JP2018516573A

JP2018516573A - 果物又は野菜基質の直接播種のための圧縮酵母

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Publication number: JP2018516573A
Application number: JP2017562308A
Authority: JP
Inventors: ビェアアクリスティーネ; ヘンドレクスビーガスヤン; ベーダキマンソア; サンダイェンスンカチャ
Original assignee: セーホーエル．ハンセンアクティーゼルスカブ
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2018-06-28
Also published as: AU2016273357A1; CA2987868A1; WO2016193465A1; ES2965880T3; EP3303551C0; BR112017025492A2; EP3303551A1; AU2016273357B2; PL3303551T3; MX2017015364A; BR112017025492B1; CN107683328A; ZA201708022B; EP3303551B1; US20180179479A1

Abstract

本発明は、果物又は野菜基質の発酵における直接播種のための、例えば飲料、例えばワイン又はビールの発酵のための、圧縮酵母の新規形態に関する。特に、本発明は、乾燥物質含量が３５〜９０重量％の好ましくは乾燥形態の圧縮酵母、当該圧縮酵母を用いて果物又は野菜基質の直接播種により発酵飲料を製造する方法、及び当該圧縮酵母を含有する容器に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、果物又は野菜基質の発酵における直接播種のための、例えば飲料、例えばワイン又はビールの発酵のための、圧縮酵母の新規形態に関する。特に、本発明は、乾燥物質含量が３５〜９０重量％の好ましくは乾燥形態の圧縮酵母、当該圧縮酵母を用いて果物又は野菜基質の直接播種により発酵飲料を製造する方法、及び当該圧縮酵母を含有する容器に関する。

ワイン産業において、使用される酵母は、通常、９０重量％を超える乾燥物質含量の活性乾燥酵母（ＡＤＹ）であり、これは、ワインに播種する前に、時間の掛かる再水和及び特定の温度での再活性化を要する。

ＡＤＹの生産には、最初に酵母を培養期中で生産し、濾過し、最後に圧縮酵母の流動層乾燥を含む、幾つかの工程を有する。

しかしながら、このプロセスは、この産物が播種に使用できるようになる前に、幾つかの工程（再水和、再活性化及び順化）を経る必要があることを意味する。

産物を乾燥させるため、酵母細胞は、脱水され、故に、それは、基質（例えばワイン製造の場合ブドウ果汁）に適応する前に代謝的に活性にするため、適切な媒体中で再水和され、そして再活性化される必要がある。これは酵母細胞にとって非常にデリケートなプロセスで、温度、時間及び活性化媒体等の要素が細胞の生存を保証するのに重要であるため、顕著な量の時間及び注意を有する。従って、ＡＤＹの再水和は、しばしば、ワイン製造プロセスにおける商業的醸造において、熟練者が多くの時間を割くことを要する。

活性乾燥酵母製造の乾燥プロセスの間、その酵母細胞の細胞膜はそれらの透過性障壁の機能を緩める（ＲｏｇｅｒＢｏｕｌｔｏｎｅｔａｌ，１９９６，ｐａｇｅ１２４）。従って、この機能を再確立するために、その酵母を４０℃で２０分間水中に入れることによりその膜を再水和することが重要である。従って、その酵母再水和プロセスは典型的には、塩素処理されていない水または水／ブドウ果汁混合物（２：１）中で３５〜３８℃の温度において２０〜３０分間の再水和、次いでその後に同じ体積のブドウ果汁（５０：５０果汁／水のブレンド）の添加を含み、それはそれをワインに添加する前にさらに２０〜３０分間そのままにしておく。そのブドウ果汁は、敏感な再水和のプロセスの間に酵母細胞を殺す可能性のあるＳＯ_２を一切含有しないことは重要である（Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，２００８）。加えて、その再水和混合物は水中で２０分後に５℃の果汁により一度に冷却されなければならない。３０分後にその再水和温度から冷却し損なうことも、結果として著しい細胞死をもたらし得る（Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，２００８）。さらに、汚染されたブドウ果汁による再水和は結果としてその再水和混合物を用いて接種した全てのワイン発酵の汚染をもたらすと考えられるため、その再水和プロトコルに関して汚染されていないブドウ果汁を用いるように注意するべきである。様々な製造業者がこのプロトコルに関して異なる形を提案しているが、重要な工程は、脱水された細胞を適切に水和させるために水または水／果汁混合物に特定の温度で、衛生的条件において、および特定の時間の間曝露させる必要があり、それにより細胞死および結果として起こる不活性を避ける。ブドウ果汁中の高い糖濃度、ＳＯ_２および他の化合物が酵母の最適な再水和を許さないため、活性乾燥酵母を直接果汁に添加するのは推奨されない。この理由のため、活性乾燥酵母のブドウ果汁液への直接接種を提案するワイン酵母製造業者は無い。

活性乾燥酵母（ＡＤＹ）は、再水和が最適でない場合、活性を失う（Ｓｏｕｂｅｙｒａｎｄｅｔａｌ．２００６）。ＡＤＹの適切でない再水和は、アルコール発酵の行き詰まりをももたらし、即ち酵母は基質中に存在する糖を全て発酵せず、甘すぎる飲料が出来てしまう。

基質に酵母を添加する他の方法は、基質に直接添加できる凍結酵母の使用である（ＷＯ２０１１／１３４９５２）。この方法において、産物は、乾燥物質含量が２８重量％を下回り直接播種が可能で直接播種の過程で高い生存率を有する、凍結クリーム酵母である。この濃縮物は、−５０℃で凍結される。

この方法の短所は、製品が−５０℃で凍結され、低温流通体系によって頒布され、そして−５０℃で保存される必要があることである。更に、この濃縮物の厳しい凍結条件は酵母細胞にダメージを与え、それらの生存率に影響する、故に、凍結及び／又は乾燥の間又は後、酵母細胞を安定化させる、添加物が、凍結の前に、液体濃縮物にしばしば添加される。

製品に添加される添加物の数が限定されるいわゆる「クリーンラベル」食品に対する消費者からの要求が増大している。食品産業は国に特有の規制、並びにＯＩＶ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＯｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎｏｆＶｉｎｅａｎｄＷｉｎｅ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｉｖ．ｉｎｔ）、ＥＢＣ（ＥｕｒｏｐｅａｎＢｒｅｗｅｒｙＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）及びＡＳＢＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＢｒｅｗｉｎｇＣｈｅｍｉｓｔｓ）等の食品局や政府間組織の勧告に従うよう努めている。更に、添加物の使用は、濃縮物を希釈して、最終的な圧縮酵母製剤中の酵母細胞の濃度（濃縮物の体積あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ））の低下をもたらす。

本発明の目的は、乳化剤、油、水分活性調整剤、及び凍結、乾燥及び／又は凍結保存の過程での酵母細胞の安定性を改善するために添加される薬剤等の添加される添加物の非存在下で酵母の生存率を高めることが可能な、果物又は野菜の直接播種による飲料の発酵のための酵母の改善された製剤の提供である。飲料の発酵における使用に加えて、本発明の酵母製剤が、炭水化物に富む液体基質の直接播種によるエタノール発酵に良く適していることを想定する。

発明者らは、乾燥物質含量が３５〜９０重量％のワイン及びビール酵母等の圧縮酵母が、凍結されたとき、相対的に含水量が高く、及び凍結、乾燥及び／又は低温保存の過程酵母細胞の生存率を改善するために添加される薬剤を含有しないにも拘らず、高い生存率を示すことを、驚くべきことに見出した。加えて、圧縮酵母は、果物又は野菜基質の直接播種にとって理想的で、１００％に近い生存率をもたらし、そして、圧縮酵母は、例えばコンタミネーションを避けるために真空パックされた、衛生的条件下では、４℃で数ヶ月間保存でき、又はより長期間凍結保存できる。

図１は、ＡＤＹの製造及びＡＤＹによる基質の播種（上）、並びに本発明の圧縮酵母の生産（下）のための下流プロセスにおける様々な工程を示す。

図１の下に見られるように、本発明の圧縮酵母の生産、及び本発明の圧縮酵母による播種のいずれも、顕著に短縮化され、それは、生産プロセスのコストを減少させる。

第一の側面において、本発明は、乾燥物質含量が３５〜９０重量％である、果物又は野菜基質の直接播種のための圧縮酵母の提供に関する。幾つかの態様において、乾燥物質含量は３０〜４５％、例えば３０〜４０％、又は３５〜４５％である。

他の態様において、圧縮酵母の乾燥物質含量は、４５〜７５重量％である。

試料の乾燥物質含量は、水分を蒸発させるために１０５℃±５℃で加熱することにより測定される。試料は乾燥前後で測定され、乾燥物質含量（重量％）を得るために、以下の計算が実施される。

重量パーセンテージ又はキログラムあたりのグラムとして表される乾燥物質（Ｗ_ｄｍ）含量は、下記の等式を用いて計算される：
ここで：
Ｗ_ｄｍ：試料の乾燥物質、パーセンテージ又はキログラムあたりのグラム；
ｍ_ａ：空の皿又はるつぼの重量、グラム；
ｍ_ｂ：試料を載せた皿又はるつぼの重量、グラム；
ｍ_ｃ：完全に脱水して全ての水分を除去した後の試料を載せた皿又はるつぼの重量、グラム；
ｆ：変換係数、結果をパーセンテージとして表す場合ｆ＝１００、キログラムあたりのグラムで表す場合ｆ＝１０００。

数値は、最も近い０．１重量％に、又は最も近い１ｇ／ｋｇに四捨五入されるべきである。

好ましい態様において、本発明の圧縮酵母は、何らかの追加の添加物を含有しない。

好ましい態様において、凍結後の圧縮酵母の生存率は、凍結前の圧縮酵母のＣＦＵ（コロニー形成単位）の濃度、及び凍結後の圧縮酵母のＣＦＵの濃度に基づいて計算された場合、２０％以上である。好ましくは、酵母の生存率は、２５％以上、例えば３０％以上、例えば３５％以上、例えば４０％以上、例えば４５％以上、例えば５０％以上、例えば５５％以上、例えば６０％以上、例えば６５％以上、例えば７０％以上、例えば７５％以上、例えば８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９１％以上、例えば９２％以上、例えば９３％以上、例えば９４％以上、例えば９５％以上、例えば９６％以上、例えば９７％以上、例えば９８％以上、例えば９９％以上である。最も好ましくは、生存率は１００％である。

好ましい態様において、圧縮酵母の生存率は、圧縮酵母のＣＦＵ（コロニー形成単位）の濃度及び播種された材料のＣＦＵの濃度に基づいて計算された場合、果物又は野菜基質の直接播種後、６０％以上である。好ましくは、酵母の生存率は、６５％以上、例えば７０％以上、例えば７５％以上、例えば８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上である。

他の好ましい態様において、圧縮酵母の生存率は、保存前の圧縮酵母のＣＦＵ（コロニー形成単位）の濃度及び播種された材料のＣＦＵの濃度に基づいて計算された場合、果物又は野菜基質の直接播種前に−２０℃で５ヶ月間保存した後、８０％以上である。好ましくは、酵母の生存率は、８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上である。

好ましい態様において、圧縮酵母は０℃未満の温度で凍結される。好ましくは圧縮酵母は、０℃よりも顕著に低い、例えば−５℃、例えば−２０℃、例えば−５０℃の温度で凍結される。

好ましい態様において、本発明の圧縮酵母は、凍結の過程又は後に酵母細胞を安定化するために液体酵母濃縮物に添加される何らかの添加剤無しで凍結される。

好ましい態様において、凍結圧縮酵母の生存率は、凍結前の圧縮酵母のＣＦＵ（コロニー形成単位）の濃度及び凍結後の圧縮酵母のＣＦＵの濃度に基づいて計算された場合、凍結後、８０％以上である。好ましくは、酵母の生存率は、２５％以上、３０％以上、例えば３５％以上、例えば４０％以上、例えば４５％以上、例えば５０％以上、例えば５５％以上、例えば６０％以上、６５％以上、例えば７０％以上、例えば７５％以上、例えば８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９１％以上、例えば９２％以上、例えば９３％以上、例えば９４％以上、例えば９５％以上、例えば９６％以上、例えば９７％以上、例えば９８％以上、例えば９９％以上である。最も好ましくは、生存率は１００％である。

酵母の生存率の決定は、当業者に知られた適切な任意の方法によって実施され得る。好ましい態様において、ＣＦＵ／ｇ及びＣＦＵ／ｍｌ細胞カウントの決定は、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＯｅｎｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｄｅｘ，２０１３ＩｓｓｕｅのチャプターＩＩのＯＩＶに記載のように実施される。

好ましい態様において、凍結圧縮酵母の生存率は、圧縮酵母のＣＦＵ（コロニー形成単位）の濃度及び播種された材料のＣＦＵの濃度に基づいて計算された場合、果物又は野菜基質の直接播種後、６０％以上である。好ましくは、酵母の生存率は、６５％以上、例えば７０％以上、例えば７５％以上、例えば８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上である。

他の好ましい態様において、凍結圧縮酵母の生存率は、凍結及び播種前の圧縮酵母のＣＦＵ（コロニー形成単位）の濃度及び播種された材料のＣＦＵの濃度に基づいて計算された場合、果物又は野菜基質の直接播種前に−２０℃で５ヶ月間保存した後、８０％以上である。好ましくは、酵母の生存率は、８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上である。

本発明の圧縮酵母は、好ましくは濃縮形態で存在する。

好ましい態様において、圧縮酵母は、１０^９ＣＦＵ／ｇ以上の酵母、例えば５ｘ１０^９ＣＦＵ／ｇ以上の酵母、例えば１０^１０ＣＦＵ／ｇ以上の酵母、例えば５ｘ１０^１０ＣＦＵ／ｇ以上の酵母、例えば１０^１１ＣＦＵ／ｇ以上の酵母、例えば５ｘ１０^１１ＣＦＵ／ｇ以上の酵母、例えば１０^１２ＣＦＵ／ｇ以上の酵母を含有する。

好ましい態様において、圧縮酵母は、サッカロマイケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイェロマイケス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ラカンケア（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ブレッタノマイケス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、メトシュニコウィア（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、サッカロマイコデス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、ザイゴサッカロマイケス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、イッサトチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、シゾサッカロマイケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ウィッケラモマイケス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ）及びデバリオマイケス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）からなる群の属から選択される。

好ましい態様において、圧縮酵母は、サッカロマイケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母、好ましくはサッカロマイケス・セレウィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母である。

他の好ましい態様において、酵母はワイン酵母又はビール酵母であり、好ましくは、ワイン酵母又はビール酵母は、サッカロマイケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイェロマイケス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ラカンケア（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ブレッタノマイケス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）及びメトシュニコウィア（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）酵母からなる群から選択される。

本発明は、更に、発酵飲料を製造する方法を提供し、当該方法は、以下の工程：
ａ）当該飲料の製造の為の果物又は野菜の基質を提供する工程；
ｂ）当該基質に本発明の圧縮酵母を直接播種する工程；及び
ｃ）当該基質を当該圧縮酵母によって発酵させて、当該発酵飲料を取得する工程；
を含む。当業者が承知しているように、直接播種とは、圧縮酵母を、再水和や再活性化工程を行わずに果物又は野菜基質に直接添加することを意味する。

発酵は好気又は嫌気条件下で実施され得、又は好気及び嫌気条件の連続下で実施されてもよい。

好ましい態様において、発酵飲料は、ワイン、ビール、シードル、日本酒及びソフトドリンクからなる群から選択される。好ましくは、発酵飲料はワインである。

他の好ましい態様において、飲料製造のための果物又は野菜基質は、果物又は野菜の汁である。好ましくは、果汁はブドウ果汁であり、発酵飲料はワインである。

本発明の圧縮酵母は、嫌気条件下でのエタノール発酵のための水性果物又は野菜基質の直接播種の類似の方法に用いるのに等しく適している。適切な果物又は野菜基質は、炭水化物に富む基質で、限定されないが、コーンシロップ、甘蔗糖／糖蜜に基づく水溶液を含む。

本発明の他の側面は、本発明の圧縮酵母を含有する容器に関する。好ましい態様において、容器は、カートン又は密封プラスチック容器からなる群から選択される。

定義
「クリーム酵母」は、本発明において、発酵器中で酵母を増殖し、遠心分離で濃縮することにより通常生産される、乾燥物質含量が２８重量％未満の液体酵母を意味する。

「圧縮酵母」は、本発明において、発酵器中で酵母を増殖し、遠心分離、濾過、押出し及び任意で流動層乾燥機等の乾燥機上で部分的に乾燥して通常生産する。乾燥物質含量が３５〜９０重量％の酵母を指す。幾つかの態様において、乾燥物質含量は、３０〜４５重量％、例えば３０〜４０％、又は３５〜４５％である。

本発明において、「部分的に乾燥した圧縮酵母」は、発酵器中で酵母を増殖し、遠心分離、濾過、押出し及び任意で流動層乾燥機等の乾燥機上で部分的に乾燥して生産する、乾燥物質含量が４５〜９０重量％の酵母を指す。

本発明において、「活性乾燥酵母」又は「ＡＤＹ」は、発酵器中で酵母を増殖し、遠心分離、濾過、押出し及び流動層乾燥機上で乾燥して通常生産する、乾燥物質含量が９０重量％を超える酵母を指す。

本発明において、「野菜」は、任意の植物を指す。好ましくは、「野菜」は、食用可能な植物又は食用可能な植物部分を指す。

本発明において、「果物」は、花から発達した植物の食用可能な部分を指す。果物は、皮（ｓｋｉｎ）皮（ｐｅｅｌ）又は鞘（ｐｏｄ）等の食用可能な部分の付属組織を含み得る。

本発明において、「酵母エンハンサー」は、ビタミン、窒素、リン酸塩又はミネラル等の、酵母の増殖の前又は間に添加される補給物質を指す。

本発明において、「添加物」は、酵母の増殖後に酵母製剤の生産の任意の時点で酵母濃縮物に添加される食品グレードの剤を指し、例えば、乳化剤、限定されないがグリセロール、グルコース、スクロース及びトレハロース並びに油等の酵母濃縮物の押出しや切断において補助する剤、凍結及び／又は低温保存の過程で酵母細胞の安定性を改善する剤、水分活性を調整する剤等の凍結した酵母製剤の融点を変える剤、が挙げられる。

本発明において添加物を言及するときの「添加」とは、添加物が、所望の効果を与えるのに十分な量で圧縮酵母の生産の過程で酵母濃縮物に導入されることを意味する。

図１は、ＡＤＹを調製する、及びＡＤＹを播種するプロトコル（上）、並びに発酵飲料の調製のための直接播種のための本発明に係る圧縮酵母を調製するプロトコル（下）を示す。

図２は、冷蔵庫又は液体窒素中で、濃縮物を４℃に維持し、又は−２０℃若しくは−５０℃で凍結して、その温度で１ヶ月間保存した後の、サッカロマイケス・セレウィシアエ酵母の生存率を示す。

図３は、冷蔵庫又は液体窒素中で、濃縮物を４℃に維持し、又は−２０℃若しくは−５０℃で凍結して、その温度で１ヶ月間保存し、それらをブドウマストに直接播種した後の、サッカロマイケス・セレウィシアエ酵母の生存率を示す。

図４は、処理後の生存率（図３）及び直接播種における生存率（図２）の両方を含む、サッカロマイケス・セレウィシアエ酵母の全生存率を示す。

図５は、処理前又は所定の温度で異なる期間保存した後の本発明の圧縮酵母として、又はＡＤＹとして製剤化された、サッカロマイケス・セレウィシアエ酵母の生存率を示す。

図６は、サッカロマイケス・セレウィシアエＡＤＹ酵母及び本発明のサッカロマイケス・セレウィシアエ凍結圧縮酵母の、ＡＤＹ酵母における標準的な播種（酵母の「再活性化」）後、及び直接播種後の、酵母細胞の生存率の比較を示す。

実施例１
従来のサッカロマイケス・セレウィシアエ株の生産の過程で、生産過程の異なる３つの段階；１）遠心分離後の液体（クリーム）酵母；２）抽出後乾燥物質含量４０％の圧縮酵母（新鮮な酵母）；及び３）流動層乾燥後乾燥物質含量９２％の活性乾燥酵母（ＡＤＹ）：で、試料を採取した。

これらの試料を、細胞カウント、冷蔵庫又は液体窒素中で、濃縮物を４℃に維持し、又は−２０℃若しくは−５０℃で凍結して、その温度で１ヶ月間保存した後の生存率（図２）、冷蔵庫又は液体窒素中で、濃縮物を４℃に維持し、又は−２０℃若しくは−５０℃で凍結して、その温度で１ヶ月間保存し、それらをブドウマストに直接播種した後の生存率（図３）、及び冷蔵庫又は液体窒素中で、濃縮物を４℃に維持し、又は−２０℃若しくは−５０℃で凍結して、その温度で１ヶ月間保存した後の、ブドウマストに直接播種した場合の全生存率（図４）について解析した。

処理及び期間中の生存率
液体酵母の試料２００ｍｌを無処理又は２０％トレハロースで処理して、−２０℃冷蔵庫中で凍結した。細胞カウントは、凍結前及び凍結後にもう一回、そして期間中測定された。

圧縮酵母は、酵母細胞の生存率に対する凍結速度の効果を評価するために、様々なサイズ及び様々な温度で凍結された。試料のサイズは、２００ｍｌボトル（大）及び５０ｍｌファルコンチューブ（小）とした。冷蔵庫の温度は、それぞれ−２０℃及び−５０℃とした。

また、圧縮酵母は、ペレットとして（１〜２ｍｌ長（小）及び５ｇクランプ（大）として）、液体窒素中で凍結された。

酵母生存率（パーセンテージ）を決定するため、細胞カウントが、凍結前に測定され、そして凍結１ヶ月後にもう一度（図２）、そして期間中（図５）測定された。

直接播種における生存率
全ての試料は、保存１ヶ月後の直接播種にも使用され、酵母細胞が水及びブドウ果汁中の高い浸透圧に晒された時の生存率が試験された。試料１．０ｇを、リースリング果汁２００ｍｌに添加した（表１）。試料を静かに撹拌して溶解し、約１０〜１５分後、希釈系列を作製し、酵母の生存率（パーセンテージ）を決定し、ＣＦＵ／ｇは、直接播種後に計算された（図３）。
表１：１ヶ月後の直接播種試験に用いたブドウ果汁のパラメーター

酵母の直接播種と「再活性化」による生存率の比較
２つの異なる方法の使用による播種の生存率を比較した。両方の方法において、播種体積は０．２ｇ／ｌとした。直接播種において、試料はシャルドネ果汁に直接添加された（表２）。標準的な播種において、試料は最初に非塩素化水中で３０分間１：１０で再水和された。そして非硫化ブドウ果汁を、この水に１：３で添加し、懸濁物を、もう２０分間活性化させた。この活性化懸濁物を、最終播種レベルが０．２ｇ／ｌに達するまで、前記果汁に添加した。全ての播種は２回実施された。

産物のＣＦＵ／ｇは播種の前及び後に計算され、生存率はパーセンテージとして計算された（図６）。
表２：８ヶ月後の直接播種実験に使用されたブドウ果汁のパラメーター

コロニー形成単位（ＣＦＵ）の決定
ブドウ果汁に播種された、又はペプトン水中に溶解した酵母から採取した試料のＣＦＵ／ｇ及びＣＦＵ／ｍｌ細胞カウントの決定は、ＹＧＣ培地上で混釈平板法（ｐｏｕｒ−ｐｌａｔｉｎｇ）によって実施された（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＯｅｎｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｄｅｘ，２０１３Ｉｓｓｕｅの別紙ＶＩ中のＯＩＶに示されるように調製された）。希釈系列（ペプトン水）から１ｍｌの試料を取ってプレートに添加し、その上に液体ＹＧＣ寒天（４５℃）を注ぎ、混合した。寒天が固まった後、プレートを３０℃で２〜３日インキュベーションした。ＣＦＵの決定は、全ての場合で３回実施された。

結論
これらの結果は、直接播種における酵母の生存率（図２）が、特に４℃で保存した圧縮酵母及び−５０℃又は液体窒素中で保存した圧縮酵母において、非常に高いことを示す。

異なる処理を行い当該試料を１ヶ月間この温度で保存した酵母の生存率は、高度な変動を示す（図３）。驚くべきことに、高い含水量を有する圧縮酵母は、−２０℃及び−５０℃で凍結したとき、ほぼ１００％の生存率を示す。圧縮酵母が液体窒素中で凍結された場合の生存率（＞６０％）も、驚異的に高い。液体酵母は、凍結の過程で非常に低い生存率を示し、ＡＤＹも、４℃で１ヶ月保存したとき、ＣＦＵの高いパーセンテージが低下する。

全生存率は、圧縮酵母は、凍結した場合であっても、最も高い生存率を示すことを示す（図４）。−５０℃で凍結して直接播種に用いた圧縮酵母の生存率は、ほぼ１００％であった。

異なるフォーマットでの安定性は５ヶ月に渡り測定され、結果は図５に示された。圧縮酵母試料の細胞カウントは、数回試料が採取されたため温度が定常ではなかったにも拘らず、非常に安定であった。

４℃で保存された圧縮酵母は、より長い期間に渡り適切な衛生状態を保つように試料が包装されなかったため、４ヶ月だけ追跡された。

活性乾燥酵母（ＡＤＹ）産物は、再水和及び再活性化後に播種された場合と比較して、直接播種された場合、より低い生存率を示した（図６）。直接播種に使用された場合、ＡＤＹの生存率は平均５３％であり、再水和及び再活性化後に播種された場合、生存率は平均８１％であった。凍結した圧縮酵母において、直接播種における生存率は９３％で、「標準的な」手順により播種された場合の生存率は８６％で、これでもＡＤＹ産物の平均よりも高い。

参考文献：
Roger Boulton, Vernon Singleton, Linda Bisson and Ralph Kunkee. 1996. Principles and Practices of Winemaking. pp. 124.
Karien O’Kennedy. (2008). How to avoid stuck fermentations, The Australian & New Zealand Grapegrower & Winemaker. November, Issue 538, 103-105.
Virginie Soubeyrand, Anne Julien and Jean-Marie Sablayrolles (2006) Rehydration Protocols for Active Dry Wine Yeasts and the Search for Early Indicators of Yeast Activity
American Journal of Enolology and Viticulture. 57(4)474-480.
WO2011/134952

Claims

発酵飲料を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）当該飲料の製造の為の果物又は野菜の基質を提供する工程；
ｂ）当該基質に圧縮酵母を直接播種する工程、ここで、当該圧縮酵母は、凍結した圧縮酵母であり、乾燥物質含量は３５〜９０重量％である；及び
ｃ）当該基質を当該圧縮酵母によって発酵させて、当該発酵飲料を取得する工程；
を含む、製造方法。
前記圧縮酵母が、凍結した圧縮酵母であり、乾燥物質含量は４５〜７５重量％である、請求項１に記載の方法。
前記圧縮酵母が、更に添加物を含有しない、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
前記圧縮酵母が、凍結中又は凍結後に酵母細胞を安定化するために液体酵母濃縮物に添加される追加の添加物無しで凍結される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記酵母の生存率が、凍結前の圧縮酵母のＣＦＵ（コロニー形成単位）の濃度及び凍結後の圧縮酵母のＣＦＵの濃度に基づいて計算された場合、凍結後に、２０％以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記酵母の生存率が、圧縮酵母のＣＦＵ（コロニー形成単位）の濃度及び播種された材料のＣＦＵの濃度に基づいて計算された場合、果物又は野菜基質の直接播種の後、６０％以上である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記酵母の生存率が、凍結前の圧縮酵母のＣＦＵ（コロニー形成単位）の濃度及び播種された材料のＣＦＵの濃度に基づいて計算された場合、果物又は野菜基質の直接播種の前に２０℃の温度で５ヶ月間保存した後、８０％以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記酵母が、サッカロマイケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイェロマイケス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ラカンケア（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ブレッタノマイケス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）メトシュニコウィア（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、サッカロマイコデス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、ザイゴサッカロマイケス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、イッサトチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、シゾサッカロマイケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ウィッケラモマイケス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ）及びデバリオマイケス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記酵母がサッカロマイケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母である、請求項８に記載の方法。
前記発酵飲料が、ワイン、ビール、シードル、日本酒及びソフトドリンクからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記基質が果汁である、請求項１０に記載の方法。
前記果汁がブドウ果汁であり、前記発酵飲料がワインである、請求項１１に記載の方法。