TWI851564B - 改良多抗原特異性細胞療法方法 - Google Patents

Abstract

本申請案提供藉由將T細胞與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞共培養來製備活化T細胞群之方法。亦提供的是使用該等活化T細胞治療個體中癌症之方法、醫藥組成物、及套組以用於基於細胞的癌症免疫療法。

Description

改良多抗原特異性細胞療法方法

本申請案係關於癌症免疫療法之領域。更具體而言，本申請案提供方法、組成物、及套組以用於使用活化T細胞治療個體中癌症。

人體具有精密的免疫系統，以保護自身來抵禦疾病。發動身體自身的抗癌免疫力已是腫瘤學上長久以來的理想。腫瘤抗原會引發對腫瘤的天然免疫反應。抗原呈現細胞(antigen presenting cell,APC)，尤其是樹突細胞(dendritic cell,DC)，可處理並在其細胞表面上呈現腫瘤抗原。成熟之後，載有腫瘤抗原之DC可觸發T細胞反應，該T細胞反應涉及細胞毒性T細胞、輔助T細胞、及功能上不同的效應T細胞及記憶T細胞，其對抗表現腫瘤抗原的癌細胞。一種特別強大的T細胞反應類型涉及生產細胞毒性T細胞，其可藉由釋放細胞激素、酶、及細胞毒素，或藉由經由細胞間相互作用誘導促進細胞凋亡的傳訊級聯反應，來殺死癌細胞。

基於細胞的癌症免疫療法欲求藉由向患者投予免疫媒介細胞來治療癌症，該等免疫媒介細胞經製備以靶向腫瘤抗原。FDA所 批准的PROVENGE^®(sipuleucel-T)係一種基於DC之療法，其包含使患者的周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)暴露於融合蛋白，該融合蛋白包含耦合至細胞激素的腫瘤衍生抗原；然後向該患者輸注該等PBMC，推測該等PBMC含有可向T細胞呈現該腫瘤衍生抗原的活化DC。參見美國專利第6,210,662號。過繼性T細胞療法涉及自患者的腫瘤單離腫瘤浸潤淋巴球(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)，離體擴增該等TIL，且在耗盡患者的天然非骨髓性淋巴球後將該等TIL輸注回該患者。參見Restifo NP et al.(2012)Nat.Rev.Immunol.12：269-81。具有經工程改造之T細胞受體的T細胞(TCR-T)或具有嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T)係藉由修飾T細胞-腫瘤相互作用的微環境，來進一步擴增過繼性T細胞療法方法的能力。最近，多抗原特異性細胞療法(Multiple Antigen Specific Cell Therapy,「MASCT」)方法已經設計以利用DC及活化T細胞兩者的治療能力，以便為癌症患者提供安全、持久且可客製化的治療。參見國際專利申請公開案第WO2016145578A1號。

在本文中所參照之所有出版物、專利、專利申請案、及已公開專利申請案之揭露全文特此以引用方式併入本文中。

本申請案提供製備活化T細胞之方法、及使用該等活化T細胞治療個體中癌症之方法。

本申請案之一個態樣提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有 該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA；及c)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，步驟c)包含在共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，該共培養基包含介白素混合物、免疫檢查點抑制劑、及抗CD3抗體。在一些實施例中，步驟c)包含：在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，在該共培養開始後約3至7天(諸如約5天)，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。

在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基進一步包含PGE2。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。

本申請案之一個態樣提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在初始共培養基中將載有該複 數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及c)在該共培養開始後約3至7天(諸如約5天)，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，步驟a)進一步包含在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(toll-like receptor,TLR)促效劑。在一些實施例中，該TLR促效劑係選自由MPLA、Poly I：C、雷西莫特(resquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)、及CL075所組成之群組。

在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。

在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。

在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該T細胞群存在於PBMC群中。

在一些根據上述方法中任一者之實施例中，藉由誘導來自PBMC之單核球群分化來獲得該樹突細胞群。

在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該樹突細胞群及該T細胞群係獲自相同個體。在一些實施例中，該樹突細胞群及該T細胞群係衍生自相同個體之PBMC。

在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該複數種腫瘤抗原肽係複數種合成腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該複數種腫瘤抗原肽不是獲自細胞樣本。

在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該複數種腫瘤抗原肽包含(多種)一般腫瘤抗原肽、(多種)癌症類型特異性抗原肽、及/或新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種新抗原肽。在一些實施例中，該複數種腫瘤抗原肽包含新抗原肽(例如，由新抗原肽組成)。在一些實施例中，該複數種腫瘤抗原肽包含至少約5種(例如，至少約10、20、30、40、或更多種)不同腫瘤抗原肽。

亦提供的是一種單離活化T細胞群，其係使用上述方法中任一者製備。

進一步提供的是一種治療個體中癌症之方法，其包含向該個體投予有效量的該等活化T細胞，該等活化T細胞係使用上述方法中任一者製備。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，該樹突細胞群及該T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，投予載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹 突細胞至少三次。在一些實施例中，載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。在一些實施例中，該個體係人類個體。在一些實施例中，該癌症係實體癌症，諸如肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、或肺癌。

進一步提供的是醫藥組成物、套組、及製品，其等係用於上述方法中任一者。

由隨後的實施方式及隨附申請專利範圍，本發明之此等及其他態樣及優點將變得顯而易見。應了解的是，本文所述的各種實施例之一項、一些、或所有性質可經組合以形成本發明之其他實施例。

圖1A顯示在含有各種類鐸受體(TLR)或組合之DC成熟培養基中培養之後的成熟DC上的共刺激分子表現水平。圖1B顯示成熟DC之細胞激素分泌水平。DC3/4：DC成熟培養基，其包含IL6、TNFα、IL1β、及Poly I：C；I：INFγ；M：MPLA；P：Poly I：C；R：雷西莫特；G：嘎德莫特；C：CL075。

圖2A顯示在含有不同濃度的TLR之DC成熟培養基中培養之後的成熟DC數目。圖2B顯示成熟DC上的共刺激分子表現水平。圖2C顯示成熟DC之細胞激素分泌水平。DC3/4：DC成熟培養基，其包含IL6、TNFα、IL1β、及Poly I：C；I：INFγ；M1：MPLA，低濃度；M2：MPLA，高濃度；R1：雷西莫特，低濃度；R2：雷西莫特，高濃度；G1：嘎德莫特，低濃度；G2：嘎德莫特，高濃度；CL1：CL075，低濃度；CL2：CL075，高濃度。

圖3A顯示在藉由具有不同PGE2濃度的類鐸受體(TLR)組成物誘導成熟之後的DC數目。圖3B顯示經誘導之抗原負載成熟DC上的共刺激分子分泌水平。圖3C顯示經誘導之抗原負載成熟DC的細胞激素表現水平。DC3/4：DC成熟培養基，其包含IL6、TNFα、IL1β、及Poly I：C；I：INFγ；M：MPLA；P1：PGE2，低濃度；P2：PGE2，中等濃度；P3：PGE2，高濃度。

圖4顯示在補充有IL-2或介白素混合物(IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)的抗原負載成熟DC與T細胞之共培養物中，在腫瘤抗原肽刺激之後分泌IFNγ之腫瘤抗原特異性T細胞的百分比及數目。

圖5A顯示在各種條件下細胞製劑中的腫瘤抗原特異性T細胞之百分比及數目。CIK：用高濃度IL-2培養的PBMC，且在共培養3天之後添加抗CD3抗體；先前MASCT：用高濃度IL-2之抗原負載DC與PBMC的共培養物，且在共培養3天之後添加抗CD3抗體；1：用抗PD1抗體、介白素混合物(包括高濃度IL-2)之抗原負載DC與PBMC的共培養物，且在共培養3天之後添加抗CD3抗體；2：用抗PD1抗體、介白素混合物(包括高濃度IL-2)之抗原負載DC與PBMC的共培養物，且在共培養5天之後添加抗CD3抗體。

圖5B顯示在用抗PD1抗體、介白素混合物(包括低濃度或高濃度IL-2)之抗原負載DC與PBMC的共培養物中腫瘤抗原特異性T細胞之百分比及數目，且在共培養5天之後添加抗CD3抗體。

圖6A顯示使用不同DC製備方法之來自健康捐贈者的經誘導之抗原負載成熟DC的IL-2分泌水平。

圖6B顯示使用不同DC製備方法之來自癌症患者的經誘導之抗原負載成熟DC的IL-2分泌水平。

圖7顯示使用不同方法製備之共培養物中生產IFN-γ的腫瘤抗原特異性T細胞之百分比。

圖8顯示使用先前MASCT規程(「P」)或改良MASCT規程(「I」)製備的活化T細胞之抗腫瘤效應。

圖9顯示例示性新MASCT治療的示意性工作流程。此圖中所示之新MASCT治療使用衍生自新抗原及腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen,TAA)兩者之抗原肽。在一些實施例中，新MASCT治療使用僅衍生自新抗原之抗原肽池。

圖10顯示用於設計新抗原肽的示意性工作流程。

圖11顯示在回應於使用新抗原肽之改良MASCT治療(「新MASCT」)的八名患者中，對新抗原肽的特異性T細胞反應率。

圖12顯示來自患者#2之在改良MASCT治療之前及之後的PBMC之ELISPOT結果。

圖13顯示來自患者#2之在新MASCT治療之前及之後的PBMC之ELISPOT結果。

圖14顯示來自患者#2及患者#5之在新MASCT治療之前及之後的PBMC之例示性ELISPOT結果。

本申請案提供藉由將T細胞與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞(DC)共培養來製備活化T細胞之改良方法。在一些實施例中， 該方法使用包含MPLA之DC成熟培養基以誘導抗原負載DC成熟、包含介白素混合物及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)之共培養基以用於T細胞與抗原負載DC的共培養、及/或抗CD3抗體至共培養物的延遲添加以提供具有增強比例的腫瘤抗原特異性T細胞及減少比例的免疫抑制調節性T細胞(Treg)之活化T細胞。相較於使用如WO2016145578A1所揭示之先前報導的多抗原特異性細胞療法(「MASCT」或「先前MASCT」)方法之例示性規程者，使用本文所揭示之方法，衍生自癌症患者之抗原負載成熟DC的IL-12分泌增加約70倍，而共培養物中的腫瘤抗原特異性T細胞百分比增加約2至4倍。本文所述的用於使用活化T細胞治療癌症之方法稱為「改良MASCT」方法。在患有癌症(包括實體癌症)的患者中，改良MASCT方法提供增強的治療療效及反應持續時間。

因此，本申請案之一個態樣提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及c)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。

本申請案之另一個態樣提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載 有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA；c)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，從而獲得該活化T細胞群。

亦提供使用本文所述方法製備的活化T細胞、治療癌症之方法、組成物、套組、及製品。

本申請案主張於2018年3月30日申請之國際專利申請案第PCT/CN2018/081338號之優先權權益，其揭露全文以引用方式併入本文中。

I.定義

除非另有定義如下，否則用語在本文中係如所屬技術領域中所通常使用般使用。

如本文中所使用，「治療(treatment/treating)」係獲得有益或所欲結果(包括臨床結果)的方式。針對本發明之目的，有益或所欲臨床結果包括但不限於下列中之一或多者：減少又一種疾病所導致的症狀、消減疾病的程度、穩定疾病(例如，預防或延遲疾病的惡化)、預防或延遲疾病的擴散(例如，轉移)、預防或延遲疾病的發生或復發、延遲或減緩疾病的進展、改善疾病狀態、提供疾病的(部分或完全)緩解、降低一或多種治療疾病所需之其他藥物的劑量、延遲疾病的進展、增加生活品質、及/或延長存活。「治療(treatment)」亦涵蓋的是癌症病理結果的減少。本發明之方法設想到此等治療態樣中之任一或多者。

如本文中所使用，「延遲(delaying)」癌症的發展意指推遲、阻礙、減緩、延緩、穩定、及/或延後疾病的發展。此延遲可為不同時間長度，其取決於疾病史及/或正接受治療之個體。如對於所屬技術領域中具有通常知識者而言為明顯的，足夠或顯著的延遲實際上可涵蓋預防，因為個體不會發展疾病。「延遲」癌症發展的方法當與未使用該方法比較時，是降低給定時段中疾病發展的可能性且/或降低給定時段中疾病程度的方法。此類比較一般是基於臨床研究、使用統計上顯著的個體數。可使用標準方法偵測癌症發展，標準方法包括但不限於電腦斷層掃描(CAT掃描)、磁共振造影(MRI)、腹部超音波、凝血測試、動脈攝影、或活檢。發展亦可指最初可能為不可偵測的癌症進展，且包括發生、復發及、發作。

用語「個體(individual)」、「對象(subject)」、及「患者(patient)」在本文中可互換使用，以描述哺乳動物，包括人類。個體包括但不限於人類、牛、馬、貓、犬、嚙齒動物、或靈長類動物。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體罹患諸如癌症之疾病。在一些實施例中，個體需要治療。

如所屬技術領域中所了解，「有效量(effective amount)」係指足以產生所欲治療成果(例如，降低一或多種癌症症狀之嚴重性或減少其持續時間、穩定一或多種癌症症狀之嚴重性、或消除一或多種癌症症狀)的組成物(例如抗原負載DC、或活化T細胞)之量。就治療用途而言，有益或所欲結果包括例如減少一或多種疾病導致的症狀(生物化學、組織學、及/或行為方面)，該症狀包括在疾病發展期 間呈現的併發症及中間病理表型；增加罹患疾病者的生活品質；降低其他治療疾病所需藥物之劑量；增強另一種藥物之效果；延遲疾病的進展；及/或延長患者的存活。

「輔助性治療(adjuvant setting)」係指其中個體已具有癌症病史且通常(但不一定)已對療法有反應的臨床環境，療法包括但不限於手術(例如，手術切除)、放射療法、及化療。然而，由於其癌症病史，將此等個體視為處於疾病發展的風險。「輔助性治療(adjuvant setting)」中的治療或投予係指後續治療模式。風險程度(例如，在輔助性治療中的個體係視為「高風險」或「低風險」時)係取決於數個因素，最常見的是首次治療時的疾病程度。

「新輔助性治療(neoadjuvant setting)」係指其中方法係在主要/決定性療法之前進行的臨床環境。

如本文中所使用，「組合療法(combination therapy)」意指第一藥劑係與另一種藥劑配合投予。「與...配合(in conjunction with)」係指一種治療型態在除了另一種治療型態之外下投予，諸如本文所述的活化T細胞在除了另一種藥劑(諸如免疫檢查點抑制劑)之投予外投予至相同個體。因此，「與...配合」係指一種治療型態在另一種治療型態遞送至個體之前、期間、或之後投予。將此類組合視為屬於單一治療方案(regimen或regime)之部分。

如本文中所使用，用語「同時投予(simultaneous administration)」意指在組合療法中的第一療法及第二療法係以不多於約15分鐘(諸如不多於約10、5、或1分鐘中之任一者)的時間間隔 投予。當第一療法及第二療法係同時投予時，第一療法及第二療法可含在相同組成物(例如，包含第一療法及第二療法兩者之組成物)中或不同組成物(例如，第一療法在一種組成物中，而第二療法係含在另一種組成物中)中。

如本文中所使用，用語「依序投予(sequential administration)」意指在組合療法中的第一療法及第二療法係以多於約15分鐘(諸如多於約20、30、40、50、60、或更多分鐘中之任一者)的時間間隔投予。可先投予第一療法或第二療法。第一療法及第二療法可含在不同組成物中，該等不同組成物可含在相同或不同包裝或套組中。

如本文中所使用，用語「並行投予(concurrent administration)」意指組合療法中的第一療法之投予與第二療法之投予彼此重疊。

如本文中所使用，以「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」或「藥理上相容(pharmacologically compatible)」意指不是在生物或其他方面上非所欲的材料，例如，可將該材料併入投予至個體的醫藥組成物中，而不會造成任何顯著非所欲的生物作用，或以有害方式與含有其之組成物中的任何其他組分相互作用。醫藥上可接受之載劑或賦形劑較佳地已符合所需毒物測試標準及製造測試標準，且/或係包括於美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug administration)所製作的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)。

如本文中所使用，用語「細胞(cell)」、「細胞系(cell line)」、及「細胞培養物(cell culture)」可互換使用，且所有此類名稱皆包括子代。據了解，由於人為或意外的突變，所有子代之DNA含量可能不完全相同。具有與原始細胞相同的功能或生物活性之變體子代係包括在內。

用語「肽(peptide)」係指不多於約100個胺基酸之胺基酸聚合物(包括蛋白質之片段)，其可係直鏈或支鏈，包含經修飾胺基酸，且/或以非胺基酸間隔。該用語亦涵蓋經過自然修飾或介入修飾的胺基酸聚合物，其包括例如雙硫鍵形成、醣基化、脂化、乙醯化、磷酸化、或任何其他操縱或修飾。亦包括在此用語內的是(例如)含有一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)之肽、以及所屬技術領域中已知的其他修飾。本文所述的肽可天然存在，即，獲自或衍生自天然來源(例如血液)，或經過合成(例如，經化學合成、或藉由重組DNA技術合成)。

如本文中所使用，「複數種腫瘤抗原肽(a plurality of tumor antigen peptides)」、「多種腫瘤抗原肽(multiple tumor antigen peptides)」、「腫瘤抗原肽之池(a pool of tumor antigen peptides)」、及「腫瘤抗原肽池(a tumor antigen peptides pool)」可互換使用，以指二或更多種腫瘤抗原肽之組合。

如本文中所使用，「載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞(dendritic cells loaded with a plurality of tumor antigen peptides)」及「抗原負載樹突細胞(antigen-loaded dendritic cells)」可互換使用，以 指在該複數種腫瘤抗原肽中具有增強的一或多種腫瘤抗原肽呈現之樹突細胞。

如本文中所使用，「活化T細胞(activated T cells)」係指具有辨識至少一種腫瘤抗原肽之T細胞受體的單株(例如，編碼相同TCR)或多株(例如，具有編碼不同TCR之殖株)T細胞之群。活化T細胞可含有一或多種T細胞亞型，其包括但不限於細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺手T細胞、γδ T細胞、調節性T細胞、及記憶T細胞。

如本文中所使用，「免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor)」係指抑制或阻斷在免疫細胞(諸如T細胞)或腫瘤細胞上之抑制性免疫檢查點分子的藥劑(包括抗體)。「免疫檢查點分子(immune checkpoint molecules)」包括提升對腫瘤細胞之免疫信號的分子(即，「共刺激分子(co-stimulatory molecules)」)、或降低對腫瘤細胞之免疫信號的分子(即，「抑制性免疫檢查點分子(inhibitory immune checkpoint molecules)」)。

本文中所使用的用語「抗體(antibody)」係以最廣泛的意義使用，且具體涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、及抗體片段，只要其等展現所欲生物活性。

「抗體片段(antibody fragment)」包含完整抗體之部分，較佳地包含其抗原結合區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')₂、及Fv片段；雙價抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；及自抗體片段形成之多特異性抗體。

如本文中所使用，用語「特異性結合至(specifically binds to)」、「辨識(recognizes)」、「特異性辨識(specifically recognizes)」、「靶向(targets)」、或「對...具特異性(specific for)」係指可測量且可再現的相互作用，諸如目標與抗體之間、或受體與配體之間、或受體與表位/MHC複合物之間的結合，其判定在分子(包括生物分子)的異質群體存在下目標的存在。例如，結合至或特異性結合至目標(其可係表位)的抗體係以較大親合性、結合性、更加容易地、且/或以更長持續時間結合此目標(相較於其結合至其他目標)的抗體。在一個實施例中，如所測量(例如藉由放射免疫檢定法(RIA))，抗體與不相關目標的結合程度小於抗體與目標的結合之約10%。在某些實施例中，特異性結合至抗原肽(或表位)的抗體具有

1μM、

100nM、

10nM、

1nM、或

0.1nM之解離常數(Kd)。在某些實施例中，抗體特異性結合至來自不同物種之蛋白質中保守的蛋白質上之表位。在另一實施例中，特異性結合可包括但不需要排他性結合。

據了解，本文所述的本發明之態樣及實施例包括「由...所組成(consisting)」及/或「基本上由...所組成(consisting essentially of)」態樣及實施例。

本文中所提及之「約(about)」一值或參數包括(並描述)關於該值或參數本身的變動。例如，提及「約X」的描述包括「X」的描述。

本文所使用的用語「約X至Y(about X-Y)」具有與「約X至約Y(about X to about Y)」相同的意義。

如本文中所使用，提及「不/非(not)」為一值或參數通常意指並描述一值或參數「以外(other than)」。例如，該方法不用於治療X類型之癌症意指該方法係用於治療X以外的類型之癌症。

如本文及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。

II.製備活化T細胞之方法

本申請案提供製備活化T細胞之方法，該等活化T細胞具有增強比例的腫瘤抗原特異性T細胞及/或減少比例的免疫抑制調節性T細胞(Treg)。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞係活化T細胞，該等活化T細胞引發對用於負載DC的腫瘤抗原肽中之一或多者的特異性反應。偵測及定量此類腫瘤抗原特異性T細胞之方法係所屬技術領域中已知的，其包括但不限於藉由以五聚體及其他多聚體(諸如dextramer)染色進行的偵測、或藉由經腫瘤抗原肽刺激後的T細胞之IFNγ生產進行的偵測。

因此，在一些實施例中，提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)在初始共培養基中將載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及c)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養 基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗CD3抗體添加至共培養物。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。

在一些實施例中，提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及c)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗CD3抗體添加至共培養物。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，樹突細胞群及T細胞群係獲自相同個體。

在一些實施例中，提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑；(c)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及d)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，TLR促效劑係選自由MPLA、Poly I：C、雷西莫特、嘎德莫特、及CL075所組成之群組。在一些實施例中，DC成熟培養基包含PGE2。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗CD3抗體添加至共培養物。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，樹突細胞群及T細胞群係獲自相同個體。

在一些實施例中，提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有 該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA；及c)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，步驟c)包含在共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，該共培養基包含介白素混合物、免疫檢查點抑制劑、及抗CD3抗體。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基進一步包含PGE2。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於共培養基中。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，樹突細胞群及T細胞群係獲自相同個體。

在一些實施例中，提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有 該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA；c)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及d)將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，在該共培養開始時，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。在一些實施例中，在該共培養開始後，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。在一些實施例中，DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基進一步包含PGE2。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，樹突細胞群及T細胞群係獲自相同個體。

在一些實施例中，提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有 該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA；c)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及d)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基進一步包含PGE2。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗CD3抗體添加至共培養物。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，樹突細胞群及T細胞群係獲自相同個體。

在一些實施例中，提供一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有 該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA、INFγ、及PGE2；c)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及抗PD-1抗體，該複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21；及d)在該共培養開始後約3至7天(例如，約5天)，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，樹突細胞群及T細胞群係獲自相同個體。

亦提供的是單離活化T細胞群及單離載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群，其係使用本文所述之任何方法製備。

樹突細胞之抗原負載

製備腫瘤抗原特異性T細胞之方法使用載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞係新鮮製備。本文所述之改良MASCT方法可包含下列步驟中之一或多者：(1)自個體獲得PBMC；(2)自PBMC獲得單核球群；(3)誘導該單核球群分化為未成熟DC；(4)使未成熟DC與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群；及(5)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含TLR促效劑(諸如MPLA)。

在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞係藉由下列製備：(a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；及(b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑。例示性TLR促效劑包括但不限於MPLA(單磷醯脂A)、Poly I：C、雷西莫特(resquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)、及CL075。可將細胞激素及其他適當分子(諸如INFγ及PGE2(前列腺素E2))進一步包括於成熟步驟中的培養基中。

在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞係藉由下列製備：(a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；及(b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA、INFγ、及PGE2。

在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞係藉由下列製備：(2)誘導單核球群分化為未成熟DC；(b)使未成熟樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；及(c)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA、INFγ、及PGE2。在一些實施例中，單核球群係獲自PBMC。

DC成熟培養基可包含合適濃度的MPLA、INFγ、及/或PGE2。在一些實施例中，DC成熟培養基以至少約0.5μg/mL的濃度包含MPLA，諸如至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更大μg/mL中任一者。在一些實施例中，DC成熟培養基以約0.5至10、1至5、5至10、或2.5至7.5μg/mL中任一者的濃度包含MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基以至少約100IU/mL的濃度包含INFγ，諸如至少約150、200、250、300、400、500、600、800、1000、或更大IU/mL中任一者。在一些實施例中，DC成熟培養基以約100至1000、100至250、250至500、500至1000、或250至750IU/mL中任一者的濃度包含INFγ。在一些實施例中，DC成熟培養基以至少約0.1μg/mL的濃度包含PGE2，諸如至少約0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、或更大μg/mL中任一者。在一些實施例中，DC成熟培養基以約0.1至0.5、0.1至0.3、0.25至0.5、或0.2至0.4μg/mL中任一者的濃度包含PGE2。

可藉由TLR促效劑誘導載有複數種腫瘤抗原肽之未成熟樹突細胞成熟至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20天 中任一者。在一些實施例中，誘導載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞成熟約8天。

在一些實施例中，抗原負載樹突細胞係呈現該複數種腫瘤抗原肽中之一或多種腫瘤抗原肽的成熟樹突細胞。由本文所述之任何方法製備的成熟樹突細胞可呈現至少約1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、或更多種中任一者的腫瘤抗原肽。相較於純真(naïve)樹突細胞、或尚未載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞，多抗原負載樹突細胞可具有增強的至少約1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、或更多種中任一者的腫瘤抗原肽之呈現水平。在一些實施例中，成熟樹突細胞具有增強的多於10種腫瘤抗原肽之呈現水平。在一些實施例中，成熟樹突細胞具有增強的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多種中任一者的腫瘤抗原肽的呈現水平，該腫瘤抗原肽係衍生自選自由下列所組成之群組的蛋白質：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。

在一些實施例中，藉由將複數種腫瘤抗原肽脈衝至樹突細胞群中，製備抗原負載樹突細胞，該等樹突細胞諸如未成熟樹突細胞、或含在或衍生(諸如分化)自PBMC的樹突細胞。如所屬技術領域中已知的，脈衝(pulsing)係指將細胞(諸如樹突細胞)與含有抗原肽的溶液混合、及可選地隨後自混合物移除抗原肽的程序。可使樹突 細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸數秒、數分鐘、數幾小時，諸如約下列中之至少任一者：30秒、1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、5小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、一週、10天、或更長。用於接觸步驟中之各腫瘤抗原肽的濃度可係至少約0.1、0.5、1、2、3、5、或10μg/mL中任一者。在一些實施例中，腫瘤抗原肽的濃度係約0.1至200μg/mL，包括例如約0.1至0.5、0.5至1、1至10、10至50、50至100、100至150、或150至200μg/mL中任一者。

在一些實施例中，樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽係在組成物存在下接觸，該組成物促進樹突細胞攝取複數種腫瘤抗原肽。在一些實施例中，化合物、材料、或組成物可包括於複數種腫瘤抗原肽的溶液中，以促進樹突細胞攝取肽。促進樹突細胞攝取複數種腫瘤抗原肽的化合物、材料、或組成物包括但不限於脂質分子及具有多個帶正電胺基酸的肽。在一些實施例中，樹突細胞群攝取多於約50%、60%、70%、80%、90%、或95%中任一者的腫瘤抗原肽。在一些實施例中，群中多於約50%、60%、70%、80%、90%、或95%中任一者的樹突細胞攝取至少一種腫瘤抗原肽。

樹突細胞(諸如未成熟樹突細胞)可獲自各種來源，包括自體來源，即來自接受治療的個體。方便的樹突細胞來源係來自周邊血液的PBMC。例如，單核球(一種白血球)係大量存在於PBMC中，其構成約5至30%的總PBMC。可使用細胞激素誘導單核球分化 為樹突細胞，諸如未成熟樹突細胞。在一些實施例中，未成熟樹突細胞係藉由下列製備：獲得PBMC群；自PBMC群獲得單核球群；及使單核球群與複數種細胞激素接觸，以獲得未成熟樹突細胞群。可用於誘導單核球分化的例示性細胞激素包括但不限於GM-CSF及IL-4，其中誘導係在所屬技術領域中已知的條件(諸如濃度、溫度、CO₂水平等)下進行。

PBMC的黏附部分含有PBMC中大多數的單核球。在一些實施例中，使來自PBMC黏附部分的單核球與細胞激素接觸，以獲得未成熟樹突細胞群。可藉由將周邊血液樣本離心、或使用血球分離(apheresis)方法自個體收集，方便地獲得PBMC。在一些實施例中，藉由人類周邊血液樣本的密度梯度離心來獲得PBMC群。在一些實施例中，樣本係來自接受下列者的個體：多抗原負載樹突細胞、活化T細胞、或其他使用多抗原負載樹突細胞製備的免疫治療組成物。

本申請案進一步提供的是一種單離樹突細胞群，其係藉由本文所述方法之任何實施例製備。在一些實施例中，單離樹突細胞群能夠在體內或離體引發MHC限制性T細胞反應。在一些實施例中，MHC限制性T細胞反應係由MHC I類及MHC II類分子媒介。在一些實施例中，單離樹突細胞群能夠誘導腫瘤抗原特異性T細胞分化及增生。

活化T細胞之製備

本文所述之用於製備活化T細胞之方法包含將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群與T細胞群係在共培養基中共培養，該共培養基包含複數種細胞激素、免疫檢查點抑制劑、及抗CD3抗體。在一些實施例中，活化T細胞係藉由下列製備：(a)在初始共培養基中將載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及(b)將抗CD3抗體添加至共培養物。

在一些實施例中，共培養基(包括初始共培養基)包含複數種細胞激素(在本文中亦稱為「細胞激素混合物」)。例示性細胞激素包括但不限於IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、及類似者。在一些實施例中，共培養基(包括初始共培養基)包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，細胞激素混合物中的各細胞激素係以至少約0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、或更高ng/mL中任一者的濃度存在。在一些實施例中，細胞激素混合物中的各細胞激素係以約0.1至1、1至5、5至10、10至20、20至30、1至30、1至10、30至50、或1至50ng/mL中任一者的濃度存在。在一些實施例中，IL-2係以至少約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000IU/ml中任一者存在於共培養基(包括初始共培養基)中。在一些實施例中，IL-2係以約100至500、500至1000、1000至1500、1500至2000、100至2000、500至1500、100至1000、或1000至2000IU/ml中任一者的濃度存在。細胞激素 可促進T細胞的活化、成熟、及/或增生，以為T細胞稍後分化為效應T細胞及記憶T細胞作準備，且/或抑制共培養物中活化T細胞群的T_REG百分比。

在一些實施例中，共培養基(包含初始共培養基)包含一或多種(諸如1、2、3、或更多種中任一者)免疫檢查點抑制劑。可使用任何已知的免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抑制性免疫檢查點分子的天然或經工程改造之配體，其包括例如CTLA-4的配體(例如，B7.1、B7.2)、TIM-3的配體(例如，半乳糖凝集素-9)、A2a受體的配體(例如，腺苷、瑞加德松(Regadenoson))、LAG-3的配體(例如，MHC I類或MHC II類分子)、BTLA的配體(例如，HVEM、B7-H4)、KIR的配體(例如，MHC I類或MHC II類分子)、PD-1的配體(例如，PD-L1、PD-L2)、IDO的配體(例如，NKTR-218、因多莫得(Indoximod)、NLG919)、及CD47的配體(例如，SIRPα受體)。

免疫檢查點抑制劑可屬於任何合適的分子型態，包括但不限於小分子、核酸(諸如DNA、RNAi、或適體)、肽、或蛋白質(諸如抗體)。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係靶向抑制性免疫檢查點蛋白的抗體(諸如拮抗劑抗體)，其係選自由下列所組成之群組：抗CTLA-4(例如，伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、KAHR-102)、抗TIM-3(例如，F38-2E2、ENUM005)、抗LAG-3(例如，BMS-986016、IMP701、IMP321、 C9B7W)、抗KIR(例如，利利單抗(lirilumab)及IPH2101)、抗PD-1(例如，尼沃魯單抗(nivolumab)、匹利珠單抗(pidilizumab)、派姆單抗(pembrolizuma)、BMS-936559、阿替珠單抗(atezolizumab)、派姆單抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042)、抗PD-L1(例如，KY-1003(EP20120194977)、MCLA-145、RG7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB0010718C、AUR-012、STI-A1010、PCT/US2001/020964、MPDL3280A、AMP-224、聚乙二醇化達匹珠單抗(dapirolizumab pegol)(CDP-7657)、MEDI-4920)、抗CD73(例如，AR-42(OSU-HDAC42,HDAC-42,AR42,AR 42,OSU-HDAC 42,OSU-HDAC-42,NSC D736012,HDAC-42,HDAC 42,HDAC42,NSCD736012,NSC-D736012)、MEDI-9447)、抗B7-H3(例如，MGA271、DS-5573a、8H9)、抗CD47(例如，CC-90002、TTI-621、VLST-007)、抗BTLA、抗VISTA、抗A2aR、抗B7-1、抗B7-H4、抗CD52(諸如阿侖單抗(alemtuzumab))、抗IL-10、抗IL-35、及抗TGF-β(諸如夫蘇木單抗(fresolumimab))。在一些實施例中，抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗體係全長抗體。在一些實施例中，抗體係選自由下列所組成之群組的抗原結合片段：Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、BiTE、奈米抗體(nanobody)、及全長抗體之其他抗原結合子序列或其經工程改造之組合。在一些實施例中，抗體係人類抗體、人源化抗體、或嵌合抗體。在一些實施例中，抗體係雙特異性抗體或多特異性抗體。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係PD-1的抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。例示性抗PD-1抗體包括但不限於尼沃魯單抗、派姆單抗、匹利珠單抗、BMS-936559、及阿替珠單抗、派姆單抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、及TSR-042。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係尼沃魯單抗(例如OPDIVO^®)。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係派姆單抗(例如，KEYTRUDA^®)。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係SHR-1210。在一些實施例中，初始共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體(例如，SHR-1210)。

在共培養基(包括初始共培養基)中之免疫檢查點抑制劑(例如抗PD-1抗體)的合適濃度包括但不限於至少約1、2、5、10、15、20、25、或更大μg/mL中任一者。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)係以約1μg/mL至約10μg/mL、約10μg/mL至約20μg/mL、約1μg/mL至約25μg/mL、或約5μg/mL至約20μg/mL中任一者存在於共培養基(包括初始共培養基)中。

抗CD3抗體可在共培養開始時存在於共培養物中，或者在抗原負載樹突細胞與T細胞的共培養開始之後被添加至共培養物。在一些實施例中，抗CD3抗體係包括於共培養基(包括初始共培養基)中。在一些實施例中，初始共培養基不包含抗CD3抗體。在一些實施例中，在共培養開始後約1、2、3、4、5、6、7、或更多天中任一者，將抗CD3抗體添加至共培養物。在一些實施例中，在共培養開始後約1至7、1至3、3至5、5至7、或3至7天中任一者，將抗CD3抗體 添加至共培養物。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗CD3抗體添加至共培養物。可使用任何合適的抗CD3抗體，包括但不限於OKT3。

在一些實施例中，T細胞群及樹突細胞群係衍生自相同個體，諸如患有癌症(例如，低至中等級癌症)的個體。在一些實施例中，T細胞群、樹突細胞群、或兩者係衍生自自體來源，即衍生自接受活化T細胞、多抗原負載樹突細胞、或兩者的個體。

在一些實施例中，將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養至少約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、或30天中任一者。在一些實施例中，將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養約7天至約21天，諸如約7至14、14至21、12至18、10至16、10、14、16、18、或21天中任一者。在一些實施例中，將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養約10天。在一些實施例中，將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養約14天。

在一些實施例中，將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群在抗CD3抗體存在下共培養至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、或更多天中任一者。在一些實施例中，將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群在抗CD3抗體存在下共培養約1至20、5至15、1至10、或10至20天中任一者。

用於本文所述方法之任何實施例中的T細胞群可衍生自各種來源。方便的T細胞來源係來自人類周邊血液的PBMC。T細胞 群可自PBMC單離，或者替代地，富含T細胞的PBMC群(諸如藉由添加T細胞特異性抗體及細胞激素)可用於共培養物中。在一些實施例中，藉由周邊血液樣本的密度梯度離心來獲得PBMC。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，PBMC係用於共培養中。

本申請案進一步提供的是一種單離活化T細胞群，其係藉由本文所述方法之任何實施例製備。本文亦提供的是一種有用於治療個體中癌症之共培養物，其包含T細胞群及載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群。在一些實施例中，T細胞群及載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群係衍生自相同個體，諸如正接受治療之個體。

本節所述之單離活化T細胞群及共培養物可用於治療癌症，諸如實體癌症。包含單離活化T細胞群或共培養物之免疫治療組成物有用於治療癌症、預防腫瘤進展或轉移、或降低癌症免疫逃脫，且係提供於本文中。單離活化T細胞群及共培養物亦可用於製造用於治療癌症、預防腫瘤進展或轉移、或降低癌症免疫逃脫之藥劑。

所意欲的是，可將本文所述之用於製備載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群或用於製備活化T細胞群之任何步驟及參數與本文所述之用於改良MASCT方法之任何步驟及參數組合，猶如每一個組合經個別描述。

複數種腫瘤抗原肽

本文所述之方法使用複數種腫瘤抗原肽以製備樹突細胞及活化T細胞(可離體及在體內觸發特異性T細胞反應)。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係複數種合成腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽不是獲自細胞樣本(諸如裂解細胞組成物)。

在一些實施例中，各腫瘤抗原肽包含至少約1、2、3、4、5、或10種中任一者的表位，該表位係來自單一蛋白質抗原(包括新抗原)。在一些實施例中，在複數種腫瘤抗原肽中的各腫瘤抗原肽包含至少一種可由T細胞受體辨識的表位。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少一種包含來自單一蛋白質抗原之至少2個表位的腫瘤抗原肽。腫瘤抗原肽可係來自含有一或多個表位之蛋白質抗原的自然衍生肽片段、或具有一或多個天然表位序列之人工設計肽，其中連接肽可選地可置於相鄰表位序列之間。在一些較佳實施例中，含在相同腫瘤抗原肽中的表位係衍生自相同的蛋白質抗原。

腫瘤抗原肽可含有至少一種MHC-I表位、至少一種MHC-II表位、或(多種)MHC-I表位及(多種)MHC-II表位兩者。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少一種包含MHC-I表位之肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少一種包含MHC-II表位之肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽中的至少一種腫瘤抗原肽包含MHC-I表位及MHC-II表位兩者。

可將特殊設計策略應用於腫瘤抗原肽(包括新抗原肽)之序列，以最佳化對載有腫瘤抗原肽之樹突細胞的免疫反應。一般而言，較確切表位肽為長的肽可增加肽至樹突細胞中的攝取。在一些實 施例中，根據具有表位的蛋白質之天然序列，將MHC-I或MHC-II表位序列在N端或C端或兩端延伸，以獲得延伸序列，其中該延伸序列係適於由I類及II類兩者HLA分子呈現、及由不同個體中不同亞型之HLA分子呈現。在一些實施例中，將表位序列在一端或兩端延伸至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20個中任一者的胺基酸殘基，以產生延伸表位。在一些實施例中，包含MHC-I或MHC-II表位的肽進一步包含在N端、C端、或兩端之側接表位的額外胺基酸。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽中的各腫瘤抗原肽係至少約7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100個中任一者的胺基酸長。複數種腫瘤抗原肽中的不同腫瘤抗原肽可具有相同長度或不同長度。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係各自約20至40個胺基酸長。

在一些實施例中，本申請案中用於設計腫瘤抗原肽的一或多個表位肽之胺基酸序列係基於所屬技術領域中已知的序列或可得自公共資料庫的序列，公共資料庫諸如Peptide Database(Vigneron N.et al.Cancer Immunity,13：15(2013))。

在一些實施例中，使用用於T細胞表位預測的生物資訊工具，基於抗原蛋白的序列，預測一或多個表位肽的胺基酸序列。用於T細胞表位預測的例示性生物資訊工具係所屬技術領域中已知的，例如參見Yang X.及Yu X.(2009)的「An introduction to epitope prediction methods and software」Rev.Med.Virol.19(2)：77-96。在一些實施例中，抗原蛋白之序列為所屬技術領域中已知的或可得自公共 資料庫。在一些實施例中，藉由對正接受治療之個體的樣本(諸如腫瘤樣本)進行定序，判定抗原蛋白的序列。

本申請案設想到衍生自所屬技術領域中已知的任何腫瘤抗原及表位(包括新抗原及新表位(neoepitope))之腫瘤抗原肽、或由發明人使用生物資訊工具特別開發或預測之腫瘤抗原肽。

在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含第一核心組之一般腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽進一步包含第二組之癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種新抗原肽。在一些實施例中，新抗原肽係癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由第一核心組之一般腫瘤抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由第一核心組之一般腫瘤抗原肽、及第二組之癌症類型特異性抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由新抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含第一核心組之一般腫瘤抗原肽、及一或多種新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由第一核心組之一般腫瘤抗原肽、第二組之癌症類型特異性抗原肽、及一或多種新抗原肽組成。

第一核心組之一般腫瘤抗原肽係衍生自常由各種不同類型癌症過度表現的腫瘤抗原。因此，第一核心組之一般腫瘤抗原肽係有用於製備樹突細胞及/或活化T細胞，以用於治療患有不同癌症類型的個體。例如，在一些實施例中，第一核心組之一般腫瘤抗原肽係有用於本文所述之用於治療各種癌症之方法，該等癌症諸如肺癌、結腸 癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰臟癌、卵巢癌、乳癌、神經膠質瘤、食道癌、鼻咽癌、子宮頸癌、腎癌、或肝細胞癌。第一核心組之例示性腫瘤抗原肽包括但不限於衍生自下列之肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、MMP7、VEGFR(諸如VEGFR1及VEGFR2)、及CDCA1。第一核心組可包含衍生自至少約1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多種中任一者的腫瘤抗原之肽。第一核心組可包含至少約1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多種中任一者的一般腫瘤抗原肽。在一些實施例中，第一核心組包含多於一種一般腫瘤抗原肽。在一些實施例中，第一核心組包含約10至約20種一般腫瘤抗原肽。

第二組之癌症類型特異性抗原肽係衍生自僅在一種或有限數目的癌症類型中過度表現的腫瘤抗原。因此，第二組之癌症類型特異性抗原肽係有用於製備樹突細胞及/或活化T細胞，以用於治療患有特定癌症類型的個體。用於治療肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)之例示性癌症類型特異性抗原肽包括但不限於衍生自SSX、AFP、及GPC3之肽。在一些實施例中，一或多種癌症特異性抗原肽係衍生自病毒的病毒特異性抗原肽，該病毒可誘導癌症，或者在感染個體時涉及個體內之癌症發展。在一些實施例中，病毒特異性抗原肽對感染個體的病毒亞型具特異性。用於治療合併HBV感染的HCC患者之例示性病毒特異性抗原肽包括但不限於衍生自HBV核心抗原(HBcAg)、及HBV DNA聚合酶之肽。在一些實施例中，第二組包含衍生自HBV 抗原之病毒特異性抗原肽，其中該方法係用以治療個體中的肝細胞癌。在一些實施例中，第二組包含衍生自HPV抗原之病毒特異性抗原肽，其中該方法係用以治療個體中的子宮頸癌。在一些實施例中，第二組包含衍生自EBV抗原之病毒特異性抗原肽，其中該方法係用以治療個體中的鼻咽癌。第二組之癌症類型特異性抗原肽可包含衍生自至少約1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多種中任一者的癌症類型特異性抗原之肽。第二組癌症類型特異性抗原肽可包含至少約1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多種中任一者的癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，第二組包含多於一種癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，第二組包含約1至約10種癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，癌症類型特異性抗原肽所靶向的癌症類型係選自基本上由下列所組成之群組：肝細胞癌、子宮頸癌、鼻咽癌、子宮內膜癌、結腸直腸癌、乳癌、及淋巴瘤。

在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種(諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多種中任一者)新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由新抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含新抗原肽，且未包含一般腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種一般腫瘤抗原肽、及一或多種新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種一般腫瘤抗原肽、一或多種癌症類型特異性抗原肽、及一或多種新抗原肽。新抗原肽係衍生自新抗原。新抗原係存在於個體(諸如正接受癌症治療之個體)之腫瘤細胞中的最新取得並表現的抗原。在一 些實施例中，新抗原係衍生自突變蛋白質抗原，該等突變蛋白質抗原僅存在於癌細胞中但不存在於正常細胞中。新抗原可獨特地存在於經癌症治療的個體之腫瘤細胞(諸如所有腫瘤細胞或部分腫瘤細胞)中，或者在患有類似的癌症類型之個體接受治療時存在於該個體中。在一些實施例中，新抗原係殖株性(clonal)新抗原。在一些實施例中，新抗原係次殖株性(subclonal)新抗原。在一些實施例中，新抗原存在於個體中至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多中任一者的腫瘤細胞中。在一些實施例中，新抗原肽包含MHC-I限制性新表位。在一些實施例中，新抗原肽包含MHC-II限制性新表位。在一些實施例中，新抗原肽經設計以促進I類及II類兩者MHC分子呈現新表位，例如藉由在N端及C端兩者延伸新表位。例示性新抗原肽包括但不限於衍生自下列之新表位：突變體KRAS(例如，KRAS^G12A)、PARP4(例如，PARP4^T1170I)、MLL3(例如，MLL3^C988F)、及MTHFR(例如，MTHFR^A222V)。

可基於正接受治療之個體之一或多個腫瘤部位的基因輪廓(genetic profile)選擇新抗原肽，且新抗原在正常組織中不會表現。在一些實施例中，腫瘤樣本的基因輪廓包含全長基因組的序列資訊。在一些實施例中，腫瘤樣本的基因輪廓包含外顯子的序列資訊。在一些實施例中，腫瘤樣本的基因輪廓包含癌症相關基因的序列資訊。

適用於本申請案的的新抗原肽可衍生自腫瘤細胞中的任何突變蛋白，諸如由突變癌症相關基因編碼的突變蛋白。在一些實施例中，新抗原肽包含衍生自癌症相關基因的單一新表位。在一些實施 例中，新抗原肽包含衍生自癌症相關基因的多於一種(諸如2、3、或更多種)新表位。在一些實施例中，新抗原肽包含衍生自多於一種(諸如2、3、或更多種)癌症相關基因的多於一種(諸如2、3、或更多種)新表位。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原包含衍生自單一癌症相關基因的複數種新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原包含衍生自多於一種(諸如2、3、4、5、或更多種中任一者)癌症相關基因的複數種新抗原肽。

癌症相關基因係過度表現於癌細胞中的基因，但該等基因係以低水平表現於正常細胞中。例示性癌症相關基因包括但不限於ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、ALOX12B、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AURKA、AURKB、AXL、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L1、BCL2L12、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BUB1B、CADM2、CARD11、CBL、CBLB、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD58、CD79B、CDC73、CDH1、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK9、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHEK2、CIITA、CREBBP、CRKL、CRLF2、CRTC1、CRTC2、CSF1R、CSF3R、CTNNB1、CUX1、CYLD、DDB2、DDR2、DEPDC5、DICER1、DIS3、DMD、DNMT3A、EED、EGFR、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ESR1、ETV1、ETV4、 ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FAS、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FKBP9、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FUS、GATA3、GATA4、GATA6、GLI1、GLI2、GLI3、GNA11、GNAQ、GNAS、GNB2L1、GPC3、GSTM5、H3F3A、HNF1A、HRAS、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IKZF3、INSIG1、JAK2、JAK3、KCNIP1、KDM5C、KDM6A、KDM6B、KDR、KEAP1、KIT、KRAS、LINC00894、LMO1、LMO2、LMO3、MAP2K1、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MCL1、MDM2、MDM4、MECOM、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MLL(KMT2A)、MLL2(KTM2D)、MPL、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYB、MYBL1、MYC、MYCL1(MYCL)、MYCN、MYD88、NBN、NEGR1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFKBIZ、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NPRL2、NPRL3、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PARK2、PAX5、PBRM1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PHF6、PHOX2B、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PMS1、PMS2、PNRC1、PRAME、PRDM1、PRF1、PRKAR1A、PRKCI、PRKCZ、PRKDC、PRPF40B、PRPF8、PSMD13、PTCH1、PTEN、PTK2、PTPN11、PTPRD、QKI、RAD21、RAF1、RARA、RB1、RBL2、RECQL4、REL、RET、RFWD2、RHEB、RHPN2、ROS1、RPL26、RUNX1、SBDS、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SETBP1、 SETD2、SF1、SF3B1、SH2B3、SLITRK6、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMC1A、SMC3、SMO、SOCS1、SOX2、SOX9、SQSTM1、SRC、SRSF2、STAG1、STAG2、STAT3、STAT6、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TCF3、TCF7L1、TCF7L2、TERC、TERT、TET2、TLR4、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VHL、WRN、WT1、XPA、XPC、XPO1、ZNF217、ZNF708、及ZRSR2。

在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少一種(諸如至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多種中任一者)腫瘤抗原肽，其各包含由癌症相關基因編碼的一或多個表位，該癌症相關基因係選自由下列所組成之群組：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少10種腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含衍生自下列的腫瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、及CDCA1。

在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽存在於組成物中，該組成物具有至少約95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、或更高百分比中任一者的腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽 的純度係至少約98%。在一些實施例中，為了將腫瘤抗原肽脈衝至樹突細胞中，複數種腫瘤抗原肽於培養基中的溶解度係至少約80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.9%、或更高中任一者。在一些實施例中，為了將腫瘤抗原肽脈衝至樹突細胞中，複數種腫瘤抗原肽係約100%可溶於培養基中。

III.治療方法

本申請案提供治療個體中癌症之基於細胞的免疫治療方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係使用第II節所述之方法中任一者製備。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。

在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症(例如，實體癌症)之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由下列製備：(a)在初始共培養基中將載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及b)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗 CD3抗體添加至共培養物。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，該樹突細胞群及該T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，投予載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞至少三次。在一些實施例中，載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含衍生自下列的腫瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、及CDCA1。在一些實施例中，該癌症係選自由下列所組成之群組的實體癌症：肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、及肺癌。

在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症(例如，實體癌症)之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由下列製備：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA；及c)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，步驟c) 包含在共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，該共培養基包含介白素混合物、免疫檢查點抑制劑、及抗CD3抗體。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基進一步包含PGE2。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於共培養基中。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，樹突細胞群及T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，投予載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞至少三次。在一些實施例中，載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。在一些實施例中，複數種腫瘤抗 原肽包含衍生自下列的腫瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、及CDCA1。在一些實施例中，該癌症係選自由下列所組成之群組的實體癌症：肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、及肺癌。

在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症(例如，實體癌症)之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由下列製備：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及c)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，步驟(a)進一步包含在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑。在一些實施例中，TLR促效劑係選自由MPLA、Poly I：C、雷西莫特、嘎德莫特、及CL075所組成之群組。在一些實施例中，DC成熟培養基包含PGE2。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗CD3抗體添加至 共培養物。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，該樹突細胞群及該T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，投予載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞至少三次。在一些實施例中，載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含衍生自下列的腫瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、及CDCA1。在一些實施例中，該癌症係選自由下列所組成之群組的實體癌症：肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、及肺癌。

在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症(例如，實體癌症)之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由下列製備：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA；c)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及d)將抗CD3抗體添加至 該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，在該共培養開始時，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。在一些實施例中，在該共培養開始後，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。在一些實施例中，DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基進一步包含PGE2。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，該樹突細胞群及該T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，投予載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞至少三次。在一些實施例中，載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含衍生自下列的腫瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、 MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、及CDCA1。在一些實施例中，該癌症係選自由下列所組成之群組的實體癌症：肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、及肺癌。

在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症(例如，實體癌症)之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由下列製備：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA；c)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及d)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基進一步包含PGE2。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共 培養基中。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗CD3抗體添加至共培養物。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，該樹突細胞群及該T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，投予載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞至少三次。在一些實施例中，載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含衍生自下列的腫瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、及CDCA1。在一些實施例中，該癌症係選自由下列所組成之群組的實體癌症：肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、及肺癌。

在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症(例如，實體癌症)之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由下列製備：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA、INFγ、及PGE2；c)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物， 該初始共培養基包含複數種細胞激素及抗PD-1抗體，該複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21；及d)在該共培養開始後約3至7天(例如，約5天)，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，該樹突細胞群及該T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，投予載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞至少三次。在一些實施例中，載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含衍生自下列的腫瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、及CDCA1。在一些實施例中，該癌症係選自由下列所組成之群組的實 體癌症：肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、及肺癌。

除了(多個)投予步驟之外，改良MASCT方法之一些實施例進一步包含下列細胞製備步驟中之一或多者：1)自該個體獲得PBMC；2)自該等PBMC獲得DC群(例如，藉由誘導來自該等PBMC之單核球群分化)；3)自該等PBMC獲得T細胞群；4)製備載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；5)在DC成熟培養基中誘導載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群成熟；6)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養(包括例如在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養；及將抗CD3抗體添加至該共培養物)；及8)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。

因此，在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症(例如，實體癌症)之方法，其包含：(a)自該個體獲得PBMC群；(b)自該PBMC群獲得樹突細胞群；(c)使該樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；(d)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA、INFγ、及PGE2；(e)可選地向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞；(f)自該等PBMC獲得T細胞群；(g)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及抗PD-1抗體，該複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL- 15、及IL-21；(h)在該共培養開始後約3至7天(例如，約5天)，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得活化T細胞群；及(i)向該個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，投予載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞至少三次。在一些實施例中，載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含衍生自下列的腫瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、及CDCA1。在一些實施例中，該癌症係選自由下列所組成之群組的實體癌症：肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、及肺癌。

本文所述方法適用於治療各種癌症，包括液體及實體癌症。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：肝細胞癌、子宮頸癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、肺癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、 淋巴瘤、腎癌、乳癌、胰臟癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、及腦癌。該等方法適用於所有期別的癌症，包括早期、晚期、及轉移性癌症。

在一些實施例中，該方法降低與癌症相關聯的一或多種症狀之嚴重性，其差異係至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%中任一者，此係相較於相同個體在治療前的對應症狀，或相較於未接受該治療方法的其他個體之對應症狀。在一些實施例中，該方法延遲癌症的進展。

在一些實施例中，該方法係用於治療肝細胞癌(HCC)。在一些實施例中，HCC係早期HCC、非轉移性HCC、原發性HCC、晚期HCC、局部晚期HCC、轉移性HCC、緩解中HCC、或復發性HCC。在一些實施例中，HCC係局部可切除的(即，侷限於肝臟之一部分而允許完全手術切除的腫瘤)、局部無法切除的(即，因為涉及至關重要的血管結構，或者因為肝臟受損，局部腫瘤可能無法切除)、或無法切除的(即，腫瘤涉及所有肝葉，且/或已擴散而涉及其他器官(例如肺部、淋巴結、骨骼))。在一些實施例中，根據TNM分類，HCC係第I期腫瘤(單個腫瘤無血管侵犯)、第II期腫瘤(單個腫瘤有血管侵犯，或多個腫瘤皆未大於5cm)、第III期腫瘤(多個腫瘤且任一個大於5cm，或腫瘤涉及門靜脈或肝靜脈之主要分支)、第IV期腫瘤(腫瘤直接侵犯膽囊以外的鄰近器官，或具有內臟腹膜穿孔)、N1腫瘤(區域淋巴結轉移)、或M1腫瘤(遠處轉移)。在一些實施例中，根據AJCC(美國癌症聯合委員會(American Joint Commission on Cancer))分期標準，HCC為T1、T2、T3、或T4期HCC。在一些實施例中，HCC係肝細胞癌、HCC之纖維板層變體、混合型肝細胞膽管癌(mixed hepatocellularcholangiocarcinoma)中任一者。在一些實施例中，HCC係由B型肝炎病毒(HBV)感染引起。

在一些實施例中，該方法係用於治療肺癌。在一些實施例中，肺癌係非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NCSLC的實例包括但不限於大細胞癌(例如，大細胞神經內分泌癌、複合型大細胞神經內分泌癌、基底細胞樣癌、淋巴上皮瘤樣癌、透明細胞癌、及具類橫紋肌表型之大細胞癌)、腺癌(例如，腺泡、乳突(例如，細支氣管肺泡癌，非黏液性、黏液性、混合型黏液性及非黏液性、及未定型細胞類型)、實體腺癌(具黏液素)、具混合亞型之腺癌、分化良好的胎兒型腺癌、黏液性(膠狀)腺癌、黏液性囊腺癌、印環狀腺癌、及透明細胞腺癌)、神經內分泌肺部腫瘤、及鱗狀細胞癌(例如，乳突、透明細胞、小細胞、及基底細胞樣)。在一些實施例中，根據TNM分類，NSCLC可為T期腫瘤(原發性腫瘤)、N期腫瘤(區域淋巴結)、或M期腫瘤(遠處轉移)。

在一些實施例中，肺癌係類癌(典型或非典型)、腺鱗狀細胞癌、圓柱瘤、或唾液腺之癌(例如，腺樣囊狀癌或黏液類上皮癌)。在一些實施例中，肺癌係具有多形性、肉瘤狀、或肉瘤部分的癌(例如，具有梭狀細胞及/或巨細胞之癌、梭狀細胞癌、巨細胞癌、癌肉瘤、或肺母細胞瘤)。在一些實施例中，肺癌係小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC；亦稱為燕麥細胞癌)。小細胞肺癌可係局限期、 擴散期、或復發性小細胞肺癌。在一些實施例中，個體可係符合以下條件的人類：具有懷疑或顯示與肺癌相關聯的基因、基因突變、或多型性(例如，SASH1、LATS1、IGF2R、PARK2、KRAS、PTEN、Kras2、Krag、Pas1、ERCC1、XPD、IL8RA、EGFR、α₁-AD、EPHX、MMP1、MMP2、MMP3、MMP12、IL1β、RAS、及/或AKT)，或者具有一或多個額外拷貝的與肺癌相關聯的基因。

在一些實施例中，該方法係用於治療子宮頸癌。在一些實施例中，子宮頸癌係早期子宮頸癌、非轉移性子宮頸癌、局部晚期子宮頸癌、轉移性子宮頸癌、緩解中子宮頸癌、無法切除的子宮頸癌、於輔助性治療中的子宮頸癌、或於新輔助性治療中的子宮頸癌。在一些實施例中，子宮頸癌係由人類乳突病毒(HPV)感染引起。在一些實施例中，根據TNM分類，子宮頸癌可為T期腫瘤(原發性腫瘤)、N期腫瘤(區域淋巴結)、或M期腫瘤(遠處轉移)。在一些實施例中，子宮頸癌係下列中任一者：第0期、第I期(Tis、N0、M0)、第IA期(T1a、N0、M0)、第IB期(T1b、N0、M0)、第IIA期(T2a、N0、M0)、第IIB期(T2b、N0、M0)、第IIIA期(T3a、N0、M0)、第IIIB期(T3b、N0、M0，或T1至T3、N1、M0)、第IVA期(T4、N0、M0)、或第IVB期(T1至T3、N0至N1、M1)子宮頸癌。在一些實施例中，子宮頸癌係子宮頸鱗狀細胞癌、子宮頸腺癌、或腺鱗狀細胞癌。

在一些實施例中，該方法係用於治療乳癌。在一些實施例中，乳癌係早期乳癌、非轉移性乳癌、局部晚期乳癌、轉移性乳癌、 激素受體陽性轉移性乳癌、緩解中乳癌、於輔助性治療中的乳癌、乳管原位癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)、侵襲性乳管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)、或於新輔助性治療中的乳癌。在一些實施例中，乳癌係激素受體陽性轉移性乳癌。在一些實施例中，乳癌(其可係HER2陽性或HER2陰性)係晚期乳癌。在一些實施例中，乳癌係乳管原位癌。在一些實施例中，個體可係符合以下條件的人類：具有與乳癌相關聯的基因、基因突變、或多型性(例如，BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、RAD51、AR、DIRAS3、ERBB2、TP53、AKT、PTEN、及/或PI3K)，或者具有一或多個額外拷貝的與乳癌相關聯的基因(例如，一或多個額外拷貝的HER2基因)。

在一些實施例中，該方法係用於治療胰臟癌。在一些實施例中，胰臟癌包括但不限於漿液性微囊性腺瘤、胰管內乳突狀黏液性腫瘤、黏液性囊性腫瘤、實體偽乳突狀腫瘤、胰臟腺癌、胰管腺癌、或胰母細胞瘤。在一些實施例中，胰臟癌係早期胰臟癌、非轉移性胰臟癌、原發性胰臟癌、經切除的胰臟癌、晚期胰臟癌、局部晚期胰臟癌、轉移性胰臟癌、無法切除的胰臟癌、緩解中胰臟癌、復發性胰臟癌、於輔助性治療中的胰臟癌、或於新輔助性治療中的胰臟癌中任一者。

在一些實施例中，該方法係用於治療卵巢癌。在一些實施例中，卵巢癌係卵巢上皮細胞癌。例示性卵巢上皮細胞癌組織學分類包括：漿液性囊瘤(例如，漿液性良性囊腺瘤、具上皮細胞增生活性及核異常但無浸潤性破壞性生長之漿液性囊腺瘤、或漿液性囊腺癌)、 黏液性囊瘤(例如，黏液性良性囊腺瘤、具上皮細胞增生活性及核異常但無浸潤性破壞性生長之黏液性囊腺瘤、或黏液性囊腺癌)、子宮內膜樣腫瘤(例如，子宮內膜樣良性囊腫、具上皮細胞增生活性及核異常但無浸潤性破壞性生長之子宮內膜樣腫瘤、或子宮內膜樣腺癌)、透明細胞(中腎樣)腫瘤(例如，良性透明細胞腫瘤、具上皮細胞增生活性及核異常但無浸潤性破壞性生長之透明細胞腫瘤、或透明細胞囊腺癌)、無法指派至上述群組中之一者的未分類腫瘤、或其他惡性腫瘤。在各種實施例中，卵巢上皮細胞癌係第I期(例如，第IA、IB、或IC期)、第II期(例如，第IIA、IIB、或IIC期)、第III期(例如，第IIIA、IIIB、或IIIC期)、或第IV期。在一些實施例中，個體可係符合以下條件的人類：具有與卵巢癌相關聯的基因、基因突變、或多型性(例如，BRCA1或BRCA2)，或者具有一或多個額外拷貝的與卵巢癌相關聯的基因(例如，一或多個額外拷貝的HER2基因)。在一些實施例中，卵巢癌係卵巢生殖細胞腫瘤。例示性組織學亞型包括：惡性胚胎瘤或其他生殖細胞腫瘤(例如，內胚竇瘤(諸如肝樣或腸腫瘤)、胚胎性癌、多胚瘤、絨毛膜癌、畸胎瘤、或混合型腫瘤)。例示性畸胎瘤係未成熟畸胎瘤、成熟畸胎瘤、實體畸胎瘤、及囊性畸胎瘤(例如，皮樣囊腫，諸如成熟囊性畸胎瘤、及具惡性轉化之皮樣囊腫)。一些畸胎瘤係單胚層且高度特異性的，諸如甲狀腺腫樣卵巢瘤、類癌、甲狀腺腫樣卵巢瘤和類癌、或其他者(例如，惡性神經外胚層及室管膜瘤)。在一些實施例中，卵巢生殖細胞腫瘤係第I期(例如，第IA、IB、或 IC期)、第II期(例如，第IIA、IIB、或IIC期)、第III期(例如，第IIIA、IIIB、或IIIC期)、或第IV期。

在一些實施例中，本文所述之改良MASCT不適用於患有T細胞來源的癌症(諸如T細胞淋巴瘤)的患者。

數種病毒與人類的癌症有關。例如，B型肝炎病毒(HBV)可能引發慢性肝臟感染，而增加個體罹患肝癌、或肝細胞癌(HCC)的可能性。人類乳突病毒(HPV)係具有多於150種相關病毒的群組，當其感染並生長於皮膚或黏膜(諸如口腔、咽喉、或陰道)時，會引起乳突瘤、或疣。已知數種類型的HPV(包括第16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、及6型)會引起子宮頸癌。HPV亦在誘導或引起其他生殖器癌症上扮演角色，並與口腔及咽喉的一些癌症相關。艾司坦-巴爾病毒(EBV)係一種皰疹病毒，其長期感染並保持潛伏於B淋巴球中。EBV感染增加個體發展鼻咽癌及某些類型快速生長淋巴瘤(諸如Burkitt氏淋巴瘤)的風險。EBV亦與霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)及一些胃癌病例相關。除了引起癌症或增加發展癌症的風險之外，病毒感染(諸如HBV、HPV、及EBV感染)可導致組織或器官損傷，其可能增加罹患癌症之個體的疾病負擔，並促成癌症進展。所屬技術領域中已知的是，可誘導人體發動有效且特異性免疫反應，該等免疫反應包括對數種癌症相關病毒的細胞毒性T細胞反應，該等病毒諸如HBV、HPV、及EBV(包括其各種亞型)。因此，在一些實施例中，提供一種治療個體中病毒相關癌症之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞，其中藉由將T細胞群與載有 複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養來製備該等活化T細胞，其中該複數種腫瘤抗原肽包含衍生自該病毒的一或多種腫瘤抗原肽。在一些實施例中，癌症係HBV相關的肝細胞癌、HPV相關的子宮頸癌、或EBV相關的鼻咽癌。

本文所述方法可用於下列目的中任一或多者：減輕癌症的一或多種症狀、延遲癌症的進展、縮小癌症腫瘤大小、擾亂(諸如破壞)癌症基質、抑制癌症腫瘤生長、延長整體存活、延長無疾病存活、延長至癌症疾病進展的時間、預防或延遲癌症腫瘤轉移、減少(諸如根除)先前存在的癌症腫瘤轉移、減少先前存在的癌症腫瘤轉移之發生率或負擔、預防癌症復發、及/或改善癌症的臨床效益。

在一些實施例中，提供一種抑制個體中癌細胞增生(諸如腫瘤生長)之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，抑制至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一者)的細胞增生。

在一些實施例中，提供一種抑制個體中腫瘤轉移之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，抑制至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一者)的轉移。在一些實施例中，提供抑制轉移至淋巴結的方法。

在一些實施例中，提供一種減小個體中腫瘤大小之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，腫瘤大小減小至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一者)。

在一些實施例中，提供一種延長個體中癌症無進展存活之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，該方法將至疾病進展的時間延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12週中任一者。

在一些實施例中，提供一種延長患有癌症的個體的存活之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。在一些實施例中，該方法將至疾病進展的時間延長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12週中任一者。在一些實施例中，該方法延長個體存活至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、或24個月中任一者。

在一些實施例中，提供一種在患有癌症的個體中減少AE及SAE之方法，其包含向該個體投予有效量的活化T細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。

在一些實施例中，該方法可預測且/或導致客觀反應(諸如部分反應或完全反應)。在一些實施例中，該方法可預測且/或導致生活品質改善。

除了通常與其他癌症療法相關聯的常見不良事件之外，一些癌症免疫療法與免疫相關不良事件(immune-related adverse event,irAE)相關聯。irAE通常與命中目標(on-target)T細胞毒性或偏離目標(off-target)效應呈機械式相關，該命中目標T細胞毒性對抗表現於正常非腫瘤組織中的目標抗原，即所謂的命中目標偏離腫瘤(on-target off-tumor)效應，該偏離目標效應諸如自身耐受性破壞或表位交叉反應。irAE可導致在下列的嚴重症狀及病況：皮膚、胃腸、內分泌、肝、眼、神經、及其他組織或器官。所屬技術領域中已知的針對癌症免疫治療方法所報導之一般irAE包括：致命免疫媒介之皮膚炎、肺炎、結腸炎、淋巴球性垂體炎、胰臟炎、淋巴腺病、內分泌病症、CNS毒性、及類似者。在一些實施例中，改良MASCT方法與不良事件(諸如irAE)的低發生率相關聯。在一些實施例中，少於約50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、或1%中任一者的個體經歷irAE，諸如第2至5級irAE。

大致上，可根據個體的大小及狀況，並根據標準醫藥實務，判定活化T細胞及載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群的劑量、時程、及投予途徑。例示性投予途徑包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肺內、膀胱內(intravesicular)、肌內、氣管內、皮下、眼內、鞘內 (intrathecal)、或經皮。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞經皮下投予。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。

投予至個體的細胞劑量可根據下列而變化：例如所投予之細胞的具體類型、投予途徑、及所治療之癌症的具體類型及階段。該量應足以產生所欲反應，諸如對癌症的治療反應，但沒有嚴重毒性或不良事件。在一些實施例中，待投予的活化T細胞或樹突細胞的量係治療有效量。在一些實施例中，細胞(諸如多抗原負載樹突細胞、或活化T細胞)的量係足以減小腫瘤大小、減少癌細胞數目、或降低腫瘤生長速率的量，其差異係至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%中任一者，此係相較於相同個體在治療前的對應腫瘤大小、癌細胞數目、或腫瘤生長速率，或相較於未接受治療的其他個體之對應活性。可使用標準方法來測量此效應的量值，諸如採用純化酶的體外檢定法、基於細胞的檢定法、動物模型、或人體試驗。

在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群係以至少約下列中任一者的劑量投予：1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、1.5×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷、或5×10⁷個細胞/個體。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群係以約下列中任一者的劑量投予：1×10⁵至5×10⁵、5×10⁵至1×10⁶、1×10⁶至2×10⁶、2×10⁶至3×10⁶、3×10⁶至4×10⁶、4×10⁶至5×10⁶、5×10⁶至6×10⁶、6×10⁶至7×10⁶、7×10⁶至8×10⁶、8×10⁶至1×10⁸、1×10⁶至3×10⁶、3×10⁶至5×10⁶、5×10⁶至 7×10⁶、2×10⁶至2×10⁷、5×10⁶至2×10⁷、或1×10⁶至2×10⁷個細胞/個體。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞係以至少約1×10⁶個細胞/個體的劑量投予。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞係以約1.5×10⁶至約1.5×10⁷個細胞/個體的劑量投予。

在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群係以至少約下列中任一者的劑量投予：1×10⁴、2.5×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、2.5×10⁵、4×10⁵、6×10⁵、8×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、或1×10⁷個細胞/kg。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群係以約下列中任一者的劑量投予：1×10⁴至5×10⁴、5×10⁴至1×10⁵、1×10⁵至2×10⁵、2×10⁵至4×10⁵、4×10⁵至6×10⁵、6×10⁵至8×10⁵、8×10⁵至1×10⁶、1×10⁶至2×10⁶、2×10⁶至1×10⁷、1×10⁴至1×10⁵、1×10⁵至1×10⁶、1×10⁶至1×10⁷、1×10⁴至1×10⁶、或1×10⁵至1×10⁷個細胞/kg。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞係以至少約2×10⁵個細胞/kg的劑量投予。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞係以約2.5×10⁴至約2.5×10⁵個細胞/kg的劑量投予。

在一些實施例中，活化T細胞係以至少約下列中任一者的劑量投予：1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、1.5×10¹⁰、2×10¹⁰、或5×10¹⁰個細胞/個體。在一些實施例中，活化T細胞係以約下列中任一者的劑量投予：1×10⁸至5×10⁸、5×10⁸至1×10⁹、1×10⁹至5×10⁹、5×10⁹至1×10¹⁰、3×10⁹至7×10⁹、1×10¹⁰至2× 10¹⁰、或1×10⁹至1×10¹⁰個細胞/個體。在一些實施例中，活化T細胞係以至少約3×10⁹個細胞/個體的劑量投予。在一些實施例中，活化T細胞係以約1×10⁹至約1×10¹⁰個細胞/個體的劑量投予。

在一些實施例中，活化T細胞係以至少約下列中任一者的劑量投予：1×10⁷、2×10⁷、4×10⁷、6×10⁷、8×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、4×10⁸、6×10⁸、8×10⁸、1×10⁹個細胞/kg。在一些實施例中，活化T細胞係以約下列中任一者的劑量投予：1×10⁷至1×10⁸、1×10⁷至5×10⁷、2×10⁷至4×10⁷、5×10⁷至1×10⁸、1×10⁸至2×10⁸、5×10⁷至1×10⁸、1×10⁸至2×10⁸、2×10⁸至5×10⁸、1×10⁸至1×10⁹、或1×10⁷至1×10⁹個細胞/kg。在一些實施例中，活化T細胞係以至少約6×10⁷個細胞/kg的劑量投予。在一些實施例中，活化T細胞係以約1.5×10⁷至約2×10⁸個細胞/kg的劑量投予。

在一些實施例中，穩定劑或賦形劑(諸如人類白蛋白)係與活化T細胞、及/或載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞一起使用。

可基於投予醫師的判斷，在治療過程中調整改良MASCT方法中細胞的劑量及給藥時程。在一些實施例中，在投予載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞後至少約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、或28天中任一者，投予活化T細胞。在一些實施例中，活化T細胞係與樹突細胞同時投予。在一些實施例中，在投予樹突細胞後約17至26天，投予活化T細胞。在一些實施例中，在投予樹突細胞後約17天，投予活化T細胞。

改良MASCT方法可包含單一治療或重複治療。在一些實施例中，投予活化T細胞至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多於10次中任一者。在一些實施例中，投予活化T細胞至少3次。在一些實施例中，投予樹突細胞至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多於10次中任一者。在一些實施例中，投予樹突細胞至少3次。在一些實施例中，在樹突細胞、活化T細胞、或兩者重複投予之前，重複一或多個細胞(諸如抗原負載樹突細胞或活化T細胞)製備步驟。在一些實施例中，改良MASCT方法係每週重複一次、2週重複一次、3週重複一次、4週重複一次、每月重複一次、每2個月重複一次、每3個月重複一次、每4個月重複一次、每5個月重複一次、每6個月重複一次、每7個月重複一次、每8個月重複一次、每9個月重複一次、或每年重複一次。在一些實施例中，樹突細胞、或活化T細胞的各投予之間的間隔係約1週至2週、2週至1個月、2週至2個月、1個月至2個月、1個月至3個月、3個月至6個月、或6個月至一年中任一者。在一些實施例中，樹突細胞、或活化T細胞的各投予之間的間隔係約1天至約5個月，諸如約2週至約2個月、或約2個月至約5個月。在一些實施例中，如果個體具有疾病穩定，則在前6個月治療期間每月、在第二回6個月治療期間每兩個月、及前12個月治療後每半年，重複改良MASCT方法的所有步驟一次。在重複治療全程期間，本文所述之改良MASCT方法之任何實施例可與該改良MASCT方法之任何其他實施例組合。

本文提供的改良MASCT方法可用於作為第一療法、第二療法、第三療法、或與所屬技術領域中已知的其他類型之癌症療法的組合療法，諸如化療、手術、輻射、基因療法、免疫療法、骨髓移植、幹細胞移植、標靶治療、冷療、超音波療法、光動力療法、射頻燒灼、或類似者，其係於輔助性療法或新輔助性療法中。在一些實施例中，改良MASCT方法係用於作為第一療法。在一些實施例中，不存在其他批准的用於個體之抗癌療法。在一些實施例中，改良MASCT方法係用於作為第二療法，其中個體先前已接受切除、射頻燒灼、化療、輻射療法、或其他類型的癌症療法。在一些實施例中，個體已發生進展或已無法耐受標準抗癌療法。在一些實施例中，個體在(多個)改良MASCT治療之前、同時、或之後，接受其他類型的癌症療法。例如，改良MASCT方法可以範圍自數分鐘、數天、數週至數個月的間隔，於其他癌症療法(諸如化療、輻射、手術、或其組合)之前或之後進行。在一些實施例中，第一療法與第二療法之間的間隔使得改良MASCT方法的活化T細胞及其他癌症療法(諸如化療、輻射、手術、或其組合)能夠對個體發揮有利組合效應。在一些實施例中，改良MASCT方法係與其他治療個體中癌症的癌症療法(諸如化療、輻射、手術、或其組合)配合使用。本文所述之組合療法方法可單獨執行或與另一種諸如下列之療法配合執行：手術、輻射、基因療法、免疫療法、骨髓移植、幹細胞移植、荷爾蒙療法、標靶治療、冷療、超音波療法、光動力療法、化療、或類似者。此外，具有較大發展增生性疾病之風險的人可接受治療，以抑制且/或延遲疾病發展。

本文所述之用於治療癌症之方法可用於單一療法、以及與另一種藥劑的組合療法。例如，可將任何本文所述之治療方法與一或多種(諸如1、2、3、4、或更多種中任一者)免疫檢查點抑制劑之投予組合。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係選自由下列所組成之群組：PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA、及LAG-3的抑制劑。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係PD-1的抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。例示性抗PD-1抗體包括但不限於尼沃魯單抗、派姆單抗、匹利珠單抗、BMS-936559、及阿替珠單抗、派姆單抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、及TSR-042。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係尼沃魯單抗(例如OPDIVO^®)。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係派姆單抗(例如，KEYTRUDA^®)。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係SHR-1210。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係PD-L1的抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-L1抗體。例示性抗PD-L1抗體包括但不限於KY-1003、MCLA-145、RG7446、BMS935559、MPDL3280A、MEDI4736、阿維魯單抗(avelumab)、或STI-A1010。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係CTLA-4的抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗CTLA-4抗體。例示性抗CTLA-4抗體包括但不限於伊匹單抗、曲美木單抗、及KAHR-102。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係伊匹單抗(例如，YERVOY^®)。

在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係同時投予。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係以單一組成物投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑存在於共培養物中。在一些實施例中，在投予前(諸如緊接在投予前)將活化T細胞及免疫檢查點抑制劑混合。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係經由不同組成物同時投予。

在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係依序投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係在投予活化T細胞之前投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係在投予活化T細胞之後投予。

免疫檢查點抑制劑的例示性投予途徑包括但不限於腫瘤內、膀胱內、肌內、腹膜內、靜脈內、動脈內、顱內、胸膜內、皮下、及表皮途徑，或經遞送至已知含有此類活癌細胞的淋巴腺、身體空間、器官、或組織中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑經靜脈內投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係藉由輸注投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係在至少約10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、或更長中任一者內輸注。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係經由與活化T細胞相同的投予途徑投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係經由與活化T細胞不同的投予途徑投予。

合適的免疫檢查點抑制劑劑量包括但不限於約下列中任一者：1mg/m²、5mg/m²、10mg/m²、20mg/m²、50mg/m²、100mg/m²、200mg/m²、300mg/m²、400mg/m²、500mg/m²、750 mg/m²、1000mg/m²、或更大。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑劑量係下列中任一者：約1至約5mg/m²、約5至約10mg/m²、約10至約20mg/m²、約20至約50mg/m²、約50至約100mg/m²、約100mg/m²至約200mg/m²、約200至約300mg/m²、約300至約400mg/m²、約400至約500mg/m²、約500至約750mg/m²、或約750至約1000mg/m²。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑劑量係約下列中任一者：1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、或更大。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑劑量係下列中任一者：約1μg/kg至約5μg/kg、約5μg/kg至約10μg/kg、約10μg/kg至約50μg/kg、約50μg/kg至約0.1mg/kg、約0.1mg/kg至約0.2mg/kg、約0.2mg/kg至約0.3mg/kg、約0.3mg/kg至約0.4mg/kg、約0.4mg/kg至約0.5mg/kg、約0.5mg/kg至約1mg/kg、約1mg/kg至約5mg/kg、約5mg/kg至約10mg/kg、約10mg/kg至約20mg/kg、約20mg/kg至約50mg/kg、約50mg/kg至約100mg/kg、或約1mg/kg至約100mg/kg。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係每日投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係以一週至少約1x、2x、3x、4x、5x、6x、或7x(即每日)中任一者投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係每週投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係每週投予且沒有中斷；每週(三週中有兩週)；每週(四週中有三週)；每兩週一 次；每3週一次；每4週一次；每6週一次；每8週、每月、或每二至12個月一次。在一些實施例中，各投予之間的間隔少於約下列中任一者：6個月、3個月、1個月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天。在一些實施例中，各投予之間的間隔多於約下列中任一者：1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、8個月、或12個月。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係每3個月投予一次。在一些實施例中，給藥時程沒有中斷。在一些實施例中，各投予之間的間隔不多於約一週。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係以與活化T細胞相同的給藥時程投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係以與活化T細胞不同的給藥時程投予。

在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係在每個改良MASCT治療週期中投予。例如，每個改良MASCT治療週期可投予免疫檢查點抑制劑約1、2、3、4、5、6、或更多次中之任一者。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑並未在每個改良MASCT治療週期中投予。例如，免疫檢查點抑制劑可約每1、2、3、4、5、或更多個改良MASCT治療週期投予一次。

可在延長時段(諸如約一個月到至多約七年)內投予免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，在至少約下列中任一者的期間內投予免疫檢查點抑制劑：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72、或84個月。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係單次投予。在一些實施例中，重複投予免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，重複投予免疫檢查點抑制劑直到疾病進展。

IV.精準改良MASCT方法

本文進一步提供的是精準改良MASCT方法，其基於個體的基因反應及治療反應針對正接受治療之個體進行客製化。可客製化以上在第III節中所述的任何治療方法，以提供精準改良MASCT方法。

在一些實施例中，本文所述之改良MASCT方法特別適用於某些個體群，諸如在癌症(諸如所有癌細胞或癌細胞的子集)中具有低突變負荷(諸如在MHC基因中)的個體、及/或具有一或多種新抗原的個體。

突變負荷

在一些實施例中，改良MASCT方法特別適用於在個體癌症中具有低總突變負荷的個體。在一些實施例中，改良MASCT方法特別適用於在個體癌症中具有癌症相關基因中低突變負荷的個體。在一些實施例中，改良MASCT方法特別適用於在個體癌症中具有T細胞反應相關免疫基因中低突變負荷的個體。在一些實施例中，改良MASCT方法特別適用於在個體癌症中具有MHC基因中低突變負荷的個體。突變負荷可係在下列中的突變負荷：所有癌細胞、或癌細胞之子集，諸如原發性或轉移性腫瘤部位，例如腫瘤活檢樣本中的細胞。

因此，在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症之方法，其包含：(a)可選地投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細 胞；及(b)向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由以上在第II節中所述之製備活化T細胞之方法中任一者製備，且其中該個體在該癌症中具有低突變負荷。

在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症之方法，其包含：(a)基於該癌症中的該突變負荷而選擇用於該方法之該個體；(b)可選地投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞；及(c)向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由以上在第II節中所述之製備活化T細胞之方法中任一者製備。

在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症之方法，其包含：(a)可選地投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞；及(b)向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由以上在第II節中所述之製備活化T細胞之方法中任一者製備，且其中基於在該癌症中具有低突變負荷來選擇該個體以進行治療。

在一些實施例中，一或多個基因的低突變負荷係在該一或多個基因上累積的突變數量少。在一些實施例中，不多於約500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5、或更少中任一者的突變之總數指示低突變負荷。在一些實施例中，在一或多個MHC基因中不多於約50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個中任一者的突變指示該一或多個MHC基因的低突變負荷。在一些實施例中，一或多個基因的低突變負荷係在該一或多個基因(諸如MHC基因)上累積的突變數量與在所選基因集(諸如癌症相關基因)或全基因組中的突變總數之間的低比率。

在一些實施例中，一或多個MHC基因包含MHC I類基因(或基因座)。在一些實施例中，一或多個MHC基因包含MHC II類基因(或基因座)。在一些實施例中，其中個體係人類個體，一或多個MHC基因係選自由HLA-A、HLA-B、HLA-C、及B2M所組成之群組。

例示性突變包括但不限於缺失、移碼、插入、插入或缺失(indel)、誤義突變、無意義突變、點突變、拷貝數變異、單一核苷酸變異(single nucleotide variation,SNV)、緘默突變、剪接位突變、剪接變體、基因融合、及易位。在一些實施例中，MHC基因的拷貝數變異係由基因組的結構性重排造成，其包括染色體或其片段的缺失、重複、倒位、及易位。在一些實施例中，一或多個MHC基因中的突變係選自點突變、移碼突變、基因融合、及拷貝數變異。在一些實施例中，突變係在MHC基因的蛋白質編碼區中。在一些實施例中，突變是非同義突變。在一些實施例中，突變不具多型性。在一些實施例中，突變存在於個體的正常細胞中。在一些實施例中，突變不存在於個體的正常細胞中。在一些實施例中，突變影響由受影響基因編碼的MHC分子之生理化學或功能性質，諸如穩定性或結合親和力。在一些實施例中，突變導致MHC分子中不可逆的缺陷。在一些實施例中，突變降低MHC分子對T細胞表位及/或T細胞受體的結合親和力。在一些實施例中，突變係功能喪失型突變。在一些實施例中，突變導致MHC分子中可逆的缺陷。在一些實施例中，突變不影響MHC分子對T細胞表 位及/或T細胞受體的結合親和力。在一些實施例中，突變係體細胞突變。在一些實施例中，突變係生殖系突變。

計入突變負荷之突變可存在於所有癌細胞中或癌細胞的子集中。在一些實施例中，突變存在於個體的所有癌細胞中。在一些實施例中，突變存在於腫瘤部位的所有癌細胞中。在一些實施例中，突變為殖株性。在一些實施例中，突變為次殖株性。在一些實施例中，突變存在於個體的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多中任一者的癌細胞中。

某些MHC基因中及/或一或多個MHC基因之某些域或位置中的突變可能對個體對本文所述之改良MASCT方法的臨床反應具有更深遠的影響。例如，功能喪失型突變可發生在HLA分子的前導肽序列、a3域(其結合T細胞的CD8輔受體)、a1肽結合域、或a2肽結合域中；參見例如Shukla S.et al.Nature Biotechnology 33,1152-1158(2015)，其以引用方式併入本文中。B2M(β2-巨球蛋白)基因中的突變亦可啟動腫瘤逃脫表型。參見例如Monica B et al.Cancer Immunol.Immu.,(2012)61：1359-1371。在一些實施例中，在一或多個MHC基因的功能區中存在任何數量(諸如1、2、3、4、5、或更多個)的突變指示高突變負荷，該等功能區諸如前導肽序列、a1域、a2域、或a3域。在一些實施例中，在一或多個MHC基因(諸如人類個體中的HLA-A、HLA-B、或HLA-C基因)中存在任何數量(諸如1、2、3、4、5、或更多個)的功能喪失型突變指示高突變負荷。在一些實施例中，一或多個MHC基因中的低突變負荷在功能區中不包含突變， 該等功能區包括該一或多個MHC基因(諸如HLA-A、HLA-B、或HLA-C基因)的前導肽序列、a1域(例如，與CD8輔受體直接接觸的殘基)、a2域、及a3域(例如，與表位直接接觸的殘基)。在一些實施例中，在B2M基因中存在任何數量的突變(諸如功能喪失型突變)指示高突變負荷。在一些實施例中，在一或多個MHC基因中的低突變負荷在B2M基因中不包含突變。

可藉由所屬技術領域中任何已知的方法來判定一或多個基因(諸如MHC基因)的突變負荷，該等方法包括但不限於基因組DNA定序、外顯子定序、或其他使用桑格定序或次世代定序平台之基於DNA定序的方法；聚合酶連鎖反應檢定；原位雜交檢定；及DNA微陣列。

在一些實施例中，藉由對來自個體的腫瘤樣本定序，判定一或多個MHC基因的突變負荷。在一些實施例中，定序係次世代定序。在一些實施例中，定序係全基因組定序。在一些實施例中，定序係外顯子定序。在一些實施例中，定序係候選基因(諸如癌症相關基因加上HLA基因)的靶向定序。例如，ONCOGXONE^TM Plus(Admera Health)可用於對癌症相關基因及HLA基因座定序，且具有高定序深度。在一些實施例中，可使用相同的定序數據來判定一或多個MHC基因的突變負荷並識別個體中的新抗原。

在一些實施例中，腫瘤樣本係組織樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本係腫瘤活檢樣本，諸如細針穿刺的腫瘤細胞、或由腹腔鏡術獲得的腫瘤細胞(諸如包括腫瘤基質)。在一些實施例中，腫瘤樣 本係新鮮獲得。在一些實施例中，腫瘤樣本經冷凍。在一些實施例中，腫瘤樣本係甲醛固定石蠟包埋(Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded,FFPE)樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本係細胞樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本包含循環轉移性癌細胞。在一些實施例中，藉由將來自血液的循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)分類，獲得腫瘤樣本。在一些實施例中，自腫瘤樣本萃取核酸(諸如DNA及/或RNA)，以用於定序分析。在一些實施例中，將腫瘤樣本的定序數據與參考樣本(諸如來自相同個體的健康組織樣本、或健康個體的樣本)的定序數據比較，以識別突變並判定腫瘤細胞中的突變負荷。在一些實施例中，將腫瘤樣本的定序數據與來自基因組資料庫的參考序列比較，以識別突變並判定腫瘤細胞中的突變負荷。

新抗原肽

在一些實施例中，改良MASCT方法特別適用於治療具有一或多種新抗原的個體。使用在複數種腫瘤抗原肽中的一或多種新抗原肽的本文所述之任何改良MASCT方法可進一步包含基於個體中具有一或多種(諸如至少5種)新抗原而選擇用於治療方法之個體的步驟、及/或下列步驟：(i)識別該個體的新抗原；及(ii)將衍生自該新抗原的新抗原肽併入該複數種腫瘤抗原肽，以用於該改良MASCT方法。

因此，在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症之方法，其包含：(a)識別該個體的新抗原；(b)將新抗原肽併入複數種腫瘤 抗原肽，其中該新抗原肽包含該新抗原中的新表位；(c)可選地投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞；(d)使用以上在第II節中所述之製備活化T細胞之方法中任一者製備活化T細胞群；及(e)向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該個體具有一或多種新抗原。

個體可具有任何數量(諸如至少約1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、100、或更多種中任一者)的新抗原，以受益於改良MASCT方法，該方法使用包含新抗原肽的複數種腫瘤抗原肽。在一些實施例中，改良MASCT方法特別適用於具有至少約4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多種中任一者的新抗原之個體。在一些實施例中，新抗原包含一或多個新表位。在一些實施例中，改良MASCT方法特別適用於具有至少約4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多個中任一者的新表位之個體。在一些實施例中，T細胞表位係MHC-I限制性表位。在一些實施例中，相較於對應的野生型T細胞表位，新表位對個體的MHC分子具有較高的親和性。在一些實施例中，相較於對應的野生型T細胞表位，新表位對模型T細胞受體具有較高的親和性。在一些實施例中，新抗原(或新表位)係殖株性新抗原。在一些實施例中，新抗原(或新表位)係次殖株性新抗原。在一些實施例中，新抗原(或新表位)存在於個體中至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多中任一者的腫瘤細胞中。

新抗原之數量可與其他生物標記或選擇標準組合，以為本文所述之改良MASCT方法中任一者選擇個體。在一些實施例中， 改良MASCT方法特別適用於以下的個體：在癌細胞中具有低突變負荷(諸如在一或多個MHC基因中)，且具有至少約4、5、6、7、8、10、或更多種中任一者的新抗原(諸如具有高親和性MHC-I限制性新表位之新抗原)。

可基於個體的新抗原設計任何數量(諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多種中任一者)的新抗原肽，並將其併入用於任何本文所述之改良MASCT方法的複數種腫瘤抗原肽中。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含單一新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含複數種新抗原肽。各新抗原肽可包含一或多個新表位，該新表位係來自個體的新抗原。在一些實施例中，新表位係T細胞表位。基於新抗原設計新抗原肽的方法係描述於「複數種腫瘤抗原肽」一節中。

可使用所屬技術領域中任何已知的方法，識別個體中的新抗原。在一些實施例中，基於來自個體之腫瘤樣本的基因輪廓識別新抗原。各新抗原包含一或多個新表位。在一些實施例中，基於腫瘤樣本的基因輪廓，識別新抗原中的一或多個新表位。可使用任何已知的基因剖析方法(諸如次世代定序(NGS)方法、微陣列、或蛋白質體方法)來提供腫瘤樣本的基因輪廓。

在一些實施例中，藉由對來自個體的腫瘤樣本定序，識別新抗原。在一些實施例中，定序係次世代定序。在一些實施例中，定序係全基因組定序。在一些實施例中，定序係外顯子定序，諸如全外顯子定序(whole exome sequencing,「WES」)。在一些實施例中， 定序係RNA定序。在一些實施例中，定序係候選基因(諸如癌症相關基因)的靶向定序。許多市售NGS癌症組(例如ONCOGXONE^TM Plus(Admera Health))可用於對癌症相關基因定序，且具有高定序深度。

在一些實施例中，腫瘤樣本係組識樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本係腫瘤活檢樣本，諸如細針穿刺的腫瘤細胞、或由腹腔鏡術獲得的腫瘤細胞(諸如包括腫瘤基質)。在一些實施例中，腫瘤樣本係新鮮獲得。在一些實施例中，腫瘤樣本經冷凍。在一些實施例中，腫瘤樣本係甲醛固定石蠟包埋(Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded,FFPE)樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本係細胞樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本包含循環轉移性癌細胞。在一些實施例中，藉由將來自血液的循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)分類，獲得腫瘤樣本。在一些實施例中，自腫瘤樣本萃取核酸(諸如DNA及/或RNA)，以用於定序分析。在一些實施例中，自腫瘤樣本萃取蛋白質，以用於定序分析。

在一些實施例中，將腫瘤樣本的基因輪廓與參考樣本(諸如來自相同個體的健康組織樣本、或健康個體的樣本)的基因輪廓比較，以識別腫瘤細胞中的候選突變基因。在一些實施例中，將腫瘤樣本的基因輪廓與來自基因組資料庫的參考序列比較，以識別腫瘤細胞中的候選突變基因。在一些實施例中，候選突變基因係癌症相關基因。在一些實施例中，各候選突變基因包含：一或多個突變，諸如非同義取代、單一核苷酸變異(SNV)、插入或缺失(indel/insertion or deletion，例如非移碼插入或缺失)、新開放閱讀框(open reading frame, ORF)、或基因融合，其可產生新抗原。常見的單核苷酸多型性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)係排除在候選突變之外。

在一些實施例中，自候選突變蛋白識別新抗原中的新表位。在一些實施例中，以電腦模擬預測新表位。用於T細胞表位預測的例示性生物資訊工具係所屬技術領域中已知的，例如參見Yang X.及Yu X.(2009)的「An introduction to epitope prediction methods and software」Rev.Med.Virol.19(2)：77-96。T細胞表位預測演算法中所考慮的因素包括但不限於個體的MHC亞型、T細胞表位的序列衍生之生理化學性質、MHC結合模體、蛋白酶體裂解模式、抗原處理相關轉運蛋白(transporter associated with antigen processing,TAP)轉運效率、MHC結合親和力、肽-MHC穩定性、及T細胞受體結合親和力。在一些實施例中，新表位係MHC-I限制性表位。在一些實施例中，新表位係MHC-II限制性表位。

在一些實施例中，新表位對個體的MHC分子具有高親和性。在一些實施例中，該方法進一步包含判定個體的MHC亞型(例如，自定序數據判定)，以識別個體的一或多種MHC分子。在一些實施例中，該方法進一步包含判定新表位對MHC分子(諸如MHC I類分子)的親和性。在一些實施例中，該方法包含判定新表位對個體之一或多種MHC(諸如MHC I類)分子的親和性。在一些實施例中，將新表位對個體之一或多種MHC分子的親和性，與對應野生型表位對個體之一或多種MHC分子的親和性比較。在一些實施例中，選擇相較於對應野生型表位，對個體之一或多種MHC分子(諸如MHC-I分子) 具有較高(諸如至少約1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)親和性的新表位。在一些實施例中，使用所屬技術領域中任何已知的工具或方法，以電腦模擬預測MHC結合親和力。在一些實施例中，藉由實驗判定MHC結合親和力，諸如使用體外結合檢定。

在一些實施例中，該方法進一步包含判定複合物對T細胞受體的親和性，該複合物包含新表位及MHC分子(諸如個體的MHC I類分子)。在一些實施例中，將包含新表位及MHC分子之複合物對T細胞受體的親和性，與包含對應野生型表位及MHC分子之複合物的親和性比較。在一些實施例中，MHC分子係來自個體。在一些實施例中，T細胞受體係在個體之一或多個T細胞的表面上。在一些實施例中，選擇相較於對應野生型表位，在複合物中對T細胞受體模型具有較高(諸如至少約1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)親和性的新表位，該複合物包含新表位及MHC分子。在一些實施例中，使用所屬技術領域中任何已知的任何工具或方法，以電腦模擬預測TCR結合親和力。在一些實施例中，藉由實驗判定TCR結合親和力，例如藉由判定T細胞對新表位的反應。

在一些實施例中，進一步基於腫瘤樣本中新抗原(或新表位)的表現水平，識別該新抗原(或新表位)。可使用所屬技術領域中任何已知的mRNA或蛋白質水平定量方法，諸如RT-PCR、基於抗體的檢定法、及質譜術，判定新抗原(或新表位)的表現水平。在一些實施例中，自腫瘤樣本的定序數據，判定新抗原(或新表位)的表現水平。在一些實施例中，新抗原(或新表位)係以至少約10、20、 50、100、200、500、1000、2000、5000、10⁴、或更多個中任一者拷貝/細胞的水平表現於腫瘤細胞中。在一些實施例中，相較於對應野生型蛋白質(或對應野生型表位)，新抗原(或新表位)係以多於約1.5、2、5、10、20、50、100、或更多倍中任一者的水平表現於腫瘤細胞中。

在一些實施例中，藉由包含下列之步驟選擇或識別新抗原肽：(a)對來自個體的腫瘤樣本定序以識別新抗原；(b)識別新抗原中的新表位；可選地(c)判定該個體的MHC亞型(例如，使用定序數據判定)，以識別該個體的MHC分子；可選地(d)判定該新表位對該個體之該MHC分子的親和性；可選地(e)判定複合物對T細胞受體的親和性，該複合物包含該新表位及該MHC分子；及(f)獲得包含該新表位之肽，以提供該新抗原肽。在一些實施例中，相較於包含對應野生型T細胞表位及MHC分子的複合物，新表位對個體之MHC分子(諸如MHC-I分子)具有較高親和性，且/或在包含該新表位及該MHC分子之複合物中對TCR具有較高親和性。在一些實施例中，根據具有表位的新抗原之天然序列，將新表位在N端或C端或兩端延伸，以獲得延伸序列，其中該延伸序列係適於由I類及II類兩者MHC分子呈現。使用一或多種新抗原肽的任何本文所述之改良MASCT方法可進一步包含任一或多個新抗原選擇/識別步驟。

改良MASCT後的監測

任何本文所述之改良MASCT方法可進一步包含在個體接受改良MASCT治療之後的監測步驟。治療後監測可有利於調整個體的治療方案，以最佳化治療成果。

例如，可基於個體對複數種腫瘤抗原肽中各者的特異性免疫反應、及/或個體對活化T細胞的臨床反應，調整或客製化本文所述的複數種腫瘤抗原肽，以提供複數種客製化腫瘤抗原肽，其可用於重複(多種)改良MASCT治療。在一些實施例中，可自用於未來製備經脈衝DC或活化T細胞的抗原肽池，移除不會引發強烈特異性免疫反應的腫瘤抗原肽。在一些實施例中，如果個體對使用一抗原肽池的改良MASCT治療沒有反應(諸如具有疾病進展、轉移等的徵象)，可調整該抗原肽池，或者可將新抗原併入該抗原肽池，以用於該改良MASCT治療的第二週期。

可使用所屬技術領域中任何已知的方法，例如藉由測量經過個體腫瘤抗原肽刺激後來自T細胞(或PBMC)的細胞毒性因子(諸如穿孔素或顆粒酶B)、或細胞激素釋放(諸如IFNγ或TNFα)之水平，判定對一或多種腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。可使用基於抗體的檢定法(諸如ELISPOT)來定量細胞毒性因子、或細胞激素(諸如IFNγ)水平。在一些實施例中，將回應於腫瘤抗原肽之來自T細胞(或PBMC)的細胞激素(諸如IFNγ)釋放水平標準化至參考物(諸如基線細胞激素釋放水平、或回應於不相關肽之來自T細胞(或PBMC)的非特異性細胞激素釋放水平)，以提供細胞激素(諸如IFNγ)倍數變化值。在一些實施例中，在ELISPOT檢定中，大於約1.2、1.5、 2、2.5、3、4、5、6、8、10、或更多中任一者的細胞激素(諸如IFNγ)倍數變化值指示對腫瘤抗原肽的強烈特異性免疫反應。在一些實施例中，將在ELISPOT檢定中細胞激素(諸如IFNγ)倍數變化值小於約10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1.2、或更小中任一者的腫瘤抗原肽自該複數種腫瘤抗原肽移除，以提供複數種用於未來改良MASCT治療的客製化腫瘤抗原肽。

可由醫師利用所屬技術領域中已知的方法，諸如利用造影方法、血液測試、生物標記評估、及活檢，評估個體對改良MASCT方法的臨床反應。在一些實施例中，藉由判定個體在接受改良MASCT治療之前及之後的循環腫瘤細胞(CTC)數目，監測臨床反應。在一些實施例中，CTC已自原發性腫瘤剝離並在體液中循環。在一些實施例中，CTC已自原發性腫瘤剝離並在血流中循環。在一些實施例中，CTC係轉移的指示。CTC數目可藉由所屬技術領域中已知的各種方法判定，該等方法包括但不限於CellSearch方法、Epic Science方法、IsoFlux、及maintrac。在一些實施例中，判定在個體血液樣本中的單CTC(包括CTC的特異性亞型)數目。在一些實施例中，當個體在接受改良MASCT治療後每mL血液樣本的單CTC數目多於約10、20、50、100、150、200、300、或更多中任一者時，其指示轉移的風險增加、及/或對改良MASCT治療的臨床反應不佳。在一些實施例中，相較於接受改良MASCT治療之前，個體在接受改良MASCT治療後的單CTC數目增加(諸如增加至少約1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示對改良MASCT治療的臨床反應不佳。在一些實施 例中，判定在個體血液樣本中的CTC團簇數目。在一些實施例中，當個體在接受改良MASCT治療後的血液樣本中偵測到至少約1、5、10、50、100、或更多個中任一者的CTC團簇時，其指示轉移的風險增加、及/或對改良MASCT治療的臨床反應不佳。在一些實施例中，相較於接受改良MASCT治療之前，個體在接受改良MASCT治療後的CTC團簇數目增加(諸如增加至少約1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示對改良MASCT治療的臨床反應不佳。

V.組成物、套組、及製品

本申請案進一步提供套組、組成物(諸如醫藥組成物)、及製品，其係用於本文所述之改良MASCT方法(包括精準改良MASCT方法)或細胞(諸如抗原負載DC或活化T細胞)製備方法的任何實施例。

在一些實施例中，提供一種用於癌症免疫療法的套組，其包含至少10種腫瘤抗原肽。所屬技術領域中具有通常知識者可使用來自第一核心組的腫瘤抗原肽之任何組合、及可選地來自第二組的癌症類型特異性抗原肽之任何組合、及/或新抗原肽以負載樹突細胞群，其可進一步用於製備有用於治療個體中癌症的活化T細胞。

套組可含有額外組分，諸如容器、試劑、培養基、細胞激素、免疫檢查點抑制劑、TLR促效劑、緩衝液、抗體、及類似者，以促進執行本文所述之治療方法或細胞製備方法的任何實施例。例如，在一些實施例中，套組進一步包含周邊血液收集及儲存設備，其可用 於收集個體的周邊血液。在一些實施例中，套組進一步包含容器及試劑，其用於周邊血液的密度梯度離心，其可用於自人類周邊血液樣本單離PBMC。在一些實施例中，套組進一步包含培養基、細胞激素、或緩衝液，其用於自周邊血液獲得樹突細胞。在一些實施例中，套組進一步包含培養基、TLR促效劑(例如，MPLA)、IFNγ、PGE2、試劑、及緩衝液，其用於使複數種腫瘤抗原肽負載至樹突細胞中。在一些實施例中，套組進一步包含細胞激素(例如，IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)、免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD1抗體)、抗CD3抗體、緩衝液、或培養基，其用於將獲自周邊血液之T細胞與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞共培養。在一些實施例中，套組進一步包含試劑，其用於判定癌細胞中之突變負荷(諸如在一或多個MHC基因中)。在一些實施例中，套組進一步包含免疫檢查點抑制劑，其用於與改良MASCT的組合療法。在一些實施例中，套組進一步包含試劑，其用於識別腫瘤樣本中的新抗原(諸如藉由定序)。在一些實施例中，套組進一步包含ELISPOT檢定，其用於評估對複數種腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。

本申請案之套組係合適包裝中。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶、罐、軟質包裝(例如，聚酯樹脂(Mylar)或塑膠袋)、及類似者。套組可選地提供額外組分，諸如緩衝液及解釋性資訊。因此，本申請案亦提供製品，其包括小瓶(諸如密封小瓶)、瓶、罐、軟質包裝、及類似者。

說明書亦可包含與使用腫瘤抗原肽(及上述可選地額外組分)有關的說明。在一些實施例中，套組進一步包含說明手冊，諸如描述下列的規程之手冊：如本文所述之改良MASCT方法(包括精準改良MASCT方法)的實施例、或細胞製備方法的實施例。說明書亦可包括有關劑量、給藥時程、及投予途徑的資訊，其係關於使用套組製備的樹突細胞及/或活化T細胞，以用於預期治療。在一些實施例中，套組進一步包含關於針對改良MASCT方法選擇個體的說明書。在一些實施例中，套組進一步包含關於判定癌細胞突變負荷、及/或判定個體中新抗原數目的說明書。在一些實施例中，套組進一步包含關於投予與改良MASCT組合之免疫檢查點抑制劑的說明書，其包括例如有關免疫檢查點抑制劑之劑量、給藥時程、及投予途徑的資訊。在一些實施例中，套組進一步包含關於識別腫瘤樣本中之新抗原(諸如藉由定序)的說明書。在一些實施例中，套組進一步包含關於在接受改良MASCT治療後監測個體的說明書。

容器可為單位劑量、批量包裝(例如，多劑量包裝)、或次單位劑量。例如，可提供含有足夠腫瘤抗原肽(如本文所揭示)的套組，以製備足夠的活化T細胞、及/或抗原負載樹突細胞(諸如樹突細胞)，以提供一段延長時段的個體有效治療，該延長時段諸如3週、6週、9週、3個月、4個月、5個月、6個月、8個月、9個月、1年、或更長中任一者。

套組亦可包括多單位劑量的腫瘤抗原肽及使用說明書，且以足以儲存於及使用於藥局(例如，醫院藥局、及調製藥局)的數量進行包裝。

進一步提供的是本文所述之單離細胞群(諸如樹突細胞、或活化T細胞)中任一者的套組、組成物(諸如醫藥組成物)、及製品。

本文所述的單離細胞群可用於醫藥組成物或配方中，其藉由組合所述單離細胞群與醫藥上可接受之載劑、賦形劑、穩定劑、及/或其他藥劑(其係所屬技術領域中已知者)，以用於本文所述之治療方法、投予方法、及劑量方案。在一些實施例中，人類白蛋白係用於作為醫藥上可接受之載劑。

合適的醫藥載劑包括無菌水；鹽水、右旋糖；於水或鹽水中的右旋糖；蓖麻油及環氧乙烷的縮合產物(每莫耳蓖麻油組合約30至約35莫耳環氧乙烷)；液體酸；低級烷醇；油，諸如玉米油；花生油、芝麻油、及類似者，與乳化劑，諸如脂肪酸之單或二甘油酯、或磷脂質(例如，卵磷脂)、及類似者；二醇；聚烯烴二醇；在懸浮劑存在下的水性介質，例如羧甲基纖維素鈉；藻酸鈉；聚(乙烯基吡咯烷酮)；及類似者，其係單獨使用、或與合適的分配劑(諸如卵磷脂)；聚氧乙烯硬脂酸酯；及類似者。載劑亦可含有佐劑(諸如保持穩定劑、潤溼劑、乳化劑、及類似者)與滲透增強劑。最終形式可係無菌，且亦可能夠易於通過注射裝置(諸如空心針)。可藉由適當選擇溶劑或賦形劑，達到並維持適當黏度。

本文所述的醫藥組成物可包括其他試劑、賦形劑、或穩定劑，以改善組成物的性質。合適的賦形劑及稀釋劑的實例包括但不限於乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、鹽水溶液、漿料、甲基纖維素、羥苯甲酸甲酯及羥苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、及礦物油。在一些實施例中，將醫藥組成物配製成其pH在約4.5至約9.0的範圍內，包括例如約5.0至約8.0、約6.5至約7.5、或約6.5至約7.0中任一者的pH範圍。在一些實施例中，亦可藉由添加合適的張力調節劑(諸如甘油)，使醫藥組成物與血液等張。

在一些實施例中，單離細胞組成物(諸如醫藥組成物)適用於向人類投予。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)適用於藉由腸胃外投予向人類投予。適用於腸胃外投予的配方包括：水性及非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑、及使配方與預期受體之血液相容的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、及保存劑。配方可以單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿及小瓶)呈現，並可儲存在僅需要緊接在使用前添加無菌液體賦形劑(即，水)以用於注射的條件下，該無菌液體賦形劑係用於本文所述之治療方法、投予方法、及劑量方案。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)係含在單次使用小瓶中，諸如單次使用密封小瓶。在一些實施例中，各單次使用小瓶含有約10⁹個活化T細胞。在一些實施例中，各單次使用小瓶所含有的活 化T細胞足以擴增為約10⁹個活化T細胞。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)係含在多次使用小瓶中。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)係以批量含在容器中。

亦提供的是單位劑型，其包含本文所述之單離細胞組成物(諸如醫藥組成物)及配方。此等單位劑型可以單一或多單位劑量儲存於合適包裝中，且亦可經進一步滅菌及密封。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)亦包括一或多種有用於治療癌症的其他化合物(或其醫藥上可接受之鹽)。

本申請案進一步提供套組，其包含本文所述之單離細胞群、組成物(諸如醫藥組成物)、配方、單位劑量、及製品中任一者，以用於本文所述之治療方法、投予方法、及劑量方案。本文所述之套組包括一或多個容器，該容器包含活化T細胞。

VI.例示性實施例

在本文所提供之實施例中的是：

1.一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及 c)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。

2.實施例1之方法，其中步驟a)進一步包含在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑。

3.實施例2之方法，其中該TLR促效劑係選自由MPLA、Poly I：C、雷西莫特、嘎德莫特、及CL075所組成之群組。

4.一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA；及c)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，從而獲得該活化T細胞群。

5.實施例3或4之方法，其中該DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。

6.實施例5之方法，其中該DC成熟培養基進一步包含PGE2。

7.實施例5或6之方法，其中該INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於該DC成熟培養基中。

8.實施例3至7中任一者之方法，其中該MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於該DC成熟培養基中。

9.實施例6至8中任一者之方法，其中該PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於該DC成熟培養基中。

10.實施例4至9中任一者之方法，其中步驟c)包含：在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。

11.實施例1至3及5至10中任一者之方法，其中該複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。

12.實施例11之方法，其中該IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於該初始共培養基中。

13.實施例1至3及5至12中任一者之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。

14.實施例13之方法，其中該抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於該初始共培養基中。

15.實施例10至14中任一者之方法，在該共培養開始後約3至7天，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。

16.實施例1至3及5至15中任一者之方法，其中在該共培養開始後約5天，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。

17.實施例1至16中任一者之方法，其中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。

18.實施例1至17中任一者之方法，其中該T細胞群存在於PBMC群中。

19.實施例1至18中任一者之方法，其中藉由誘導來自PBMC之單核球群分化來獲得該樹突細胞群。

20.實施例1至19中任一者之方法，其中該樹突細胞群及該T細胞群係獲自相同個體。

21.如請求項1至20中任一項之方法，其中該複數種腫瘤抗原肽包含新抗原肽，可選地其中該複數種腫瘤抗原肽係由新抗原肽組成。

22.實施例1至21中任一者之方法，其中該複數種腫瘤抗原肽係複數種合成腫瘤抗原肽。

23.實施例1至22中任一者之方法，其中該複數種腫瘤抗原肽不是獲自細胞樣本。

24.一種單離活化T細胞群，其係使用實施例1至23中任一者之方法製備。

25.一種治療個體中癌症之方法，其包含向該個體投予有效量的實施例24之活化T細胞。

26.實施例25之方法，其進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞。

27.實施例26之方法，其中該樹突細胞群及該T細胞群係獲自正接受治療之個體。

28.實施例25至27中任一者之方法，其中向該個體投予該等活化T細胞至少三次。

29.實施例25至28中任一者之方法，其中該等活化T細胞經靜脈內投予。

30.實施例25至29中任一者之方法，其中投予載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞至少三次。

31.實施例25至30中任一者之方法，其中載有該複數種腫瘤抗原肽之該等樹突細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。

32.實施例25至31中任一者之方法，其中該癌症係實體癌症。

33.實施例32之方法，其中該實體癌症係選自由下列所組成之群組：肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、及肺癌。

34.實施例25至33中任一者之方法，其中該個體係人類個體。

35.一種組成物，其包含實施例24之活化T細胞，以用於治療個體中癌症。

36.一種實施例24之活化T細胞於製備用於治療個體中癌症之藥劑的用途。

實例

以下實例旨在純粹為本申請案的示例，因此不應視為以任何方式限制本發明。以下實例及詳細說明係以說明方式而非限制方式提供。

實例1：最佳化DC成熟培養基 實驗方法

藉由以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)進行的密度梯度離心，獲得來自健康志願者的周邊血液單核細胞(PBMC)。繼續將黏附單核球培養於AIM-V培養基中以分化為未成熟樹突細胞(DC)，該AIM-V培養基具有1000U/mL GM-CSF及500U/mL IL-4。將所得未成熟DC以多種腫瘤抗原肽池(1μg/mL/肽)進行脈衝，隨後於DC成熟培養基中培養2天以分化為成熟DC。

使細胞培養物經受流動式細胞測量術，以判定成熟DC(CD11C+細胞)及其亞群(表現各種共刺激分子)之數目。將成熟DC之數目標準化至細胞總數。將各DC亞群中之細胞數目標準化至成熟DC之總數。用於樹突細胞表面染色之抗體係獲自BD Biosciences(抗人類CD86-FITC、CD40-FITC、CD11C-PE、CCR7-FITC、PD-L1-FITC、HLA-DR-FITC)。使用FACS CantoII(BD Biosciences)流動式細胞儀執行流動式細胞測量術，並利用Flowjo程式分析數據。

藉由ELISA評估成熟DC之細胞激素分泌。將成熟DC之上清液離心以移除顆粒碎屑，並將其儲存於-80℃下直到使用為止。根據製造商的規程，用特定ELISA套組(eBioscience)測量IL-12p70及IL-10分泌水平。使用Procarta Plex Multiplex Immunoassays(Affymetrix)，判定TNF-α分泌水平。

不同 TLR的效應

將抗原負載未成熟DC培養於包含不同類鐸受體(TLR)的DC成熟培養基中：DC3/4指示來自先前報導之例示性MASCT方法的DC成熟培養基，其包括IL6、TNFα、IL1β、及Poly I：C；M+I培養基，其包含MPLA(「M」)及INFγ(「I」)；I+P+R培養基，其包含INFγ、Poly I：C(「P」)、及雷西莫特(「R」)；M+I+G培養基，其包含MPLA、INFγ、及嘎德莫特(「G」)；M+I+P培養基，其包含MPLA、INFγ、及Poly I：C；及M+I+C培養基，其包含MPLA、INFγ、及CL075。在兩種DC成熟培養基含有相同成分的情況下，該成分之濃度在該兩種DC成熟培養基中係相同的。

如圖1A所示，不同TLR及其組合對成熟DC上的共刺激分子表現沒有顯著影響。然而，如圖1B所示，M+I及M+I+G培養基導致成熟DC之IL12及TNFα分泌水平顯著增加。

TLR在不同濃度下的效應

將抗原負載未成熟DC培養於以不同濃度包含TLR的DC成熟培養基中：DC3/4指示來自先前報導之例示性MASCT方法的DC成熟培養基，其包括IL6、TNFα、IL1β、及Poly I：C；I+M培養基，其包含INFγ及低濃度的MPLA；I+M2培養基，其包含INFγ及高濃度的MPLA I+M+G1培養基，其包含MPLA、INFγ、及低濃度的嘎德莫特；I+M+G2培養基，其包含MPLA、INFγ、及高濃度的嘎德莫特；I+M+R1培養基，其包含MPLA、INFγ、及低濃度的雷西莫特； I+M+R2培養基，其包含MPLA、INFγ、及高濃度的雷西莫特；I+M+CL1培養基，其包含MPLA、INFγ、及低濃度的CL075；及I+M+CL2培養基，其包含MPLA、INFγ、及高濃度的CL075。M的濃度係介於1μg/mL與10μg/mL之間。嘎德莫特的濃度係介於1μg/mL與10μg/mL之間。雷西莫特的濃度係介於1μg/mL與10μg/mL之間。CL075的濃度係介於1μg/mL與5μg/mL之間。

如圖2A所示，DC3/4培養基導致較高的成熟DC數目。然而，如圖2B所示，各種DC成熟培養基並未導致成熟DC上的共刺激分子表現有顯著差異。如圖2C所示，I+M、I+M1、及I+M+G1培養基顯著增加成熟DC之IL12/IL10比率。評級為對誘導DC成熟具最高功效至最低功效的DC成熟培養基係如下：I+M>I+M+G1>I+M+R1。

PGE2之效應

將抗原負載未成熟DC培養於包含MPLA、INFγ、及不同濃度的PGE2之DC成熟培養基中：DC3/4指示來自先前報導之例示性MASCT方法的DC成熟培養基，其包括IL6、TNFα、IL1β、及Poly I：C；M+I培養基，其包含INFγ及MPLA，但無PGE2；M+I+P1培養基，其包含INFγ、MPLA、及低濃度的PGE2；M+I+P2培養基，其包含INFγ、MPLA、及中等濃度的PGE2；M+I+P3培養基，其包含INFγ、MPLA、及高濃度的PGE2。PGE2的濃度係介於0.1μg/mL與5μg/mL之間。

DC成熟培養基對誘導DC成熟的效應係顯示於圖3A至圖3C中，並彙總於下表1中。對誘導DC成熟具有最高功效的DC成熟培養基係M+I+P1。

實例2：最佳化共培養條件 細胞激素混合物之效應

在初始共培養基(AIM-V培養基)中將來自冷凍儲備液的經解凍T細胞與實例1中所製備之抗原負載成熟DC混合，以提供共培養物。初始共培養基含有IL-2或介白素混合物(包括IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)、及抗PD-1抗體SHR-1210(Jiangsu Hengrui)。將共培養物培養19天。

為了判定腫瘤抗原特異性T細胞的增生，如Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit(Invitrogen)中所述，執行FACS分析。利用細胞內細胞激素染色及FACS分析，偵測腫瘤抗原特異性T細胞之IFNγ生產。用於細胞表面染色之抗人類CD3-PE抗體、及用於細胞內細胞激素染色之抗人類IFN-γ-APC抗體係獲自 BD Biosciences。利用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)固定並滲透細胞，來執行細胞內細胞激素染色。使用FACS CantoII(BD Biosciences)流動式細胞儀執行流動式細胞測量術，並利用Flowjo程式分析數據。

圖4顯示使用來自三名健康捐贈者的PBMC樣本之DC及T細胞共培養的結果。相較於具有單獨IL-2之初始共培養基，具有介白素混合物之初始共培養基產生較高的分泌IFNγ之腫瘤抗原特異性T細胞的增生水平及百分比於共培養物中。

抗 PD-1、IL-2、及抗 CD3抗體之效應

在初始共培養基(AIM-V培養基)中將來自冷凍儲備液的經解凍T細胞與實例1中所製備之抗原負載成熟DC混合，以提供共培養物。如下表2所示，使共培養物經受各種條件。例如，測試以下的初始共培養基：具有或不具有抗PD-1抗體SHR-1210(Jiangsu Hengrui)，具有低濃度或高濃度的IL-2(rIL-2；R&D Systems,Minneapolis,MN)，且在自共培養開始起3天或5天後將抗CD3抗體(eBioscience,San Diego,CA)添加至共培養物。將DC與T細胞共培養總共19天。如上所述，判定共培養物中的腫瘤抗原特異性T細胞之數目及分泌IFNγ之T細胞的百分比。

「CIK」條件類似於用於製備經細胞激素誘導之殺手細胞的標準條件，除了在共培養開始後3天添加抗CD3抗體。「先前MASCT」條件類似於如先前於WO2016145578A1中所揭示的用於製備活化T細胞之例示性條件，除了在共培養開始後3天添加抗CD3抗體。如圖5A所示，條件2在共培養物中產生最高的腫瘤抗原特異性T細胞數目、及最高的分泌IFNγ之T細胞百分比。

不同 IL-2濃度之效應

在初始共培養基(AIM-V培養基)中將來自冷凍儲備液的經解凍T細胞與實例1中所製備之抗原負載成熟DC混合，以提供共培養物。初始共培養基含有抗PD-1抗體SHR-1210(Jiangsu Hengrui)、介白素混合物、低濃度或高濃度的IL-2(rIL-2；R&D Systems,Minneapolis,MN)，且在自共培養開始起3天或5天後將抗CD3抗體(eBioscience,San Diego,CA)添加至共培養物。將DC與T細胞共培養總共19天。IL-2的濃度係介於100IU/mL與1000IU/mL之間。如上所述，判定共培養物中的腫瘤抗原特異性T細胞之數目、及分泌IFNγ之T細胞的百分比。

如圖5B所示，相較於低濃度的IL-2，高濃度的IL-2在共培養物中產生較高的腫瘤抗原特異性T細胞數目、及較高的分泌IFNγ之T細胞百分比。

實例3：例示性改良MASCT及先前MASCT細胞製備方法的比較

此實例提供使用下列來製備之免疫細胞的直接比較(head-to-head comparison)：本申請案中所述之例示性細胞製備方法(「改良MASCT規程」)對WO2016145578A1中所揭示之例示性細胞製備方法(「先前MASCT規程」)。

對成熟 DC之 IL-12分泌的效應

藉由以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)進行的密度梯度離心，獲得來自健康志願者及癌症患者的周邊血液單核細胞(PBMC)。繼續將黏附單核球培養於AIM-V培養基中以分化為未成熟樹突細胞(DC)，該AIM-V培養基具有1000U/mL GM-CSF及500U/mL IL-4。將所得未成熟DC以多種腫瘤抗原肽池(1μg/mL/肽)進行脈衝，隨後於「改良MASCT」DC成熟培養基或「先前MASCT」DC成熟培養基中培養兩天以分化為成熟DC。改良MASCT DC成熟培養基包含IFN-γ、MPLA、及PGE2。先前MASCT DC成熟培養基包含IL-6、TNF-α、IL-1β、POLY(I：C)、及PGE2。判定自成熟DC之IL-12p分泌水平。

藉由ELISA評估成熟DC之細胞激素分泌。如圖6A至圖6B所示，相較於由先前MASCT DC成熟培養基所誘導之DC，由改良MASCT DC成熟培養基所誘導之DC分泌顯著較高水平的IL-12p70。值得注意的是，相較於先前MASCT DC成熟培養基，改良MASCT DC成熟培養基藉由使用來自癌症患者的PBMC導致IL-12p70分泌水平增加多於70倍。相較於衍生自健康志願者的DC，衍生自癌症患者的DC之IL-12分泌增加更為明顯。藉由使用改良MASCT DC成熟培養基所製備之成熟DC而增強的細胞激素分泌水平增加了DC對實體腫瘤的細胞毒性。

對腫瘤特異性 T細胞之效應

根據例示性改良MASCT規程或例示性先前MASCT規程，將衍生自健康志願者(n=5)的PBMC之T細胞與抗原負載成熟DC共培養。改良MASCT規程涉及在初始共培養基中將T細胞與抗原負載成熟DC共培養，該初始共培養基含有介白素混合物(包括IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)、及抗PD-1抗體SHR-1210(Jiangsu Hengrui)。當將抗CD3抗體添加至共培養物時，將該共培養物培養5天。將細胞共培養總共19天，以提供活化T細胞。先前MACT規程涉及在共培養基中將T細胞與抗原負載成熟DC共培養，該共培養基含有IL-2及抗CD3抗體。將細胞共培養總共19天，以提供活化T細胞。

利用如實例2所述之細胞內細胞激素染色及FACS分析，偵測回應於腫瘤抗原的活化T細胞之IFNγ生產。如圖7所示，相較於 使用先前MASCT規程者，使用改良MASCT規程顯著增加(約2至4倍)共培養物中的生產IFNγ之活化T細胞的百分比。

使用改良MASCT規程及先前MASCT規程製備的活化T細胞之抗腫瘤效應係使用各種實體腫瘤細胞系來判定，該等實體腫瘤細胞系包括MBA231(乳癌細胞)、CNE1(鼻咽癌細胞)、HepG2(肝癌細胞)、及Saos-2(骨肉瘤細胞)。簡言之，將腫瘤細胞培養於補充有下列之DMEM中：10%失活胎牛血清、100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素、Glutamax、MEM NEAA(Gibico,Carlsbad,CA)。將腫瘤細胞用D-PBS(Invitrogen)洗滌，並將其與活化T細胞在96孔圓底盤中以1：10或1：30之T細胞：目標(T：目標)比率以三重複於AIM-V中共培養4小時。細胞毒性顯示為在裂解後釋放並由Cytotox 96檢定套組(Promega G1780,Canada)測得的最大LDH之百分比。

如圖8所示，相較於使用先前MASCT規程製備的活化T細胞，使用改良MASCT規程製備的活化T細胞針對所有四種類型的腫瘤細胞系皆具有顯著增強的細胞毒性。

實例4：改良MASCT臨床研究

改良MASCT研究係一種開放標籤的多中心研究，其旨在探討改良MASCT方法之實施例在治療患有實體腫瘤之患者中的安全性及療效，該等實體腫瘤包括肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、子宮內膜癌、結腸直腸癌、及肺癌。參與試驗之患者可能先前已接受根除性切除(諸如切除或RFA)或一線化療。

患者接受一或多個週期的改良MASCT治療。例如，患者可在1至2年期間每1至3個月接受一個週期的改良MASCT治療。在各週期的改良MASCT治療中，PBMC係獲自各患者。未成熟樹突細胞係獲自PBMC。在第1天，將未成熟樹突細胞以抗原肽池進行脈衝，該抗原肽池包括至多44種衍生自下列之抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、CDCA1、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。抗原肽池亦可含有至多10種衍生自新抗原之抗原肽。將載有抗原肽池之未成熟樹突細胞培養於DC成熟培養基中，以提供載有該抗原肽池之成熟樹突細胞，該DC成熟培養基含有IFN-γ、MPLA、及PGE2。在第8天，患者接受載有抗原肽池之成熟樹突細胞的皮下注射。自第8天至第13天，將PBMC中的T細胞與載有抗原肽池之成熟樹突細胞在細胞激素混合物(IL-2、IL-7、IL-15、IL-21)及抗PD-1抗體(例如，SHR-1210)存在下共培養。在第13天，將抗CD3抗體(例如，OKT-3)添加至共培養物。在第28天，將含有活化T細胞的共培養物輸注至患者。在組合療法組中，患者接受抗PD-1抗體治療或化療治療。

除非患者經歷疾病進展或不可接受之毒性，否則各患者接受改良MASCT治療達至多18個週期。對患者追蹤約2.5年或直到所有患者死亡或有疾病進展為止(以較早發生者為準)。

患者必須符合所有下列標準以具進入研究的資格。

1.患者經診斷出患有實體腫瘤，該等實體腫瘤包括肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、子宮內膜癌、結腸直腸癌、及NSCLC；

2.如RECIST標準1.1針對實體腫瘤所定義的至少一種可測量病變；

3.在主門靜脈、肝管之第一分支、肝靜脈之第一分支、或下腔靜脈中無癌栓；

4.ECOG體能狀態(ECOG-PS)

2；

5.預期存活時間多於6個月；

6.血液、肝臟、及腎臟之測試符合以下標準：

a.WBC>3×10⁹/L

b.嗜中性球計數>1.5×10⁹/L

c.血紅素

85g/L

d.血小板計數

50×10⁹/L

e.PT正常或延長時間<3s

f.BUN

上限的1.5倍，

g.血清肌酸酐

上限的1.5倍

7.根據當地機構及/或大學人體實驗委員會規定及/或中央機構審查委員會(Institutional Review Board,IRB)或其他者(適當時)獲得並簽署的患者同意。

符合任何下列標準的患者不具進入研究的資格：1.壞孕或哺乳期間或計畫在2年內懷孕的女性； 2.如由CT或MRI評估所判定的已知活動性腦部轉移；3.知道在6個月內全身性及連續使用免疫調節劑(諸如干擾素、胸腺素、中藥)的時期；4.呈HIV抗體或HCV抗體陽性；5.具有免疫缺乏疾病或自體免疫疾病(諸如類風濕性關節炎、Buerger氏病、多發性硬化症、或第1型糖尿病)之病史；6.患有器官衰竭的患者；7.患有嚴重精神疾病的患者；8.參與試驗前1年內藥物成癮，包括酗酒；9.在篩選前3個月內參加其他臨床試驗；10.研究者認定不適於該研究的其他原因。

主要成果量度包括改良MASCT治療的安全性及療效。次要成果量度包括整體存活(overall survival,OS)、無進展存活(progression-free survival,PFS)、客觀反應率(objective response rate,ORR)、完全反應(complete response,CR)、部分反應(partial response,PR)、疾病穩定率(stable disease rate,SDR)、及疾病相關生物標記測量。使用RECIST標準(v1.1)評估腫瘤反應及進展。基於生命徵象、臨床實驗室發現、及根據NCI CTCAE第4.02版分級的不良事件，評估安全性。執行ELISPOT檢定，以判定各患者在各週期的改良MASCT治療中活化T細胞之抗原肽特異性反應。

實例5：經新MASCT治療之患者對新抗原的免疫反應

為了探討新抗原是否可在患有實體腫瘤(例如，HCC、子宮內膜癌、及結腸癌)的患者中誘導腫瘤特異性免疫反應，對經根除性切除後的患者施加使用改良MASCT製備規程的新抗原刺激細胞療法(「新MASCT」)。

根據實例4所述之臨床規程，患者接受新MASCT治療。如圖9所示，在各週期的新MASCT治療中，各患者接受載有多種共有腫瘤相關抗原(TAA)及數種個人化新抗原之肽池的成熟樹突細胞(DC)注射，隨後接受由此等DC刺激的自體T細胞輸注。共有腫瘤相關抗原(TAA)包括一般腫瘤抗原及癌症類型特異性腫瘤抗原兩者。患者接受1至10個週期的新MASCT治療。

圖10顯示用於設計新抗原肽的示意性流程圖。為了獲得新抗原序列，在進行活檢或手術之後立即取得新鮮腫瘤樣本，以用於後續全外顯子定序(WES)及RNAseq。藉由將來自腫瘤與正常組織的次世代定序數據進行比較，來偵測包括SNV、非移碼插入/缺失(插入或缺失)、及新ORF之所有突變。根據患者的HLA I類基因型，藉由MASNEO^TM演算法來預測所有新表位候選物。選擇具較高親和性的含有25至31個胺基酸之長新抗原肽，以用於進一步合成及治療。較佳的是含有多個新表位之肽。較少數的新抗原肽可使用NetMHC演算法(Andreatta M,Nielsen M.Bioinformatics(2016)Feb 15；32(4)：511-7)自相同次世代定序結果預測。

進行ELISPOT檢定以判定患者是否發展出對腫瘤抗原肽(包括新抗原肽)之各者的MHC限制性T細胞反應。簡言之，將來 自患者之PBMC在細胞培養盤上接種(1×10⁶個細胞/孔)於不具任何細胞激素的AIM-V培養基中，並進一步用個別抗原肽刺激48h。然後，將PBMC轉移至96孔ELISPOT檢定盤(U-CyTech Biosciences)上以用於IFNγ偵測。將PBMC進一步用肽再刺激16h。根據製造商之說明書，執行並分析ELISPOT檢定。用電腦輔助影像分析軟體(ChampSpot；Saizhi)判定斑點形成單位數。反應係以每10⁵個PBMC/孔的斑點形成單位來顯示。結果係以藉由特異性肽組：不相關肽組計算之IFNγ生產倍數指數來展示。例示性原始ELISPOT結果係顯示於圖14中。

圖11彙總八名對新抗原肽有反應之患者的ELISPOT結果，包括六名HCC患者、一名子宮內膜癌患者、及一名結腸癌患者。如MASNEO^TM所預測，各患者回應於25%至100%的新抗原肽。使用由MASNEO^TM預測的新抗原肽，在患者中達到66%的整體反應率。

在HCC患者組內，八名HCC患者已接受新MASCT，並使用ELISPOT檢定來測試其中七名之對TAA及新抗原兩者的特異性免疫反應。結果顯示，新MASCT分別在五名患者(5/7,71%)中誘導了TAA特異性免疫反應，並在六名患者(6/7,86%)中誘導了新抗原特異性免疫反應。在新MASCT治療後，一名患者(患者#2)展示對所有五種新抗原肽(5/5,100%)的特異性T細胞反應。在六名有反應的HCC患者中，新抗原的平均反應率係65%(22/34的肽)。

圖12顯示使用來自患者#2之在新MASCT治療之前及在四個週期的新MASCT治療之後的PBMC之ELISPOT結果。「基本 肽」指示使用一般腫瘤抗原肽池的結果，其包括：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CDCA1、VEGFR1、VEGFR2、RGS5、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、及WT-1。「HCC肽」指示使用HCC特異性腫瘤抗原肽池的結果，其包括HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。在新MASCT治療之後，觀察到對基本肽池、HCC肽池、以及個別腫瘤抗原肽(例如，p53、存活素、CEA、CDCA1、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、Her2、GPC3、及SSC)的增強T細胞反應。

圖13顯示使用來自患者#2之在新MASCT治療之前、在2個週期的新MASCT治療之後、及在5個週期的新MASCT治療之後的PBMC之ELISPOT結果。「新肽」指示使用新抗原肽池的結果，其包括ZGQ-1、ZGQ-2、ZGQ-4、ZGQ-5、ZGQ-6、及ZGQ-7。在多輪新MASCT治療之後，觀察到對新肽池及個別新抗原肽的增強T細胞反應。

總而言之，結果證實，具有改良MASCT製備規程的新MASCT在癌症患者中耐受良好，並引發對多種腫瘤抗原(尤其是個人化新抗原)的免疫反應。在此實例中的新MASCT治療使用新抗原肽及腫瘤相關抗原肽兩者。鑒於對新抗原肽的高特異性T細胞反應率，吾人計畫進行使用新抗原肽池而未使用任何一般腫瘤抗原肽的臨床研究，以製備用於實體腫瘤患者的新MASCT治療之活化T細胞。

Claims (7)

1. 一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞(DC)群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及c)在該共培養開始後3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。
2. 如請求項1之方法，其中步驟a)進一步包含在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑，其中該TLR促效劑係選自由MPLA、Poly I：C、雷西莫特(resquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)及CL075所組成之群組。
3. 一種製備活化T細胞群之方法，該方法包含：a)使樹突細胞(DC)群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群，該DC成熟培養基包含MPLA、干擾素γ(INFγ)及前列腺素E2(PGE2)；及c)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與T細胞群共培養，其中步驟c)包含：在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽 之該樹突細胞群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群，從而獲得該活化T細胞群。
4. 如請求項2或3之方法，其中該DC成熟培養基包含INFγ及MPLA；其中：(1)該INFγ以至少100IU/mL的濃度存在於該DC成熟培養基中；且/或(2)該MPLA以至少0.5μg/mL的濃度存在於該DC成熟培養基中。
5. 如請求項2或3之方法，其中該DC成熟培養基進一步包含PGE2，其中該PGE2以至少0.1μg/mL的濃度存在於該DC成熟培養基中。
6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中：(i)該複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15及IL-21，其中該IL-2以至少500IU/mL的濃度存在於該初始共培養基中；且/或(ii)該免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體，其中該抗PD-1抗體以至少10μg/mL的濃度存在於該初始共培養基中。
7. 如請求項1至3中任一項之方法，其中：(i)在該共培養開始後3至7天，將該抗CD3抗體添加至該共培養物，其中在該共培養開始後5天，將該抗CD3抗體添加至該共培養物；且/或(ii)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該樹突細胞群與該T細胞群在該抗CD3抗體存在下共培養至少10天。

Images