BR112020001176B1

BR112020001176B1 - Método para produzir uma bebida fermentada por levedura, kit e uso da cepa de levedura capaz de produzir uma bebida fermentada

Info

Publication number: BR112020001176B1
Application number: BR112020001176-2A
Authority: BR
Inventors: Matthew J. Farber
Original assignee: University Of The Sciences
Priority date: 2017-07-20
Filing date: 2018-07-20
Publication date: 2023-11-07
Also published as: BR112020001176A2; US11286445B2; WO2019018803A1; EP3655515A1; US20220213417A1; CA3070213A1; AU2018304545A1; US20200165551A1; EP3655515A4

Abstract

a presente invenção refere-se à descoberta inesperada de uma nova linhagem de levedura, chamada de gy7b, que está relacionada à lachancea thermotolerans, mas que é genética e fenotipicamente diferente dela. a invenção propõe métodos para produzir cerveja ácida usando a gy7b, sendo que os métodos não exigem o uso de ácido láctico nem de bactérias produtoras de ácido láctico.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Com respaldo no Código dos Estados Unidos 35 § 119(e), o presente pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos EUA no 62/534.770, depositado no dia 20 de julho de 2017, o qual incorpora-se ao presente documento por referência na íntegra para todos os fins.

DECLARAÇÃO DE DEPÓSITO

[002]A cepa de levedura GY7B foi depositada, de acordo com o Tratado de Budapeste, junto à American Type Culture Collection (ATCC®) no dia 19 de julho de 2018 sob o Número de Acesso PTA-125167. De acordo com o Código de Regulamentos Federais 37 § 1.808, as depositantes garantem que todas as restrições impostas à disponibilidade ao público dos materiais depositados serão irrevogavelmente removidas quando da concessão de uma patente.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003]Estima-se que há 5,1 milhões espécies diferentes de levedura, ainda que só 1-2% tenham sido caracterizados e descritos. Diferentes cepas de levedura têm propriedades diferentes. Exemplos de categorias de cepa de levedura comercialmente proveitosas incluem a "levedura de pão" (que é um agente fermentador) e a "levedura de cerveja" (que é usada em processos de fermentação alcoólica). Deve-se ter em mente que, dentro de cada categoria, cepas específicas podem produzir diferentes subprodutos metabólicos, que alteram as propriedades dos produtos alimentícios aos quais se incorporam.

[004]Na produção da cerveja, certos estilos e técnicas de produção prestam- se a uma característica ácida. Há dois métodos principais para acidular a cerveja na indústria das bebidas fermentadas. Ácido lático de grau alimentício pode ser adicionado diretamente ao mosto ou cerveja, o que produz azedume e acidez no palato mas muitas vezes provoca um sabor tostado e insípido. O outro método envolve o uso de bactérias ácido-lácticas (LAB), em especial de bactérias pertencentes a gêneros como Lactobacillus ou Pediococcus. As LABs podem ser adicionadas ao mosto entre a brassagem e a fervura, em uma técnica denominada kettle-souring. Sabores ácidos mais plenamente desenvolvidos requerem o uso de bactérias na fermentadora ou durante a maturação da cerveja em tanques claros, barris ou foeders, podendo levar 2 meses a 2 anos para desenvolver-se plenamente.

[005]Há, portanto, a necessidade na técnica de identificar cepas de levedura que possam ser usadas na fermentação de cerveja ácida. Em certas modalidades, essas cepas devem permitir a rápida produção de cerveja ácida sem o uso de ácido lático e/ou de LABs. A presente invenção trata dessas necessidades.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006]A invenção propõe um método para produzir uma bebida fermentada por levedura. A invenção propõe ainda uma cepa de levedura capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com baixo pH e sabor ácido sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático. A invenção propõe ainda composições que compreendem uma cepa de levedura contemplada dentro da invenção. A invenção propõe ainda um kit que compreendem uma cepa de levedura contemplada dentro da invenção. A invenção propõe ainda o uso de uma cepa de levedura contemplada dentro da invenção para produzir uma cerveja com baixo pH e sabor ácido. A invenção contempla ainda o uso de um kit contemplado dentro da invenção para produzir uma cerveja com baixo pH e sabor ácido.

[007]Em certas modalidades, o método compreende fermentar um mosto na presença de uma cepa de levedura capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com baixo pH e sabor ácido sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático. Em outras modalidades, a cepa de levedura é capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com um pH de cerca de 4,2 a cerca de 3,3 sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático.

[008]Em certas modalidades, a bebida fermentada por levedura é uma cerveja. Em outras modalidades, a cerveja é produzida sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático. Em ainda outras modalidades, a cerveja é produzida sem o uso de ácido lático. Em ainda outras modalidades, a cerveja tem um pH de cerca de 4,2 a cerca de 3,3.

[009]Em certas modalidades, a cepa de levedura é capaz de reduzir o pH do mosto para cerca de 3,5 em cerca de 5 dias sem o uso de bactérias produtoras de ácido. Em outras modalidades, a cepa de levedura pertence ao gênero Lachancea. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura é a GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 no dia 19 de julho de 2018). Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1.

[010]Em certas modalidades, o método produz uma bebida fermentada por levedura com um pH de cerca de 4,2 a cerca de 3,3. Em outras modalidades, o mosto é fermentado na ausência de quaisquer bactérias produtoras de ácido. Em ainda outras modalidades, o método não compreende o uso de ácido lático, ou de um equivalente do mesmo. Em ainda outras modalidades, ácido lático, ou um equivalente do mesmo, não é adicionado ao mosto antes, durante e/ou depois da fermentação.

[011]Em certas modalidades, o mosto é fermentado na ausência de quaisquer bactérias produtoras de ácido lático. Em outras modalidades, o mosto é fermentado na ausência de bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus. Em ainda outras modalidades, o mosto é fermentado na ausência de bactérias pertencentes ao gênero Pediococcus. Em ainda outras modalidades, o mosto é fermentado na ausência de bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus e/ou Pediococcus. Em ainda outras modalidades, o mosto compreende malte derivado de um ou mais grãos selecionados dentre o grupo composto por cevada, trigo, milho, centeio, arroz, aveia, sorgo, painço, trigo-sarraceno, quinoa e teff.

[012]Em certas modalidades, o mosto é fermentado na presença de ao menos uma cepa de levedura adicional.

[013]Em certas modalidades, a cepa de levedura faz parte de uma composição que compreende ainda ao menos uma levedura adicional selecionada dentre o grupo composto por uma levedura Saccharomyces, outra levedura Lachancea e uma levedura Brettanomyces. Em outras modalidades, a cepa de levedura faz parte de uma composição que compreende ainda ao menos uma levedura Saccharomyces. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura faz parte de uma composição que compreende ainda ao menos uma levedura Lachancea adicional. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura faz parte de uma composição que compreende ainda ao menos uma levedura Brettanomyces.

[014]Em certas modalidades, a composição compreende ainda ao menos uma levedura adicional. Em outras modalidades, a ao menos uma levedura adicional é selecionada dentre o grupo composto por uma levedura Saccharomyces, outra levedura Lachancea e uma levedura Brettanomyces. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma levedura adicional é uma levedura Saccharomyces. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma levedura adicional é outra levedura Lachancea. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma levedura adicional é uma levedura Brettanomyces.

[015]Em certas modalidades, a cepa de levedura é capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com um pH de cerca de 4,2 a cerca de 3,3 sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático. Em outras modalidades, a cepa de levedura é capaz de reduzir o pH do mosto para cerca de 3,5 em cerca de 5 dias sem o uso de bactérias produtoras de ácido.

[016]Em certas modalidades, a cepa de levedura pertence ao gênero Lachancea. Em outras modalidades, a cepa de levedura é a GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 no dia 19 de julho de 2018). Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1.

[017]Em certas modalidades, o kit compreende uma cepa de levedura contemplada dentro da invenção e um ou mais itens ou ingredientes adequados para produzir uma bebida fermentada por levedura.

[018]Em certas modalidades, o kit compreende a cepa de levedura GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 no dia 19 de julho de 2018). Em outras modalidades, um kit compreende ainda materiais instrutivos que compreendem instruções para produzir uma bebida fermentada por levedura usando a cepa de levedura GY7B. Em ainda outras modalidades, o kit compreende ainda um ou mais itens ou ingredientes para produzir uma bebida fermentada por levedura usando a GY7B.

[019]Em certas modalidades, o kit compreende uma cepa de levedura do gênero Lachancea, em que a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS e/ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1. Em outras modalidades, o kit compreende materiais instrutivos que compreendem instruções para produzir uma bebida fermentada por levedura usando a cepa de levedura. Em ainda outras modalidades, o kit compreende um ou mais itens ou ingredientes para produzir uma bebida fermentada por levedura usando a cepa de levedura.

[020]Em certas modalidades, os um ou mais itens ou ingredientes compreendem uma solução preparada de mosto. Em outras modalidades, os um ou mais itens ou ingredientes compreendem um extrato de malte seco. Em ainda outras modalidades, os um ou mais itens ou ingredientes compreendem um ou mais grãos selecionados dentro do grupo composto por cevada, trigo, milho, centeio, arroz, aveia, sorgo, painço, trigo-sarraceno, quinoa e teff. Em ainda outras modalidades, os um ou mais itens ou ingredientes compreendem ao menos uma cepa de levedura adicional. Em ainda outras modalidades, os um ou mais itens ou ingredientes compreendem uma ou mais variedades de lúpulo. Em ainda outras modalidades, os um ou mais itens ou ingredientes compreendem um água cervejeira condicionada. Em ainda outras modalidades, os um ou mais itens ou ingredientes compreendem um ou mais adjuntos de açúcar.

[021]Em certas modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a selecionada dentre o grupo composto por Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces ludwigii, Aureobasidium pullulans, Cyberlindnera saturnus, Hansensiaspora uvarum, Hansensiaspora guilliermondii, Hansensiaspora osmophila, Hansensiasporavineae, Hansenula anomala, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Pichia kluyveri, Pichia caribbica, Pichia fermentans, Pichia kudriavzevii, Pichia Membranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa, Torulaspora delbrueckii, Candida colliculosa, Candida shehatae, Candida tropicalis, Candida ethanolica, Candida krusei, Candida magnolia, Candida milleri, Clavispora lusitaniae, Wickerhamomyces subpelliculosus, Wickerhamomyces anomalus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces fermentati, Zygosaccharomycesflorentinus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis e Dekkera anomala.

[022]Em certas modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Saccharomyces cerevisiae. Em outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Saccharomyces pastorianus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Saccharomyces paradoxus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Saccharomyces eubayanus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Saccharomyces ludwigii. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Aureobasidium pullulans. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Cyberlindnera saturnus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Hansensiaspora uvarum. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Hansensiaspora guilliermondii. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Hansensiaspora osmophila. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Hansensiasporavineae. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Hansenula anomala. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Issatchenkia occidentalis. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Issatchenkia orientalis. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Pichia kluyveri. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Pichia caribbica. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Pichia fermentans. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Pichia kudriavzevii. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Pichia Membranifaciens. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Rhodotorula mucilaginosa. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Torulaspora delbrueckii. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Candida colliculosa. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Candida shehatae. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Candida tropicalis. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Candida ethanolica. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Candida krusei. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Candida magnolia. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Candida milleri. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Clavispora lusitaniae. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Wickerhamomyces subpelliculosus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Wickerhamomyces anomalus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Zygosaccharomyces rouxii. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Zygosaccharomyces bailii. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Zygosaccharomyces fermentati. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Zygosaccharomycesflorentinus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Kluyveromyces lactis. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Kluyveromyces marxianus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Lachancea thermotolerans. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Brettanomyces bruxellensis. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Brettanomyces anomalus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Brettanomyces custersianus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Brettanomyces naardenensis. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Brettanomyces nanus. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Dekkera bruxellensis. Em ainda outras modalidades, a ao menos uma cepa de levedura adicional é a Dekkera anomala.

[023]Em algumas modalidades, o mosto compreende lúpulo. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Ahtanum. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Armarillo. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Apollo. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Cacade. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Centennial. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Chinook. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Citra. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Cluster. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Columbus. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Crystal. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Eroica. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Galena. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Glacier. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Greenburg. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Horizon. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Liberty. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Millenium. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Mount Hood. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Mount Rainier. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Newport. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Nugget. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Palisade. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Santiam. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Simcoe. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Sterling. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Summit. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Tomahawk. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Ultra. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Vanguard. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Warrior. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Willamette. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Zeus. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Admiral. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Brewer's Gold. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Bullion. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Challenger. Em outras modalidades, o lúpulo compreende First Gold. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Fuggles. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Goldings. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Herald. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Northdown. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Northern Brewer. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Phoenix. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Pilot. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Pioneer. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Progress. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Target. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Whitbread Golding Variety (WGV). Em outras modalidades, o lúpulo compreende Hallertau. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Hersbrucker. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Saaz. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Tettnang. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Spalt. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Feux-Coeur Francais. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Galaxy. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Green Bullet. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Motueka. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Nelson Sauvin. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Pacific Gem. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Pacific Jade. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Pacifica. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Pride of Ringwood. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Riwaka. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Southern Cross. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Lublin. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Magnum. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Perle. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Polnischer Lublin. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Saphir. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Satus. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Select. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Strisselspalt. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Styrian Goldings. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Tardif de Bourgogne. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Tradition. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Bravo. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Calypso. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Chelan. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Comet. Em outras modalidades, o lúpulo compreende El Dorado. Em outras modalidades, o lúpulo compreende San Juan Ruby Red. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Satus. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Sonnet Golding. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Super Galena. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Tillicum. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Bramling Cross. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Pilgrim. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Hallertauer Herkules. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Hallertauer Magnum. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Hallertauer Taurus. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Merkur. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Opal. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Smaragd. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Halleratau Aroma. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Kohatu. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Rakau. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Stella. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Sticklebract. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Summer Saaz. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Super Alpha. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Super Pride. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Topaz. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Wai-iti. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Bor. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Junga. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Marynka. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Premiant. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Sladek. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Styrian Atlas. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Styrian Aurora. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Styrian Bobek. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Styrian Celeia. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Sybilla. Em outras modalidades, o lúpulo compreende Sorachi Ace.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[024]A descrição detalhada de modalidades específicas da invenção a seguir será mais bem entendida quando lida em conjunto com os desenhos anexos. Com a finalidade de ilustrar a invenção, os desenhos representam modalidades específicas. Deve-se ter em mente, contudo, que a invenção não se limita às estruturas e meios exatamente como ilustrados nas modalidades dos desenhos .

[025]As FIGs. 1A a 1C são um diagrama ilustrativo não exaustivo que delineia os métodos usados para selecionar, isolar e caracterizar cepas de levedura de possível interesse. As cepas de levedura de possível interesse podem ser selecionadas na etapa 102, quando cepas de levedura coletadas são cultivadas com mosto contendo antibiótico e avaliadas quanto à produção de CO2, redução na densidade do mosto e tolerância a altas concentrações de açúcar dissolvido.

[026]As FIGs. 2A e 2B são gráficos que relacionam o pH (FIG. 2A) e o extrato aparente (FIG. 2B) de ensaios de fermentação de mosto de extrato de malte seco claro a 10% (DME) sem lúpulo usando a Saccharomyces cerevisiae (cepa Belle Saison; Lallemand), uma cepa de levedura GY7B recém-descoberta e uma mistura de ambas as cepas. O mosto foi incubado a 20° C e inoculado com 1x106 células de levedura por mililitro por grau Plato. A cepa GY7B demonstrou maior acidulação e maior longevidade do que a Saccharomyces cerevisiae ou amostras de cepa mista. Como demonstra a FIG. 2B, a GY7B não fermenta com a mesma rapidez que a cepa Saccharomyces cerevisiae usada neste ensaio. Sem nos limitar a nenhuma teoria, é possível que a falta de acidulação observada na cofermentação entre a GY7B e a Saccharomyces cerevisiae deva-se às capacidades de fermentação mais rápida das cepas de levedura ale tradicionais, que superam a capacidade da GY7B de criar ácido lático.

[027]A FIG. 2C é um gráfico que relaciona o pH e o extrato aparente de um mosto de cerveja usando a Saccharomyces cerevisiae (cepa American Ale II; Wyeast 1272), GY7B e a Lachancea thermotolerans; tipo de cepa NRRL Y-8284. A GY7B fermentou mais rapidamente do que a L. thermotolerans porém mais lentamente do que a S. cerevisiae. A GY7B exibiu rápida acidulação durante a fermentação, chegando a um pH de 3,5 em 4 dias.

[028]As FIGs. 3A e 3B são imagens que comparam a morfologia da GY7B (FIG. 3A) e da Lachancea thermotolerans padrão; levedura NRRL Y-8284 (FIG. 3B). Culturas foram cultivadas no ágar extrato de levedura peptona dextrose (YPD) por 72 horas a 25° C e visualizadas sob microscopia diferencial de interferência. Utilizando o ImageJ, o comprimento médio da GY7B = 4,6 ± 0,607 μm e Y8284 = 6,9 ± 0,934 μm.

[029]As FIGs. 4A a 4B são gráficos que exibem o efeito do pH sobre as taxas de crescimento para a GY7B (FIG. 4A) e a Lachancea thermotolerans padrão; levedura NRRL Y-8284 (FIG. 4B) ao longo do tempo. A GY7B exibiu maior tolerância a pH baixo do que a L. thermotolerans.

[030]As FIGs. 5A e 5B são gráficos que ilustram o efeito da concentração de etanol sobre as taxas de crescimento para a GY7B (FIG. 5A) e a levedura Lachancea thermotolerans NRRL Y8284 (FIG. 5B) ao longo do tempo. A GY7B exibiu maior tolerância a alta concentrações de etanol do que a L. thermotolerans.

[031]A FIG. 6 é uma imagem comparando as características de floculação da GY7B e da Lachancea thermotolerans padrão; NRLL Y-8284. A GY7B é altamente floculante, ao passo que a L. thermotolerans não o é.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[032]A presente invenção refere-se à descoberta inesperada de uma nova cepa de levedura, chamada de GY7B, que está relacionada à Lachancea thermotolerans, mas que é genética e fenotipicamente diferente dela. A invenção propõe métodos para produzir uma bebida fermentada por levedura, tal como, entre outras, uma cerveja ácida, usando a GY7B, em que os métodos não exigem o uso de ácido lático e/ou de LABs. Os métodos da invenção podem produzir um mosto com um pH de cerca de 3,5 depois de fermentar por 5 dias na presença de GY7B, ao passo que os métodos conhecidos na técnica que fazem uso de bactérias podem levar meses para chegar a esse mesmo pH. Em certas modalidades, os métodos da invenção são realizados sem a adição de ácido lático, ou de equivalentes do mesmo, às composições contempladas dentro da invenção. Em outras modalidades, dentro dos métodos da invenção, ácido lático, ou quaisquer equivalentes do mesmo, não é adicionado durante a fermentação. Em ainda outras modalidades, dentro dos métodos da invenção, ácido lático, ou quaisquer equivalentes do mesmo, não é adicionado após a fermentação. Em ainda outras modalidades, a levedura contemplada dentro da invenção tipicamente não é da espécie Lachancea thermotolerans.

DEFINIÇÕES

[033]Conforme usado neste documento, cada um dos termos a seguir tem o significado associado a ele nesta seção.

[034]Salvo menção em contrário, todos os termos técnicos e científicos usado neste documento têm o mesmo significado de conhecimento geral por parte dos versados na técnica a que pertence a presente invenção. Embora quaisquer métodos e materiais parecidos ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais exemplificativos são descritos.

[035]Em termos gerais, a nomenclatura usada neste documento e os procedimentos de laboratório no cultivo de leveduras e na produção de cerveja são bem conhecidos e comumente empregados na técnica.

[036]Conforme usados neste documento, os artigos indefinidos "um" e "uma" referem-se a um ou mais de um (isto é, ao menos um) do objeto gramatical do artigo. À guisa de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento.

[037]Conforme usado neste documento, o termo "cerca de" será entendido pelos versados na técnica e variará em certa medida no contexto em que for usado. Conforme usado neste documento em alusão a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração no tempo e seus semelhantes, o termo "cerca de" visa a abranger variações de ±20% ou ±10%, mais preferivelmente de ±5%, ainda mais preferivelmente de ±1%, e mais preferivelmente ainda de ±0,1% do valor especificado, uma vez que essas variações são apropriadas para praticar os métodos revelados.

[038]Conforme usado neste documento, em certas modalidades, o termo "GY7B" pode ser mencionado como a levedura depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 no dia 19 de julho de 2018. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura GY7B é caracterizada por ter a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura GY7B é caracterizada por ter a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura GY7B é caracterizada por ter a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1.

[039]"Material instrutivo", conforme o termo é usado neste documento, inclui uma publicação, uma gravação, um diagrama ou qualquer outro meio de expressão que possa ser usado para comunicar a utilidade da composição e/ou composto da invenção em um kit. O material instrutivo do kit pode ser, por exemplo, afixado em um recipiente que contém o composto e/ou a composição da invenção ou ser enviado junto com um recipiente que contém o composto e/ou a composição. Como alternativa, o material instrutivo pode ser enviado à parte do recipiente com a intenção de que o destinatário utilize o material instrutivo e o composto cooperativamente. A entrega do material instrutivo pode ser, por exemplo, por entrega física da publicação ou outro meio de expressão comunicando a utilidade do kit ou, como alternativa, pode ser consumada por transmissão eletrônica, por exemplo, por meio de um computador, tal como por correio eletrônico, ou download de um site.

[040]Conforme usado neste documento, o termo “baixo pH” em um bebida fermentada indica que o pH da bebida é superior ou igual a cerca de 2,5 e inferior ou igual a cerca de 4,5. O limite superior do baixo pH pode ser inferior ou igual a cerca de 4,5, inferior ou igual a cerca de 4,4, inferior ou igual a cerca de 4,3, inferior ou igual a cerca de 4,2, inferior ou igual a cerca de 4,1, e/ou inferior ou igual a cerca de 4,0. O limite inferior do pH pode ser definido como superior ou igual a cerca de 2,5, superior ou igual a cerca de 2,6, superior ou igual a cerca de 2,7, superior ou igual a cerca de 2,8, superior ou igual a cerca de 2,9, superior ou igual a cerca de 3,0, superior ou igual a cerca de 3,1, superior ou igual a cerca de 3,2, superior ou igual a cerca de 3,3, superior ou igual a cerca de 3,4 e/ou superior ou igual a cerca de 3,5. Quaisquer faixas numéricas com os limites superiores e os limites inferiores conforme dados em outras partes neste documento podem ser adotadas. Por exemplo, o pH da bebida pode ser nas faixas de cerca de 2,7 ou mais, e cerca de 4,5 ou menos; cerca de 2,7 ou mais, e cerca de 4,2 ou menos; cerca de 2,7 ou mais, e cerca de 4,0 ou menos; cerca de 3,0 ou mais, e cerca de 4,5 ou menos; cerca de 3,0 ou mais, e cerca de 4,2 ou menos; cerca de 3,1 ou mais, e cerca de 4,2 ou menos; cerca de 3,2 ou mais, e cerca de 4,2 ou menos; cerca de 3,3 ou mais, e cerca de 4,2 ou menos; cerca de 3,0 ou mais, e cerca de 4,0 ou menos; cerca de 3,5 ou mais, e cerca de 4,5 ou menos; cerca de 3,5 ou mais, e cerca de 4,2 ou menos; e/ou cerca de 3,5 ou mais, e cerca de 4,0 ou menos. Em certas modalidades, o pH é de cerca de 2,5. Em outras modalidades, o pH é de cerca de 2,6. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 2,7. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 2,8. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 2,9. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,0. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,1. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,2. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,3. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,4. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,5. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,6. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,7. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,8. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 3,9. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 4,0. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 4,1. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 4,2. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 4,3. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 4,4. Em ainda outras modalidades, o pH é de cerca de 4,5.

[041]Conforme usado neste documento, entende-se pelo termo “massa” uma mistura de grãos moídos e água usada em processos de infusão e destilação para produzir o mosto. Tipicamente, os grãos maltados são aquecidos para quebrar o amido nos grãos em açúcares simples, que podem ser então fermentados para produzir álcool.

[042]Conforme usado neste documento, a "escala Plato" ou "escala de gravidade Plato" refere-se à escala hidrométrica empiricamente derivada usada para medir a densidade do mosto de cerveja em termos de porcentagem do extrato em peso. Os termos “graus Plato” ou “° Plato” ou “° P” são unidades de medida na escala Plato.

[043]Conforme usado neste documento, o termo “ácido” em uma bebida fermentada refere-se a um sabor ácido, amargo e/ou ardido no palato causado pela bebida. Em certas modalidades, o sabor ácido é associado ao baixo pH da bebida fermentada.

[044]Conforme usado neste documento, entende-se pelo termo “mosto” o líquido extraído do processo de brassagem durante um processo de fermentação ou destilação. O mosto contém os açúcares extraídos dos grãos maltados que serão fermentados pela levedura fermentadora a fim de produzir álcool.

[045]Ao longo de toda a revelação, vários aspectos da invenção podem ser dados em um formato em faixas. Deve-se ter em mente que a descrição em faixas serve unicamente a fins de conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível ao âmbito da invenção. Logo, a descrição de uma faixa deve ser considerada como se revelasse especificamente todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro da faixa em questão. Por exemplo, a descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 deve ser considerada se revelasse especificamente subfaixas como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro da faixa em questão, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6.

[046]As abreviações a seguir são usadas neste documento: BLAST, ferramenta de busca de alinhamentos locais básicos; DME, extrato de malte seco; IBU, Unidades Internacionais de Amargor; LAB, bactérias ácido-lácticas; nt, nucleotídeo; OD, densidade óptica; PCR, reação em cadeia da polimerase; P/S, Penicilina/Estreptomicina; YPD, extrato de levedura peptona dextrose.

COMPOSIÇÕES

[047]A invenção propõe uma cepa de levedura capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com baixo pH e sabor ácido sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático. Em outras modalidades, a cepa de levedura é capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com um pH de cerca de 4,2 a cerca de 3,3 sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura é capaz de reduzir o pH do mosto para cerca de 3,5 em cerca de 5 dias sem o uso de bactérias produtoras de ácido. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura pertence ao gênero Lachancea. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura é a GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 no dia 19 de julho de 2018). Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1.

[048]Em certas modalidades, a cepa de levedura da invenção faz parte de uma composição. Em outras modalidades, a composição é compatível com processos de fermentação. Em ainda outras modalidades, a composição compreende ainda ao menos uma levedura adicional selecionada dentre o grupo composto por Saccharomyces, Lachancea e Brettanomyces. Em ainda outras modalidades, a composição compreende ainda uma levedura Saccharomyces. Em ainda outras modalidades, a composição compreende ainda uma levedura Lachancea distinta. Em ainda outras modalidades, a composição compreende ainda uma levedura Brettanomyces.

MÉTODOS

[049]Em um aspecto, a presente invenção propõe um método para produzir uma bebida fermentada por levedura com baixo pH e sabor ácido sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático.

[050]Em certas modalidades, a invenção propõe um método para produzir uma bebida fermentada por levedura. Em outras modalidades, o método compreende fermentar um mosto na presença de uma cepa de levedura capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com baixo pH e sabor ácido sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático. Em certas modalidades, a bebida fermentada por levedura é uma cerveja.

[051]Em certas modalidades, o método não compreende o uso de ácido lático, ou de qualquer equivalente do mesmo. Em outras modalidades, ácido lático, ou qualquer equivalente do mesmo, não é adicionado ao mosto antes, durante e/ou depois da fermentação.

[052]Em certas modalidades, a cepa de levedura é capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com um pH de cerca de 4,2 a cerca de 3,3 sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático. Em outras modalidades, a cepa de levedura é capaz de reduzir o pH do mosto para cerca de 3,5 em cerca de 5 dias sem o uso de bactérias produtoras de ácido. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura pertence ao gênero Lachancea. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura é a GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA- 125167 no dia 19 de julho de 2018). Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1. Em ainda outras modalidades, a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1.

[053]Em certas modalidades, o método produz uma bebida fermentada por levedura com um pH de cerca de 4,2 a cerca de 3,3. Em outras modalidades, o mosto é fermentado na ausência de quaisquer bactérias produtoras de ácido. Em ainda outras modalidades, o mosto é fermentado na ausência de quaisquer bactérias produtoras de ácido lático. Em ainda outras modalidades, o mosto é fermentado na ausência de bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus ou Pediococcus. Em ainda outras modalidades, o mosto compreende malte derivado de um ou mais grãos selecionados dentre o grupo composto por cevada, trigo, milho, centeio, arroz, aveia, sorgo, painço, trigo-sarraceno, quinoa e teff. Em outras modalidades, o mosto compreende ainda lúpulo. Em ainda outras modalidades, o mosto é fermentado na presença de ao menos uma cepa de levedura adicional selecionada dentre o grupo composto por Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces ludwigii, Aureobasidium pullulans, Cyberlindnera saturnus, Hansensiaspora uvarum, Hansensiaspora guilliermondii, Hansensiaspora osmophila, Hansensiasporavineae, Hansenula anomala, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Pichia kluyveri, Pichia caribbica, Pichia fermentans, Pichia kudriavzevii, Pichia Membranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa, Torulaspora delbrueckii, Candida colliculosa, Candida shehatae, Candida tropicalis, Candida ethanolica, Candida krusei, Candida magnolia, Candida milleri, Clavispora lusitaniae, Wickerhamomyces subpelliculosus, Wickerhamomyces anomalus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces fermentati, Zygosaccharomycesflorentinus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis e Dekkera anomala.

[054]Em certas modalidades, o lúpulo é ao menos um selecionado dentre o grupo composto por Ahtanum, Amarillo, Apollo, Cascade, Centennial, Chinook, Citra, Cluster, Columbus, Crystal, Eroica, Galena, Glacier, Greenburg, Horizon, Liberty, Millenium, Mount Hood, Mount Rainier, Newport, Nugget, Palisade, Santiam, Simcoe, Sterling, Summit, Tomahawk, Ultra, Vanguard, Warrior, Willamette, Zeus, Admiral, Brewer's Gold, Bullion, Challenger, First Gold, Fuggles, Goldings, Herald, Northdown, Northern Brewer, Phoenix, Pilot, Pioneer, Progress, Target, Whitbread Golding Variety (WGV), Hallertau, Hersbrucker, Saaz, Tettnang, Spalt, Feux-Coeur Francais, Galaxy, Green Bullet, Motueka, Nelson Sauvin, Pacific Gem, Pacific Jade, Pacifica, Pride of Ringwood, Riwaka, Southern Cross, Lublin, Magnum, Perle, Polnischer Lublin, Saphir, Satus, Select, Strisselspalt, Styrian Goldings, Tardif de Bourgogne, Tradition, Bravo, Calypso, Chelan, Comet, El Dorado, San Juan Ruby Red, Satus, Sonnet Golding, Super Galena, Tillicum, Bramling Cross, Pilgrim, Hallertauer Herkules, Hallertauer Magnum, Hallertauer Taurus, Merkur, Opal, Smaragd, Halleratau Aroma, Kohatu, Rakau, Stella, Sticklebract, Summer Saaz, Super Alpha, Super Pride, Topaz, Wai-iti, Bor, Junga, Marynka, Premiant, Sladek, Styrian Atlas, Styrian Aurora, Styrian Bobek, Styrian Celeia, Sybilla e Sorachi Ace.

[055]A invenção propõe ainda o uso de uma cepa de levedura contemplada neste documento, e/ou de um kit contemplado neste documento, para produzir uma cerveja com baixo pH e sabor ácido. Em certas modalidades, a cerveja é produzida sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático. Em outras modalidades, a cerveja é produzida sem o uso de ácido lático. Em ainda outras modalidades, a cerveja tem um pH de cerca de 4,2 a cerca de 3,3.

[056]Em certas modalidades, o método compreende fermentar o mosto na presença da levedura GY7B. Em certas modalidades, o método produz a bebida fermentada por levedura com sabor ácido mais rapidamente do que métodos conhecidos que fazem uso de bactérias produtoras de ácido lático.

[057]Em certas modalidades, a bebida fermentada por levedura é uma cerveja. Em outras modalidades, a cerveja é uma cerveja ácida semelhante em estilo a uma bebida selecionada dentre o grupo composto por lambic, geuze (gueuze), saison, farmhouse, framboise, kriek, Berliner weisse, Flanders red ale, oud bruin, gose e American wild ale.

[058]Em certas modalidades, a levedura GY7B reduz o pH do mosto para cerca de 3,5 em cerca de 5 dias sem o uso de bactérias produtoras de ácido. Em outras modalidades, a levedura GY7B é mais tolerante a pH baixo do que as leveduras de cerveja habituais conhecidas na técnica, tais como, entre outras, a Saccharomyces cerevisiae e a Lachancea thermotolerans. Em outras modalidades, a levedura GY7B prospera em ambientes chegando a pH 3. Em ainda outras modalidades, a levedura GY7B produz uma cerveja com um pH de cerca de 4,2 a cerca de 3,3.

[059]Em certas modalidades, a levedura GY7B tolera concentrações de álcool de até cerca de 10% vol/vol de álcool.

[060]O processo para produzir cerveja é familiar aos versados na técnica e pode ser delineado da maneira não limitante a seguir. O malte pode ser preparado a partir de grãos de cereal germinados secos (principalmente cevada ou trigo) e triturado em grãos moídos que podem conter adjuntos não maltados. Os grãos moídos podem ser empastados (misturados com água e embebidos) para permitir que as enzimas no malte convertam o amido em açúcares. As partículas de grão e adjuntos podem ser separados do mosto líquido em um processo chamado de lautering. As etapas de produção de malte e brassagem podem ser puladas adicionando água ao extrato de malte. Depois de adicionar lúpulo e/ou outros ingredientes, tais como ervas e açúcares, o mosto pode ser fervido (o lúpulo também pode ser adicionado depois de fervê-lo), resfriado e areado. Em seguida, o mosto pode ser conduzido a um tanque de fermentação e fermentado pela adição de uma levedura de cerveja. A fermentação primária, que dura tipicamente de 5 a 10 dias, pode ser seguida por uma etapa de fermentação secundária usando uma levedura de cerveja adicional. Depois da fermentação, a cerveja fresca ou cerveja "verde" pode ser condicionada, opcionalmente filtrada e carbonada.

[061]Lúpulo pode ser adicionado ao mosto para equilibrar a doçura do malte com o amargo e imprimir à cerveja sabores e aromas desejáveis. Há diversas variedades de lúpulo, incluindo, entre outras, Amarillo, Apollo, Cascade, Centennial, Chinook, Citra, Cluster, Columbus, Crystal, Eroica, Galena, Glacier, Greenburg, Horizon, Liberty, Millenium, Mount Hood, Mount Rainier, Newport, Nugget, Palisade, Santiam, Simcoe, Sterling, Summit, Tomahawk, Ultra, Vanguard, Warrior, Willamette, Zeus, Admiral, Brewer's Gold, Bullion, Challenger, First Gold, Fuggles, Goldings, Herald, Northdown, Northern Brewer, Phoenix, Pilot, Pioneer, Progress, Target, Whitbread Golding Variety (WGV), Hallertau, Hersbrucker, Saaz, Tettnang, Spalt, Feux-Coeur Francais, Galaxy, Green Bullet, Motueka, Nelson Sauvin, Pacific Gem, Pacific Jade, Pacifica, Pride of Ringwood, Riwaka, Southern Cross, Lublin, Magnum, Perle, Polnischer Lublin, Saphir, Satus, Select, Strisselspalt, Styrian Goldings, Tardif de Bourgogne e Tradition. Há também outras variedades, incluindo, entre outras, Bravo, Calypso, Chelan, Comet, El Dorado, San Juan Ruby Red, Satus, Sonnet Golding, Super Galena, Tillicum, Bramling Cross, Pilgrim, Hallertauer Herkules, Hallertauer Magnum, Hallertauer Taurus, Merkur, Opal, Smaragd, Halleratau Aroma, Kohatu, Rakau, Stella, Sticklebract, Summer Saaz, Super Alpha, Super Pride, Topaz, Wai-iti, Bor, Junga, Marynka, Premiant, Sladek, Styrian Atlas, Styrian Aurora, Styrian Bobek, Styrian Celeia, Sybilla e Sorachi Ace.

[062]Em certas modalidades, a bebida fermentada por levedura é produzida fermentando o mosto derivado de uma massa que compreende um ou mais grãos selecionados dentre o grupo composto por cevada, trigo, milho, centeio, arroz, aveia, sorgo, painço, trigo-sarraceno, quinoa, teff, extrato de malte seco e extrato de malte líquido. Em certas modalidades, a bebida fermentada por levedura pode conter açúcar fermentável adicional conforme provido por adjuntos tais como, entre outros, açúcares purificados ou xaropes. Em certas modalidades, a massa compreende grãos maltados. Em certas modalidades, o método compreende ainda a adição de flores do lúpulo, Humulus lupulus, ao mosto. Em certas modalidades, o lúpulo é adicionado ao mosto antes da adição da levedura GY7B. Em certas modalidades, o lúpulo é adicionado à cerveja em fermentação após a adição da levedura GY7B.

[063]Em certas modalidades, o método compreende fermentar o mosto na presença da levedura GY7B sozinha ou na presença de ao menos uma cepa de levedura adicional selecionada dentre o grupo composto por Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces eubayanus,Saccharomyces ludwigii, Aureobasidium pullulans, Cyberlindnera saturnus Hansensiaspora uvarum Hansensiaspora guilliermondii, Hansensiaspora osmophila, Hansensiasporavineae, Hansenula anomala, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Pichia kluyveri, Pichia caribbica, Pichia fermentans, Pichia kudriavzevii, Pichia Membranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa, Torulaspora delbrueckii, Candida colliculosa, Candida shehatae, Candida tropicalis, Candida ethanolica, Candida krusei, Candida magnolia, Candida milleri, Clavispora lusitaniae Wickerhamomyces subpelliculosus, Wickerhamomyces anomalus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces fermentati, Zygosaccharomycesflorentinus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis e Dekkera anomala.

[064]Em certas modalidades, a gravidade inicial do mosto é de cerca de 6° P a cerca de 25° P. Em outras modalidades, a gravidade inicial do mosto é de cerca de 10° P a cerca de 16° P.

[065]Em certas modalidades, a concentração de GY7B no mosto é de cerca de 1x106 células/mL a cerca de 2x107 células/ml.

[066]Em certas modalidades, o mosto é fermentado a uma temperatura de cerca de 9° C a cerca de 30° C. Em outras modalidades, o mosto é fermentado a cerca de 20° C.

[067]Em certas modalidades, o método requer filtragem mínima, ou não requer filtragem alguma. A GY7B exibe alta floculação e rapidamente precipita-se no fundo do recipiente de fermentação, facilitando assim a separação. Em certas modalidades, o método facilita a floculação de cepas de levedura adicionais durante a cofermentação.

[068]Em certas modalidades, o método compreende ainda a pasteurização. Em outras modalidades, o mosto fermentado é pasteurizado a 15 a 30 Unidades de Pasteurização.

[069]Em certas modalidades, a GY7B é adicionada à fermentadora. Em outras modalidades, a GY7B é adicionada à massa. Em outras modalidades, a GY7B é adicionada a um recipiente de fermentação ou maturação secundário tal como uma fermentadora, barril, foeder, tanque claro, KEG, tonel, lata ou frasco.

KITS

[070]A presente invenção propõe um kit que compreende ao menos uma cepa de levedura contemplada neste documento e um ou mais itens ou ingredientes adequados para produzir uma bebida fermentada por levedura. A invenção propõe ainda um kit que compreende a cepa de levedura GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 no dia 19 de julho de 2018) e um ou mais itens ou ingredientes adequados para produzir uma bebida fermentada por levedura. A invenção propõe ainda um kit que compreende uma cepa de levedura do gênero Lachancea, em que a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS e/ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1, e um ou mais itens ou ingredientes adequados para produzir uma bebida fermentada por levedura.

[071]Em certas modalidades, um kit compreende ainda materiais instrutivos que compreendem instruções para produzir uma bebida fermentada por levedura usando a cepa de levedura contemplada.

[072]Em certas modalidades, a bebida fermentada por levedura é uma cerveja.

[073]Em certas modalidades, os um ou mais itens ou ingredientes compreendem ao menos um item selecionado dentre o grupo composto por: solução preparada de mosto; extrato de malte seco; um ou mais grão selecionados dentre o composto por cevada, trigo, milho, centeio, arroz, aveia, sorgo, painço, trigo- sarraceno, quinoa e teff; ao menos uma cepa de levedura adicional selecionada dentre o grupo composto por Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces ludwigii, Aureobasidium pullulans, Cyberlindnera saturnus, Hansensiaspora uvarum, Hansenisaspora guilliermondii, Hansensiaspora osmophila, Hansensiasporavineae, Hansenula anomala, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Pichia kluyveri, Pichia caribbica, Pichia fermentans, Pichia kudriavzevii, Pichia Membranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa, Torulaspora delbrueckii, Candida colliculosa, Candida shehatae, Candida tropicalis, Candida ethanolica, Candida krusei, Candida magnolia, Candida milleri, Clavispora lusitaniae, Wickerhamomyces subpelliculosus, Wickerhamomyces anomalus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces fermentati, Zygosaccharomycesflorentinus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis e Dekkera anomala; uma ou mais variedades de lúpulo; água cervejeira condicionada; e um ou mais adjuntos de açúcar. Exemplos ilustrativos de lúpulo contemplados são descritos em outras partes neste documento.

[074]A invenção propõe ainda kits que compreendem a GY7B e itens e ingredientes necessários para produzir cerveja.

[075]Em algumas modalidades, o kit compreende a GY7B embalada. Em outras modalidades, o kit compreende GY7B seca na forma de um pó. Em outras modalidades, o kit compreende a GY7B em um recipiente fechado a vácuo. Em outras modalidades, o kit compreende a GY7B de uma propagação fresca ou lama pós-fermentação em um recipiente ventilado.

[076]Em certas modalidades, o kit compreende ainda um ou mais itens necessários para executar os métodos da invenção selecionados dentre o grupo composto por um ou mais recipientes adaptados e configurados para a fermentação do mosto, um ou mais termômetros, um ou mais hidrômetros, um ou mais recipientes adaptados e configurados para a fervura do mosto, um ou mais recipientes adaptados e configurados para a pasteurização, um ou mais recipientes adaptados e configurados para o armazenamento de cerveja, um ou mais recipientes adaptados e configurados para o envelhecimento de cerveja. Em outras modalidades, o kit compreende ainda um ou mais itens selecionados dentre o grupo composto por tanques de CO2 comprimido, tanques de N2 comprimido, reguladores de gás, tubulação e medidores de pressão.

[077]Em certas modalidades, o kit compreende ainda ao menos um ingrediente adicional necessário para executar os métodos da invenção selecionado dentre o grupo composto por solução preparada de mosto, extrato de malte seco ou líquido, um ou mais grãos selecionados dentre o grupo composto por cevada, trigo, milho, centeio, arroz, aveia, sorgo, painço, trigo-sarraceno, quinoa e teff, ao menos uma cepa de levedura adicional selecionada dentre o grupo composto por Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces eubayanus,Saccharomyces ludwigii, Aureobasidium pullulans, Cyberlindnera saturnus Hansensiaspora uvarum Hansensiaspora guilliermondii, Hansensiaspora osmophila, Hansensiasporavineae, Hansenula anomala, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Pichia kluyveri, Pichia caribbica, Pichia fermentans, Pichia kudriavzevii, Pichia Membranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa, Torulaspora delbrueckii, Candida colliculosa, Candida shehatae, Candida tropicalis, Candida ethanolica, Candida krusei, Candida magnolia, Candida milleri, Clavispora lusitaniae Wickerhamomyces subpelliculosus, Wickerhamomyces anomalus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces fermentati, Zygosaccharomycesflorentinus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis e Dekkera anomala, uma ou mais variedades de lúpulo, água cervejeira condicionada, e um ou mais adjuntos de açúcar.

[078]Em certas modalidades, o kit compreende ainda materiais instrutivos contendo instruções para executar os métodos da invenção. Em certas modalidades, os materiais instrutivos fornecem informações referentes à produção de cerveja com a GY7B usando os itens e ingredientes do kit da invenção.

[079]Uma cepa de levedura exemplificativa da invenção é a cepa de levedura GY7B. De acordo com os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes, o depósito da cepa de levedura foi realizado junto à American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, Md., EUA.

[080]A cessionária da requerente, a University of the Sciences, representa que a ATCC é um depósito com a permanência do depósito e pronta acessibilidade ao mesmo pelo público se uma patente for concedida. Todas as restrições sobre a disponibilidade ao público do material assim depositado serão irrevogavelmente removidas quando da concessão de uma patente. O material será prontamente disponibilizado durante a pendência do pedido de patente a qualquer pessoa determinada pelo Comissário como autorizada a tanto de acordo com o Código de Regulamentos Federais 37 § 1.14 e Código dos Estados Unidos 35 § 122. O material depositado será preservado com todo o cuidado necessário para mantê-lo viável e não contaminado por um período de ao menos cinco anos após o pedido mais recente para provisão de uma amostra do material depositado, e, em todo caso, por um período de ao menos trinta (30) anos após a data do depósito ou pela vida exequível da patente, o que durar mais. A cessionária da requerente reconhece seu dever em substituir o depósito se a depositária for incapaz de prover uma amostra quando solicitada devido à condição do depósito.

[081]Os versados na técnica reconhecerão, ou poderão verificar usando não mais do que a experimentação rotineira, vários equivalentes aos procedimentos, modalidades, reivindicações e exemplos específicos descritos neste documento. Esses equivalentes foram considerados dentro do âmbito da presente invenção e abrangidos pelas reivindicações apensas. Por exemplo, deve-se ter em mente que modificações nas condições de reação, incluindo, entre outras, os tempos de reação, tamanho/volume de reação e reagentes experimentais, por alternativas reconhecidas na técnica e usando não mais do que a experimentação rotineira encontram-se dentro do âmbito do presente pedido.

[082]Deve-se ter em mente que, sempre que valores e faixas forem dados neste documento, a descrição em faixas serve unicamente para efeito de conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível ao âmbito da invenção. Logo, todos os valores e faixas abrangidos por esses valores e faixas destinam-se a ser tidos como dentro do âmbito da presente invenção. Além disso, todos os valores que enquadram-se nessas faixas, bem como os limites superior ou inferior de uma faixa de valores, também são contemplados pelo presente pedido. A descrição de uma faixa deve ser considerada como se revelasse especificamente todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro da faixa em questão e, quando apropriado, números inteiros parciais dos valores numéricos dentro das faixas. Por exemplo, a descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 deve ser considerada como revelando especificamente subfaixas como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro da faixa em questão, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6.

[083]Os exemplos a seguir ilustram mais a fundo aspectos da presente invenção. No entanto, eles não constituem de forma alguma uma limitação aos ensinamentos ou à revelação da presente invenção conforme estabelecidos neste documento.

EXEMPLOS

[084]Agora, descrever-se-á a invenção com referência aos Exemplos a seguir. Estes Exemplos são dados a título meramente ilustrativo, e a invenção não se limita a eles mas, em vez disso, abrange todas as variações que transparecerão em decorrência dos ensinamentos dados neste documento.

MATERIAIS E MÉTODOS Métodos para a coleta de amostras

[085]Amostras para o isolamento de leveduras selvagens foram coletadas usando uma técnica asséptica no campo. Em seguida, as amostras foram inoculadas diretamente em uma solução de DME a 10% (BREISS®) contendo Penicilina/Estreptomicina (P/S) (GIBCO®). Depois de duas semanas, as amostras foram plaqueadas em YPD contendo P/S e cultivadas a 25° C por 48 horas. Colônias individuais foram selecionadas para nova propagação em placas de YPD P/S nas mesmas condições de cultura. A pureza das colônias foi validada por uniformidade na morfologia, quando então as colônias foram mantidas em placas de YPD sem antibiótico. Estoques de glicerol foram criados pegando uma colônia e cultivando em caldo de YPD a 25° C, 180 rpm por 49 horas. Em seguida, as culturas foram incubadas a 4° C por mais 48 horas. Por fim, as leveduras foram ressuspensas em YPD fresco com glicerol a 15% e congeladas em crioampolas a - 80° C. Todos os experimentos foram realizados com levedura recém-propagada de estoques de glicerol.

Formulação do mosto de fermento teste

[086]Fermentações teste foram realizadas em DME a 10%, meio sem lúpulo, chamadas de mosto de laboratório ou em mosto preparado na cervejaria piloto da University of the Sciences. No caso do mosto de laboratório DME a 10%, 100 g de DME foram dissolvidos em 1 L de água destilada, fervidos por 15 minutos e resfriados em temperatura ambiente. O mosto a 10° P foi preparado na cervejaria piloto da USciences usando malte de 2 fileiras pálido a 100% (BREISS®). Ele foi triturado e empastado em uma SABCOTM BrewMagic usando água destilada a 65° C por 60 min. Após o vorlauf, o fly sparge contínuo foi realizado com água destilada a 75° C acidulada para pH 6,0 com ácido lático de grau alimentício (produtos químicos SPECTRUM®). O mosto foi fervido por 60 minutos, com uma adição amargosa de 007: The Golden Hop (Yakima Valley Hops) para produzir 10 IBU de amargo. Adicionou-se Whirlfloc (LD CARLSONTM) faltando 15 min na fervura de acordo com as instruções da fabricante. Adicionou-se o suplemento de levedura Servomyces (WHITE LABS) faltando 10 min na fervura de acordo com as instruções da fabricante. Depois de fervê-lo, o mosto foi submetido a redemoinho e permitido sedimentar por 15 min antes de resfriá-lo à temperatura ambiente com uma SABCO Chill Wizard. Todo o mosto foi envasado, autoclavado e armazenado a 4° antes do uso.

Placas de Cultura de Levedura

[087]Ágar YPD (2% de glicose, 2% de peptona, 1% de extrato de levedura e 1,5% de ágar) foi suplementado com uma diluição a 1:100 de P/S de acordo com o necessário. Todos os reagentes foram da Research Products International.

Cepas de levedura

[088]As cepas a seguir foram usadas para comparação com a GY7B: Wyeast American Ale II, Saccharomyces cerevisiae (Wy1272); Lallemand Belle Saison, Saccharomyces cerevisiae; NRRL Y-8284/CBS 6340T, Lachancea thermotolerans

PCR para a identificação da levedura

[089]Para a identificação da levedura, utilizaram-se culturas de levedura frescas cultivadas a 25° a 30° C por <48 horas em YPD. A extração de DNA bruto foi realizada selecionando uma colônia de levedura pequena e transferindo para SDS a 0,2%, seguida por incubação a 90° C por 4 minutos. A levedura lisada foi então diluída a 1:10 em água sem nuclease. Essa diluição foi adicionalmente diluída a 1:40 na reação PCR. A PCR foi realizada com o kit de PCR Phusion High-fidelity (NEW ENGLAND BIOLABS®) de acordo com as instruções da fabricante em um ciclador Mastercycler EPPENDORF®. O domínio D1/D2 da região de rDNA 26S foi amplificado usando os iniciadores NL1 (SEQ ID NO: 1: 5'- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL4 (SEQ ID NO: 2: 5‘-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3‘). A amplificação foi realizada por 36 ciclos com desnaturação a 98° C por 10 segundos, anelamento a 52° C por 20 segundos e extensão a 72° C por 20 segundos. A região ITS do rDNA foi amplificada usando os iniciadores ITS1 (SEQ ID NO: 3: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITF4 (SEQ ID NO: 4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). A amplificação foi realizada usando 34 ciclos com desnaturação a 98° C por 10 segundos, anelamento a 52° C por 20 segundos com um aumento de 0,2° C a cada ciclo e extensão a 72° C por 20 segundos. O gene da actina 1 foi amplificado usando os iniciadores CA21 (SEQ ID NO: 5: 5’- ATTGATAACGGTTCCGGTATGTG-3’) e CA22R (SEQ ID NO: 6: 5’-TCGTCGTATTCTTGCTTTGAGATCCAC-3’). A amplificação foi realizada usando 20 ciclos com desnaturação a 98° C por 10 segundos, anelamento a 60° C por 30 segundos com uma redução de 0,5° C a cada ciclo e extensão a 72° C por 30 segundos, seguida por 15 ciclos com desnaturação a 98° C por 10 segundos, anelamento a 50° C por 30 segundos e extensão a 72° C por 30 segundos.

Eletroforese em gel e purificação

[090]As reações PCR foram resolvidas em gel de agarose a 1% a 120 volts (BIO-RAD®) e visualizadas com brometo de etídio sob luz UV. Bandas foram extirpadas e purificadas usando o kit GeneJet Gel Extraction (THERMO FISHER SCIENTIFIC®) de acordo com as instruções da fabricante.

Análise de sequenciamento

[091]O DNA purificado da PCR foi preparado por sequenciamento de Sanger por uma Genewiz de acordo com suas instruções. Cada produto de PCR foi sequenciado tanto com os iniciadores diretos quanto com os iniciadores reversos usados na amplificação da PCR original. As sequências retornadas foram validadas quanto à precisão alinhando as sequências diretas e reversas com um A Plasmid Editor (M. Wayne Davis). Quaisquer discrepâncias foram adicionalmente resolvidas por análise visual do cromatograma. Qualquer sequência que carecesse de cobertura dupla foi descartada. As sequências validadas foram analisadas com a Nucleotide BLAST (NCBI) usando os parâmetros padrão.

Exemplo 1: Métodos para coletar e testar cepas de levedura selvagens

[092]Com referência às FIGs. de 1A a 1C, amostras de árvores florescentes locais, bem como de uma colmeia local, foram coletadas no Woodlands Cemetery (4000 Woodland Ave, Philadelphia, PA 19104) por zaragatoa (101) e inoculadas em mosto estéril (102). As amostras foram incubadas sem agitação a 25° C por cerca de 1 semana. O sedimento foi cuidadosamente ressuspenso e plaqueado em placas de YPD (103). Uma vez que colônias visíveis fizeram-se presentes após 48 a 72 h de crescimento a 25° C, colônias morfologicamente distintas foram subcultivadas para purificação (104). As cepas de levedura purificadas foram submetidas a PCR da região D1/D2 para amplificar o material genético para análise (105). O DNA extraído foi separado através de eletroforese em gel (106), sequenciado (107) e analisado usando a Ferramenta de Busca de Alinhamentos Locais Básicos (BLAST) para descobrir similaridades genéticas (108). A Tabela 1A lista todas as cepas isoladas e sua fonte. A Tabela 1B lista a semelhança entre a sequência de D1/D2 do isolado de levedura e o top BLAST hit. Além disso, fermentos teste contendo o mosto de laboratório foram inoculados com a levedura isolada e observados por um período de 7 dias. Das amostras coletadas, a GY7B foi o fermento mais robusto como demonstra a visível evolução do CO2 no tubo da amostra.

[093]A GY7B foi isolada de um botão de Cornecaea cornus (Dogwood tree). A análise BLAST da sequência de D1/D2 retornou uma coincidência de 100% com 0 diferenças de nt para a Lachancea thermotolerans, indicando que ela é uma cepa selvagem relacionada à L. thermotolerans. TABELA 1A TABELA 1B

Exemplo 2: Ensaios de fermentação usando a GY7B

[094]Uma vez identificada, a GY7B isolada foi testada quanto à fermentação do mosto em condições controladas. O mosto de laboratório foi inoculado com 1x106 células de levedura/ml/° P de Saccharomyces cerevisiae (cepa Belle Saison da Lallemand), GY7B ou ambas as cepas cada uma a 1x106 células de levedura/ml/° P. Os fermentos foram incubados a 20° C por 5 dias. O pH e extrato aparente dos fermentos foram acompanhados diariamente usando um medidor de pH e um densitômetro, respectivamente. A GY7B reduziu o pH do mosto para cerca de 3,5 após 5 dias, ao passo que tanto a S. cerevisiae quanto amostras de cepa mista reduziram o pH do mosto para apenas cerca de 4,25 após 5 dias (FIG. 2A).

[095]A GY7B provou-se uma levedura de fermentação mais lenta do que a S. cerevisiae, uma vez que tanto a S. cerevisiae quanto amostras de cepa mista exibiram uma redução mais rápida no ° P ao longo de 5 dias em relação à amostra de GY7B (FIG. 2B). Sem nos limitar a nenhuma teoria específica, suspeita-se de que a falta de acidulação observada na cofermentação entre a GY7B e a Saccharomyces cerevisiae deva-se às capacidades de fermentação mais rápida da S. cerevisiae, que superam a capacidade da GY7B de criar ácido lático. A otimização das taxas de inoculação de células durante a cofermentação permite a produção oportuna de cerveja ácida por meio da GY7B com os benefícios da fermentação com uma cepa ale tradicional.

[096]Para examinar mais a fundo as propriedades de rápida acidulação da GY7B em comparação à fermentação pela levedura de cerveja, a fermentação da GY7B foi comparada à cepa do tipo L. thermotolarans, NRRL Y-8284, e a uma cepa ale Saccharomyces cerevisiae tradicional, American Ale II, Wyeast 1272. Mosto de cerveja com uma gravidade original de 1,040 e pH 5,25 foi produzido na cervejaria piloto da University of the Sciences. Triplicatas da fermentação de 400 mL em frascos Erlenmeyer vedados com airlock de fermentação foram inoculadas com 1x106 células de levedura/mL/° P. O extrato aparente e pH foram medidos diariamente no mesmo horário, sendo as médias divulgadas na FIG. 2C. O desvio padrão é dado pelas barras de erro. Como esperado, a S. cerevisiae fermenta rapidamente o mosto a uma gravidade final de 1,003 em 4 dias. O extrato aparente do mosto fermentado pela L. thermotolerans é de apenas 1,027 após 9 dias de fermentação. A GY7B fermenta lentamente mas atinge gradativamente 1,011 de atenuação aparente após 9 dias. A fermentação ainda não foi concluída após 9 dias nesse ensaio uma vez que a gravidade final com a GY7B em outras fermentações foi observada em cerca de 1,001. Mais importantemente, o pH dessas fermentações piloto indicou o rápido poder de acidulação da GY7B uma vez que o pH chegou a 3,5 depois de apenas 4 dias. O pH da S. cerevisiae chegou a 4,1 depois de 9 dias de fermentação e o da L. thermotolerans só chegou a 4,4.

[097]Esses dados demonstram que a GY7B e a cepa do tipo L. thermotolerans NRRL Y-8284 são fenotipicamente distintas e que a GY7B é capaz da rápida fermentação ácida da cerveja.

Exemplo 3: Comparação morfológica da Lachancea thermotolerans e GY7B

[098]Para ilustrar mais a fundo as diferenças fenotípicas entre a GY7B e a L. thermotolerans, as morfologias celulares foram comparadas. Culturas de GY7B (FIG. 3A) ou L. thermotolerans (FIG. 3B) foram cultivadas em ágar extrato de levedura peptona dextrose (YPD) por 72 horas a 25° C e visualizadas sob microscopia de interferência diferencial. Utilizando o software ImageJ (NIH) para medir o tamanho das células, o comprimento médio da GY7b é de 4,6 ± 0,607 μm e o da Y8284 de 6,9 ± 0,934 μm.

Exemplo 4: Tolerância a pH e etanol da GY7B

[099]A tolerância a pH e etanol da GY7B e da L. thermotolerans foi avaliada medindo o crescimento a um pH variável (FIG. 4A a 5B) ou porcentagens de etanol variáveis (v/v) (FIG. 5A-5B). Leveduras recém-cultivadas foram propagadas em 5 mL de YPD, agitados a 180 rpm a 30 ° C de um dia para o outro. Utilizou-se um espectrômetro para medir a OD600, e a cultura foi diluída com YPD fresco para obter uma OD600 de 0,1. No caso da tolerância a etanol, cada amostra foi perfurada com Etanol a 100% para atingir uma concentração final de 0%, 4%, 6%, 8% ou 10% (v/v). No caso do pH, o YPD foi acidulado com ácido clorídrico para cobrir uma faixa de pH de 3 a 7, que foi então usada para ressuspender a levedura após a centrifugação. 200 μL de OD600 = 0,1 cultura foi posicionada em um poço de uma placa com 96 poços claros de fundo redondo (Corning). Um fluorímetro TECAN foi usado para ler a OD600 a cada 5 minutos. No decorrer do experimento, o fluorímetro foi mantido a 30° C com 4 minutos de agitação orbital a 120 rpm e 1 minuto de agitação linear a 270 rpm entre cada leitura. Todas as amostras foram obtidas em triplicata, sendo os valores médios divulgados. O desvio padrão é exibido como barras de erro. A GY7B é mais tolerante ao ácido e tolerante ao etanol do que a L. thermotolerans. Tanto a GY7B quanto a L. thermotolerans podem proliferar em até 10% de etanol (v/v).

Exemplo 5: Sequenciamento genético da GY7B e comparação com a Lachancea thermotolerans

[0100]Para examinar mais a fundo diferenças genotípicas entre a L. thermotolerans e a GY7B, avaliaram-se as sequências da região ITS do rDNA e do gene da actina 1 da GY7B. Iniciadores específicos para cada região foram usados em uma reação PCR. As sequências foram resolvidas via eletroforese em gel. Em seguida, os amplicons foram extirpados, purificados e enviados para sequenciamento. As sequências resultantes foram validadas e analisadas com BLAST. A L. thermotolerans NRRL Y8284 e a GY7B diferem em 2 nt na região ITS e em 7 nt no gene da actina 1. As sequências consenso são listadas abaixo. Aliada às vastas diferenças fenotípicas entre a GY7B e à cepa do tipo L. thermotolerans, essa evidência sugere fortemente que a GY7B é uma nova espécie do gênero Lachancea. TABELA 2

>GY7B D1D2: SEQ ID NO: 7:

[0101]ACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCT TCGGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGCTACTTTGGGGCTAGTCCTTGTCTAT GTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTATGGCGAGGAGTC TAGTCCTATGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTA AGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAA CAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTAC GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGACCCT CGCTCCTTGTGGGTGGGGATCTCGCAGCTCACTGGGCCAACATCAGTTTTGGC GGTAGGATAAATCTTTGGGAACGTGGCTTGTCTTCGGAGAAGCGTTATAGCCCA GGGGAATACTGCCAGCCGGGACTGAGGACTGCGACTTT

>GY7B ITS: SEQ ID NO: 8:

[0102]GTTAGAGCAGCCGGGAAGTTCAGGAGCCTGCGCTTGATTGCGCG GCCGATGATGCTTTCTGTTAACGACTGTCTCTCTACACACACACTGTGGAGTAAT TTATTTTACAACGCTTCTTCTTTGGGCTTTACGGCCCAAGGGTTACAAACACAAA CAACTATTGTATTTTAAACATTGTCAATTATTTTTCATTTTAGAAAAAAAATATTTA AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAA TGCGATAAGTATTGTGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA CATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTC TCAAACCCTCGGGTTTGGTAGTGAGTGGTACTCTTTCTGGGTTAACTTGAAAATG CTGGCCATCTGGCTGTTGCTGACTGAGGTTTTAGTCCAGTCCGCTGATACTCTG CGTATTAGGTTTTACCAACTCGTAGTGGCGTTAGTAGGCGTTTTAAAGGCTTTTA CTGAAAGTACAGACAGTCTGGCAAACAGTATTCATAAAGTTT

>GY7B actina 1: SEQ ID NO: 9:

[0103]GCTCAGTCCAAGAGAGGTATCTTGACCCTGCGTTACCCTATCGAG CACGGTATCGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTC TACAACGAGCTGAGAGTGGCCCCAGAGGAGCACCCAGTCTTGTTGACCGAGGC CCCAATGAACCCTAAGTCCAACAGAGAGAAGATGACTCAGATCCTGTTCGAGAC CTTCAACGTTCCAGCCTTCTACGTCTCCATCCAGGCCGTCTTATCCCTGTACTCC TCTGGTAGAACCACCGGTATCGTCTTGGACTCCGGTGACGGTGTTACTCACGTT GTGCCAATCTACGCCGGTTTCTCCTTGCCTCACGGTATCTTGAGAATCGACTTG GCTGGTAGAGACATGACCGACTACTTGATGAAGATCTTGAGTGAGCGTGGCTAC TCTTTCTCCACAACCGCCGAGAGAGAAATCGTGCGTGACATCAAGGAGAAGTTG TGTTACGTCGCCTTGGACTTCGAGCAAGAGATGCAGACCGCTGCCCAGTCCTCT GCCATTGAGAAGTCTTACGAGTTGCCTGACGGCCAAGTCATCACCATCGGTAAC GAGAGATTCAGAGCCCCAGAGGCCCTGTTCCACCCAAGTCTGCTGGGTCTGGA AGCTGCTGGTATCGACCAGACTGCTTACAACTCTATCATGAAGTGTGACGTCGA CGTCCGTAAGGAGTTGTACGGTAATATCGTCATGTCTGGTGGTACCACCATGTT CCCAGGTATTGCCGAGAGAATGCAGAAGGAAATCACTGCTTTGGCTCCATCCTC CATGAAGGTGAAGATCATTGCCCCACCAGAGAGAAAGTACTCTGTCTGGATCGG TGGTTCTA

Exemplo 6: Ensaio de assimilação de açúcar

[0104]A comparação da assimilação de açúcar entre a L. thermotolerans NRRL Y8284 e a GY7B foi realizada usando microplacas YT (BIOLOG®). Colônias de levedura recém-propagadas em ágar YPD foram selecionadas de 48 a 72 horas após crescimento a 25° a 30° C. Uma única colônia foi inoculada em 15 mL de água estéril e ajustada de acordo com o necessário para produzir uma % de transmitância de 47% ± 2% conforme determinada por um espectrofotômetro. Em seguida, colocaram-se 100 μL em cada um dos 96 poços da microplaca YT. A placa foi incubada a 27° C em uma câmara umedecida por cerca de 3 dias, e os resultados foram interpretados por inspeção visual. Para validar os resultados, cada experimento foi repetido duas vezes por dois analistas independentes. A Tabela 3 traz os resultados consensuais. Uma cédula vazia indica ausência de crescimento, um único sinal de mais (+) indica crescimento fraco e três sinais de mais (+++) indicam forte crescimento. A Tabela 3 foi construída de acordo com a disposição da microplaca YT. As primeiras três linhas acinzentadas são testes de oxidação que utilizam uma mudança de cor patenteada em resposta ao metabolismo celular das leveduras. Os demais poços são testes de assimilação de crescimento nos quais a turvação do poço é registrada. A Tabela 3 demonstra as diferenças de metabolismo e assimilação entre a GY7B e a L. thermotolerans. TABELA 3

Exemplo 7: Floculação

[0105]Para comparar a capacidade de floculação da GY7B e da L. thermotolerans, uma colônia recém-cultivada em ágar YPD foi selecionada para propagação em 5 mL de mosto de laboratório. Cada uma foi cultivada a 25° C sem agitação por 7 dias. Em seguida, ambos os tubos foram submetidos a redemoinho simultânea e consistentemente à mão para avaliar o impacto sobre a ressuspensão do pélete de levedura. A L. thermotolerans exibe baixa floculação conforme demonstrado por seu pélete disperso e cerveja turva. A GY7B é altamente floculante conforme demonstrado por seu pélete remanescente e cerveja clara (FIG. 6). A alta capacidade de floculação da GY7B ajudará em grande medida na remoção da levedura após a fermentação da cerveja, permitindo assim uma centrifugação, filtragem, pasteurização ou quaisquer outros processos pós-fermentação estabilizantes/clarificantes mais eficazes.

[0106]As revelações de toda e qualquer patente, pedido de patente e publicação citados neste documento incorporam-se ao presente documento por referência na íntegra. Embora a presente invenção tenha sido revelada com referência a modalidades específicas, transparecerá que outras modalidades e variações da presente invenção podem ser divisadas por outros versados na técnica sem divergir do verdadeiro âmbito e essência da invenção. As reivindicações apensas devem ser interpretadas de modo a incluir todas essas modalidades e variações equivalentes.

Claims

1. Método para produzir uma bebida fermentada por levedura, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende fermentar um mosto na presença de uma cepa de levedura capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com um pH baixo e um sabor ácido sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático, em que a cepa de levedura é GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 em 19 de julho de 2018).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a cepa de levedura é capaz de produzir uma bebida fermentada por levedura com um pH de 4,2 a 3,3 sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a bebida fermentada por levedura é cerveja.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a cepa de levedura é capaz de reduzir o pH do mosto para 3,5 em 5 dias sem o uso de bactérias produtoras de ácido.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a cepa de levedura pertence ao gênero Lachancea.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a cepa de levedura compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8 dentro da região ITS e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 dentro do gene da actina 1.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o método produz uma bebida fermentada por levedura com um pH de 4,2 a 3,3.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o mosto é fermentado na ausência de quaisquer bactérias produtoras de ácido.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o mosto é fermentado na ausência de quaisquer bactérias produtoras de ácido lático.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o mosto é fermentado na ausência de bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus ou Pediococcus.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o mosto compreende malte derivado de um ou mais grãos selecionados dentre o grupo consistindo em cevada, trigo, milho, centeio, arroz, aveia, sorgo, painço, trigo-sarraceno, quinoa e teff.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o mosto é fermentado na presença de ao menos uma cepa de levedura adicional selecionada dentre o grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces ludwigii, Aureobasidium pullulans, Cyberlindnera saturnus, Hansensiaspora uvarum, Hansensiaspora guilliermondii, Hansensiaspora osmophila, Hansensiasporavineae, Hansenula anomala, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Pichia kluyveri, Pichia caribbica, Pichia fermentans, Pichia kudriavzevii, Pichia Membranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa, Torulaspora delbrueckii, Candida colliculosa, Candida shehatae, Candida tropicalis, Candida ethanolica, Candida krusei, Candida magnolia, Candida milleri, Clavispora lusitaniae, Wickerhamomyces subpelliculosus, Wickerhamomyces anomalus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces fermentati, Zygosaccharomycesflorentinus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis e Dekkera anomala.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o mosto compreende ainda lúpulo.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o método não compreende o uso de ácido lático.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que ácido lático não é adicionado ao mosto antes, durante ou depois da fermentação.

18. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a cepa de levedura GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 em 19 de julho de 2018) e um ou mais itens ou ingredientes adequados para produzir uma bebida fermentada por levedura, em que os um ou mais itens ou ingredientes compreendem ao menos um item selecionado dentre o grupo consistindo em: solução preparada de mosto; extrato de malte seco; um ou mais grão selecionados dentre o grupo consistindo em cevada, trigo, milho, centeio, arroz, aveia, sorgo, painço, trigo-sarraceno, quinoa e teff; ao menos uma cepa de levedura adicional selecionada dentre o grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces ludwigii, Aureobasidium pullulans, Cyberlindnera saturnus, Hansensiaspora uvarum, Hansenisaspora guilliermondii, Hansensiaspora osmophila, Hansensiasporavineae, Hansenula anomala, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Pichia kluyveri, Pichia caribbica, Pichia fermentans, Pichia kudriavzevii, Pichia Membranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa, Torulaspora delbrueckii, Candida colliculosa, Candida shehatae, Candida tropicalis, Candida ethanolica, Candida krusei, Candida magnolia, Candida milleri, Clavispora lusitaniae, Wickerhamomyces subpelliculosus, Wickerhamomyces anomalus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces fermentati, Zygosaccharomycesflorentinus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis e Dekkera anomala; uma ou mais variedades de lúpulo; água cervejeira condicionada; e um ou mais adjuntos de açúcar.

19. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a cepa de levedura GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 em 19 de julho de 2018); materiais instrutivos compreendendo instruções para produzir uma bebida fermentada por levedura usando a cepa de levedura GY7B; um ou mais itens ou ingredientes para produzir uma bebida fermentada por levedura usando a GY7B; em que os um ou mais itens ou ingredientes compreendem um ou mais itens selecionados dentre o grupo consistindo em: solução preparada de mosto; extrato de malte seco; um ou mais grão selecionados dentre o grupo consistindo em cevada, trigo, milho, centeio, arroz, aveia, sorgo, painço, trigo-sarraceno, quinoa e teff; ao menos uma cepa de levedura adicional selecionada dentre o grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces ludwigii, Aureobasidium pullulans, Cyberlindnera saturnus, Hansensiaspora uvarum, Hansenisaspora guilliermondii, Hansensiaspora osmophila, Hansensiasporavineae, Hansenula anomala, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Pichia kluyveri, Pichia caribbica, Pichia fermentans, Pichia kudriavzevii, Pichia Membranifaciens, Rhodotorula mucilaginosa, Torulaspora delbrueckii, Candida colliculosa, Candida shehatae, Candida tropicalis, Candida ethanolica, Candida krusei, Candida magnolia, Candida milleri, Clavispora lusitaniae, Wickerhamomyces subpelliculosus, Wickerhamomyces anomalus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces fermentati, Zygosaccharomycesflorentinus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis e Dekkera anomala; uma ou mais variedades de lúpulo; água cervejeira condicionada; e um ou mais adjuntos de açúcar.

20. Método, de acordo com a reivindicação 15, ou kit, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o lúpulo é ao menos um selecionado dentre o grupo consistindo em Ahtanum, Amarillo, Apollo, Cascade, Centennial, Chinook, Citra, Cluster, Columbus, Crystal, Eroica, Galena, Glacier, Greenburg, Horizon, Liberty, Millenium, Mount Hood, Mount Rainier, Newport, Nugget, Palisade, Santiam, Simcoe, Sterling, Summit, Tomahawk, Ultra, Vanguard, Warrior, Willamette, Zeus, Admiral, Brewer's Gold, Bullion, Challenger, First Gold, Fuggles, Goldings, Herald, Northdown, Northern Brewer, Phoenix, Pilot, Pioneer, Progress, Target, Whitbread Golding Variety (WGV), Hallertau, Hersbrucker, Saaz, Tettnang, Spalt, Feux-Coeur Francais, Galaxy, Green Bullet, Motueka, Nelson Sauvin, Pacific Gem, Pacific Jade, Pacifica, Pride of Ringwood, Riwaka, Southern Cross, Lublin, Magnum, Perle, Polnischer Lublin, Saphir, Satus, Select, Strisselspalt, Styrian Goldings, Tardif de Bourgogne, Tradition, Bravo, Calypso, Chelan, Comet, El Dorado, San Juan Ruby Red, Satus, Sonnet Golding, Super Galena, Tillicum, Bramling Cross, Pilgrim, Hallertauer Herkules, Hallertauer Magnum, Hallertauer Taurus, Merkur, Opal, Smaragd, Halleratau Aroma, Kohatu, Rakau, Stella, Sticklebract, Summer Saaz, Super Alpha, Super Pride, Topaz, Wai-iti, Bor, Junga, Marynka, Premiant, Sladek, Styrian Atlas, Styrian Aurora, Styrian Bobek, Styrian Celeia, Sybilla e Sorachi Ace.

21. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a bebida fermentada por levedura é cerveja.

22. Uso da cepa de levedura GY7B (depositada junto à ATCC sob o Número de Acesso PTA-125167 em 19 de julho de 2018), ou do kit, como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 20 CARACTERIZADO pelo fato de que é na produção de uma cerveja com um pH baixo e um sabor ácido.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a cerveja é produzida sem o uso de bactérias produtoras de ácido lático.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a cerveja é produzida sem o uso de ácido lático.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a cerveja possui um pH de 4,2 a 3,3.