CN105753921A - 基于肠道octn2载体蛋白设计的前药及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及以肠道新型有机阳离子转运体2(novel organ? ic cation transporter 2，OCTN2)为靶点的载体前药制备方法。包括L/D?肉毒碱通过连接臂对含有羟基或氨基的抗肿瘤药物进行修饰的前药结构设计合成。本发明提供的一系列前药，可提高或改善药物的口服生物利用度。涉及通式I、II所示的L/D?肉毒碱衍生物，及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其中Drug、R具有在说明书中给出的定义。

Description

基于肠道OCTN2载体蛋白设计的前药及其制备方法

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及一类新化合物，具体涉及以OCTN2为靶点的载体前药及其制备和应用。

背景技术:

口服给药是目前最常见的给药途径，口服药物相对更加的方便，安全，快捷，患者也更容易适应这种给药方式。但口服生物利用度不高往往是造成许多药物无法口服给药的重要原因。药物的口服吸收受多种因素影响，如药物的渗透性、水溶性、系统前的代谢和首过效应以及外排转运蛋白的外排等，正是这些因素使BCSIII和IV类抗肿瘤药物的口服药物开发面临较大的挑战。

载体前药是一种前药策略，以体内药物转运体为靶点，如寡肽转运体(oligopeptidetransporter1,PEPT1)、新型有机阳离子转运体2(novelorganiccationtransporter2，OCTN2)，按照其底物结构要求在母药结构上连接特定基团，使之在体内转运时被靶向转运体所识别，来改变其膜渗透性，进而提高口服吸收。例如已上市的以PEPT1为靶点的载体前药伐昔洛韦(valaciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)和甲氧胺福林(midodrine)等。但在研究中也发现基于酯键的前药体内代谢稳定性较差，母药释放可能过快，对进一步提高口服吸收和降低系统毒性不利。OCTN2转运体是有机阳离子转运家族之一，属于溶质载体22A家族，为高亲和性转运体(K_m＝22.1μM)(Circulation.2006,113:1114-1122)，生理状态下具有Na⁺依赖性转运肉毒碱的作用，在人体广泛分布，尤其在小肠的全肠段都有表达，这对于口服主动靶向小分子前药来说，有效吸收部位增加和有效的摄取时间延长，非常有利于提高小分子药物的口服吸收。目前已经有一些非常成功的基于OCTN2转运体的前药实例。张志荣教授设计泼尼松龙的L-肉毒碱前药，用于呼吸系统给药以治疗支气管哮喘，其中泼尼松龙通过丁二酸与L-肉毒碱的羟基共价连接形成的前药是OCTN2的底物，可以有效增加母药经肺部的吸收，降低IL-6的生成，为哮喘的控制奠定基础(MolPharm.2011,8(5):1629-40)。孙逊教授设计了OCTN2介导的肾靶向雷公藤内酯醇前体药物，将L-肉毒碱以丁二酸桥联雷公藤内酯醇，结果表明肾上皮细胞通过OCTN2转运体有效摄取该前药，该前药具有良好的肾靶向性(四川大学学报医学版.2012,43(6):936-940)。Napolitano等设计合成了六氢烟碱酸的L-肉毒碱前药，用于腹腔给药以治疗惊厥，通过其与血脑屏障上表达的OCTN2相互作用，增加了母药在脑内的分布，延缓了戊四唑诱导的惊厥产生(Molecules.2009,14(9):3268-74)。这些结果说明L-肉毒碱的衍生物能够被OCTN2有效识别，并增加基于OCTN2介导的前药膜转运。

目前，基于中国药科大学的操峰教授以PEPT1为靶点的载体前药策略扩展到BCSIV类药物，对齐墩果酸进行系列衍生化，使之成为PEPT1底物，取得了很好的效果(MolPharm,2012；9(8):2127-2135)，证明了载体前药策略能应用于难溶性药物的口服转运。目前，基于OCTN2转运蛋白设计的前药的报道较少且给药部位局限于腹腔和呼吸道，还未见以口服方式给药的报道，这限制了大量的口服吸收差的抗肿瘤药物的开发。为了验证基于肠道OCTN2的口服载体前药的可行性以及拓宽OCTN2载体前药的应用范围，本发明以肠道OCTN2转运体为靶点，以肉毒碱为载体，对BCSIII、IV类抗肿瘤药物进行结构修饰，分别合成了BCSIII、IV类抗肿瘤药物的口服靶向前药。利用Caco-2细胞实验、在体肠灌流实验和大鼠药动学实验对其膜通透性和亲和性进行了比较，以寻求具有较好连接臂的前药对母药药动学行为的改善，进而显著改善口服生物利用度。本发明首次合成以肠道OCTN2转运蛋白为靶点的载体前药，为解决部分BCSIII、IV类抗肿瘤药物通透性差，口服生物利用度低等问题提供了一种解决方案。

发明内容

本发明的目的是设计一种以肠道OCTN2转运蛋白为靶点，以肉毒碱为载体前药，以提高BCSIII、IV类抗肿瘤药物肠细胞的膜透性，提高药物的血药浓度，提高代谢稳定性，进而显著提高药物的口服生物利用度。

为了实现这一目的，为了实现这一目的，本发明提供通式(I)所示结构的化合物：

其中：R为苄基、氢；Y1为二元脂肪酸残基；X为N、O；Drug为含氨基或羟基的抗肿瘤药残基。

本发明所述通式(I)所示结构的化合物：其特征在于，Drug为含有氨基或羟基的抗肿瘤药物残基。其中，含有氨基的抗肿瘤药选自吉西他滨、地西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、克拉屈滨、氟达拉滨、阿扎胞苷，及其衍生物；阿霉素、柔红霉素、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、放线菌素D、丝裂霉素、光辉霉素、更生霉素，及其衍生物；含有羟基的抗肿瘤药选自紫杉醇、多西他赛，及其衍生物；喜树碱、羟基喜树碱，及其衍生物；长春新碱、长春瑞滨、长春地辛、长春花碱，及其衍生物。

本发明所述通式(I)所示结构的化合物：其中，Y1为二元脂肪酸残基，选自乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、更二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸连十二碳二酸、十三碳二酸、十四碳二酸、十五碳二酸、十六碳二酸、十七碳二酸、十八碳二酸、十九碳二酸或二十碳二酸。

本发明所述通式(I)化合物的具体的制备方法如下：a、利用溴卞保护L/D-肉毒碱的羧基；b、苄基保护的L/D-肉毒碱与二元脂肪酸在DCC/DMAP的作用下，生成L/D-肉毒碱-脂肪酸酯；c、抗肿瘤药物与L/D-肉毒碱-脂肪酸酯在氯甲酸异丁酯的催化下反应，Pd/H2脱苄基后，生成目标产物。

反应条件：a溴卞，DMF，140℃；bDCC/DMAP，室温；c氯甲酸异丁酯，三乙胺，低温无水无氧；d钯碳、H2，室温。

为了实现本发明的目的，本发明还提供通式(II)所示的化合物：

其中：R为苄基、氢；Y₃为二元脂肪酸残基；Y2为二元脂肪醇残基；Drug为含有氨基的抗肿瘤药残基。

本发明所述通式(II)所示的化合物，其特征在于，Drug为含有氨基的抗肿瘤药物残基；抗肿瘤药物选自吉西他滨、地西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、克拉屈滨、氟达拉滨、阿扎胞苷，及其衍生物；阿霉素、柔红霉素、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、放线菌素D、丝裂霉素、光辉霉素、更生霉素，及其衍生物。

本发明所述通式(II)所示的化合物，其另一特征在于，Y2为二元脂肪醇残基，选自乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二醇、壬二醇、癸二醇、十一烷二醇、十二烷二醇、十三烷二醇、十四烷二醇、十五烷二醇、十六烷二醇、十七烷二醇、十八烷二醇、十九烷二醇和二十烷二醇残基。

本发明所述通式(II)所示的化合物，其又一特征在于Y3为二元脂肪酸残基，选自乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、更二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十二碳二酸、十三碳二酸、十四碳二酸、十五碳二酸、十六碳二酸、十七碳二酸、十八碳二酸、十九碳二酸、二十碳二酸残基。

本发明所述通式(II)化合物的具体的制备方法如下：a、二元脂肪醇与叔丁基二苯基氯硅烷在咪唑的催化下反应，生成单取代的二元醇硅醚；b、抗肿瘤药物的氨基与单取代的二元醇硅醚在三光气的催化下反应，生成抗肿瘤药物-氨基甲酸酯硅醚衍生物，四丁基氟化铵脱羟基保护，生成药物-氨基甲酸酯醇衍生物；c、利用溴卞保护L/D-肉毒碱的羧基；d、苄基保护的L/D-肉毒碱与二元脂肪酸在DCC/DMAP的作用下，生成L/D-肉毒碱-脂肪酸酯；e、抗肿瘤药物-氨基甲酸酯醇衍生物与L/D-肉毒碱-脂肪酸酯在氯甲酸异丁酯的催化下反应，Pd/H2脱苄基后，生成目标产物。

反应条件：a叔丁基二苯基氯硅烷，咪唑，室温；b三光气；c四丁基氟化铵，水，室温；d溴卞，DMF，140℃；eDCC/DMAP，室温；f氯甲酸异丁酯，三乙胺，低温无水无氧；g钯碳、H2，室温。

本发明还提供了所述通式(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的化合物在提高药物生物利用度中的应用。

本发明的优势在于：

1本发明基于肠道OCTN2转运蛋白在小肠全场段表达和Na+驱动的特征，设计以OCTN2为靶点的口服载体前药。

2用酰胺键或氨基甲酸酯键代替酯键，将前药设计成酰胺前药或氨基甲酸酯前药，增加前药的体内代谢稳定性，降低了毒性。

3拓宽了以OCTN2为靶点的口服载体前药的应用范围，包括BCSIII、IV类抗肿瘤药物，通过提高膜透性，增加溶解性，进而提高口服生物利用度。

4本发明使只能以注射方式给药的抗肿瘤药物口服成为可能，降低了风险，增加了患者顺应性。

附图说明

图1为吉西他滨-L-肉毒碱酯前药在体肠吸收情况(n＝3)。(A)JJR、JDR、Gem、JDR-Bn和J-D在不同肠段的吸收情况；JDR(B)和JJR(C)在L-肉毒碱竞争性抑制条件下的在体肠吸收情况。(*P<0.05；**P<0.01)

图2(A)Na+和(B)核苷转运体抑制剂对吉西他滨-L-肉毒碱酯前药JJR、JDRCaco-2细

胞摄取的影响，其中A1为Na+浓度对前药JDR摄取的影响；A2为Na+浓度对前药JJR摄取的影响；B1为不同浓度的核苷转运体抑制剂双嘧达莫对前药JDR摄取的影响；B2为不同浓度的核苷转运体抑制剂双嘧达莫对前药JJR摄取的影响。(n＝3)(*P<0.05；**P<0.01)

图3吉西他滨-L-肉毒碱酯前药(JJR、JDR)、对照前药(JDR-Bn、J-D)和吉西他滨Caco-2细胞转运情况(n＝3)(*P<0.05)。

图4.(A)吉西他滨-L-肉毒碱酯前药(JJR、JDR)对OCTN2转运体底物L-肉毒碱转运的影响；L-肉毒碱对吉西他滨-L-肉毒碱酯前药JJR(B)、JDR(C)细胞转运的影响(n＝3)(*P<0.05)。

图5为大鼠口服后，吉西他滨-L-肉毒碱酯前药及吉西他滨的药物浓度-时间曲线。A为JDR和吉西他滨药物浓度-时间曲线；B为JJR和吉西他滨药物-时间曲线；C为JDR和JDR+L-肉毒碱药物浓度-时间曲线(给药剂量：JDR、JJR经过换算相当于吉西他滨50mg/Kg，L-肉毒碱给药剂量30mg/Kg，n＝6)。

图6丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药和丝裂霉素Caco-2细胞转运情况(n＝3)(*P<0.05)。

图7.(A)丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药对OCTN2转运体底物L-肉毒碱转运的影响；(B)L-肉毒碱对丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药细胞转运的影响(n＝3)(*P<0.05)。

图8为大鼠口服后，丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药及丝裂霉素的药物浓度-时间曲线。A为丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药和丝裂霉素药物浓度-时间曲线；B为丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药和丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药+L-肉毒碱药物浓度-时间曲线(给药剂量：丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药经过换算相当于丝裂霉素30mg/Kg，L-肉毒碱给药剂量30mg/Kg，n＝6)。

具体实施方式

本发明通过以下实施例对本发明作进一步阐述，但并不受限于此。

实例14-苄基L-肉毒碱制备

将L-肉毒碱5.3g(32.9mmol)和溴卞4.50g(26.3mmol)溶于20mLDMF中，140℃下加热回流2h，减压浓缩得到白色固体5.53g，收率83.3％。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):252(中间体1)。

实例22-丁酸基-4-苄基-L-肉毒碱制备

将中间体1g(3.9mmol)和丁二酸酐0.48g(4.8mmol)溶于10mLDMF中，在0℃条件下滴加三乙胺2滴，滴毕抽真空氮气保护，2h后反应完毕，反应无需处理直接进行下一步。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):352(中间体2)。

实例32-己酸基-4-苄基-L-肉毒碱制备

将中间体1g(3.9mmol)和己二酸酐0.59g(4.8mmol)溶于10mLDMF中，在0℃条件下滴加三乙胺2滴，滴毕抽真空氮气保护，2h后反应完毕，反应无需处理直接进行下一步。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):380(中间体3)。

实例4吉西他滨-丁二酰-4-苄基-L-肉毒碱制备(JDR-Bn)

将吉西他滨0.83g(3.2mmol)溶于中间体2中，在0℃条件下滴加三乙胺0.19g(1.9mmol)和氯甲酸异丁酯0.65g(4.8mmol)，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，TLC监测反应完全。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体0.64g，收率40％。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):598(中间体5)，m.p.220-221℃；1H-NMR(DMSO,400MHz):δ:8.29(1H),7.3(1H),7.19(4H),6.4(1H),5.22(1H),3.91(1H),4.4(1H),4.11(1H),3.61(2H),3.54-3.77(2H),3.3(9H),2.53(2H),2.57(2H),2.62(2H),2.29(1H),2.0(2H)(中间体4)。

实例5吉西他滨-己二酰-4-苄基-L-肉毒碱制备

将吉西他滨0.83g(3.2mmol)溶于中间体3中，在0℃条件下滴加三乙胺0.19g(1.9mmol)和氯甲酸异丁酯0.65g(4.8mmol)，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，TLC监测反应完全。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体0.56g，收率35％。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):622(中间体5)。

实例6吉西他滨-丁二酰-L-肉毒碱制备(JDR)

将中间体40.5g(0.83mmol)溶于甲醇中，加入10％钯碳，室温通入氢气，反应2h，TLC监测反应完全。减压浓缩得到白色固体0.3g。收率71.4％。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):507；m.p.222-224℃；1H-NMR(DMSO,400MHz):δ:8.30(1H),7.3(1H),6.4(1H),4.8(1H),4.4(1H),4.11(1H),3.91(1H),3.61(2H),3.54-3.77(2H),3.3(9H),2.77(2H),2.57(2H),2.52(2H),2.0(2H)。

实例7吉西他滨-己二酰-L-肉毒碱制备(JJR)

将中间体50.5g(0.83mmol)溶于甲醇中，加入10％钯碳，室温通入氢气，反应2h，TLC监测反应完全，减压浓缩得到白色固体0.36g。收率85.7％。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):534；m.p.218-220℃；1H-NMR(DMSO,400MHz):δ:8.29(1H),7.3(1H),6.4(1H),4.81(1H),4.4(1H),4.11(1H),3.91(1H),3.61(2H),3.31(9H),3.54-3.77(2H),2.77(2H),2.25(2H),2.18(2H),2.0(2H)。

实例84-N-丁二酰-吉西他滨制备(J-D)

将吉西他滨1g(3.8mmol)和丁二酸酐0.30g(3.0mmol)溶于10mLDMF中，在0℃条件下滴加三乙胺2滴，滴毕抽真空氮气保护，12h后TLC监测反应完全。减压浓缩反应液得到白色的油状物，制备柱色谱纯化。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):352；m.p.152-153℃；1H-NMR(DMSO,400MHz):δ:8.0(1H),7.3(1H),5.93(1H),4.5(1H),4.28(1H),3.79(1H),3.65(1H),3.54(1H),2.18(2H),2.0(2H),1.61(2H),0.96(3H)。

实例9叔丁基二苯基氯硅基乙二醇醚的制备

将乙二醇1.0g(16.1mmol)和叔丁基二苯基氯硅烷4.40g(16.1mmol)溶于20mL二氯甲烷中，在室温条件下滴加咪唑0.5g(7.4mmol)加热回流2h，减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):300(中间体6)。

实例10丝裂霉素-6-氨基甲酸酯的制备

将中间体3g(9.9mmol)、丝裂霉素1.44g(14.4mmol)和三光气3.6g(12.0mmol)溶于10mL乙酸乙酯中，在室温条件下滴加三乙胺0.45g(1.5mmol)滴，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，TLC监测反应完全。向反应液中加入四丁基氟化铵2.4g(9.9mmol),室温搅拌0.5h，TLC监测。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体2.4g，收率36％。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):422(中间体7)。

实例11丝裂霉素-L-肉毒碱卞酯的制备

将丝裂霉素6-氨基甲酸酯2.4g(3.6mmol)溶于中间体2中，在0℃条件下滴加三乙胺0.19g(1.9mmol)和氯甲酸异丁酯0.65g(4.8mmol)，滴毕抽真空氮气保护，反应过夜，TLC监测反应完全。减压浓缩反应液得到红棕色的油状物。柱层析得到白色固体1.0g，收率40％。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):712(中间体8)。

实例12丝裂霉素-L-肉毒碱酯的制备

将中间体81.0g(1.4mmol)溶于甲醇中，加入10％钯碳，室温通入氢气，反应2h，TLC监测反应完全。减压浓缩得到白色固体0.65g。收率75％。ESI-MS[M+H]⁺(m/z):622；m.p.372-373℃；1H-NMR(DMSO,400MHz):δ:8.1(1H),6.1(2H),4.83(1H),4.35(2H),4.36(2H),4.21(2H),3.95(3H),3.36(2H),3.30(9H),3.0(2H),2.77(2H),2.65(2H),2.64(2H),2.14(1H),1.93(3H),1.1(1H)。

实例13吉西他滨-L-肉毒碱酯前药大鼠在体肠灌吸收研究

大鼠实验前禁食12h(可自由饮水)，用20％(w/w)的乌拉坦腹腔注射麻醉(1.0g·kg^-1)。将大鼠固定在恒温手术台上，沿腹中线剪开3.0～4.0cm的开口，打开腹腔后，分离出待考察肠段约10cm，两端切口插管后结扎，用预热至37℃的生理盐水轻缓的将内容物清洗干净，再用空气将生理盐水排净。实验前用供试液将管路饱和30min，直至出液口药液浓度与进液口供试液浓度相等，以消除实验过程中管路对药物的吸附作用。将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿，用红外灯维持体温(37±0.5)℃。进口处用已知重量的装有供试液的小瓶进行灌流，流速为0.2mL·min^-1，每隔15min在出口处用一已知重量的小瓶收集一次(同时迅速更换下一个供试液小瓶和收集液小瓶)，称量此时供试液小瓶和收集液小瓶的重量，计算灌入和收集的供试品质量，实验持续时间为120min。实验结束后，将大鼠处死，剪下被灌流肠段，测量其长度(l)和内径(r)，计算小肠吸收的表面积。所收集的样品过滤后用HPLC法测定质量浓度。将所测数据按公式计算吸收速率常数Ka和表观渗透系数P_app。每组供试液在体肠吸收实验均按以上操作进行，每组3只。

计算公式如下：

$\begin{array}{cc}Ka=\{1-\frac{CoutQout}{CinQin}\}\frac{Q}{V}& P_{app}=\frac{-Qln\left(\frac{Cout}{Cin}\right)}{2\mathrm{\&pi;}rl}\end{array}$

以上公式中：Qin和Qout分别为肠段进出口灌流液的体积(mL)；Cin和Cout分别为肠道进出口灌流液的质量浓度(mg·L^-1)；l和r分别为被灌流肠段的长度(cm)和横截面半径(cm)；Q为灌流速度(mL·min-1)；V为灌流肠段的容积(cm³)。

对吉西他滨脂肪酸前药(J-D、JDR-Bn)、吉西他滨-L-肉毒碱酯前药(JDR、JJR)及吉西他滨进行在体肠灌流实验(图1A)，实验结果显示，吉西他滨-L-肉毒碱酯前药相对于脂肪酸前药以及吉西他滨具有更好的肠吸收，尤其是在十二指肠和空肠较明显；图1B,C分别考察OCTN2转运体的专属性底物L-肉毒碱对吉西他滨前药肠道吸收的影响，结果表明10mML-肉毒碱显著降低了前药JJR和JDR肠道吸收，说明OCTN2转运体介导了前药的跨膜转运和肠吸收。

实例14吉西他滨-L-肉毒碱酯前药Caco-2细胞摄取研究

将培养15天的Caco-2细胞用37℃的HBSS轻柔地清洗细胞单层3次，洗去细胞单分子层表面的杂质，最后一次置于37℃培养箱中培养30min。吸去缓冲溶液，加入含有受试药物(50μmol/L)的HBSS1.0mL，将24孔板于恒温摇床(37℃，50r/min)中温孵，5，10，20，30，60，120min后取出，加入4℃的HBSS中止药物的细胞摄取试验，并快速清洗3遍细胞单分子层。加入0.3mL细胞裂解液，置恒温摇床(37℃，50r/min)中温孵15min，裂解细胞后，收集细胞质液，一部分用BCA法测定细胞蛋白含量，一部分于16000rpm/min离心10min，取上清液，UPLC-MS/MS法测定药物浓度，计算药物的摄取量(nmol/mgprotein)。

以Caco-2细胞为模型，考察Na⁺对吉西他滨-L-肉毒碱酯前药细胞摄取的影响(图2A)，结果表明Caco-2细胞在无Na⁺的条件下对前药的摄取明显减少，说明吉西他滨-L-肉毒碱酯前药细胞摄取是Na⁺依赖的。同时将核苷转运体的高效抑制剂双嘧达莫与前药溶液共同孵育细胞，考察核苷转运体对前药摄取的贡献(图2B)，结果表明大浓度的核苷转运体抑制剂不能减少前药的细胞摄取，说明核苷转运体对前药的摄取没有贡献。

实例15吉西他滨-L-肉毒碱酯前药Caco-2细胞转运研究

将培养21天、符合转运条件(TEER>250Ω·m²)且细胞生长形态完好的MillicellTM膜用37℃的HBSS轻柔地清洗细胞单层3次，洗去细胞单分子层表面的杂质，最后一次置于37℃培养箱中培养30min。吸去缓冲溶液，在AP侧(肠腔侧、供给池)加入含有受试药物的HBSS0.4mL，作为供给液，在BL侧(基底侧、接受池)加入0.6mL空白HBSS作为接收液。将载有MillicellTM的24孔板于恒温摇床(37℃，50r/min)中温孵，分别在不同时间(10，20，30，60，90，120min)从接受池吸取0.1mL接收液，同时补加0.1mL空白HBSS。样品以UPLC-MS/MS法测定药物浓度。

Caco-2细胞可以同时测定药物的双向转运，通过参数计算确定药物的吸收转运机制。表观渗透系数的计算公式如下：

$P_{app}(cm/s)=\frac{dQ/dt}{A\&times;C_0}$

其中：C₀是受试药物供给池(Donor)的初始浓度(μmol/mL)，dQ/dt是在接受池(Receiver)受试药物出现的速率(μmol/s)，A是聚碳酯膜的表面积(cm²)。

采用跨膜电阻>250Ω·cm²的Caco-2单层细胞进行转运实验，将吉西他滨-L-肉毒碱酯前药、脂肪酸前药和吉西他滨加入到Caco-2细胞膜给药侧，测定AP-BL(图3A)和BL-AP侧的渗透性(图3B)。结果表明，在AP-BL转运过程中，吉西他滨-L-肉毒碱酯前药JJR、JDR的膜渗透性明显高于对照前药JDR-Bn、J-D和吉西他滨，说明吉西他滨-L-肉毒碱酯前药可以有效提高吉西他滨的膜渗透性。在BL-AP转运过程中，吉西他滨-L-肉毒碱酯前药与对照前药及吉西他滨的膜透性差别不大，说明OCTN2转运体分布于Caco-2细胞顶侧。

将吉西他滨-L-肉毒碱酯前药JJR、JDR和L-肉毒碱共同加入到Caco-2细胞膜供给侧，测定AP-BL膜渗透率，考察前药对OCTN2特异性底物L-肉毒碱的跨膜转运的影响。实验结果显示，吉西他滨-L-肉毒碱酯前药明显减少细胞对L-肉毒碱的摄取(图4A)，说明二者在跨膜转运过程中发生竞争性抑制，由同一转运体介导跨膜转运；同时考察了L-肉毒碱对吉西他滨-L-肉毒碱酯前药跨膜转运的影响，结果表明同L-肉毒碱也能明显的减少前药JJR、JDR的跨膜转运(图4B,C)。由此可得出结论JJR、JDR是OCTN2转运体的底物，而且JJR的膜透性优于JDR。

实例16吉西他滨-L-肉毒碱酯前药大鼠口服药动学研究

SD大鼠24只于实验前称量体重，禁食12h不禁水。实验时随机分为4组，每组6只，口服灌胃方式给药(吉西他滨、JDR、JJR、JDR+L-肉毒碱)。每只大鼠给药剂量相当于吉西他滨50mg·Kg^-1，L-肉毒碱的给药剂量30mg·Kg^-1。分别与给药后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h眼眶取血0.3mL，置于肝素-四氢尿苷处理后的EP管中，于3000rpm条件下离心3min，取出上层血浆，UPLC-MS/MS测定血药浓度，计算药动学参数。

对脂肪酸前药(J-D、JDR-Bn)、吉西他滨-L-肉毒碱酯前药(JDR、JJR)及吉西他滨进行大鼠口服药动学研究(图5A、B，表1-4)。结果表明相对于母药吉西他滨，L-肉毒碱修饰的吉西他滨前药JDR和JJR的半衰期提高了2-3倍，而口服生物利用度分别增加了3.7倍和4.9倍。同时还将L-肉毒碱与前药JDR同时进行口服药动学研究(图5C，表4)，考察L-肉毒碱对前药大鼠口服吸收的影响。结果表明相对于前药JDR，L-肉毒碱能显著降低JDR的AUC_0-24，降低的倍数是1.9倍。相对于对照前药，L-肉毒碱修饰的吉西他滨前药JDR和JJR的AUC_0-24也明显高于对照前药。

大鼠药动学结果表明L-肉毒碱修饰的吉西他滨前药能够显著提高吉西他滨的代谢稳定性和口服生物利用度。更重要的发现是JJR的口服生物利用度优于JDR，和细胞实验、肠灌流实验的结果一致，说明连接臂的延长有助于提高药物与转运体的亲和性，进而提高口服吸收。

表1.吉西他滨和JDR的主要药动学参数

**P<0.01

表2.吉西他滨和JJR主要药动学参数

**P<0.01

表3.JDR、J-D和JDR-Bn主要药动学参数

**P<0.01

表4.JDR给药组、JDR和L-肉毒碱共同给药组的主要药动学参数

实例17丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药Caco-2细胞转运研究

采用跨膜电阻>250Ω·cm²的Caco-2单层细胞进行转运实验，将丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药和丝裂霉素加入到Caco-2细胞膜给药侧，测定AP-BL(图6A)和BL-AP侧的渗透性(图6B)。结果表明，在AP-BL转运过程中，丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药的膜渗透性明显高于丝裂霉素，说明丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药可以有效提高丝裂霉素的膜渗透性。在BL-AP转运过程中，丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药与丝裂霉素的膜透性差别不大，说明OCTN2转运体分布于Caco-2细胞顶侧，介导丝裂霉素-L-肉毒碱前药跨膜转运。

将丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药和L-肉毒碱共同加入到Caco-2细胞膜供给侧，测定AP-BL膜渗透率，考察前药对OCTN2特异性底物L-肉毒碱的跨膜转运的影响。实验结果显示，丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药明显减少细胞对L-肉毒碱的摄取(图7A)，说明二者在跨膜转运过程中发生竞争性抑制，由同一转运体介导跨膜转运；同时考察了L-肉毒碱对丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药膜转运的影响，结果表明同L-肉毒碱也能明显的减少前药的跨膜转运(图7B)。由此可得出结论丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药是OCTN2转运体的底物。

实例18丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药大鼠口服药动学研究

SD大鼠18只于实验前称量体重，禁食12h不禁水。实验时随机分为3组，每组6只，口服灌胃方式给药(丝裂霉素、丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药、丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药+L-肉毒碱)。每只大鼠给药剂量相当于丝裂霉素30mg·Kg^-1，L-肉毒碱的给药剂量30mg·Kg^-1。分别与给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h眼眶取血0.3mL，置于肝素处理后的EP管中，于3000rpm条件下离心3min，取出上层血浆，UPLC-MS/MS测定血药浓度，计算药动学参数。

对丝裂霉素及丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药进行大鼠口服药动学研究(图8A，表5)。结果表明相对于母药丝裂霉素，L-肉毒碱修饰的丝裂霉素前药的半衰口服生物利用度分别增加了2.7倍。同时还将L-肉毒碱与前药同时进行口服药动学研究(图8B，表6)，考察L-肉毒碱对前药大鼠口服吸收的影响。结果表明相对于前药，L-肉毒碱能显著降低前药的AUC_0-24，降低的倍数是3倍。

大鼠药动学结果表明L-肉毒碱修饰的丝裂霉素前药能够显著提高丝裂霉素的口服生物利用度。

表5.丝裂霉素和丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药的主要药动学参数

**P<0.01

表6.丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药给药组和丝裂霉素-L-肉毒碱酯前药+L-肉毒碱共同给药组的主要药动学参数

**P<0.01。

Claims (10)

1.通式（I）或（II）所示的化合物，及其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药：

其中：R为苄基、氢；X为N、O；Y₁为二元脂肪酸残基；Y₂为二元脂肪醇残基；Y₃为二元脂肪酸残基；Drug为含氨基或羟基的抗肿瘤药残基。

2.权利要求1所述的化合物，及其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其特征在于，所述含有氨基的抗肿瘤药选自吉西他滨、地西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、克拉屈滨、氟达拉滨、阿扎胞苷，及其衍生物；阿霉素、柔红霉素、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、放线菌素D、丝裂霉素、光辉霉素、更生霉素，及其衍生物；含有羟基的抗肿瘤药选自紫杉醇、多西他赛，及其衍生物；喜树碱、羟基喜树碱，及其衍生物；长春新碱、长春瑞滨、长春地辛、长春花碱，及其衍生物。

3.根据权利1所述的化合物，及其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其特征在于，所述二元脂肪酸选自乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、更二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸连十二碳二酸、十三碳二酸、十四碳二酸、十五碳二酸、十六碳二酸、十七碳二酸、十八碳二酸、十九碳二酸或二十碳二酸。

4.根据权利要求1所述的化合物，及其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其特征在于，所述二元脂肪醇选自乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二醇、壬二醇、癸二醇、十一烷二醇、十二烷二醇、十三烷二醇、十四烷二醇、十五烷二醇、十六烷二醇、十七烷二醇、十八烷二醇、十九烷二醇或二十烷二醇。

5.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，通式（I）化合物的制备方法如下:

a、利用溴卞保护L/D-肉毒碱的羧基；

b、苄基保护的L/D-肉毒碱与二元脂肪酸在DCC/DMAP的作用下，生成L/D-肉毒碱-脂肪酸酯；

c、抗肿瘤药物与L/D-肉毒碱-脂肪酸酯在氯甲酸异丁酯的催化下反应，Pd/H₂脱苄基后，生成目标产物。

6.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，通式（II）化合物的制备方法如下:

a、二元脂肪醇与叔丁基二苯基氯硅烷在咪唑的催化下反应，生成单取代的二元醇硅醚；

b、抗肿瘤药物的氨基与单取代的二元醇硅醚在三光气的催化下反应，生成抗肿瘤药物-氨基甲酸酯硅醚衍生物，四丁基氟化铵脱羟基保护，生成药物-氨基甲酸酯醇衍生物；

c、利用溴卞保护L/D-肉毒碱的羧基；

d、苄基保护的L/D-肉毒碱与二元脂肪酸在DCC/DMAP的作用下，生成L/D-肉毒碱-脂肪酸酯；

e、抗肿瘤药物-氨基甲酸酯醇衍生物与L/D-肉毒碱-脂肪酸酯在氯甲酸异丁酯的催化下反应，Pd/H₂脱苄基后，生成目标产物。

7.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-4中任何一项所述的化合物，及其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药和药学上可接受的载体。

8.一种药物制剂，其特征在于，包含权利要求包含权利要求1-4中任何一项所述的化合物，及其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药或权利要求7所述的药物组合物。

9.权利要求1-4任何一项所述的化合物及其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药或权利要求7所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.权利要求1-4任何一项所述的化合物及其几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药或权利要求7所述的药物组合物在提高药物生物利用度中的应用。