CN107683328A - 用于直接接种果实或植物基质的压榨酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在果实或植物基质的发酵(例如用于饮料如葡萄酒或啤酒的发酵)中直接接种的新型压榨酵母。特别地，本发明涉及优选冷冻形式的干物质含量为35％至90％(w/w)的压榨酵母、通过用所述压榨酵母直接接种果实或植物基质来生产发酵饮料的方法和包含所述压榨酵母的容器。

Description

用于直接接种果实或植物基质的压榨酵母
技术领域
本发明涉及一种用于在果实或植物基质的发酵(例如用于饮料诸如酒或啤酒等的发酵)中直接接种的新型压榨酵母。特别地，本发明涉及优选冷冻形式的干物质含量为35％至90％(w/w)的压榨酵母、通过用所述压榨酵母直接接种果实或植物基质来生产发酵饮料的方法和包含所述压榨酵母的容器。
发明背景
在酿酒行业中，所用的酵母通常是干物质含量超过90％(w/w)的活性干酵母(ADY)，其在接种到酒之前需要在特定温度下的耗时的再水合和再活化。
ADY的生产包括几个步骤，其中使酵母首先在发酵罐中产生，浓缩，过滤，最后包括压榨酵母的流化床干燥。
然而，这个过程意味着产品在可以用于接种之前需要经过几个步骤(再水合、再活化和适应)。
由于产品逐渐干燥，酵母细胞脱水，因此需要再水合，然后在合适的培养基中再活化，以在施用于基质(例如如葡萄酒酿造情况中的葡萄汁)之前具有代谢活性。这对酵母细胞而言是一个非常微妙的过程，需要大量的时间和精力，因为诸如温度、时机和活化培养基等因素对于确保细胞的存活是重要的。因此，在葡萄酒酿造过程中在商业酿酒厂，ADY的再水合通常需要大量的熟练工时。
在活性干酵母生产的干燥过程中，酵母细胞的细胞膜失去其可渗透性屏障功能(Roger Boulton等，1996，第124页)。因此，为了重新建立这种功能，通过在40℃下将酵母加至水中20分钟来再水合膜是重要的。因此，酵母再水合过程通常涉及在35-38℃的温度下在未氯化水或水/葡萄汁混合物(2:1)中再水合20-30分钟，然后加入同样体积的葡萄汁(50:50的果汁/水混合物)，将其静置另外的20-30分钟，然后将其加入葡萄酒中。重要的是，葡萄汁不含有任何SO2，SO2可在敏感的再水合过程中杀死酵母细胞(O'Kennedy，2008)。此外，在水中20分钟后，再水合混合物必须用果汁冷却，每次5℃。30分钟后不能从再水合温度冷却也可导致显著的细胞死亡(O'Kennedy，2008)。此外，应注意将未受污染的葡萄汁用于再水合方案，因为用受污染的葡萄汁进行再水合将导致使用再水合混合物接种的全部酒发酵的污染。不同的制造商提出了这个方案的变化，但关键的步骤是，脱水细胞需要在特定的温度在清洁条件下暴露于水或水/果汁混合物特定的次数，以便恰当水合，从而避免细胞死亡和作为结果的失活。由于葡萄汁中的高糖浓度、SO2和其它化合物不允许酵母的最佳再水合，因此不推荐将活性干酵母直接加入到果汁中。为此，葡萄酒酵母制造商都没有提出将活性干酵母直接接种到鲜葡萄汁。
活性干酵母(ADY)在没有最佳再水合时失去活性(Soubeyrand等，2006)。ADY的不正确再水合也可导致酒精发酵停滞(O'Kennedy，2008)，即酵母不发酵基质中存在的所有糖，导致饮料太甜。
将酵母添加至基质的另一种方式是使用可直接添加至基质的冷冻酵母(WO2011/134952)。在该方法中，产品是干物质含量低于28％(w/w)的冷冻乳状酵母(cream yeast)，其允许直接接种和在直接接种期间高存活率。浓缩物在-50℃冷冻。这种方法的缺点是，产品在-50℃下冷冻、冷链分配并在-50℃储存是至关重要的。而且，浓缩物的苛刻的冷冻条件损害酵母细胞，影响其存活率。结果，通常在冷冻之前将冷冻和/或干燥期间和之后稳定酵母细胞的添加剂加入到液体浓缩物中。
消费者越来越需要所谓的“清洁标签”食品，其中添加到产品中的添加剂的数量是有限的。食品工业努力遵循食品当局和政府间组织如OIV(国际葡萄与葡萄酒组织，http://www.oiv.int)、EBC(欧洲啤酒公约)和ASBC(美国酿造化学家协会)的国家特异性法规和建议。此外，使用添加剂稀释浓缩物，导致最终压榨酵母制剂中酵母细胞浓度(每单位体积浓缩物的集落形成单位(CFU))较低。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于通过直接接种果实或植物基质而发酵饮料的酵母的改良制剂，其允许酵母在不存在添加的添加剂下较高的存活率，所述添加剂例如乳化剂、油、水分活性改性剂和经添加以改善冷冻、干燥和/或冷藏过程中酵母细胞的稳定性的物质。除了用于饮料的发酵之外，预期根据本发明的酵母制剂非常适合通过直接接种富含碳水化合物的液体基质进行乙醇发酵。
本发明人惊奇地发现，干物质含量在35％至90％(w/w)之间的压榨酵母如葡萄酒和啤酒酵母显示在冷冻时高的存活率，尽管含水量相对较高和在不存在经添加以改善冷冻、干燥和/或冷藏过程中酵母细胞的稳定性的物质。另外，压榨酵母对于直接接种果实或植物基质是理想的，导致接近100％的存活力，并且可将压榨酵母在清洁条件下(例如真空包装以避免污染)在4℃下储存数月，或长时间冷冻保存。
发明详述
图1显示了用于生产ADY和用ADY接种基质(顶部)以及生产根据本发明的压榨酵母(底部)的下游方法的不同步骤。
从图1(底部)可以看出，根据本发明的压榨酵母的生产以及根据本发明的压榨酵母的接种都显著缩短，导致生产成本降低。
本发明在第一方面涉及提供用于直接接种果实或植物基质的干物质含量在35％和90％(w/w)之间的压榨酵母。在一些实施方案中，所述干物质含量在30％与45％之间，例如在30％与40％之间或在35％与45％之间。
在另一个实施方案中，压榨酵母的干物质含量在45％和75％(w/w)之间。
通过在105℃+/-5℃加热以蒸发水分来测量样品的干物质含量。在干燥之前和之后测量样品，并且进行下面的计算以获得以％(w/w)表示的干物质含量：
使用以下等式计算以质量百分比或克/千克表示的干物质(Wdm)含量：
其中：
Wdm为以百分比或克/千克计的样品的干物质；
ma为以克计的空盘或坩埚的质量；
mb为以克计的含有样品的盘或坩埚的质量；
mc为完全脱水并除去所有的水后以克计的含有样品的盘或坩埚的质量，克(g)，；
f为换算系数，对于以百分比表示的结果，f＝100，且对于以克/千克计的表述，系数f＝1000。
值应该四舍五入到最接近的0.1％(w/w)或者最接近的1g/kg。
在优选的实施方案中，根据本发明的压榨酵母不包含任何添加的添加剂。
在优选的实施方案中，冷冻后压榨酵母的存活率为至少20％，如根据冷冻前压榨酵母的CFU(集落形成单位)浓度和冷冻后压榨酵母的CFU浓度所计算的。优选地，酵母的存活率为至少25％，例如至少30％、例如至少35％、例如至少40％、例如至少45％、例如至少50％、例如至少55％、例如至少60％、至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％。最优选地，所述存活率是100％。
在优选的实施方案中，直接接种果实或植物基质后，压榨酵母的存活率为至少60％，如根据压榨酵母的CFU(集落形成单位)浓度和接种物的CFU浓度所计算的。优选地，酵母的存活率为至少65％，例如至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％。
在另一个优选的实施方案中，在-20℃的温度下储存5个月接着直接接种果实或植物基质之后，压榨酵母的存活率为至少80％，如根据储存之前压榨酵母的CFU(集落形成单位)浓度和接种物的CFU浓度所计算的。优选地，酵母的存活率为至少85％，例如至少90％，例如至少95％。
在优选的实施方案中，压榨酵母在低于0℃的温度下冷冻。优选地，将压榨酵母在显著低于0℃的温度下(例如在-5℃下，例如在-20℃下，例如在-50℃下)冷冻。
在优选的实施方案中，根据本发明的冷冻压榨酵母在不存在添加到液体酵母浓缩物中以便在冷冻期间和之后稳定酵母细胞的任何添加剂的情况下冷冻。
在优选的实施方案中，冷冻后冷冻压榨酵母的存活率为至少20％，如根据冷冻前压榨酵母的CFU(集落形成单位)浓度和冷冻后压榨酵母的CFU浓度所计算的。优选地，酵母的存活率是至少25％、至少30％、例如至少35％、例如至少40％、例如至少45％、例如至少50％、例如至少55％、例如至少60％、至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％。最优选地，存活率是100％。
可以通过技术人员已知的任何合适的方法来确定酵母的存活率。在优选实施方案中，如OIV在International Oenological Codex 2013版第二章中所述进行CFU/g和CFU/ml细胞计数的测定。
在优选的实施方案中，冷冻的压榨酵母的存活率在直接接种果实或植物基质后为至少60％，如根据压榨酵母的CFU(集落形成单位)浓度和接种物的CFU浓度计算的。优选地，酵母的存活率为至少65％，例如至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％。
在另一个优选的实施方案中，在-20℃的温度下储存5个月随后直接接种果实或植物基质之后，冷冻的压榨酵母的存活率为至少80％，如根据冷冻和储存前的压榨酵母的CFU(集落形成单位)浓度和接种物的CFU浓度计算的。优选地，酵母的存活率为至少85％，例如至少90％，例如至少95％。
根据本发明的压榨酵母优选以浓缩形式存在。
在优选的实施方案中，压榨酵母含有至少109CFU/g酵母，例如至少5x109CFU/g酵母，例如至少1010CFU/g酵母，例如至少5x1010CFU/g酵母，例如至少1011CFU/g酵母，例如至少5x1011CFU/g酵母，例如至少1012CFU/g酵母。
在优选的实施方案中，压榨酵母选自下列属：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Lachancea、有孢圆酵母属(Torulaspora)、酒香酵母属(Brettanomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hanseniaspora)、类酵母属(Saccharomycodes)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)和德巴利酵母属(Debaryomyces)。
在优选的实施方案中，压榨酵母是酵母属酵母，优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
在另一个优选的实施方案中，酵母是葡萄酒酵母或啤酒酵母，优选葡萄酒酵母或啤酒酵母是选自酵母属、克鲁维酵母属、Lachancea、有孢圆酵母属、酒香酵母属、毕赤酵母属和梅奇酵母属酵母的酵母。
本发明进一步提供用于产生发酵饮料的方法，其包括以下步骤：
a)提供用于产生饮料的果实或植物基质；
b)用根据本发明的压榨酵母直接接种所述基质；和
c)用压榨酵母发酵所述基质以获得发酵饮料。
如技术人员已知的，直接接种意指将压榨酵母直接加入到果实或植物基质中而无任何再水合或再活化步骤。
发酵可以在好氧或厌氧条件下进行，或者可以在一系列好氧和厌氧条件下进行。
在优选实施方案中，发酵饮料选自葡萄酒、啤酒、苹果酒、清酒和软饮料。优选地，发酵饮料是葡萄酒。
在另一个优选的实施方案中，用于产生饮料的果实或植物基质是果汁或植物汁。优选地，果汁是葡萄汁，并且发酵饮料是葡萄酒。
预期根据本发明的压榨酵母将同样适用于在厌氧条件下直接接种水性果实或植物基质以用于乙醇发酵的类似方法中。合适的果实或植物基质是富含碳水化合物的基质，包括但不限于基于玉米糖浆、蔗糖/糖蜜的水溶液。
本发明的另一方面涉及一种容器，其包含根据本发明的压榨酵母。在优选实施方案中，容器选自纸盒或密封塑料容器。
定义
本文中的术语“乳状酵母”是指通过在发酵罐中繁殖酵母接着通过离心浓缩而常规产生的干物质含量低于28％(w/w)的液体酵母。
术语“压榨酵母”在本文中是指通过在发酵罐中繁殖酵母，接着浓缩、过滤、挤出和任选地在干燥器例如流化床干燥器上部分干燥而常规地产生的干物质含量在35％与90％(w/w)之间的酵母。在一些实施方案中，干物质含量在30％与45％之间，例如在30％与40％之间或在35％与45％之间。
因此，术语“部分干燥的压榨酵母”在本文中是指通过在发酵罐中繁殖酵母，接着浓缩、过滤、挤出和在干燥器例如流化床干燥器上部分干燥而产生的干物质含量在45％与90％(w/w)之间的酵母。
术语“活性干酵母”或“ADY”在本文中是指通过在发酵罐中繁殖酵母，接着浓缩、过滤、挤出和在流化床干燥器上干燥而常规地产生的干物质含量超过90％(w/w)的酵母。
术语“植物”在本文中是指任何植物。优选地，本文中的术语“植物”是指可食用植物或可食用植物部分。
术语“果实”在本文中是指从花形成的植物的可食用部分。果实可以包括可食用部分的任何附属组织，例如外壳、果皮或豆荚。
术语“酵母增强剂”在本文中是指在酵母繁殖之前或期间添加的补充营养素，例如维生素、氮、磷酸盐或矿物质。
术语“添加剂”在本文中是指食品级物质，其在繁殖酵母后在酵母制剂产生期间的任何时间点添加到酵母浓缩物中，例如以帮助挤出和切割酵母浓缩物，例如乳化剂(包括但不限于甘油、葡萄糖、蔗糖和海藻糖以及油)，以改善冷冻和/或冷藏期间酵母细胞的稳定性，以改变冷冻酵母制剂的熔点，例如水分活性改性剂等。
当提及添加剂时，术语“添加”在本文中是指在产生压榨酵母期间将添加剂以足以产生所需效果的量引入酵母浓缩物中。
附图简述
图1描述了用于制备ADY和用于接种ADY的方案(上图)以及用于制备用于直接接种以制备发酵饮料的根据本申请的压榨酵母的方案(下图)。
图2显示了将浓缩物保持在4℃或将浓缩物在冰箱或液氮中于-20℃、-50℃冷冻并在指定的温度储存酵母1个月后的酿酒酵母的存活率。
图3显示了将浓缩物保持在4℃或将浓缩物在冰箱或液氮中于-20℃、-50℃冷冻并在指定的温度储存酵母1个月接着在鲜葡萄汁中直接接种后的酿酒酵母的存活率。
图4显示了酿酒酵母的总存活率，其包括处理后的存活率(图3)和直接接种中的存活率(图2)。
图5显示了在处理之前和在指定温度储存不同时间之后，配制为根据本发明的压榨酵母的酿酒酵母或配制为ADY的酿酒酵母的存活率。
图6显示了分别在直接接种和ADY酵母的标准接种(酵母的“再活化”)之后，酿酒酵母ADY酵母和根据本发明的酿酒酵母冷冻压榨酵母的酵母细胞存活率之间的比较。
实施例
实施例1
在生产常规的酿酒酵母菌株期间，在生产期间的三个不同阶段取样；1)作为离心后液体(乳状)酵母；2)作为挤出后干物质含量为40％的压榨酵母(鲜酵母)；和3)作为流化床干燥后干物质含量为92％的活性干酵母(ADY)：
根据细胞计数、在将浓缩物保持在4℃或将浓缩物在冰箱或液氮中于-20℃、-50℃冷冻并在指定的温度储存1个月后的存活率(图2)、在将浓缩物保持在4℃或将浓缩物在冰箱或液氮中于-20℃、-50℃冷冻并在指定的温度储存1个月接着在鲜葡萄汁中直接接种后的存活率(图3)以及在将浓缩物保持在4℃或将浓缩物在冰箱或液氮中于-20℃、-50℃冷冻并在指定的温度储存1个月后在鲜葡萄汁中直接接种的总存活率(图4)，分析这些样品。
处理的存活率和随着时间的推移的存活率
将液体酵母以未经处理的200ml样品或与20％海藻糖一起的所述样品在-20℃冰箱中冷冻。在冷冻之前测量细胞计数，并在冷冻一个月后再次测量细胞计数，并且随着时间推移测量细胞计数。
将压榨酵母以不同的体积和在不同的温度冷冻以验证冷冻速率对酵母细胞存活率的影响。样品的大小是200ml瓶(大)和50ml离心管(小)。冰箱的温度分别为-20℃和-50℃。
还将压榨酵母在液氮中作为丸粒(1-2ml长(小)和5g块(大))冷冻。
为了确定酵母存活率(以百分比计)，在冷冻之前并再次于冷冻后一个月(图2)而且随着时间推移(图5)测量细胞计数。
直接接种的存活率
所有的样品在储存1个月后也用于直接接种，以便观察当酵母细胞暴露于水和葡萄汁中的高渗透压时的存活率。将1.0g样品加入到200mL雷司令汁中(表1)。通过温和搅拌溶解样品，样品在大约10-15min后溶解。进行系列稀释并且为了测定酵母存活率(以百分比计)，直接接种后计算CFU/g(图3)。
表1：用于1个月后的直接接种实验的葡萄汁的参数
葡萄汁 糖(g/l) 苹果酸(g/l) TSO2(mg/l)
雷司令(德国) 180 6.6 0
通过直接接种和“再活化”酵母进行的存活率比较
比较了通过使用两种不同方法进行的接种的存活率。在两种方法中，接种体积为0.2g/l。对于直接接种，将样品直接加入霞多丽(Chardonnay)汁(表2)。对于标准接种，首先将样品在未氯化水中以1:10再水合约半小时。然后将未硫化的葡萄汁按比例(1:3)加入水中，然后将悬浮液静置以再活化约20分钟。然后将最终的活化悬浮液加入到果汁中以达到0.2g/l的最终接种水平。所有接种一式两份进行。
在接种前和接种后计算产物的CFU/g，然后以百分比计算存活率(图6)。
表2：用于8个月后的直接接种实验的葡萄汁的参数
葡萄汁 糖(g/l) 苹果酸(g/l) TSO2(mg/l)
霞多丽(德国) 180 6.7 0
集落形成单位(CFU)的测定
为了测定CFU/g和CFU/ml，通过在YGC培养基(如由OIV在InternationalOenological Codex 2013版附录VI所述制备)上倒板对自接种的葡萄汁或溶解在蛋白胨水中的酵母中获得的样品进行细胞计数。将1ml来自稀释系列(蛋白胨水)的样品加入到板中，另外将液体YGC琼脂(45℃)倒在样品上并混合。放置后，将板在30℃温育2-3天。在所有情况下，CFU的测定以一式三份进行。
结论：
结果表明尤其对于在4℃储存的压榨酵母和在-50℃或液氮中冷冻的压榨酵母，直接接种的酵母的存活率(图2)非常高。
在不同的处理并将样品在该温度下储存1个月后，酵母的存活率显示高的变化(图3)。令人惊讶的是，具有高含水量的压榨酵母当在-20℃和-50℃冷冻时显示出接近100％的存活率。当压榨酵母在液氮中冷冻时，存活率(>60％)也惊人地高。液体酵母在冷冻期间显示非常低的存活率，在4℃下储存1个月时，ADY也失去高百分比的CFU。
整体生存率表明，压榨酵母即使在冷冻时也显示最高的生存率(图4)。在-50℃冷冻并用于直接接种的压榨酵母的存活率接近100％。
在5个月内测量不同形式的稳定性，结果如图5所示。即使由于样品已被取出几次，温度不是恒定的，压榨酵母样品的细胞计数是非常稳定的。
仅仅跟踪在4℃下储存的压榨酵母4个月，因为样品没有以适当的清洁方式包装以保存更长的时间。与在再水合和再活化后接种时相比，活性干酵母(ADY)产品在直接接种时显示更低的存活率(图6)。当用于直接接种时，ADY显示53％的平均存活率，并且在再水合和再活化后接种时，存活率平均为81％。对于冷冻的压榨酵母，直接接种的存活率为93％，按照“标准”程序接种时的存活率为86％，这也高于ADY产品的平均值。
参考文献
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WO2011/134952

Claims (12)

1.一种生产发酵饮料的方法，其包括以下步骤：
a)提供用于生产饮料的果实基质或植物基质；
b)用压榨酵母直接接种所述基质，其中所述压榨酵母是干物质含量为35％至90％(w/w)的冷冻压榨酵母；和
c)用所述压榨酵母发酵所述基质以获得发酵饮料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述压榨酵母是冷冻压榨酵母，其中所述干物质含量为45％至75％(w/w)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述压榨酵母不包含任何添加的添加剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在不存在添加到液体酵母浓缩物中以便在冷冻期间和冷冻之后稳定酵母细胞的任何添加的添加剂的情况下，将所述压榨酵母冷冻。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如根据冷冻前压榨酵母的CFU(集落形成单位)浓度和冷冻后压榨酵母的CFU浓度所计算的，所述酵母的存活率在冷冻后为至少20％。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如根据压榨酵母的CFU(集落形成单位)浓度和接种物的CFU浓度所计算的，所述酵母的存活率在直接接种果实基质或植物基质后为至少60％。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如根据冷冻前压榨酵母的CFU(集落形成单位)浓度和接种物的CFU浓度计算的，在-20℃的温度储存5个月接着直接接种果实基质或植物基质之后，所述酵母的存活率为至少80％。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酵母是选自以下属组成的组的属：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Lachancea、有孢圆酵母属(Torulaspora)、酒香酵母属(Brettanomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hanseniaspora)、类酵母属(Saccharomycodes)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)和德巴利酵母属(Debaryomyces)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酵母是酵母属酵母。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵饮料选自葡萄酒、啤酒、苹果酒、清酒和软饮料。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述基质是果汁。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述果汁是葡萄汁，所述发酵饮料是葡萄酒。
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