CN107519496A - 一类l‑肉毒碱两亲性衍生物及其修饰的纳米粒及其用途 - Google Patents

一类l‑肉毒碱两亲性衍生物及其修饰的纳米粒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及一类L‑肉毒碱两亲性衍生物及其修饰的纳米粒。还涉及L‑肉毒碱衍生物及其修饰的纳米粒的制备，及其L‑肉毒碱衍生物作为药物递送载体在脑部药物递送方面的应用。本发明利用血脑屏障和脑胶质瘤表面高表达的OCTN2转运体作为靶点，合成L‑肉毒碱两亲性衍生物，采用物理镶嵌的方法修饰纳米粒使其表面携带L‑肉毒碱，以生物相容性好的高分子材料为基础载体，包载抗肿瘤药物后制成基于OCTN2转运体的脑胶质瘤靶向药物递送系统，用于提高纳米载体的脑内分布及脑胶质瘤治疗效果。所述的两亲性化合物结构如下：

Description

一类L-肉毒碱两亲性衍生物及其修饰的纳米粒及其用途
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及一类L-肉毒碱两亲性衍生物及其修饰的纳米粒。还涉及L-肉毒碱衍生物及其修饰的纳米粒的制备，及其L-肉毒碱衍生物作为药物递送载体在脑部药物递送方面的应用。
背景技术
脑胶质瘤属于脑部的恶性肿瘤，具有极高的发病率和致死率。由于脑胶质瘤的恶性生长、侵润性和渗透性，其很难通过手术的手段完全去除，化疗可以作为一种补充治疗的手段用于脑胶质瘤的治疗。然而，由于血脑屏障将大脑与血液循环系统分开，超过98％的小分子药物不能进入脑部，而且进入脑部的化疗药物也不能有效分布在肿瘤区域。因此，跨越血脑屏障并增加脑胶质瘤细胞摄取对抗脑胶质瘤药物递送系统来说非常重要。
近年来，纳米技术应用于药物递送系统有效提高了化疗药物的治疗效果，比如纳米粒、胶束、脂质体等。然而，传统的纳米药物递送系统并不能有效跨过血脑屏障进入脑部。为了提高纳米载体的脑部递送效率，可以将纳米粒修饰上特殊的多肽或者抗体，其可以特异性的粘附到血脑屏障上表达的受体或转运体，从而增加纳米载体的透过性，进一步靶向脑胶质瘤细胞，增加纳米药物的治疗效果。随着生物学和生物化学的发展，血脑屏障上和脑胶质瘤部位越来越多的受体或者转运体被解析出来，其可以作为纳米药物递送的靶点，提高纳米药物的治疗效果。
研究显示血脑屏障上表达的膜转运体主要提供大脑的营养物质需求，比如葡萄糖、氨基酸、多肽、和维生素。这些转运体也可以作为纳米药物递送的靶点进行脑部药物的递送，目前已经报道有一些转运体作为纳米药物递送系统的靶点，如葡萄糖转运体GLUT1，维生素C转运体SVCT2，大型氨基酸转运体LAT1和胆碱转运体；此外，由于脑胶质瘤的恶性生长，这些营养型转运体也同样在胶质瘤细胞高表达。选择性靶向这些转运体的纳米药物载体不仅可以有效提高药物的跨血脑屏障效率，也可以提高纳米药物载体在脑胶质瘤的分布，增加药物对脑胶质瘤的治疗效果。新型有机阳离子转运体OCTN2，可以有效转运L-肉毒碱用于长链脂肪酸的β-氧化，其同样在血脑屏障上高表达。虽然脂肪酸的β-氧化并不是脑部细胞的能量来源，但是乙酰-L-肉毒碱在维持脑部功能及能量稳定方面具有重要作用，其主要通过OCTN2穿过血脑屏障进入脑部。我们发现在多型性胶质母细胞瘤T98G细胞上OCTN2也有高度表达，因此OCTN2也可以作为脑胶质瘤治疗的纳米药物递送靶点，用于提高纳米载体透过血脑屏障的效率和提高胶质瘤细胞的靶向性，进而提高纳米药物对脑胶质瘤的治疗效果。
基于此，我们构建以L-肉毒碱为靶向配体的纳米粒，通过靶向血脑屏障上表达的OCTN2转运体提高脑部分布，通过靶向脑胶质瘤细胞提高治疗效果，并降低对正常细胞的伤害。目前未见以OCTN2转运体为靶点的脑部纳米药物递送系统的报道。我们将OCTN2的专属性底物设计为靶点，通过聚乙二醇将其与硬脂酸桥连，制成两亲性化合物，用来修饰纳米载体，构建用于靶向OCTN2转运体治疗脑胶质瘤的纳米药物递送系统。
发明内容
本发明的目的是针对脑胶质瘤化疗药物难以递送的问题，提供一种L-肉毒碱为配基、血脑屏障和脑胶质瘤高表达的OCTN2转运体为靶点的纳米药物递送系统。
本发明提供一类L-肉毒碱两亲性衍生物及其制备方法，该类衍生物以聚乙二醇将L-肉毒碱和疏水性链段桥连。
本发明提供该修饰纳米粒的制剂处方，使用制备的L-肉毒碱两亲性衍生物为修饰材料，以生物可降解高分子材料为基础载体，包载抗肿瘤药物，制成抗脑胶质瘤药物递送系统。
本发明提供的靶向纳米粒稳定性好，靶向效率高，可使药物跨过血脑屏障，有效分布到脑胶质瘤细胞内，其也可应用于其他药物的脑部递送。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明所述的一类由聚乙二醇将OCTN2转运体底物L-肉毒碱和疏水性链段硬脂酸桥连的两亲性化合物，是一种稳定性好的用于构建OCTN2靶向纳米药物递送系统的修饰材料。
所述的聚乙二醇可以为PEG500-5000。
所述的硬脂酸可以为长链脂肪酸，如十八酸、十六酸、十四酸等。
所述的两亲性化合物结构如下：
进一步地，n可以为10-40，优选为10，25，40。
本发明提供了一类L-肉毒碱的两亲性衍生物的制备方法，其具体采用如下步骤制备：
(1)L-肉毒碱的保护
将L-肉毒碱和溴化苄以摩尔比1：1～1.4的比例加入DMF中搅拌均匀，加热至110～130℃，搅拌条件下反应2～6小时，减压蒸馏除去溶剂DMF及未反应的溴化苄，即得L-肉毒碱苄酯(A)。
(2)L-肉毒碱苄酯与丁二酸桥连
将得到的化合物(A)和丁二酸酐以摩尔比1：1～1.4的比例加入无水二氯甲烷中，加热至35～45℃，搅拌条件下反应12～36小时。在减压蒸馏条件下除去溶剂二氯甲烷，残留物用乙醚和二氯甲烷混合溶剂(乙醚：二氯甲烷体积比为1：1～3)洗三次，所得到的黄色粘稠残留物即为化合物(B)。
(3)聚乙二醇硬脂酸-L-肉毒碱苄酯的合成
化合物(B)与碳二亚胺类活化试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)以摩尔比1：1.1～1.4的比例加入二氯甲烷中，冰浴中反应1～2小时进行活化，然后加入聚乙二醇硬脂酸酯(聚乙二醇硬脂酸酯与化合物(B)摩尔比为1：1.1～1.4)和催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)(聚乙二醇硬脂酸酯和DMAP摩尔比为1：0.1～0.3)，在40℃氮气保护条件下继续反应24～72小时。减压除去二氯甲烷，采用二氯甲烷：甲醇＝20～60：1的流动相进行柱分离，得到化合物(C)。
(4)脱保护
将上述所得的化合物(C)溶于甲醇中搅拌均匀，加入10％钯碳还原剂(化合物(C)：10％钯碳还原剂重量比为1：0.1～0.4)，加热至25～35℃，在H2保护条件下反应3～6小时，将反应液过滤除去钯碳，在减压蒸馏条件下除去溶剂甲醇，即得目标化合物(D)。
以硬脂酸为例，其反应过程如下所示：
所述的由聚乙二醇将L-肉毒碱和疏水性链段硬脂酸桥连的两亲性化合物，可作为OCTN2转运体靶向纳米载体修饰物，制备纳米粒，用于增加纳米载体的脑内分布及脑胶质瘤治疗效果。
该纳米粒以血脑屏障和脑胶质瘤高表达的OCTN2转运体为靶点，可以通过级联药物递送实现对脑胶质瘤的治疗；该纳米粒以生物相容性高分子聚合物材料为纳米内核，通过聚乙二醇桥连，连接L-肉毒碱，通过L-肉毒碱与OCTN2转运体的相互作用实现高效药物递送；首次以血脑屏障和脑胶质瘤高表达的OCTN2转运体为靶点，以靶向纳米粒的方式实现增加脑部药物递送及脑胶质瘤的精确治疗。
所述的纳米粒包含：疏水性药物、L-肉毒碱两亲性衍生物、纳米载体材料，三者的质量比为1：(2～8)：20。其中纳米载体材料可为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚乳酸(polylactide，PLA)、聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)中任一种难溶性聚合物材料。其中疏水性药物可为紫衫烷类、喜树碱类、蒽醌类或难溶性药物二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生物。
本发明以乳化溶剂挥发法制备基于OCTN2转运体的脑胶质瘤靶向纳米粒，将聚合物、L-肉毒碱聚乙二醇衍生物、疏水性药物溶于有机溶剂中，并将其与含有表面活性剂的混合、乳化，除去有机溶剂之后即可得到载药的L-肉毒碱修饰的OCTN2靶向纳米粒溶液。
具体采用下述步骤：将上述的药物、L-肉毒碱两亲性衍生物以及纳米载体材料同时溶于与水不互溶的有机溶剂(如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯等)，将其与一定比例的水相混合，以50～300w的功率探头超声2～10min(超声3s，停止2s)，得到均匀的纳米乳，挥去有机溶剂，离心，0.80μm滤膜过滤，得到载药纳米粒溶液；超速离心后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，冻干。
所述水相为浓度为0.1～10％的表面活性剂溶液，如聚乙烯醇(polyvinylalcohol，PVA)，Tween 80，普朗尼克F68，TPGS等)；
所述油水相比例为1：1～10(体积比)
本发明具有以下突出优点及特征：
利用血脑屏障和脑胶质瘤表面高表达的OCTN2转运体作为靶点，合成L-肉毒碱两亲性衍生物，采用物理镶嵌的方法修饰纳米粒使其表面携带L-肉毒碱，以生物相容性好的高分子材料为基础载体，包载抗肿瘤药物后制成基于OCTN2转运体的脑胶质瘤靶向药物递送系统，用于提高纳米载体的脑内分布及脑胶质瘤治疗效果。
本发明的L-肉毒碱修饰的靶向OCTN2的纳米粒进入细胞的过程是受钠离子驱动、并可以被游离的L-肉毒碱所特异性抑制的。所述的纳米粒可以通过表面修饰的L-肉毒碱与血脑屏障高表达的OCTN2转运体相互匹配，增加纳米粒的粘附力，进而增加纳米粒跨过血脑屏障的能力；跨过血脑屏障之后可以与脑胶质瘤高表达的OCTN2转运体作用，提高靶向脑胶质瘤的能力，实现包载药物的级联递送。
本发明制备过程简单、易操作。所制备的靶向纳米粒粒径均一，包封率高，稳定性好，可作为难溶性化疗药物的储库，可以达到缓释效果。
本发明制备的靶向纳米粒可用于细胞和动物实验。该靶向纳米粒基于系统中L-肉毒碱的作用，提高了其与血脑屏障上表达的OCTN2转运体的结合能力，使其更高效地跨过血脑屏障进入脑部；进而与脑胶质瘤细胞表达的OCTN2结合，提高肿瘤细胞的摄取，增加所包载药物对肿瘤细胞的杀伤作用，提高纳米药物的抗胶质瘤效果。
附图说明
图1 L-肉毒碱衍生物L-肉毒碱苄酯(A)的核磁表征及氢分布。
图2聚乙二醇硬脂酸的核磁表征及氢分布。
图3 L-肉毒碱衍生物聚乙二醇硬脂酸L-肉毒碱苄酯(C)的核磁表征及氢分布。
图4 L-肉毒碱衍生物聚乙二醇500硬脂酸L-肉毒碱酯(D)的核磁表征及氢分布。
图5 L-肉毒碱衍生物聚乙二醇1000硬脂酸L-肉毒碱酯(D)的核磁表征及氢分布。
图6 L-肉毒碱衍生物聚乙二醇2000硬脂酸L-肉毒碱酯(D)的核磁表征及氢分布。
图7普通纳米粒和L-肉毒碱修饰纳米粒的粒径及分布；A,PLGA NPs,B,LC-0-PLGANPs,C,LC-500-PLGA NPs,D,LC-1000-PLGA NPs,E,LC-2000-PLGA NPs。
图8包载有紫杉醇的普通纳米粒和L-肉毒碱修饰的纳米粒在pH7.4的磷酸缓冲液中的稳定性。
图9纳米粒的电镜照片，A，PLGA NPs；B，LC-500-PLGA NPs；C，LC-1000-PLGA NPs；D，LC-2000-PLGA NPs。
图10溶液剂、普通纳米粒和靶向纳米粒在pH7.4磷酸缓冲液(含有2％聚氧乙烯蓖麻油)中的释放曲线。
图11OCTN2在血脑屏障细胞hCMEC/D3和脑胶质瘤细胞T98G的表达。A，mRNA表达；B，Western blot蛋白表达；C，在hCMEC/D3细胞中免疫荧光表征；D，在T98G细胞中免疫荧光表征。
图12纳米粒在hCMEC/D3细胞的摄取特征。A，香豆素-6包载的纳米粒摄取的荧光图片；B，香豆素-6包载的纳米粒在不同缓冲液中的摄取定量结果。
图13纳米粒在T98G细胞的摄取特征。A，香豆素-6包载的纳米粒摄取的荧光图片；B，香豆素-6包载的纳米粒在不同缓冲液中的摄取定量结果。
图14紫杉醇包载的纳米粒及溶液剂在T98G细胞中的体外细胞毒性。
图15尾静脉注射Taxol，以及紫杉醇包载的纳米粒后，紫杉醇在脑部的分布结果。n＝3.*,P<0.05,**,P<0.01相对于溶液剂组；α,P<0.05,β,P<0.01相对于未修饰普通纳米粒。
图16DIR包载的普通纳米粒和L-肉毒碱修饰纳米粒在小鼠主要器官的分布。从上到下依次为：脑、心脏、肝、脾、肺、肾。
图17 T98G肿瘤球经过10天10μg/ml的紫杉醇溶液剂以及包载的纳米粒的处理后的形态学变化。
图18相对于对照组，T98G肿瘤球经药物组处理后的直径变化(n＝3)。
具体实施方式
实施例1.L-肉毒碱两亲性衍生物的合成
将L-肉毒碱6mmol(约968mg)、溴化苄7.2mmol加入约30ml DMF中搅拌均匀，加热至125℃，搅拌条件下反应4小时，减压蒸馏除去溶剂DMF及未反应的溴化苄，即得L-肉毒碱苄酯(化合物A)。将得到的L-肉毒碱苄酯(A)3mmol(约756mg)和丁二酸酐3.3mmol(约330mg)加入无水二氯甲烷中，加热至40℃，搅拌条件下反应过夜。在减压蒸馏条件下除去溶剂二氯甲烷，残留物用乙醚和二氯甲烷混合溶剂(1：2)洗三次，得到黄色粘稠残留物即为化合物(B)。将化合物(B)1mmol(约352mg)与碳二亚胺类活化试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)1.1mmol(约210mg)加入二氯甲烷中，冰浴中反应2小时进行活化，然后加入聚乙二醇硬脂酸酯1mmol(约2.5g)和催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.3mmol(约36.6mg)，在40℃氮气保护条件下继续48小时。减压除去二氯甲烷，采用二氯甲烷：甲醇＝40：1的流动相进行柱分离，得到化合物(C)。将所得的化合物(C)1g溶于甲醇中搅拌均匀，加入10％钯碳还原剂(约0.1g)，加热至25～35℃，在H2保护条件下反应6小时，将反应液过滤除去钯碳，在减压蒸馏条件下除去溶剂甲醇，即得目标化合物(D)。
实施例1的反应路线图见上文。反应中的硬脂酸可以为十六酸、十四酸等其他长链脂肪酸，但并不局限于此；聚乙二醇可以为分子量500，1000以及5000，但不局限于此。采用核磁共振1HNMR氢谱来确定实施例1中中间体和产物的结构，结果如图1-6。
实施例2.靶向纳米粒的制备
精密称取紫杉醇0.50mg，合成的L-肉毒碱聚乙二醇500 0.50mg，PLGA 10.0mg，溶解在1mL二氯甲烷中，将其与5mL 1％的PVA水溶液相混和，以200w的功率探头超声5min，室温搅拌4h，挥去有机溶剂，得到纳米粒溶液，13000r/min离心30min后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，即得LC-500-PLGA NPs。
将L-肉毒碱聚乙二醇500 0.5mg替换为L-肉毒碱聚乙二醇1000 1.0mg或L-聚乙二醇2000 2.0mg按上述方法即可制得LC-1000-PLGA NPs和LC-2000-PLGA NPs。
实施例3.普通对照纳米粒的制备
精密称取紫杉醇0.50mg，PLGA 10.0mg，溶解在1mL二氯甲烷中，将其与5mL 1％的PVA水溶液相混和，以200w的功率探头超声5min，室温搅拌4h，挥去有机溶剂，得到纳米粒溶液，13000r/min离心30min后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，即得PLGA NPs。
实施例4以聚乳酸为载体材料制备靶向纳米粒
精密称取紫杉醇0.50mg，合成的L-肉毒碱聚乙二醇2000 0.50mg，PLA 10.0mg，溶解在1mL二氯甲烷中，将其与5mL 1％的PVA水溶液相混和，以200w的功率探头超声5min，室温搅拌4h，挥去有机溶剂，得到纳米粒溶液，13000r/min离心30min后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，即得LC-2000-PLA NPs。
实施例5以聚己内酯为载体材料制备靶向纳米粒
精密称取紫杉醇0.50mg，合成的L-肉毒碱聚乙二醇2000 0.50mg，PCL 10.0mg，溶解在1mL二氯甲烷中，将其与5mL 1％的PVA水溶液相混和，以200w的功率探头超声5min，室温搅拌4h，挥去有机溶剂，得到纳米粒溶液，13000r/min离心30min后，弃去上清液，加入去离子水分散，重复操作三次，洗去表面活性剂，即得LC-2000-PCL NPs。
实施例6.测定纳米粒的包封率和载药量
取实施例2和3中挥去有机溶剂得到的纳米粒溶液1ml，加入10ml量瓶中，乙腈稀释并定容，0.22μm滤膜过滤，取续滤液进样20μL，在227nm波长条件下测定药物浓度，计算溶液中总药量m总；取实施例2和3中洗去表面活性剂所得到的纳米粒溶液1ml，加入10ml量瓶中，乙腈稀释并定容，0.22μm滤膜过滤，取续滤液进样20μL，在227nm波长条件下测定药物浓度，计算溶液中纳米粒包载药量m包；样品中所加入的PLGA和修饰材料含量为m材。按公式：包封率＝m包/m总×100％计算载药纳米粒的包封率(％)，按公式：载药量＝m包/(m总+m材)×100％计算载药纳米粒的载药量(％)。结果如表1所示，载药纳米粒的包封率在50％以上，载药量在2.5％以上。
表1.所制备的纳米粒的包封率和载药量
包封率(％) 载药量(％)
PLGA NPs 76.5±3.0 3.64±0.14
LC-500-PLGA NPs 71.0±1.6 3.38±0.04
LC-1000-PLGA NPs 91.4±1.2 4.35±0.02
LC-2000-PLGA NPs 57.8±1.8 2.75±0.03
LC-2000-PLA NPs 58.3±2.1 2.77±0.04
LC-2000-PCL NPs 78.4±2.6 3.73±0.11
实施例7.动态光散射技术测定纳米粒粒径分布及稳定性
采用动态光散射法(dynamic light scattering，DLS)测定纳米粒的粒径及粒径分布，它利用粒子被光束照射时向各个方向散射和衍射的强度与粒子大小有关的原理来测定粒子的大小和分布。具体操作为取一定量纳米粒分散溶液，放入样品池使液柱高为1cm，介质为水，在25℃下进行测定，结果见图7，纳米粒粒径均在200nm左右，且分布较为均一。
此外，将所制备的纳米粒溶液放置于4℃环境下贮存，分别于第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10天，按照上述方法操作测定制剂的粒径以观察其稳定性。结果见图8，在4℃条件下，10天内，纳米粒的粒径及分布均不发生明显变化，由此可知，所制备的纳米粒粒径稳定性良好。
实施例8.透射电子显微镜观察纳米粒的形态
利用透射电子显微镜观察所制备的对照纳米粒及OCTN2靶向纳米粒的粒子形态及大小。本发明采用复染法制备样品，具体制备方法如下：将自制的纳米粒溶液稀释至适当浓度，滴在表面覆有支持膜的铜网上，用1％磷钨酸溶液染色，用滤纸吸走多余液体后，自然挥干，在透射电镜下观察其形态，并对其拍照。
结果见图9，A为普通纳米粒，B～D分别为LC-500-PLGA NPs，LC-1000-PLGA NPs，LC-2000-PLGA NPs，均呈圆整的球形结构，分散性好且粒径分布较为均一。此外，透射电镜照片显示的纳米粒粒径相较动态光散射测定的粒径较小(图7)，是因为透射电镜样品制备过程中，纳米粒失水发生皱缩，粒径变小，而动态管散射测定的是水动力学半径，由于水化层的影响，粒径相对较大。
实施例9.体外释放实验
采用透析袋法测定紫杉醇纳米粒的体外释放行为。透析袋的截留分子量为12000～14000Da，以pH 7.4的PBS(含2％聚氧乙烯蓖麻油,w/v)在37℃为释放介质。具体操作如下：分别移取溶液剂或纳米粒2mL置于透析袋中，两端夹紧后，加入30mL的释放介质，于37℃空气浴下振荡，速率为100rpm。分别于给定时间内取样2mL，同时补充相同体积的新鲜介质，用0.22μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液20μL，采用高效液相进行含量测定，计算累积释放百分数，并绘制释放曲线。具体结果见图10。相对于溶液剂，纳米粒均能缓慢地将药物释放出来，且没有明显的突释。
实施例10.细胞水平OCTN2基因、蛋白表达
采用PCR技术测定血脑屏障细胞hCMEC/D3和脑胶质瘤细胞T98G中OCTN2的mRNA的表达水平。采用TRIzol试剂提取总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA，采用OCTN2相应的引物对其进行PCR扩增，所得样品采用琼脂糖凝胶分离。HRPT基因作为内标，Caco-2细胞作为阳性对照，结果见图11A，在血脑屏障细胞和脑胶质瘤细胞，OCTN2的mRNA表达丰富。
采用Western Blot技术测定血脑屏障细胞hCMEC/D3和脑胶质瘤细胞T98G中OCTN2的蛋白表达水平。采用蛋白提取试剂提取细胞中的总蛋白，采用BCA方法测定蛋白浓度，采用SDS-PAGE凝胶进行分离，使用OCTN2相应的抗体进行成像表征。Β-Actin蛋白作为内标，Caco-2细胞作为阳性对照，结果见图11B，在血脑屏障细胞和脑胶质瘤细胞，OCTN2的蛋白表达较为丰富。
采用免疫荧光技术对血脑屏障细胞hCMEC/D3和脑胶质瘤细胞T98G中OCTN2的蛋白进行表征。将贴壁细胞在室温条件下用4％多聚甲醛固定15分钟，用PBS清洗3次，用10％的山羊血清在室温条件下封闭1h，在4℃条件下与OCTN2一抗孵育过夜，用PBS清洗三次，然后与相应的荧光二抗在室温条件孵育1h，用PBS清洗三次，用含有DAPI的封片液封片，室温下避光保存过夜，然后采用荧光显微镜进行成像分析。以不加OCTN2一抗的样品作为阴性对照。结果见图11C(hCMEC/D3)和11D(T98G)，两种细胞表面均有丰富的OCTN2表达。
实施例11.荧光显微镜可视化观察纳米粒摄取
将各载体用荧光探针香豆素-6标记，用于示踪纳米粒在细胞水平的摄取。将hCMEC/D3和T98G细胞分别以2×105细胞/孔的密度培养在带有盖玻片的24孔板中，48h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态，当细胞密度达到90％左右且形态良好时，分别加入荧光标记的各载体，浓度为5μg/mL，每孔200μL，37℃孵育1h后，用冷PBS洗3次，将盖玻片小心取出，用含有DAPI的封片液封片，避光室温保存12h后，用共聚焦显微镜观察。结果见图12A(hCMEC/D3)和13A(T98G)，随着PEG长度的增加，纳米粒的摄取效率会显著增加，但是，当PEG长度增加到一定程度后，过长的PEG反倒限制了纳米粒的摄取，在PEG长度为1000的条件下，该靶向纳米粒的摄取可以达到最大效果。
实施例12.细胞水平评价纳米粒基于OCTN2的摄取机制
将各载体用荧光探针香豆素-6标记，用于评价纳米粒在细胞水平的摄取能力以及基于OCTN2的摄取机制。将hCMEC/D3和T98G细胞分别以1.5×105细胞/孔的密度培养在24孔板中，48h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态，当细胞密度达到90％左右且形态良好时，分别用不同的缓冲液(NaCl缓冲液，无Na+缓冲液，含有10mM L-肉毒碱的NaCl缓冲液)洗两遍后，分别加入用不同缓冲液稀释的荧光标记的各载体，浓度为5μg/mL，每孔200μL，37℃孵育1h后，用冷PBS洗三次，每孔加入细胞裂解液500μL，避光条件下震荡1h，将孔内液体全部转移至洁净小管，斡旋混匀，转移200μL样品至96孔板中，采用多功能酶标仪测定细胞摄取量(λex＝466nm，λem＝504nm)，另采用BCA试剂盒法测定蛋白浓度，结果用单位蛋白质量的荧光标记物(μg/mg)来表示。结果见图12B(hCMEC/D3)和13B(T98G)，在NaCl缓冲液中，L-肉毒碱修饰后，纳米粒可以靶向OCTN2转运体，经肉毒碱修饰后的纳米粒的摄取显著增加，且随着PEG链长的增加，摄取效率先增加后减小，可能是由于过长的PEG反倒不利于纳米粒的黏附和摄取；对于OCTN2来说，其主要采用Na+驱动的方式来转运底物，在OCTN2介导的纳米粒摄取中，Na+的驱动作用依然很明显，在无Na+缓冲液中，靶向纳米粒的摄取显著降低；L-肉毒碱作为OCTN2的底物，可以显著降低靶向纳米粒的摄取，说明靶向纳米粒主要采用OCTN2介导的方式入胞。因此，修饰有L-肉毒碱的纳米粒可以在hCMEC/D3和T98G细胞中均靶向OCTN2，提高吸收，并且该过程是Na+驱动的，可以被游离的L-肉毒碱所抑制。
实施例13.细胞毒测定
将T98G细胞以3.0×103细胞/孔的密度培养在96孔板中，24h后，分别加入Taxol，PLGA NPs，LC-500-PLGA NPs，LC-1000-PLGA NPs，LC-2000-PLGA NPs的系列浓度，并连续培养72h。加入MTT溶液在37℃继续培养4h，移除MTT溶液，加入DMSO溶解形成的结晶，采用多功能酶标仪进行测定，并计算细胞存活率。选择没有细胞的组作为空白，选择有细胞但是没有药物处理组为对照组，结果见图14，相对于溶液剂和未修饰的纳米粒，修饰之后的纳米粒对脑胶质瘤细胞T98G的毒性显著增强，且LC-1000-PLGA NPs的抗肿瘤细胞效果最强。
实施例14.包载有紫杉醇的靶向纳米粒在小鼠的脑内定量分布测定
15只小鼠随机分为5组，按紫杉醇含量计算，以1mg/kg的剂量分别尾静脉注射给以溶液剂Taxol，包载紫杉醇的PLGA NPs，LC-500-PLGA NPs，LC-1000-PLGA NPs，LC-2000-PLGA NPs。在给药2，6，12h后，将小鼠处死，取出脑组织，在冰浴条件下匀浆，获得的匀浆采用UPLC-MS/MS进行定量分析，结果见图15，修饰之后的纳米粒相对于未修饰纳米粒和溶液剂来说，在脑部的分布显著增加。
实施例15.靶向纳米粒的成像分析
8只小鼠随机分为2组，按照所包载DIR的含量计算，以2mg/kg的剂量分别尾静脉注射给以包载有DIR的PLGA NPs和LC-1000-PLGA NPs，在给药2，4，8，12h后，将小鼠处死，取出主要器官，在成像系统里成像，进行分析，结果见图16，LC-1000-PLGA NPs相对于未修饰的PLGA NPs，在脑部分布显著增加。
实施例16.在体外肿瘤球模型考察抗肿瘤活性
采用圆底的96孔板，每孔加入3000细胞，1500g条件下离心15min，然后放入培养箱培养，24h后，分别加入1μg/ml和10μg/ml(以紫杉醇浓度计算)的Taxol，包载紫杉醇的PLGANPs和LC-1000-PLGA NPs。每天记录肿瘤球的形态和直径变化，持续十天，结果见图17和18。结果显示，经含药的溶液剂或纳米粒处理后，肿瘤球的直径相对于对照组明显减小，且修饰之后的纳米粒相对于未修饰的纳米粒和溶液剂来说，对肿瘤球的抑制、杀伤作用更好。
本发明的靶向策略及载体同样可以应用于其他抗肿瘤药物，如多西他赛，喜树碱，长春新碱等药物，对其包载形成OCTN2靶向含药纳米粒，通过主动靶向血脑屏障和脑胶质瘤，实现对脑胶质瘤的治疗。

Claims (10)

1.L-肉毒碱两亲性衍生物，其特征在于，所述衍生物由聚乙二醇将OCTN2转运体底物L-肉毒碱和疏水性链段硬脂酸桥连的两亲性化合物，其结构为：
2.如权利要求1所述的L-肉毒碱两亲性衍生物，其特征在于，n为10-40。
3.如权利要求1所述的L-肉毒碱两亲性衍生物，其特征在于，所述的硬脂酸为长链脂肪酸，优选十八酸、十六酸或十四酸。
4.如权利要求1所述的L-肉毒碱两亲性衍生物的制备方法，其特征在于，
(1)L-肉毒碱的保护
将L-肉毒碱和溴化苄以摩尔比1：1～1.4的比例加入DMF中搅拌均匀，加热至110～130℃，搅拌条件下反应2～6小时，减压蒸馏除去溶剂DMF及未反应的溴化苄，即得L-肉毒碱苄酯(A)；
(2)L-肉毒碱苄酯与丁二酸桥连
将得到的化合物L-肉毒碱苄酯和丁二酸酐以摩尔比1：1～1.4的比例加入无水二氯甲烷中，加热至35～45℃，搅拌条件下反应12～36小时，在减压蒸馏条件下除去溶剂二氯甲烷，残留物用乙醚和二氯甲烷混合溶剂洗三次，其中，乙醚：二氯甲烷体积比为1：1～3，，所得到的黄色粘稠残留物即为化合物(B)；
(3)聚乙二醇硬脂酸-L-肉毒碱苄酯的合成
化合物(B)与碳二亚胺类活化试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以摩尔比1：1.1～1.4的比例加入二氯甲烷中，冰浴中反应1～2小时进行活化，然后加入聚乙二醇硬脂酸酯和催化剂4-二甲氨基吡啶，在40℃氮气保护条件下继续反应24～72小时，减压除去二氯甲烷，采用二氯甲烷：甲醇＝20～60：1的流动相进行柱分离，得到化合物(C)；其中，聚乙二醇硬脂酸酯与化合物(B)摩尔比为1：1.1～1.4，聚乙二醇硬脂酸酯和4-二甲氨基吡啶摩尔比为1：0.1～0.3，
(4)脱保护
将上述所得的化合物(C)溶于甲醇中搅拌均匀，加入10％钯碳还原剂，其中，化合物(C)：10％钯碳还原剂重量比为1：0.1～0.4，加热至25～35℃，在H2保护条件下反应3～6小时，将反应液过滤除去钯碳，在减压蒸馏条件下除去溶剂甲醇，即得目标化合物(D)。
5.一种载药纳米粒，其特征在于，包含疏水性药物、L-肉毒碱两亲性衍生物、纳米载体材料，三者的质量比为1：(2～8)：20。
6.如权利要求5所述的载药纳米粒，其特征在于，所述的纳米载体材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯中任一种。
7.如权利要求5所述的载药纳米粒，其特征在于，所述的疏水性药物为紫衫烷类、喜树碱类、蒽醌类或难溶性药物二氢吡啶类、非甾体抗炎药中的任一物质或其衍生物。
8.权利要求1所述的L-肉毒碱两亲性衍生物在制备增加脑部分布药物递送系统中的应用。
9.权利要求1所述的L-肉毒碱两亲性衍生物在制备脑胶质瘤靶向药物递送系统中的应用。
10.权利要求1所述的L-肉毒碱两亲性衍生物在制备抗肿瘤药物递送系统中的应用。
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