT方法是用于作为第一疗法。在一些实施方案中，不存在其他批准的用于个体的抗癌疗法。在一些实施方案中，改良MASCT方法是用于作为第二疗法，其中个体先前已接受切除、射频烧灼、化疗、辐射疗法、或其他类型的癌症疗法。在一些实施方案中，个体已发生进展或已无法耐受标准抗癌疗法。在一些实施方案中，个体在(多个)改良MASCT治疗之前、同时、或之后，接受其他类型的癌症疗法。例如，改良MASCT方法可以范围自数分钟、数天、数周至数个月之间隔，于其他癌症疗法(诸如化疗、辐射、手术、或其组合)之前或之后进行。在一些实施方案中，第一疗法与第二疗法之间之间隔使得改良MASCT方法的活化T细胞和其他癌症疗法(诸如化疗、辐射、手术、或其组合)能够对个体发挥有利组合效应。在一些实施方案中，改良MASCT方法是与其他治疗个体中癌症的癌症疗法(诸如化疗、辐射、手术、或其组合)配合使用。本文所述的组合疗法方法可单独执行或与另一种诸如下列的疗法配合执行：手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、荷尔蒙疗法、标靶治疗、冷疗、超音波疗法、光动力疗法、化疗、或类似者。此外，具有较大发展增生性疾病的风险的人可接受治疗，以抑制和/或延迟疾病发展。
本文所述的用于治疗癌症的方法可用于单一疗法、以及与另一种药剂的组合疗法。例如，可将任何本文所述的治疗方法与一或多种(诸如1、2、3、4、或更多种中任一者)免疫检查点抑制剂的施用组合。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自：PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA、和LAG-3的抑制剂。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。示例性抗PD-1抗体包括但不限于尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、BMS-936559、和阿替珠单抗、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、和TSR-042。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是尼沃鲁单抗(例如
Figure BDA0002710879240000462
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗(例如，/>
Figure BDA0002710879240000461
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是SHR-1210。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。示例性抗PD-L1抗体包括但不限于KY-1003、MCLA-145、RG7446、BMS935559、MPDL3280A、MEDI4736、阿维鲁单抗(avelumab)、或STI-A1010。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA-4抗体包括但不限于伊匹单抗、曲美木单抗、和KAHR-102。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002710879240000463
)。
在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是同时施用。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是以单一组合物施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂存在于共培养物中。在一些实施方案中，在施用前(诸如紧接在施用前)将活化T细胞和免疫检查点抑制剂混合。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是经由不同组合物同时施用。
在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在施用活化T细胞之前施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在施用活化T细胞之后施用。
免疫检查点抑制剂的示例性施用途径包括但不限于肿瘤内、膀胱内、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、颅内、胸膜内、皮下、和表皮途径，或经递送至已知含有此类活癌细胞的淋巴腺、身体空间、器官、或组织中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂经静脉内施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是通过输注施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、或更长中任一者内输注。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是经由与活化T细胞相同的施用途径施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是经由与活化T细胞不同的施用途径施用。
合适的免疫检查点抑制剂剂量包括但不限于约下列中任一者：1mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、20mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、200mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、750mg/m2、1000mg/m2、或更大。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是下列中任一者：约1至约5mg/m2、约5至约10mg/m2、约10至约20mg/m2、约20至约50mg/m2、约50至约100mg/m2、约100mg/m2至约200mg/m2、约200至约300mg/m2、约300至约400mg/m2、约400至约500mg/m2、约500至约750mg/m2、或约750至约1000mg/m2。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量为约下列中任一者：1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、或更大。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是下列中任一者：约1μg/kg至约5μg/kg、约5μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约0.1mg/kg、约0.1mg/kg至约0.2mg/kg、约0.2mg/kg至约0.3mg/kg、约0.3mg/kg至约0.4mg/kg、约0.4mg/kg至约0.5mg/kg、约0.5mg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约100mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每日施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以一周至少约1x、2x、3x、4x、5x、6x、或7x(即每日)中任一者施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每周施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每周施用且没有中断；每周(三周中有两周)；每周(四周中有三周)；每两周一次；每3周一次；每4周一次；每6周一次；每8周、每月、或每二至12个月一次。在一些实施方案中，各施用之间之间隔少于约下列中任一者：6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天。在一些实施方案中，各施用之间之间隔多于约下列中任一者：1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、或12个月。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每3个月施用一次。在一些实施方案中，给药时程没有中断。在一些实施方案中，各施用之间之间隔不多于约一周。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以与活化T细胞相同的给药时程施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以与活化T细胞不同的给药时程施用。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在每个改良MASCT治疗周期中施用。例如，每个改良MASCT治疗周期可施用免疫检查点抑制剂约1、2、3、4、5、6、或更多次中的任一者。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂并未在每个改良MASCT治疗周期中施用。例如，免疫检查点抑制剂可约每1、2、3、4、5、或更多个改良MASCT治疗周期施用一次。
可在延长时段(诸如约一个月到至多约七年)内施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，在至少约下列中任一者的期间内施用免疫检查点抑制剂：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72、或84个月。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是单次施用。在一些实施方案中，重复施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，重复施用免疫检查点抑制剂直到疾病进展。
IV.精准改良MASCT方法
本文进一步提供的是精准改良MASCT方法，其基于个体的基因反应及治疗反应针对正接受治疗的个体进行定制。可定制以上在第III节中所述的任何治疗方法，以提供精准改良MASCT方法。
在一些实施方案中，本文所述的改良MASCT方法特别适用于某些个体群，诸如在癌症(诸如所有癌细胞或癌细胞的子集)中具有低突变负荷(诸如在MHC基因中)的个体、和/或具有一或多种新抗原的个体。
突变负荷
在一些实施方案中，改良MASCT方法特别适用于在个体癌症中具有低总突变负荷的个体。在一些实施方案中，改良MASCT方法特别适用于在个体癌症中具有癌症相关基因中低突变负荷的个体。在一些实施方案中，改良MASCT方法特别适用于在个体癌症中具有T细胞反应相关免疫基因中低突变负荷的个体。在一些实施方案中，改良MASCT方法特别适用于在个体癌症中具有MHC基因中低突变负荷的个体。突变负荷可是在下列中的突变负荷：所有癌细胞、或癌细胞的子集，诸如原发性或转移性肿瘤部位，例如肿瘤活检样本中的细胞。
因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)可选地施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；以及(b)向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过以上在第II节中所述的制备活化T细胞的方法中任一者制备，且其中该个体在该癌症中具有低突变负荷。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)基于该癌症中的该突变负荷而选择用于该方法的该个体；(b)可选地施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；以及(c)向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过以上在第II节中所述的制备活化T细胞的方法中任一者制备。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)可选地施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞；以及(b)向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过以上在第II节中所述的制备活化T细胞的方法中任一者制备，且其中基于在该癌症中具有低突变负荷来选择该个体以进行治疗。
在一些实施方案中，一个或多个基因的低突变负荷是在该一个或多个基因上累积的突变数量少。在一些实施方案中，不多于约500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5、或更少中任一者的突变的总数指示低突变负荷。在一些实施方案中，在一个或多个MHC基因中不多于约50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个中任一者的突变指示该一个或多个MHC基因的低突变负荷。在一些实施方案中，一个或多个基因的低突变负荷是在该一个或多个基因(诸如MHC基因)上累积的突变数量与在所选基因集(诸如癌症相关基因)或全基因组中的突变总数之间的低比率。
在一些实施方案中，一个或多个MHC基因包括MHC I类基因(或基因座)。在一些实施方案中，一个或多个MHC基因包括MHC II类基因(或基因座)。在一些实施方案中，其中个体是人类个体，一个或多个MHC基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、和B2M。
示例性突变包括但不限于缺失、移码、插入、插入或缺失(indel)、误义突变、无意义突变、点突变、拷贝数变异、单一核苷酸变异(single nucleotide variation,SNV)、缄默突变、剪接位突变、剪接变体、基因融合、和易位。在一些实施方案中，MHC基因的拷贝数变异是由基因组的结构性重排造成，其包括染色体或其片段的缺失、重复、倒位、和易位。在一些实施方案中，一个或多个MHC基因中的突变是选自点突变、移码突变、基因融合、和拷贝数变异。在一些实施方案中，突变是在MHC基因的蛋白质编码区中。在一些实施方案中，突变是非同义突变。在一些实施方案中，突变不具多型性。在一些实施方案中，突变存在于个体的正常细胞中。在一些实施方案中，突变不存在于个体的正常细胞中。在一些实施方案中，突变影响由受影响基因编码的MHC分子的生理化学或功能性质，诸如稳定性或结合亲和力。在一些实施方案中，突变导致MHC分子中不可逆的缺陷。在一些实施方案中，突变降低MHC分子对T细胞表位和/或T细胞受体的结合亲和力。在一些实施方案中，突变是功能丧失型突变。在一些实施方案中，突变导致MHC分子中可逆的缺陷。在一些实施方案中，突变不影响MHC分子对T细胞表位和/或T细胞受体的结合亲和力。在一些实施方案中，突变是体细胞突变。在一些实施方案中，突变是生殖系突变。
计入突变负荷的突变可存在于所有癌细胞中或癌细胞的子集中。在一些实施方案中，突变存在于个体的所有癌细胞中。在一些实施方案中，突变存在于肿瘤部位的所有癌细胞中。在一些实施方案中，突变为殖株性。在一些实施方案中，突变为次殖株性。在一些实施方案中，突变存在于个体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中任一者的癌细胞中。
某些MHC基因中和/或一个或多个MHC基因的某些域或位置中的突变可能对个体对本文所述的改良MASCT方法的临床反应具有更深远的影响。例如，功能丧失型突变可发生在HLA分子之前导肽序列、a3域(其结合T细胞的CD8辅受体)、a1肽结合域、或a2肽结合域中；参见例如Shukla S.et al.Nature Biotechnology 33,1152-1158(2015)，其以引用方式并入本文中。B2M(β2-巨球蛋白)基因中的突变也可启动肿瘤逃脱表型。参见例如Monica B etal.Cancer Immunol.Immu.,(2012)61:1359-1371。在一些实施方案中，在一个或多个MHC基因的功能区中存在任何数量(诸如1、2、3、4、5、或更多个)的突变指示高突变负荷，此类功能区诸如前导肽序列、a1域、a2域、或a3域。在一些实施方案中，在一个或多个MHC基因(诸如人类个体中的HLA-A、HLA-B、或HLA-C基因)中存在任何数量(诸如1、2、3、4、5、或更多个)的功能丧失型突变指示高突变负荷。在一些实施方案中，一个或多个MHC基因中的低突变负荷在功能区中不包括突变，此类功能区包括该一个或多个MHC基因(诸如HLA-A、HLA-B、或HLA-C基因)之前导肽序列、a1域(例如，与CD8辅受体直接接触的残基)、a2域、和a3域(例如，与表位直接接触的残基)。在一些实施方案中，在B2M基因中存在任何数量的突变(诸如功能丧失型突变)指示高突变负荷。在一些实施方案中，在一个或多个MHC基因中的低突变负荷在B2M基因中不包括突变。
可通过所属技术领域中任何已知的方法来判定一个或多个基因(诸如MHC基因)的突变负荷，此类方法包括但不限于基因组DNA定序、外显子定序、或其他使用桑格定序或次世代定序平台的基于DNA定序的方法；聚合酶连锁反应检定；原位杂交检定；以及DNA微数组。
在一些实施方案中，通过对来自个体的肿瘤样本定序，判定一个或多个MHC基因的突变负荷。在一些实施方案中，定序是次世代定序。在一些实施方案中，定序是全基因组定序。在一些实施方案中，定序是外显子定序。在一些实施方案中，定序是候选基因(诸如癌症相关基因加上HLA基因)的靶向定序。例如，ONCOGXONETMPlus(Admera Health)可用于对癌症相关基因和HLA基因座定序，且具有高定序深度。在一些实施方案中，可使用相同的定序数据来判定一个或多个MHC基因的突变负荷并识别个体中的新抗原。
在一些实施方案中，肿瘤样本是组织样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是肿瘤活检样本，诸如细针穿刺的肿瘤细胞、或由腹腔镜术获得的肿瘤细胞(诸如包括肿瘤基质)。在一些实施方案中，肿瘤样本是新鲜获得。在一些实施方案中，肿瘤样本经冷冻。在一些实施方案中，肿瘤样本是甲醛固定石蜡包埋(Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded,FFPE)样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是细胞样本。在一些实施方案中，肿瘤样本包括循环转移性癌细胞。在一些实施方案中，通过将来自血液的循环肿瘤细胞(circulating tumorcell,CTC)分类，获得肿瘤样本。在一些实施方案中，自肿瘤样本萃取核酸(诸如DNA和/或RNA)，以用于定序分析。在一些实施方案中，将肿瘤样本的定序数据与参考样本(诸如来自相同个体的健康组织样本、或健康个体的样本)的定序数据比较，以识别突变并判定肿瘤细胞中的突变负荷。在一些实施方案中，将肿瘤样本的定序数据与来自基因组数据库的参考序列比较，以识别突变并判定肿瘤细胞中的突变负荷。
新抗原肽
在一些实施方案中，改良MASCT方法特别适用于治疗具有一或多种新抗原的个体。使用在多种肿瘤抗原肽中的一或多种新抗原肽的本文所述的任何改良MASCT方法可进一步包括基于个体中具有一或多种(诸如至少5种)新抗原而选择用于治疗方法的个体的步骤、和/或下列步骤：(i)识别该个体的新抗原；以及(ii)将衍生自该新抗原的新抗原肽并入该多种肿瘤抗原肽，以用于该改良MASCT方法。
因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)识别该个体的新抗原；(b)将新抗原肽并入多种肿瘤抗原肽，其中该新抗原肽包括该新抗原中的新表位；(c)可选地施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞；(d)使用于上在第II节中所述的制备活化T细胞的方法中任一者制备活化T细胞群；以及(e)向该个体施用有效量的活化T细胞，其中该个体具有一或多种新抗原。
个体可具有任何数量(诸如至少约1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、100、或更多种中任一者)的新抗原，以受益于改良MASCT方法，该方法使用包括新抗原肽的多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，改良MASCT方法特别适用于具有至少约4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多种中任一者的新抗原的个体。在一些实施方案中，新抗原包括一个或多个新表位。在一些实施方案中，改良MASCT方法特别适用于具有至少约4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多个中任一者的新表位的个体。在一些实施方案中，T细胞表位是MHC-I限制性表位。在一些实施方案中，相较于对应的野生型T细胞表位，新表位对个体的MHC分子具有较高的亲和性。在一些实施方案中，相较于对应的野生型T细胞表位，新表位对模型T细胞受体具有较高的亲和性。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是殖株性新抗原。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是次殖株性新抗原。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)存在于个体中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中任一者的肿瘤细胞中。
新抗原的数量可与其他生物标记或选择标准组合，以为本文所述的改良MASCT方法中任一者选择个体。在一些实施方案中，改良MASCT方法特别适用于以下的个体：在癌细胞中具有低突变负荷(诸如在一个或多个MHC基因中)，且具有至少约4、5、6、7、8、10、或更多种中任一者的新抗原(诸如具有高亲和性MHC-I限制性新表位的新抗原)。
可基于个体的新抗原设计任何数量(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种中任一者)的新抗原肽，并将其并入用于任何本文所述的改良MASCT方法的多种肿瘤抗原肽中。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括单一新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。各新抗原肽可包括一个或多个新表位，该新表位是来自个体的新抗原。在一些实施方案中，新表位是T细胞表位。基于新抗原设计新抗原肽的方法是描述于“多种肿瘤抗原肽”一节中。
可使用所属技术领域中任何已知的方法，识别个体中的新抗原。在一些实施方案中，基于来自个体的肿瘤样本的基因轮廓识别新抗原。各新抗原包括一个或多个新表位。在一些实施方案中，基于肿瘤样本的基因轮廓，识别新抗原中的一个或多个新表位。可使用任何已知的基因解析方法(诸如次世代定序(NGS)方法、微数组、或蛋白质体方法)来提供肿瘤样本的基因轮廓。
在一些实施方案中，通过对来自个体的肿瘤样本定序，识别新抗原。在一些实施方案中，定序是次世代定序。在一些实施方案中，定序是全基因组定序。在一些实施方案中，定序是外显子定序，诸如全外显子定序(whole exome sequencing,“WES”)。在一些实施方案中，定序是RNA定序。在一些实施方案中，定序是候选基因(诸如癌症相关基因)的靶向定序。许多市售NGS癌症组(例如ONCOGXONETMPlus(Admera Health))可用于对癌症相关基因定序，且具有高定序深度。
在一些实施方案中，肿瘤样本是组织样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是肿瘤活检样本，诸如细针穿刺的肿瘤细胞、或由腹腔镜术获得的肿瘤细胞(诸如包括肿瘤基质)。在一些实施方案中，肿瘤样本是新鲜获得。在一些实施方案中，肿瘤样本经冷冻。在一些实施方案中，肿瘤样本是甲醛固定石蜡包埋(Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded,FFPE)样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是细胞样本。在一些实施方案中，肿瘤样本包括循环转移性癌细胞。在一些实施方案中，通过将来自血液的循环肿瘤细胞(circulating tumorcell,CTC)分类，获得肿瘤样本。在一些实施方案中，自肿瘤样本萃取核酸(诸如DNA和/或RNA)，以用于定序分析。在一些实施方案中，自肿瘤样本萃取蛋白质，以用于定序分析。
在一些实施方案中，将肿瘤样本的基因轮廓与参考样本(诸如来自相同个体的健康组织样本、或健康个体的样本)的基因轮廓比较，以识别肿瘤细胞中的候选突变基因。在一些实施方案中，将肿瘤样本的基因轮廓与来自基因组数据库的参考序列比较，以识别肿瘤细胞中的候选突变基因。在一些实施方案中，候选突变基因是癌症相关基因。在一些实施方案中，各候选突变基因包括：一个或多个突变，诸如非同义取代、单一核苷酸变异(SNV)、插入或缺失(indel/insertion or deletion，例如非移码插入或缺失)、新开放阅读框(open reading frame,ORF)、或基因融合，其可产生新抗原。常见的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是排除在候选突变之外。
在一些实施方案中，自候选突变蛋白识别新抗原中的新表位。在一些实施方案中，以计算机仿真预测新表位。用于T细胞表位预测的示例性生物信息工具是所属技术领域中已知的，例如参见Yang X.和Yu X.(2009)的“An introduction to epitope predictionmethods and software”Rev.Med.Virol.19(2):77-96。T细胞表位预测算法中所考虑的因素包括但不限于个体的MHC亚型、T细胞表位的序列衍生的生理化学性质、MHC结合模体、蛋白酶体裂解模式、抗原处理相关转运蛋白(transporter associated with antigenprocessing,TAP)转运效率、MHC结合亲和力、肽-MHC稳定性、和T细胞受体结合亲和力。在一些实施方案中，新表位是MHC-I限制性表位。在一些实施方案中，新表位是MHC-II限制性表位。
在一些实施方案中，新表位对个体的MHC分子具有高亲和性。在一些实施方案中，该方法进一步包括判定个体的MHC亚型(例如，自定序数据判定)，以识别个体的一或多种MHC分子。在一些实施方案中，该方法进一步包括判定新表位对MHC分子(诸如MHC I类分子)的亲和性。在一些实施方案中，该方法包括判定新表位对个体的一或多种MHC(诸如MHC I类)分子的亲和性。在一些实施方案中，将新表位对个体的一或多种MHC分子的亲和性，与对应野生型表位对个体的一或多种MHC分子的亲和性比较。在一些实施方案中，选择相较于对应野生型表位，对个体的一或多种MHC分子(诸如MHC-I分子)具有较高(诸如至少约1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)亲和性的新表位。在一些实施方案中，使用所属技术领域中任何已知的工具或方法，以计算机仿真预测MHC结合亲和力。在一些实施方案中，通过实验判定MHC结合亲和力，诸如使用体外结合检定。
在一些实施方案中，该方法进一步包括判定复合物对T细胞受体的亲和性，该复合物包括新表位和MHC分子(诸如个体的MHC I类分子)。在一些实施方案中，将包括新表位和MHC分子的复合物对T细胞受体的亲和性，与包括对应野生型表位和MHC分子的复合物的亲和性比较。在一些实施方案中，MHC分子是来自个体。在一些实施方案中，T细胞受体是在个体的一个或多个T细胞的表面上。在一些实施方案中，选择相较于对应野生型表位，在复合物中对T细胞受体模型具有较高(诸如至少约1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)亲和性的新表位，该复合物包括新表位和MHC分子。在一些实施方案中，使用所属技术领域中任何已知的任何工具或方法，以计算机仿真预测TCR结合亲和力。在一些实施方案中，通过实验判定TCR结合亲和力，例如通过判定T细胞对新表位的反应。
在一些实施方案中，进一步基于肿瘤样本中新抗原(或新表位)的表现水平，识别该新抗原(或新表位)。可使用所属技术领域中任何已知的mRNA或蛋白质水平定量方法，诸如RT-PCR、基于抗体的检定法、和质谱术，判定新抗原(或新表位)的表现水平。在一些实施方案中，自肿瘤样本的定序数据，判定新抗原(或新表位)的表现水平。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是以至少约10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、104、或更多个中任一者拷贝/细胞的水平表现于肿瘤细胞中。在一些实施方案中，相较于对应野生型蛋白质(或对应野生型表位)，新抗原(或新表位)是以多于约1.5、2、5、10、20、50、100、或更多倍中任一者的水平表现于肿瘤细胞中。
在一些实施方案中，通过包括下列的步骤选择或识别新抗原肽：(a)对来自个体的肿瘤样本定序以识别新抗原；(b)识别新抗原中的新表位；可选地(c)判定该个体的MHC亚型(例如，使用定序数据判定)，以识别该个体的MHC分子；可选地(d)判定该新表位对该个体的该MHC分子的亲和性；可选地(e)判定复合物对T细胞受体的亲和性，该复合物包括该新表位和该MHC分子；以及(f)获得包括该新表位的肽，以提供该新抗原肽。在一些实施方案中，相较于包括对应野生型T细胞表位和MHC分子的复合物，新表位对个体的MHC分子(诸如MHC-I分子)具有较高亲和性，和/或在包括该新表位和该MHC分子的复合物中对TCR具有较高亲和性。在一些实施方案中，根据具有表位的新抗原的天然序列，将新表位在N端或C端或两端延伸，以获得延伸序列，其中该延伸序列是适于由I类和II类两者MHC分子呈现。使用一或多种新抗原肽的任何本文所述的改良MASCT方法可进一步包括任一个或多个新抗原选择/识别步骤。
改良MASCT后的监测
任何本文所述的改良MASCT方法可进一步包括在个体接受改良MASCT治疗之后的监测步骤。治疗后监测可有利于调整个体的治疗方案，以优化治疗成果。
例如，可基于个体对多种肿瘤抗原肽中各自的特异性免疫反应、和/或个体对活化T细胞的临床反应，调整或定制本文所述的多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽，其可用于重复(多种)改良MASCT治疗。在一些实施方案中，可自用于未来制备经脉冲DC或活化T细胞的抗原肽池，移除不会引发强烈特异性免疫反应的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，如果个体对使用一抗原肽池的改良MASCT治疗没有反应(诸如具有疾病进展、转移等的征象)，可调整该抗原肽池，或者可将新抗原并入该抗原肽池，以用于该改良MASCT治疗的第二周期。
可使用所属技术领域中任何已知的方法，例如通过测量经过个体肿瘤抗原肽刺激后来自T细胞(或PBMC)的细胞毒性因子(诸如穿孔素或颗粒酶B)、或细胞因子释放(诸如IFNγ或TNFα)的水平，判定对一或多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。可使用基于抗体的检定法(诸如ELISPOT)来定量细胞毒性因子、或细胞因子(诸如IFNγ)水平。在一些实施方案中，将响应于肿瘤抗原肽的来自T细胞(或PBMC)的细胞因子(诸如IFNγ)释放水平标准化至参考物(诸如基线细胞因子释放水平、或响应于不相关肽的来自T细胞(或PBMC)的非特异性细胞因子释放水平)，以提供细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值。在一些实施方案中，在ELISPOT检定中，大于约1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、或更多中任一者的细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值指示对肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫反应。在一些实施方案中，将在ELISPOT检定中细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值小于约10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1.2、或更小中任一者的肿瘤抗原肽自该多种肿瘤抗原肽移除，以提供多种用于未来改良MASCT治疗的定制肿瘤抗原肽。
可由医师利用所属技术领域中已知的方法，诸如利用造影方法、血液测试、生物标记评估、和活检，评估个体对改良MASCT方法的临床反应。在一些实施方案中，通过判定个体在接受改良MASCT治疗之前和之后的循环肿瘤细胞(CTC)数目，监测临床反应。在一些实施方案中，CTC已自原发性肿瘤剥离并在体液中循环。在一些实施方案中，CTC已自原发性肿瘤剥离并在血流中循环。在一些实施方案中，CTC是转移的指示。CTC数目可通过所属技术领域中已知的各种方法判定，此类方法包括但不限于CellSearch方法、Epic Science方法、IsoFlux、和maintrac。在一些实施方案中，判定在个体血液样本中的单CTC(包括CTC的特异性亚型)数目。在一些实施方案中，当个体在接受改良MASCT治疗后每mL血液样本的单CTC数目多于约10、20、50、100、150、200、300、或更多中任一者时，其指示转移的风险增加、和/或对改良MASCT治疗的临床反应不佳。在一些实施方案中，相较于接受改良MASCT治疗之前，个体在接受改良MASCT治疗后的单CTC数目增加(诸如增加至少约1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示对改良MASCT治疗的临床反应不佳。在一些实施方案中，判定在个体血液样本中的CTC团簇数目。在一些实施方案中，当个体在接受改良MASCT治疗后的血液样本中检测到至少约1、5、10、50、100、或更多个中任一者的CTC团簇时，其指示转移的风险增加、和/或对改良MASCT治疗的临床反应不佳。在一些实施方案中，相较于接受改良MASCT治疗之前，个体在接受改良MASCT治疗后的CTC团簇数目增加(诸如增加至少约1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示对改良MASCT治疗的临床反应不佳。
V.组合物、试剂盒和制品
本专利申请进一步提供试剂盒、组合物(诸如药物组合物)、和制品，其是用于本文所述的改良MASCT方法(包括精准改良MASCT方法)或细胞(诸如抗原负载DC或活化T细胞)制备方法的任何实施方案。
在一些实施方案中，提供一种用于癌症免疫疗法的试剂盒，其包括至少10种肿瘤抗原肽。所属领域技术人员可使用来自第一核心组的肿瘤抗原肽的任何组合、和可选地来自第二组的癌症类型特异性抗原肽的任何组合、和/或新抗原肽以负载树突细胞群，其可进一步用于制备有用于治疗个体中癌症的活化T细胞。
试剂盒可含有附加组分，诸如容器、试剂、培养基、细胞因子、免疫检查点抑制剂、TLR激动剂、缓冲液、抗体、和类似者，以促进执行本文所述的治疗方法或细胞制备方法的任何实施方案。例如，在一些实施方案中，试剂盒进一步包括周边血液收集和储存设备，其可用于收集个体的周边血液。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括容器和试剂，其用于周边血液的密度梯度离心，其可用于自人类周边血液样本分离的PBMC。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括培养基、细胞因子、或缓冲液，其用于自周边血液获得树突细胞。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括培养基、TLR激动剂(例如，MPLA)、IFNγ、PGE2、试剂、和缓冲液，其用于使多种肿瘤抗原肽负载至树突细胞中。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21)、免疫检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)、抗CD3抗体、缓冲液、或培养基，其用于将获自周边血液的T细胞与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞共培养。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括试剂，其用于判定癌细胞中的突变负荷(诸如在一个或多个MHC基因中)。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括免疫检查点抑制剂，其用于与改良MASCT的组合疗法。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括试剂，其用于识别肿瘤样本中的新抗原(诸如通过定序)。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括ELISPOT检定，其用于评估对多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。
本专利申请的试剂盒在合适包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软质包装(例如，聚酯树脂(Mylar)或塑料袋)、和类似者。试剂盒可选地提供附加组分，诸如缓冲液和解释性信息。因此，本专利申请还提供制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、罐、软质包装、和类似者。
说明书也可包括与使用肿瘤抗原肽(和上述可选地附加组分)有关的说明。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括说明手册，诸如描述下列的规程的手册：如本文所述的改良MASCT方法(包括精准改良MASCT方法)的实施方案、或细胞制备方法的实施方案。说明书也可包括有关剂量、给药时程、和施用途径的信息，其涉及使用试剂盒制备的树突细胞和/或活化T细胞，以用于预期治疗。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于针对改良MASCT方法选择个体的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于判定癌细胞突变负荷、和/或判定个体中新抗原数目的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于施用与改良MASCT组合的免疫检查点抑制剂的说明书，其包括例如有关免疫检查点抑制剂的剂量、给药时程、和施用途径的信息。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于识别肿瘤样本中的新抗原(诸如通过定序)的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于在接受改良MASCT治疗后监测个体的说明书。
容器可为单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)、或次单位剂量。例如，可提供含有足够肿瘤抗原肽(如本文所公开)的试剂盒，以制备足够的活化T细胞、和/或抗原负载树突细胞(诸如树突细胞)，以提供一段延长时段的个体有效治疗，该延长时段诸如3周、6周、9周、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、1年、或更长中任一者。
试剂盒也可包括多单位剂量的肿瘤抗原肽和使用说明书，且以足以储存于和使用于药房(例如，医院药房、和调制药房)的数量进行包装。
进一步提供的是本文所述的分离的细胞群(诸如树突细胞、或活化T细胞)中任一者的试剂盒、组合物(诸如药物组合物)、和制品。
本文所述的分离的细胞群可用于药物组合物或制剂中，其通过组合所述分离的细胞群与医药上可接受的载剂、赋形剂、稳定剂、和/或其他药剂(其是所属技术领域中已知者)，以用于本文所述的治疗方法、施用方法、和剂量方案。在一些实施方案中，人类白蛋白是用于作为医药上可接受的载剂。
合适的医药载剂包括无菌水；盐水、右旋糖；于水或盐水中的右旋糖；蓖麻油和环氧乙烷的缩合产物(每摩尔蓖麻油组合约30至约35摩尔环氧乙烷)；液体酸；低级烷醇；油，诸如玉米油；花生油、芝麻油、和类似者，与乳化剂，诸如脂肪酸的单或二甘油酯、或磷脂质(例如，卵磷脂)、和类似者；二醇；聚烯烃二醇；在悬浮剂存在下的水性介质，例如羧甲基纤维素钠；藻酸钠；聚(乙烯基吡咯烷酮)；以及类似者，其是单独使用、或与合适的分配剂(诸如卵磷脂)；聚氧乙烯硬脂酸酯；以及类似者。载剂也可含有佐剂(诸如保持稳定剂、润湿剂、乳化剂、和类似者)与渗透增强剂。最终形式可为无菌，且也可能够易于通过注射装置(诸如空心针)。可通过适当选择溶剂或赋形剂，达到并维持适当黏度。
本文所述的药物组合物可包括其他试剂、赋形剂、或稳定剂，以改善组合物的性质。合适的赋形剂和稀释剂的示例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、浆料、甲基纤维素、羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、和矿物油。在一些实施方案中，将药物组合物配制成其pH在约4.5至约9.0的范围内，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中任一者的pH范围。在一些实施方案中，也可通过添加合适的张力调节剂(诸如甘油)，使药物组合物与血液等渗。
在一些实施方案中，分离的细胞组合物(诸如药物组合物)适用于向人类施用。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)适用于通过肠胃外施用向人类施用。适用于肠胃外施用的制剂包括：水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和使制剂与预期受体的血液相容的溶质；以及水性及非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和保存剂。制剂可以单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)呈现，并可储存在仅需要紧接在使用前添加无菌液体赋形剂(即，水)以用于注射的条件下，该无菌液体赋形剂是用于本文所述的治疗方法、施用方法、和剂量方案。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)是含在单次使用小瓶中，诸如单次使用密封小瓶。在一些实施方案中，各单次使用小瓶含有约109个活化T细胞。在一些实施方案中，各单次使用小瓶所含有的活化T细胞足以扩增为约109个活化T细胞。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)是含在多次使用小瓶中。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)是以批量含在容器中。
还提供的是单位剂型，其包括本文所述的分离的细胞组合物(诸如药物组合物)和制剂。这些单位剂型可以单一或多单位剂量储存于合适包装中，且也可经进一步灭菌及密封。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)还包括一或多种有用于治疗癌症的其他化合物(或其医药上可接受的盐)。
本专利申请进一步提供试剂盒，其包括本文所述的分离的细胞群、组合物(诸如药物组合物)、制剂、单位剂量、和制品中任一者，以用于本文所述的治疗方法、施用方法、和剂量方案。本文所述的试剂盒包括一个或多个容器，该容器包括活化T细胞。
VI.示例性实施方案
在本文所提供的实施方案中的是：
1.一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：
a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；
b)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及
c)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。
2.根据实施方案1所述的方法，其中步骤a)进一步包括在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂。
3.根据实施方案2所述的方法，其中该TLR激动剂选自MPLA、聚肌胞苷酸、雷西莫特、嘎德莫特和CL075。
4.一种制备活化T细胞群的方法，该方法包括：
a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；
b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群，该DC成熟培养基包含MPLA；以及
c)将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，从而获得该活化T细胞群。
5.根据实施方案3或4所述的方法，其中该DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。
6.根据实施方案5所述的方法，其中该DC成熟培养基进一步包含PGE2。
7.根据实施方案5或6所述的方法，其中该INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于该DC成熟培养基中。
8.根据实施方案3至7中任一项所述的方法，其中该MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于该DC成熟培养基中。
9.根据实施方案6至8中任一项所述的方法，其中该PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于该DC成熟培养基中。
10.根据实施方案4至9中任一项所述的方法，其中步骤c)包括：在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。
11.根据实施方案1至3和5至10中任一项所述的方法，其中该多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21。
12.根据实施方案11所述的方法，其中该IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于该初始共培养基中。
13.根据实施方案1至3和5至12中任一项所述的方法，其中该免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。
14.根据实施方案13所述的方法，其中该抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于该初始共培养基中。
15.根据实施方案10至14中任一项所述的方法，在该共培养开始后约3至7天，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。
16.根据实施方案1至3和5至15中任一项所述的方法，其中在该共培养开始后约5天，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。
17.根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中将载有该多种肿瘤抗原肽的该树突细胞群与该T细胞群在该抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。
18.根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中该T细胞群存在于PBMC群中。
19.根据实施方案1至18中任一项所述的方法，其中通过诱导从PBMC分化单核细胞群来获得该树突细胞群。
20.根据实施方案1至19中任一项所述的方法，其中该树突细胞群和该T细胞群从相同个体获得。
21.根据根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽，可选地其中该多种肿瘤抗原肽是由新抗原肽组成。
22.根据实施方案1至21中任一项所述的方法，其中该多种肿瘤抗原肽是多种合成肿瘤抗原肽。
23.根据实施方案1至22中任一项所述的方法，其中该多种肿瘤抗原肽不是获自细胞样本。
24.一种分离的活化T细胞群，其使用根据实施方案1至23中任一项所述的方法制备。
25.一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的根据实施方案24所述的活化T细胞。
26.根据实施方案25所述的方法，其进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的树突细胞。
27.根据实施方案26所述的方法，其中该树突细胞群和该T细胞群从正接受治疗的个体获得。
28.根据实施方案25至27中任一项所述的方法，其中向该个体施用此类活化T细胞至少三次。
29.根据实施方案25至28中任一项所述的方法，其中此类活化T细胞经静脉内施用。
30.根据实施方案25至29中任一项所述的方法，其中施用载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞至少三次。
31.根据实施方案25至30中任一项所述的方法，其中载有该多种肿瘤抗原肽的此类树突细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。
32.根据实施方案25至31中任一项所述的方法，其中该癌症是实体肿瘤。
33.根据实施方案32所述的方法，其中该实体肿瘤选自：肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌和肺癌。
34.根据实施方案25至33中任一项所述的方法，其中该个体是人类个体。
35.一种组合物，其包含根据实施方案24所述的活化T细胞，以用于治疗个体中癌症。
36.根据实施方案24所述的活化T细胞用于制备用于治疗个体中癌症的药剂的用途。
实施例
以下实施例旨在纯粹为本专利申请的示例，因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细说明是以说明方式而非限制方式提供。
实施例1：优化DC成熟培养基
实验方法
通过以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)进行的密度梯度离心，获得来自健康志愿者的周边血液单核细胞(PBMC)。继续将黏附单核细胞培养于AIM-V培养基中以分化为未成熟树突细胞(DC)，该AIM-V培养基具有1000U/mL GM-CSF和500U/mL IL-4。将所得未成熟DC以多种肿瘤抗原肽池(1μg/mL/肽)进行脉冲，随后于DC成熟培养基中培养2天以分化为成熟DC。
使细胞培养物经受流动式细胞测量术，以判定成熟DC(CD11C+细胞)及其亚群(表现各种共刺激分子)的数目。将成熟DC的数目标准化至细胞总数。将各DC亚群中的细胞数目标准化至成熟DC的总数。用于树突细胞表面染色的抗体是获自BD Biosciences(抗人类CD86-FITC、CD40-FITC、CD11C-PE、CCR7-FITC、PD-L1-FITC、HLA-DR-FITC)。使用FACSCantoII(BD Biosciences)流动式细胞仪执行流动式细胞测量术，并利用Flowjo程序分析数据。
通过ELISA评估成熟DC的细胞因子分泌。将成熟DC之上清液离心以移除颗粒碎屑，并将其储存于-80℃下直到使用为止。根据制造商的规程，用特定ELISA试剂盒(eBioscience)测量IL-12p70和IL-10分泌水平。使用Procarta Plex MultiplexImmunoassays(Affymetrix)，判定TNF-α分泌水平。
不同TLR的效应
将抗原负载未成熟DC培养于包含不同toll样受体(TLR)的DC成熟培养基中：DC3/4指示来自先前报导的示例性MASCT方法的DC成熟培养基，其包含IL6、TNFα、IL1β、和聚肌胞苷酸；M+I培养基，其包含MPLA(“M”)和INFγ(“I”)；I+P+R培养基，其包含INFγ、聚肌胞苷酸(“P”)、和雷西莫特(“R”)；M+I+G培养基，其包含MPLA、INFγ、和嘎德莫特(“G”)；M+I+P培养基，其包含MPLA、INFγ、和聚肌胞苷酸；以及M+I+C培养基，其包含MPLA、INFγ、和CL075。在两种DC成熟培养基含有相同成分的情况下，该成分的浓度在该两种DC成熟培养基中是相同的。
如图1A所示，不同TLR及其组合对成熟DC上的共刺激分子表现没有显著影响。然而，如图1B所示，M+I和M+I+G培养基导致成熟DC的IL12和TNFα分泌水平显著增加。
TLR在不同浓度下的效应
将抗原负载未成熟DC培养于以不同浓度包含TLR的DC成熟培养基中：DC3/4指示来自先前报导的示例性MASCT方法的DC成熟培养基，其包含IL6、TNFα、IL1β、和聚肌胞苷酸；I+M培养基，其包含INFγ和低浓度的MPLA；I+M2培养基，其包含INFγ和高浓度的MPLA I+M+G1培养基，其包含MPLA、INFγ、和低浓度的嘎德莫特；I+M+G2培养基，其包含MPLA、INFγ、和高浓度的嘎德莫特；I+M+R1培养基，其包含MPLA、INFγ、和低浓度的雷西莫特；I+M+R2培养基，其包含MPLA、INFγ、和高浓度的雷西莫特；I+M+CL1培养基，其包含MPLA、INFγ、和低浓度的CL075；以及I+M+CL2培养基，其包含MPLA、INFγ、和高浓度的CL075。M的浓度是介于1μg/mL与10μg/mL之间。嘎德莫特的浓度是介于1μg/mL与10μg/mL之间。雷西莫特的浓度是介于1μg/mL与10μg/mL之间。CL075的浓度是介于1μg/mL与5μg/mL之间。
如图2A所示，DC3/4培养基导致较高的成熟DC数目。然而，如图2B所示，各种DC成熟培养基并未导致成熟DC上的共刺激分子表现有显著差异。如图2C所示，I+M、I+M1、和I+M+G1培养基显著增加成熟DC的IL12/IL10比率。评级为对诱导DC成熟具最高功效至最低功效的DC成熟培养基是如下：I+M>I+M+G1>I+M+R1。
PGE2的效应
将抗原负载未成熟DC培养于包含MPLA、INFγ、和不同浓度的PGE2的DC成熟培养基中：DC3/4指示来自先前报导的示例性MASCT方法的DC成熟培养基，其包含IL6、TNFα、IL1β、和聚肌胞苷酸；M+I培养基，其包含INFγ和MPLA，但无PGE2；M+I+P1培养基，其包含INFγ、MPLA、和低浓度的PGE2；M+I+P2培养基，其包含INFγ、MPLA、和中等浓度的PGE2；M+I+P3培养基，其包含INFγ、MPLA、和高浓度的PGE2。PGE2的浓度是介于0.1μg/mL与5μg/mL之间。
DC成熟培养基对诱导DC成熟的效应是显示于图3A至图3C中，并汇总于下表1中。对诱导DC成熟具有最高功效的DC成熟培养基是M+I+P1。
表1：PGE2对DC成熟的效应
参数 DC3/4 M+I M+I+P1 M+I+P2 M+I+P3
DC数目 2 1 2 2 2
在DC上的共刺激分子表现 2 1 3 2 3
IL-12的分泌 1 3 3 2 1
总计 5 5 8 6 6
实施例2：优化共培养条件
细胞因子混合物的效应
在初始共培养基(AIM-V培养基)中将来自冷冻储备液的经解冻T细胞与实施例1中所制备的抗原负载成熟DC混合，以提供共培养物。初始共培养基含有IL-2或介白素混合物(包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21)、和抗PD-1抗体SHR-1210(Jiangsu Hengrui)。将共培养物培养19天。
为了判定肿瘤抗原特异性T细胞的增生，如Click-iT EdU Alexa Fluor488FlowCytometry Assay Kit(Invitrogen)中所述，执行FACS分析。利用细胞内细胞因子染色和FACS分析，检测肿瘤抗原特异性T细胞的IFNγ生产。用于细胞表面染色的抗人类CD3-PE抗体、和用于细胞内细胞因子染色的抗人类IFN-γ-APC抗体是获自BD Biosciences。利用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)固定并渗透细胞，来执行细胞内细胞因子染色。使用FACS CantoII(BD Biosciences)流动式细胞仪执行流动式细胞测量术，并利用Flowjo程序分析数据。
图4显示使用来自三名健康捐赠者的PBMC样本的DC和T细胞共培养的结果。相较于具有单独IL-2的初始共培养基，具有介白素混合物的初始共培养基产生较高的分泌IFNγ的肿瘤抗原特异性T细胞的增生水平及百分比于共培养物中。
抗PD-1、IL-2、和抗CD3抗体的效应
在初始共培养基(AIM-V培养基)中将来自冷冻储备液的经解冻T细胞与实施例1中所制备的抗原负载成熟DC混合，以提供共培养物。如下表2所示，使共培养物经受各种条件。例如，测试以下的初始共培养基：具有或不具有抗PD-1抗体SHR-1210(Jiangsu Hengrui)，具有低浓度或高浓度的IL-2(rIL-2；R&D Systems,Minneapolis,MN)，且在自共培养开始起3天或5天后将抗CD3抗体(eBioscience,San Diego,CA)添加至共培养物。将DC与T细胞共培养总共19天。如上所述，判定共培养物中的肿瘤抗原特异性T细胞的数目和分泌IFNγ的T细胞的百分比。
表2：共培养条件。
Figure BDA0002710879240000671
“CIK”条件类似于用于制备经细胞因子诱导的杀手细胞的标准条件，除了在共培养开始后3天添加抗CD3抗体。“先前MASCT”条件类似于如先前于WO2016145578A1中所公开的用于制备活化T细胞的示例性条件，除了在共培养开始后3天添加抗CD3抗体。如图5A所示，条件2在共培养物中产生最高的肿瘤抗原特异性T细胞数目、和最高的分泌IFNγ的T细胞百分比。
不同浓度的IL-2的效应
在初始共培养基(AIM-V培养基)中将来自冷冻储备液的经解冻T细胞与实施例1中所制备的抗原负载成熟DC混合，以提供共培养物。初始共培养基含有抗PD-1抗体SHR-1210(Jiangsu Hengrui)、介白素混合物、低浓度或高浓度的IL-2(rIL-2；R&D Systems,Minneapolis,MN)，且在自共培养开始起3天或5天后将抗CD3抗体(eBioscience,SanDiego,CA)添加至共培养物。将DC与T细胞共培养总共19天。IL-2的浓度是介于100IU/mL与1000IU/mL之间。如上所述，判定共培养物中的肿瘤抗原特异性T细胞的数目、和分泌IFNγ的T细胞的百分比。
如图5B所示，相较于低浓度的IL-2，高浓度的IL-2在共培养物中产生较高的肿瘤抗原特异性T细胞数目、和较高的分泌IFNγ的T细胞百分比。
实施例3：示例性改良MASCT和先前MASCT细胞制备方法的比较
此实施例提供使用下列来制备的免疫细胞的直接比较(head-to-headcomparison)：本专利申请中所述的示例性细胞制备方法(“改良MASCT规程”)对WO2016145578A1中所公开的示例性细胞制备方法(“先前MASCT规程”)。
对成熟DC的IL-12分泌的效应
通过以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)进行的密度梯度离心，获得来自健康志愿者和癌症患者的周边血液单核细胞(PBMC)。继续将黏附单核细胞培养于AIM-V培养基中以分化为未成熟树突细胞(DC)，该AIM-V培养基具有1000U/mL GM-CSF和500U/mLIL-4。将所得未成熟DC以多种肿瘤抗原肽池(1μg/mL/肽)进行脉冲，随后于“改良MASCT”DC成熟培养基或“先前MASCT”DC成熟培养基中培养两天以分化为成熟DC。改良MASCT DC成熟培养基包含IFN-γ、MPLA、和PGE2。先前MASCT DC成熟培养基包含IL-6、TNF-α、IL-1β、POLY(I:C)、和PGE2。判定自成熟DC的IL-12p分泌水平。
通过ELISA评估成熟DC的细胞因子分泌。如图6A至图6B所示，相较于由先前MASCTDC成熟培养基所诱导的DC，由改良MASCT DC成熟培养基所诱导的DC分泌显著较高水平的IL-12p70。值得注意的是，相较于先前MASCT DC成熟培养基，改良MASCT DC成熟培养基通过使用来自癌症患者的PBMC导致IL-12p70分泌水平增加多于70倍。相较于衍生自健康志愿者的DC，衍生自癌症患者的DC的IL-12分泌增加更为明显。通过使用改良MASCT DC成熟培养基所制备的成熟DC而增强的细胞因子分泌水平增加了DC对实体肿瘤的细胞毒性。
对肿瘤特异性T细胞的效应
根据示例性改良MASCT规程或示例性先前MASCT规程，将衍生自健康志愿者(n＝5)的PBMC的T细胞与抗原负载成熟DC共培养。改良MASCT规程涉及在初始共培养基中将T细胞与抗原负载成熟DC共培养，该初始共培养基含有介白素混合物(包括IL-2、IL-7、IL-15、和IL-21)、和抗PD-1抗体SHR-1210(Jiangsu Hengrui)。当将抗CD3抗体添加至共培养物时，将该共培养物培养5天。将细胞共培养总共19天，以提供活化T细胞。先前MACT规程涉及在共培养基中将T细胞与抗原负载成熟DC共培养，该共培养基含有IL-2和抗CD3抗体。将细胞共培养总共19天，以提供活化T细胞。
利用如实施例2所述的细胞内细胞因子染色和FACS分析，检测回应于肿瘤抗原的活化T细胞的IFNγ生产。如图7所示，相较于使用先前MASCT规程者，使用改良MASCT规程显著增加(约2至4倍)共培养物中的生产IFNγ的活化T细胞的百分比。
使用改良MASCT规程和先前MASCT规程制备的活化T细胞的抗肿瘤效应使用各种实体肿瘤细胞系来判定，此类实体肿瘤细胞系包括MBA231(乳癌细胞)、CNE1(鼻咽癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、和Saos-2(骨肉瘤细胞)。简言的，将肿瘤细胞培养于补充有下列的DMEM中：10％失活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、Glutamax、MEM NEAA(Gibico,Carlsbad,CA)。将肿瘤细胞用D-PBS(Invitrogen)洗涤，并将其与活化T细胞在96孔圆底盘中以1:10或1:30的T细胞:目标(T:目标)比率以三重复于AIM-V中共培养4小时。细胞毒性显示为在裂解后释放并由Cytotox 96检定试剂盒(Promega G1780,Canada)测得的最大LDH的百分比。
如图8所示，相较于使用先前MASCT规程制备的活化T细胞，使用改良MASCT规程制备的活化T细胞针对所有四种类型的肿瘤细胞系皆具有显著增强的细胞毒性。
实施例4：改良MASCT临床研究
改良MASCT研究是一种开放标签的多中心研究，其旨在探讨改良MASCT方法的实施方案在治疗患有实体肿瘤的患者中的安全性和疗效，此类实体肿瘤包括肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、子宫内膜癌、结肠直肠癌、和肺癌。参与试验的患者可能先前已接受根除性切除(诸如切除或RFA)或一线化疗。
患者接受一个或多个周期的改良MASCT治疗。例如，患者可在1至2年期间每1至3个月接受一个周期的改良MASCT治疗。在各周期的改良MASCT治疗中，PBMC是获自各患者。未成熟树突细胞是获自PBMC。在第1天，将未成熟树突细胞以抗原肽池进行脉冲，该抗原肽池包括至多44种衍生自下列的抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、CDCA1、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、和AFP。抗原肽池也可含有至多10种衍生自新抗原的抗原肽。将载有抗原肽池的未成熟树突细胞培养于DC成熟培养基中，以提供载有该抗原肽池的成熟树突细胞，该DC成熟培养基含有IFN-γ、MPLA、和PGE2。在第8天，患者接受载有抗原肽池的成熟树突细胞的皮下注射。自第8天至第13天，将PBMC中的T细胞与载有抗原肽池的成熟树突细胞在细胞因子混合物(IL-2、IL-7、IL-15、IL-21)和抗PD-1抗体(例如，SHR-1210)存在下共培养。在第13天，将抗CD3抗体(例如，OKT-3)添加至共培养物。在第28天，将含有活化T细胞的共培养物输注至患者。在组合疗法组中，患者接受抗PD-1抗体治疗或化疗治疗。
除非患者经历疾病进展或不可接受的毒性，否则各患者接受改良MASCT治疗达至多18个周期。对患者追踪约2.5年或直到所有患者死亡或有疾病进展为止(以较早发生者为准)。
患者必须符合所有下列标准以具进入研究的资格。
1.患者经诊断出患有实体肿瘤，此类实体肿瘤包括肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、子宫内膜癌、结肠直肠癌、和NSCLC；
2.如RECIST标准1.1针对实体肿瘤所定义的至少一种可测量病变；
3.在主门静脉、肝管的第一分支、肝静脉的第一分支、或下腔静脉中无癌栓；
4.ECOG体能状态(ECOG-PS)≤2；
5.预期存活时间多于6个月；
6.血液、肝脏、和肾脏的测试符合以下标准：
a.WBC>3×109/L
b.嗜中性球计数>1.5×109/L
c.血红素≥85g/L
d.血小板计数≥50×109/L
e.PT正常或延长时间<3s
f.BUN≤上限的1.5倍，
g.血清肌酸酐≤上限的1.5倍
7.根据当地机构和/或大学人体实验委员会规定和/或中央机构审查委员会(Institutional Review Board,IRB)或其他者(适当时)获得并签署的患者同意。
符合任何下列标准的患者不具进入研究的资格：
1.怀孕或哺乳期间或计划在2年内怀孕的女性；
2.如由CT或MRI评估所判定的已知活动性脑部转移；
3.知道在6个月内全身性及连续使用免疫调节剂(诸如干扰素、胸腺素、中药)的时期；
4.呈HIV抗体或HCV抗体阳性；
5.具有免疫缺乏疾病或自体免疫疾病(诸如类风湿性关节炎、Buerger氏病、多发性硬化症、或第1型糖尿病)的病史；
6.患有器官衰竭的患者；
7.患有严重精神疾病的患者；
8.参与试验前1年内药物成瘾，包括酗酒；
9.在筛选前3个月内参加其他临床试验；
10.研究者认定不适于该研究的其他原因。
主要成果量度包括改良MASCT治疗的安全性和疗效。次要成果量度包括整体存活(overall survival,OS)、无进展存活(progression-free survival,PFS)、客观反应率(objective response rate,ORR)、完全反应(complete response,CR)、部分反应(partialresponse,PR)、疾病稳定率(stable disease rate,SDR)、和疾病相关生物标记测量。使用RECIST标准(v1.1)评估肿瘤反应和进展。基于生命征象、临床实验室发现、和根据NCICTCAE第4.02版分级的不良事件，评估安全性。执行ELISPOT检定，以判定各患者在各周期的改良MASCT治疗中活化T细胞的抗原肽特异性反应。
实施例5：经新MASCT治疗的患者对新抗原的免疫反应
为了探讨新抗原是否可在患有实体肿瘤(例如，HCC、子宫内膜癌、和结肠癌)的患者中诱导肿瘤特异性免疫反应，对经根除性切除后的患者施加使用改良MASCT制备规程的新抗原刺激细胞疗法(“新MASCT”)。
根据实施例4所述的临床规程，患者接受新MASCT治疗。如图9所示，在各周期的新MASCT治疗中，各患者接受载有多种共有肿瘤相关抗原(TAA)及数种个人化新抗原的肽池的成熟树突细胞(DC)注射，随后接受由这些DC刺激的自体T细胞输注。共有肿瘤相关抗原(TAA)包括一般肿瘤抗原及癌症类型特异性肿瘤抗原两者。患者接受1至10个周期的新MASCT治疗。
图10显示用于设计新抗原肽的示意性流程图。为了获得新抗原序列，在进行活检或手术之后立即取得新鲜肿瘤样本，以用于后续全外显子定序(WES)和RNAseq。通过将来自肿瘤与正常组织的次世代定序数据进行比较，来检测包括SNV、非移码插入/缺失(插入或缺失)、和新ORF的所有突变。根据患者的HLA I类基因型，通过MASNEOTM算法来预测所有新表位候选物。选择具较高亲和性的含有25至31个氨基酸的长新抗原肽，以用于进一步合成和治疗。优选的是含有多个新表位的肽。较少数的新抗原肽可使用NetMHC算法(Andreatta M,Nielsen M.Bioinformatics(2016)Feb 15；32(4):511-7)自相同次世代定序结果预测。
进行ELISPOT检定以判定患者是否发展出对肿瘤抗原肽(包括新抗原肽)的各自的MHC限制性T细胞反应。简言的，将来自患者的PBMC在细胞培养盘上接种(1×106个细胞/孔)于不具任何细胞因子的AIM-V培养基中，并进一步用个别抗原肽刺激48h。然后，将PBMC转移至96孔ELISPOT检定盘(U-CyTech Biosciences)上以用于IFNγ检测。将PBMC进一步用肽再刺激16h。根据制造商的说明书，执行并分析ELISPOT检定。用计算机辅助影像分析软件(ChampSpot；Saizhi)判定斑点形成单位数。反应是以每105个PBMC/孔的斑点形成单位来显示。结果是以通过特异性肽组:不相关肽组计算的IFNγ生产倍数指数来展示。示例性原始ELISPOT结果是显示于图14中。
图11汇总八名对新抗原肽有反应的患者的ELISPOT结果，包括六名HCC患者、一名子宫内膜癌患者、和一名结肠癌患者。如MASNEOTM所预测，各患者响应于25％至100％的新抗原肽。使用由MASNEOTM预测的新抗原肽，在患者中达到66％的整体反应率。
在HCC患者组内，八名HCC患者已接受新MASCT，并使用ELISPOT检定来测试其中七名的对TAA和新抗原两者的特异性免疫反应。结果显示，新MASCT分别在五名患者(5/7,71％)中诱导了TAA特异性免疫反应，并在六名患者(6/7,86％)中诱导了新抗原特异性免疫反应。在新MASCT治疗后，一名患者(患者#2)展示对所有五种新抗原肽(5/5,100％)的特异性T细胞反应。在六名有反应的HCC患者中，新抗原的平均反应率为65％(22/34的肽)。
图12显示使用来自患者#2的在新MASCT治疗之前和在四个周期的新MASCT治疗之后的PBMC的ELISPOT结果。“基本肽”指示使用一般肿瘤抗原肽池的结果，其包括：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CDCA1、VEGFR1、VEGFR2、RGS5、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、和WT-1。“HCC肽”指示使用HCC特异性肿瘤抗原肽池的结果，其包括HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、和AFP。在新MASCT治疗之后，观察到对基本肽池、HCC肽池、以及个别肿瘤抗原肽(例如，p53、存活素、CEA、CDCA1、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、Her2、GPC3、和SSC)的增强T细胞反应。
图13显示使用来自患者#2的在新MASCT治疗之前、在2个周期的新MASCT治疗之后、和在5个周期的新MASCT治疗之后的PBMC的ELISPOT结果。“新肽”指示使用新抗原肽池的结果，其包括ZGQ-1、ZGQ-2、ZGQ-4、ZGQ-5、ZGQ-6、和ZGQ-7。在多轮新MASCT治疗之后，观察到对新肽池和个别新抗原肽的增强T细胞反应。
总而言的，结果证实，具有改良MASCT制备规程的新MASCT在癌症患者中耐受良好，并引发对多种肿瘤抗原(尤其是个人化新抗原)的免疫反应。在此实施例中的新MASCT治疗使用新抗原肽和肿瘤相关抗原肽两者。鉴于对新抗原肽的高特异性T细胞反应率，我们计划进行使用新抗原肽池而未使用任何一般肿瘤抗原肽的临床研究，以制备用于实体肿瘤患者的新MASCT治疗的活化T细胞。

Claims (30)

1.一种制备活化T细胞群的方法，所述方法包括：
a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触以获得载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；
b)在包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂的初始共培养基中共培养载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群和T细胞群以提供共培养物；以及
c)在所述共培养开始后5天，将抗CD3抗体添加至所述共培养物，从而获得所述活化T细胞群。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)还包括在包含toll样受体(TLR)激动剂的DC成熟培养基中培养载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述TLR激动剂选自MPLA、聚肌胞苷酸、雷西莫特、嘎德莫特和CL075。
4.一种制备活化T细胞群的方法，所述方法包括：
a)使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触以获得载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞群；
b)在包含浓度为0.5至10μg/mL的MPLA、浓度为100IU/mL至1000IU/mL的干扰素γ(INFγ)和浓度为0.1至0.5μg/mL的PGE2的DC成熟培养基中培养载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群；以及
c)共培养载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群和T细胞群，从而获得所述活化T细胞群。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述DC成熟培养基还包含PGE2。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述INFγ以100IU/mL至1000IU/mL的浓度存在于所述DC成熟培养基中。
8.根据权利要求3、5和6中任一项所述的方法，其中所述MPLA以0.5μg/mL至10μg/mL的浓度存在于所述DC成熟培养基中。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述PGE2以0.1μg/mL至0.5μg/mL的浓度存在于所述DC成熟培养基中。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括：在包含多种细胞因子和免疫检查点抑制剂的初始共培养基中共培养载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群和T细胞群以提供共培养物；并且将抗CD3抗体添加至所述共培养物，从而获得所述活化T细胞群。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15和IL-21。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述IL-2以至少500IU/mL的浓度存在于所述初始共培养基中。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗PD-1抗体以至少10μg/mL的浓度存在于所述初始共培养基中。
15.根据权利要求1所述的方法，其中将载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞群和所述T细胞群在所述抗CD3抗体存在下共培养至少10天。
16.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述T细胞群存在于PBMC群中。
17.根据权利要求1或4所述的方法，其中通过诱导从PBMC分化单核细胞群来获得所述树突细胞群。
18.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述树突细胞群和所述T细胞群从相同个体获得。
19.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽。
20.一种使用根据权利要求1-19中任一项所述的方法制备的分离的活化T细胞群。
21.根据权利要求20所述的活化T细胞在制备用于治疗个体的癌症的药物中的应用，所述治疗包括向所述个体施用有效量的所述活化T细胞。
22.根据权利要求21所述的应用，其中所述治疗还包括向所述个体施用有效量的载有所述多种肿瘤抗原肽的树突细胞。
23.根据权利要求22所述的应用，其中所述树突细胞群和所述T细胞群从接受治疗的个体获得。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的应用，其中所述治疗包括向所述个体施用所述活化T细胞至少三次。
25.根据权利要求21-23中任一项所述的应用，其中所述治疗包括静脉内施用所述活化T细胞。
26.根据权利要求21-23中任一项所述的应用，其中所述治疗包括施用载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞至少三次。
27.根据权利要求21-23中任一项所述的应用，其中所述治疗包括皮下、皮内或静脉内施用载有所述多种肿瘤抗原肽的所述树突细胞。
28.根据权利要求21所述的应用，其中所述癌症是实体肿瘤。
29.根据权利要求28所述的应用，其中所述实体肿瘤选自肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、软组织肉瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌和肺癌。
30.根据权利要求21所述的应用，其中所述个体是人类个体。
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