CN107449821A - 一种细胞传感器、其制备方法以及利用该细胞传感器评价抗氧化能力的方法 - Google Patents

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Abstract

一种细胞传感器、其制备方法以及利用该细胞传感器评价抗氧化能力的方法。提供了一种细胞传感器、其制备方法以及利用该细胞传感器评价抗氧化能力的方法，该细胞传感器以巨噬细胞作为传感介质，采用电化学阻抗作为指标，突破了常规检测评价的束缚，为评价抗氧化能力提供一条崭新的途径。细胞传感器包括裸金电极以及固定在裸金电极上的巨噬细胞RAW264.7。本发明以建立细胞模型的方式，模拟巨噬细胞RAW264.7氧化应激损伤情况，深入研究评价抗氧化物质对于巨噬细胞抗氧化性能的研究，这对推动抗氧化物质对于细胞抗氧化性能的研究具有重要意义，尤其适用于研究抗氧化物质对人体的抗氧化作用。

Description

一种细胞传感器、其制备方法以及利用该细胞传感器评价抗 氧化能力的方法
技术领域
本发明涉及抗氧化能力测定领域，具体涉及一种采用电化学方法基于细胞传感器的用于评价抗氧化能力的新方法。以巨噬细胞为传感介质，构建了3D巨噬细胞电化学传感器，对抗氧化能力进行评估。
背景技术
人体在与外界的接触中，包括呼吸、污染、紫外线照射等因素不断的在人体内产生自由基。机体内正常生理活动过程中发生的氧化反应，都有氧化活性物质参与，当自由基及其诱发产生的新自由基超出身体抗氧化能力，就会导致氧自由基在细胞内过量蓄积而引发氧化应激的状态，这种状态会导致细胞内大分子物质(蛋白质、脂质、糖类)的积累性氧化损伤，加速人体细胞衰老的趋势。近年来，越来越多的实验数据证明，体内氧化应激是诱导多种慢性疾病(炎症、心血管疾病、癌症等)发生、发展的主要机制。科学研究证实，经常摄入富含抗氧化物质的食物(果蔬等)可以有效降低或延缓上述疾病的发病风险。物质的抗氧化能力有可能反应该物质预防或缓解相关疾病的功效。因此，为了预测各种物质对于人体健康的保护作用，抗氧化能力评价就成为了科研工作者们关注的焦点。
令人遗憾的是，时至今日仍然缺乏一种准确可靠的抗氧化能力评价方法。体外抗氧化实验主要是用化学测定的方法，而体内抗氧化是反应是综合因素相互作用的复杂过程。无法用单一的化学反应过程来阐述其机理。且大分子生命体的体内实验无法完全模拟细胞微环境，而且动物实验不仅复杂而且受试体差异大，测试结果无法比较。因此构建一种简单的、模拟体内环境并且结果直观可比的评价物质抗氧化能力的方法是急需解决的问题。
发明内容
本发明针对以上问题，提供了一种细胞传感器、其制备方法以及利用该细胞传感器评价抗氧化能力的方法，该细胞传感器以巨噬细胞作为传感介质，采用电化学阻抗作为指标，突破了常规检测评价的束缚，为评价抗氧化能力提供一条崭新的途径。
本发明的技术方案是：一种细胞传感器，包括裸金电极以及固定在裸金电极上的巨噬细胞RAW264.7。
一种细胞传感器的制备方法，包括如下步骤：
a)、酸化二氧化锰的制备：将MnO2在超声波浴中溶解在浓H2SO4和浓HNO3的组合酸液中得到混合液，然后将混合液在冰浴中搅拌3-5h，离心，洗涤和干燥后，得到a-MnO2纳米材料；
b)、修饰电极的制备：将a-MnO2纳米材料在超声波下分散在壳聚糖溶液中得到固相浓度为0.9-1.1mg/mL的悬浮液，然后取8-12μL悬浮液滴在干燥的金电极表面上，4-6℃条件下干燥后得修饰电极；
c)、混合凝胶的制备：将氧化石墨烯与浓度为10mmol/L的DMEM培养液按质量体积比为0.1g：100mL的比例混合，超声处理4-6min，使得氧化石墨烯均匀地分散在DMEM高糖培养液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1％海藻酸钠的DMEM培养液中滴加占DMEM培养液质量分数为10％的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸钠/氧化石墨烯混合凝胶；
d)、巨噬细胞的培养：在37℃、CO2含量为5％的培养环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养巨噬细胞2-3天，得到巨噬细胞悬浮液；
e)、细胞固定：将细胞悬浮液与混合凝胶按体积比1:1混合中，混匀后吸取4-6μL混合了细胞的凝胶滴加在修饰电极的表面，然后浸没于CaCl2溶液中进行固定，固定3-5min，并置于5％CO2的37℃培养箱孵育2-4min，制备得到细胞传感器。
还包括如下步骤：
清洁：将步骤e)制得的到细胞传感器置于Piranha溶液中浸泡12-18min后分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉末将电极表面打磨抛成镜面，再用5％的稀硫酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5-8min，氮气吹干，4℃条件下储存备用。
所述步骤a)中的浓H2SO4和浓HNO3的体积比为3:1。
一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法，包括如下步骤：
1)、空白：将细胞传感器一在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后添加PMA，使PMA浓度为100ng/mL，静置10分钟，用PBS缓冲液洗涤2-4次，然后将细胞传感器一连接到电化学工作站；
2)、预处理：将待测物与细胞传感器二在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后加入PMA，使PMA浓度为100ng/mL，静置10min，然后用PBS缓冲液洗涤2-4次后，将细胞传感器二连接到电化学工作站；
3)、电化学检测：在含有1.0mM Fe(CN)6 3-或1.0mM Fe(CN)6 4-或0.1M PBS的溶液中分别对细胞传感器一和细胞传感器二进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流记为I0和IS；
4)、判断待测物是否具有抗氧化能力：
4.1)当I0＞IS时，说明该待测物具有抗氧化性，进而进入步骤5)评价其抗氧化能力；
4.2)当I0≤IS时，说明该待测物没有抗氧化性；
5)评价待测物的抗氧化能力：通过计算相对抗氧化能力值(RAC)来评价待测物的抗氧化能力。
所述步骤1)中的PBS缓冲液的pH值为7.4。
所述步骤2)中的电化学方法为微分脉冲伏安法，所述微分脉冲伏安法条件为：扫描范围-0.2～0.6V，振幅0.05V。
所述步骤5)中的相对抗氧化能力值通过以下公式计算：
其中RAC指的是相对抗氧化能力值，I0是用100ng/mL PMA刺激时的峰值电流，IS是在待测物保护作用下的峰值电流，I是没有PMA刺激的峰值电流。
步骤5)中评价待测物的抗氧化能力的方法为：
当RAC＝10％～40％时，说明该待测物抗氧化能力弱，
当RAC＝40％～70％时，说明该待测物抗氧化能力中等，
当RAC＞70％时，说明该待测物抗氧化能力强。
所述I的测定方法为：将细胞传感器三在37℃下置于Tyrode缓冲液中，10分钟后用PBS缓冲液洗涤3次，然后连接到电化学工作站，在含有1.0mM Fe(CN)6 3-或1.0mM Fe(CN)6 4-或0.1M PBS的溶液中分别对细胞传感器三进行电化学方法检测，记录电流信号并读取峰值电流记为I。
本发明的有益效果是：1)将细胞作为受试体可以很好的模拟实验微环境，由于细胞具有很高的仿生性，能更准确更接近地阐述在生物体体内的抗氧化反应机理，而且培养周期短，差异小，成本低，可控性好，大大缩短了研究周期；2)利用H2O2建立细胞损伤模型，H2O2不是自由基，而是一种氧化作用很强的烈性活性氧，但其生物活性比很多活性氧都低，极易透过细胞膜并与细胞内铁离子通过芬顿反应(FENTON)形成高活性的自由基，导致一系列反应；同时，H2O2所诱导的多种细胞氧化应激，直接参与细胞凋亡过程，因此利用H2O2所造的氧化损伤细胞模型极具应用价值和参考意义，亦因其易于获得且性质稳定；建立细胞氧化损伤的模型可以进一步了解抗氧化物质保护的作用机制以及程度；3)作为传感介质的巨噬细胞本身就属于免疫系统，当用PMA(丙二醇甲醚醋酸酯)刺激细胞时，会诱导该巨噬细胞自身产生过氧化氢，用电化学法对细胞自产过氧化氢的量进行检测，建立细胞电化学信号与过氧化氢剂量之间的关系；其次通过在细胞上覆盖水凝胶形成3D结构，将细胞固定在电极上，水凝胶可以形成网孔结构将细胞保护在其中，不仅提高了细胞在电极上的粘附力而且适量添加的氧化石墨烯提高了凝胶的导电性，延长了细胞的使用寿命；4)以微分脉冲伏安法来作为主要的检测信号，提升检测的灵敏度，且耗时更短，克服了传统方法的弊端，真正实现了快速检测。
本发明以建立细胞模型的方式，模拟巨噬细胞RAW264.7氧化应激损伤情况，深入研究评价抗氧化物质对于巨噬细胞抗氧化性能的研究，这对推动抗氧化物质对于细胞抗氧化性能的研究具有重要意义，尤其适用于研究抗氧化物质对人体的抗氧化作用。
附图说明
图1是细胞传感器构建流程图，
图2是金电极表面修饰表征循环伏安图，
图3是金电极表面修饰表征微分脉冲伏安图，
图4是细胞传感器表面细胞SEM扫描电镜图，
图5是检测不同浓度植物乳杆菌NJAU-01抗氧化性的微分脉冲伏安图，
图6是植物乳杆菌NJAU-01菌液的相对抗氧化能力图，
图7是茶多酚、维生素C、维生素E、1010CFU/mL的植物乳杆菌NJAU-01的RAC值；
图2-3中a表示裸金电极，b表示酸化二氧化锰/金电极，c表示氧化石墨烯/海藻酸钠/酸化二氧化锰/金电极，d表示细胞传感器；
图6中A为阳性对照，B、C、D、E、F、G分别表示浓度为105,106,107,108,109,1010CFU/mL的植物乳杆菌NJAU-01菌液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作具体说明。
细胞传感器包括裸金电极以及固定在裸金电极上的巨噬细胞RAW264.7，构建流程如图1所示，
a)、酸化二氧化锰的制备：将MnO2在超声波(超声波条件：100KHz、时间5min)浴中溶解在浓H2SO4和浓HNO3(浓硫酸的质量分数≥70％，浓硝酸的质量分数约为68％)的组合酸液中得到混合液，然后将混合液在冰浴(0℃)中搅拌3-5h，离心，洗涤和干燥后，得到a-MnO2(酸化二氧化锰)纳米材料；
b)、修饰电极的制备：将a-MnO2纳米材料在超声波(超声波条件：100KHz、时间8min)下分散在壳聚糖溶液中得到固相浓度为0.9-1.1mg/mL的悬浮液，然后取8-12μL悬浮液滴在干燥的金电极表面上，4-6℃条件下干燥后得修饰电极；
c)、混合凝胶的制备：将氧化石墨烯与浓度为10mmol/L的DMEM高糖培养液(葡萄糖含量为4.5g/mL)按质量体积比为0.1g：100mL的比例混合，超声(条件：100KHz)处理4-6min，使得氧化石墨烯均匀地分散在DMEM高糖培养液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1％海藻酸钠的DMEM培养液中滴加占DMEM培养液质量分数为10％的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸钠/氧化石墨烯混合凝胶；
d)、巨噬细胞的培养：在37℃、CO2含量(体积含量)为5％的培养环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的1×DMEM培养基(葡萄糖含量为4.5g/mL)中培养巨噬细胞(细胞数量控制在1×107个/mL)2-3天，得到巨噬细胞悬浮液；
e)、细胞固定：将细胞悬浮液与混合凝胶按体积比1:1混合(细胞悬浮液为0.5mL，加入到0.5mL的混合凝胶中)中，混匀后吸取4-6μL混合了细胞的凝胶滴加在修饰电极的表面，然后浸没于CaCl2溶液(浓度为80-120mM[mM表示mmol/L])中进行固定，固定3-5min，并置于5％CO2的37℃培养箱孵育2-4min，制备得到细胞传感器。
f)清洁：将步骤e)制得的到细胞传感器置于Piranha溶液(食人鱼溶液，又叫食人鱼刻蚀液，是浓硫酸和30％过氧化氢的混合物(7:3))中浸泡12-18min后分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉末将电极表面打磨抛成镜面，再用5％的稀硫酸、无水乙醇、超纯水依次超声(100KHz)清洗5-8min，氮气吹干，4℃条件下储存备用。
在含有1.0mM Fe(CN)6 3-或1.0mM Fe(CN)6 4-或0.1M PBS的溶液中分别对裸金电极、酸化二氧化锰/金电极、氧化石墨烯/海藻酸钠/酸化二氧化锰/金电极和细胞传感器进行电化学方法检测用循环伏安法和微分脉冲伏安法检测(循环伏安法条件为：扫描范围：-0.2～0.6V，振幅：0.05V；微分脉冲伏安法条件为：扫描范围：-0.2～0.6V，振幅：0.05V)，记录电流信号，如图2-3所示，图2-3结果说明对电极的修饰产生了理想的效果，同时对细胞传感器用SEM扫描电镜进行表征，如图4所示，图4显示成功构建了凝胶/细胞3D结构。
为了方便实验和读取数值，我们最后选择电流峰值均朝上的微分脉冲伏安法来作为最终电化学检测方法。
下面是细胞传感器评价各物质抗氧化能力的应用实施例。
实施例1对照组
阳性对照：将细胞传感器一在37℃下置于Tyrode缓冲液(台氏液配制：1000ml台氏液含：NaCl 8.0g、10％KCl 2.0ml(0.2g)、10％MgSO4.7H2O 2.6ml(0.26g)、5％NaH2PO4.2H2O1.3ml(0.065g)、NaHCO3 1.0g、1M CaCL2 1.8ml(0.2g)、葡萄糖1.0g)中，加入PMA，使其浓度为100ng/mL，静置10分钟，用PH＝7.4的PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)洗涤3次，然后将细胞传感器一连接到电化学工作站，在含有1.0mM Fe(CN)6 3-的溶液中细胞传感器进行电化学方法检测，记录电流信号I0＝84.6μA；
空白：将细胞传感器三在37℃下置于Tyrode缓冲液中，10分钟后用PBS缓冲液洗涤3次，然后连接到电化学工作站，在含有1.0mM Fe(CN)6 3-的溶液中对细胞传感器三进行电化学方法检测，记录电流信号并读取峰值电流记为I＝21.5μA。
实施例2植物乳杆菌NJAU-01
1)、菌液制备：从中国传统发酵火腿分离的植物乳杆菌NJAU-01用于接种发酵香肠作为起始培养物。通过API 50CHL试剂盒(法国bioMérieuxInc.)和16S rDNA测序分析鉴定。植物乳杆菌NJAU-01菌株在MRS肉汤中在37℃下生长18h。首先，收获细菌细胞，洗涤并重新悬浮于去离子水中。将细胞浓度调节至105，106，107，108，109和1010CFU/mL。接下来，将细胞与1mg/ml溶菌酶在37℃温育30min，然后在冰浴中超声破碎。通过离心(8000g，10min，4℃)除去细胞碎片后，得到上清液作为植物乳杆菌NJAU-01菌液。
2)、预处理：将植物乳杆菌NJAU-01菌液菌液与细胞传感器二在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后加入PMA使其浓度为100ng/mL，静置10min，然后用PBS缓冲液洗涤3次后，将细胞传感器连接到电化学工作站；
3)、电化学检测：在含有1.0mM Fe(CN)6 3-PBS的溶液中细胞传感器二进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流IS1并计算其相对抗氧化值RAC1，结果如表1和图5-6所示；
表1植物乳杆菌NJAU-01的抗氧化能力评价
峰值电流IS1(μA) RAC1(％)
105CFU/mL 74.0 16.8
106CFU/mL 66.0 29.5
107CFU/mL 51.2 53.1
108CFU/mL 41.8 68.0
109CFU/mL 36.2 76.8
1010CFU/mL 28.5 88.9
从表1中可以看出，峰值电流随着植物乳杆菌NJAU-01菌液浓度的增加而明显降低，高浓度的植物乳杆菌菌株具有更好的抗氧化能力。
实施例3茶多酚
1)、茶多酚溶液制备：准确称取1.20g茶多酚溶于200mL的无水乙醇中，制得浓度为0.6％的茶多酚溶液。
2)、预处理：将茶多酚溶液与细胞传感器四在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后加入PMA使其浓度达到100ng/mL，静置10分钟，然后用PBS缓冲液洗涤3次后，将细胞传感器四连接到电化学工作站；
3)、电化学检测：在含有1.0mM Fe(CN)6 4-的溶液中细胞传感器四进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流IS2，IS2＝24.7μA，计算茶多酚相对抗氧化值RAC2＝95.1％，如图7所示。
实施例4维生素E
1)、VE溶液制备：准确称取1.20gVE溶于200mL的无水乙醇中，制得浓度为0.6％的VE溶液。
2)、预处理：将维生素E溶液与细胞传感器五在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后加入PMA使其浓度达到100ng/mL，静置10分钟，然后用PBS缓冲液洗涤3次后，将细胞传感器五连接到电化学工作站；
3)、电化学检测：在含有0.1M(mol/L)PBS的溶液中细胞传感器五进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流IS3，IS3＝26.5μA，计算维生素E相对抗氧化值RAC3＝92.2％，如图7所示。
实施例5维生素C
1)、VC溶液制备：准确称取1.20gVC溶于200mL的无水乙醇中，制得浓度为0.6％的VC溶液。
2)、预处理：将维生素C溶液与细胞传感器六在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后加入PMA使其浓度达到100ng/mL，静置10分钟，然后用PBS缓冲液洗涤3次后，将细胞传感器六连接到电化学工作站；
3)、电化学检测：在含有0.1M PBS的溶液中细胞传感器六进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流IS4，IS4＝25.3μA，计算维生素C相对抗氧化值RAC4＝94.2％，如图7所示。
从图7中可以看出，茶多酚、维生素C、维生素E、植物乳杆菌NJAU-01都有较强的抗氧化能力，各抗氧化物质的抗氧化能力为：茶多酚＞维生素C＞维生素E＞植物乳杆菌NJAU-01。
本发明实验方法简单，耗时短，结果可直观的进行比较各抗氧化物质的抗氧化能力。

Claims (10)

1.一种细胞传感器，其特征在于，包括裸金电极以及固定在裸金电极上的巨噬细胞RAW264.7。
2.一种权利要求1所述的一种细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)、酸化二氧化锰的制备：将MnO2在超声波浴中溶解在浓H2SO4和浓HNO3的组合酸液中得到混合液，然后将混合液在冰浴中搅拌3-5h，离心，洗涤和干燥后，得到a-MnO2纳米材料；
b)、修饰电极的制备：将a-MnO2纳米材料在超声波下分散在壳聚糖溶液中得到固相浓度为0.9-1.1mg/mL的悬浮液，然后取8-12μL悬浮液滴在干燥的金电极表面上，4-6℃条件下干燥后得修饰电极；
c)、混合凝胶的制备：将氧化石墨烯与浓度为10mmol/L的DMEM培养液按质量体积比为0.1g：100mL的比例混合，超声处理4-6min，使得氧化石墨烯均匀地分散在DMEM高糖培养液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1％海藻酸钠的DMEM培养液中滴加占DMEM培养液质量分数为10％的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸钠/氧化石墨烯混合凝胶；
d)、巨噬细胞的培养：在37℃、CO2含量为5％的培养环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养巨噬细胞2-3天，得到巨噬细胞悬浮液；
e)、细胞固定：将细胞悬浮液与混合凝胶按体积比1:1混合中，混匀后吸取4-6μL混合了细胞的凝胶滴加在修饰电极的表面，然后浸没于CaCl2溶液中进行固定，固定3-5min，并置于5％CO2的37℃培养箱孵育2-4min，制备得到细胞传感器。
3.根据权利要求2所述的一种细胞传感器的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
清洁：将步骤e)制得的到细胞传感器置于Piranha溶液中浸泡12-18min后分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉末将电极表面打磨抛成镜面，再用5％的稀硫酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5-8min，氮气吹干，4℃条件下储存备用。
4.根据权利要求2所述的一种细胞传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中的浓H2SO4和浓HNO3的体积比为3:1。
5.一种利用权利要求1所述的细胞传感器评价抗氧化能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、空白：将细胞传感器一在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后添加PMA，使PMA浓度为100ng/mL，静置10分钟，用PBS缓冲液洗涤2-4次，然后将细胞传感器一连接到电化学工作站；
2)、预处理：将待测物与细胞传感器二在37℃下置于Tyrode缓冲液中，然后加入PMA，使PMA浓度为100ng/mL，静置10min，然后用PBS缓冲液洗涤2-4次后，将细胞传感器二连接到电化学工作站；
3)、电化学检测：在含有1.0mM Fe(CN)6 3-或1.0mM Fe(CN)6 4-或0.1M PBS的溶液中分别对细胞传感器一和细胞传感器二进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流记为I0和IS；
4)、判断待测物是否具有抗氧化能力：
4.1)当I0＞IS时，说明该待测物具有抗氧化性，进而进入步骤5)评价其抗氧化能力；
4.2)当I0≤IS时，说明该待测物没有抗氧化性；
5)评价待测物的抗氧化能力：通过计算相对抗氧化能力值(RAC)来评价待测物的抗氧化能力。
6.根据权利要求5所述的一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法，其特征在于，所述步骤1)中的PBS缓冲液的pH值为7.4。
7.根据权利要求5所述的一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法，其特征在于，所述步骤2)中的电化学方法为微分脉冲伏安法，所述微分脉冲伏安法条件为：扫描范围-0.2～0.6V，振幅0.05V。
8.根据权利要求5所述的一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法，其特征在于，所述步骤5)中的相对抗氧化能力值通过以下公式计算：
<mrow> <mi>R</mi> <mi>A</mi> <mi>C</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <msub> <mi>I</mi> <mn>0</mn> </msub> <mo>-</mo> <msub> <mi>I</mi> <mi>S</mi> </msub> </mrow> <mrow> <msub> <mi>I</mi> <mn>0</mn> </msub> <mo>-</mo> <mi>I</mi> </mrow> </mfrac> <mo>&amp;times;</mo> <mn>100</mn> <mi>%</mi> </mrow>
其中RAC指的是相对抗氧化能力值，I0是用100ng/mL PMA刺激时的峰值电流，IS是在待测物保护作用下的峰值电流，I是没有PMA刺激的峰值电流。
9.根据权利要求5所述的一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法，其特征在于，所述步骤5)中评价待测物的抗氧化能力的方法为：
当RAC＝10％～40％时，说明该待测物抗氧化能力弱，
当RAC＝40％～70％时，说明该待测物抗氧化能力中等，
当RAC＞70％时，说明该待测物抗氧化能力强。
10.根据权利要求8所述的一种利用细胞传感器评价抗氧化能力的方法，其特征在于，所述I的测定方法为：将细胞传感器三在37℃下置于Tyrode缓冲液中，10分钟后用PBS缓冲液洗涤3次，然后连接到电化学工作站，在含有1.0mM Fe(CN)6 3-或1.0mM Fe(CN)6 4-或0.1MPBS的溶液中分别对细胞传感器三进行电化学方法检测，记录电流信号并读取峰值电流记为I。
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