CN107397798A - 基于肉苁蓉的苯乙醇苷类物质提取方法及其抗抑郁应用 - Google Patents

Abstract

一种基于肉苁蓉提取物的应用，将肉苁蓉提取物用于制备抗抑郁药物；该肉苁蓉提取物，通过将肉苁蓉药材粉经过液体回流提取后得到浓缩液，最后经大孔吸附树脂柱层析分离得到的有效部位。本发明通过利用荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉经一定的提取分离方法制备的有效组分，具有较好的抗抑郁作用，可应用于制备及开发抗抑郁制剂。

Description

基于肉苁蓉的苯乙醇苷类物质提取方法及其抗抑郁应用

技术领域

本发明涉及的是一种生物医药领域的技术，具体是一种基于肉苁蓉的苯乙醇苷类物质提取方法及其抗抑郁应用。

背景技术

现代病理学研究表明，由于抑郁症的发病机制较为复杂，诱发的原因有很多，针对某单一环节的药物往往难以取得满意疗效。目前，用于治疗抑郁症的合成类药物主要是单胺类氧化酶抑制剂、三环类抗抑郁药和5-羟色胺再摄取抑制剂。合成类抗抑郁药虽然具有一定效果，但其普遍存在抗抑郁谱窄、耐药性、毒副作用大等弊端。例如，约12-15％的抑郁症患者在服用基于“单胺神经递质假说”设计的抗抑郁药物后病情没有得到改善，且产生如胃肠道反应、性功能障碍、头疼、失眠和皮疹等诸多毒副作用。因此，国内外研究者在抗抑郁药的开发方面，越来越关注更加安全、高效、且副作用小的天然药物的开发和应用。据报道，几乎所有抗抑郁药均可引起性功能障碍的不良反应，而近36％的抑郁症患者把抗抑郁药引起的性功能障碍视为一种不可接受的不良反应，从而严重影响了药物依从性。针对目前临床上抑郁症的治疗手段及现有药物存在的弊端，开发疗效好、副作用较小的治疗抑郁症的中药或天然药物，特别是具备抗抑郁疗效且能改善性功能障碍的药物，具有重要意义和应用前景。

发明内容

本发明针对现有技术提取过程复杂且涉及多种人体无法食用的丙酮等有机试剂，提出一种基于肉苁蓉的苯乙醇苷类物质提取方法及其抗抑郁应用，可应用于制备治疗抑郁症的药物或保健品且制备过程简单，不涉及有毒有害溶剂。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种基于肉苁蓉提取物的应用，即将从肉苁蓉中提取的肉苁蓉苯乙醇苷类提取物用于制备抗抑郁药物。

所述的肉苁蓉苯乙醇苷类提取物，为肉苁蓉总提取物或肉苁蓉中的苯乙醇苷类提取物。

所述的药物，包括但不限于颗粒剂、片剂、胶囊剂、贴剂或软膏剂。

所述的提取物，通过将肉苁蓉药材粉经过液体回流提取后得到浓缩液，最后经大孔吸附树脂柱层析分离得到的苯乙醇苷类有效部位。

所述的肉苁蓉药材粉，包括荒漠肉苁蓉和/或管花肉苁蓉药材粉。

所述的液体回流提取是指：将荒漠肉苁蓉和/或管花肉苁蓉药材粉以8-16倍重量的水或乙醇量大于0且小于等于95％的水-乙醇液回流提取三次，每次1-2小时，三层纱布过滤，合并三次药液，浓缩成荒漠肉苁蓉和/或管花肉苁蓉浓缩液。

所述的大孔吸附树脂柱层析是指：将浓缩液用大孔吸附树脂柱层析分离，先用水洗脱，得水洗脱部位，再用含量为40％的乙醇液洗脱，浓缩各部位，冷冻干燥后，得到水部位和40％乙醇洗脱部位。

所述的有效部位是指：荒漠肉苁蓉和/或管花肉苁蓉的40％乙醇洗脱部位，抗抑郁效果较为显著，该活性部位可直接应用于制备治疗抑郁症的药物或保健品方面的应用。

技术效果

与现有技术相比，本发明提取工艺简单，所用有机溶剂单一且成本低，易于工业化生产；肉苁蓉总提取物及其苯乙醇苷类活性部位具有显著抗抑郁活性，可用于制备治疗抑郁症药物或保健品的开发。

附图说明

图1为实施例2肉苁蓉各给药组对小鼠悬尾实验影响示意图；

图中：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较，n＝15，Mean±SEM；

图2为实施例2肉苁蓉各给药组对小鼠强迫游泳实验影响示意图；

图中：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较，n＝15，Mean±SEM；

图3为实施例2肉苁蓉各给药组对小鼠旷场实验活动总路程影响示意图

图中：n＝15，Mean±SEM；

图4为实施例3管花肉苁蓉提取物对慢性不可预知致抑郁大鼠模型强迫游泳不动时间的影响示意图；

图中：#P<0.05，与模型组比较，n＝8，Mean±SEM；

图5为实施例3管花肉苁蓉提取物对慢性不可预知致抑郁大鼠模型蔗糖偏好指数的影响示意图；

图中：*P<0.05，与空白组比较；#P<0.05，与模型组比较，n＝8，Mean±SEM；

图6为实施例3管花肉苁蓉提取物对慢性不可预知致抑郁大鼠模型旷场实验活动总路程的影响示意图；

图中：**P<0.01，与空白组比较；#P<0.05，与模型组比较，n＝8，Mean±SEM；

图7为实施例3管花肉苁蓉提取物对慢性不可预知致抑郁大鼠模型新环境进食抑制时间的影响示意图；

图中：*P<0.05，与空白组比较；#P<0.05，与模型组比较，n＝8，Mean±SEM；

图8为实施例4管花肉苁蓉提取物UPLC-Q-TOF-MS总离子流图；

图9为实施例4管花肉苁蓉提取物中松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的结构式及质谱裂解碎片。

具体实施方式

实施例1

肉苁蓉及其各部位的制备工艺如下

将荒漠肉苁蓉或管花肉苁蓉药材粉碎，得到药材粉；然后将药材粉以10倍重量的70％乙醇液回流提取三次，每次2小时，三层纱布过滤，合并三次药液，减压浓缩成浓缩液。将浓缩液用大孔吸附树脂柱层析分离，先用水洗脱，得水洗脱部位，再用含量为40％的乙醇液洗脱，浓缩各部位，冷冻干燥后，得到水部位和40％乙醇洗脱部位。

实施例2

荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉及其各部位对小鼠行为绝望模型抗抑郁药效学研究。

选用小鼠行为绝望模型(小鼠悬尾实验、小鼠强迫游泳实验)评价荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉醇提液及其不同洗脱部位的抗抑郁作用。

实验动物：雄性ICR小鼠，135只，体重18g-20g。

实验分组：

实验1组：空白组

实验2组：15mg/kg氟西汀(阳性药)

实验3组：15mg/kg丙咪嗪(阳性药)

实验4组：2181mg/kg荒漠肉苁蓉醇提液

实验5组：1112mg/kg荒漠肉苁蓉醇提液水洗脱部位

实验6组：917mg/kg荒漠肉苁蓉醇提液40％乙醇洗脱部位

实验7组：1555mg/kg管花肉苁蓉醇提液

实验8组：456mg/kg管花肉苁蓉醇提液水洗脱部位

实验9组：792mg/kg管花肉苁蓉醇提液40％乙醇洗脱部位

实验方法：取健康雄性清洁级ICR小鼠135只，随机分为9组，每组15只，由上海交通大学实验动物中心负责从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买。小鼠适应一周后，按各组给药剂量灌胃给药，空白组灌胃生理盐水，每天1次，连续给药7天。

(1)悬尾实验

小鼠给药后第8天，将小鼠尾尖部位约1cm处用医用胶布贴紧，另一端贴在悬尾装置横杆上，悬挂时间为6min，统计后4min内小鼠累计不动时间。

(2)强迫游泳实验

小鼠给药后第9天，将小鼠分别放进水温23-25℃的5L烧杯中，使小鼠后肢不能靠底部支撑身体。游泳时间为6min，统计后4min内小鼠累计不动时间。

(3)旷场实验

小鼠给药后第10天，将小鼠放于旷场箱中，记录每只小鼠5min内活动总路程，中央区域活动路程。

实验结果：

小鼠悬尾实验结果

由图1可以看出，连续给药7天后，与空白组相比，荒漠肉苁蓉醇提物组、管花肉苁蓉醇提物组、管花肉苁蓉水部位组、管花肉苁蓉40％乙醇部位组、丙咪嗪阳性对照组均能够显著减少小鼠在悬尾实验中的不动时间。

小鼠强迫游泳实验结果

由图2可以看出，连续给药7天后，荒漠肉苁蓉醇提物组、荒漠肉苁蓉水部位组、荒漠肉苁蓉40％乙醇部位组、管花肉苁蓉醇提物组、管花肉苁蓉40％乙醇部位组、氟西汀阳性对照组、丙咪嗪阳性对照组与空白组相比较，均能够显著减少小鼠在强迫游泳实验中的不动时间。

小鼠旷场实验结果

结果如图3所示，连续给药7天后，所有给药组与空白组相比，小鼠在旷场实验中自发活动均无显著性差异，表示所有给药组均不会影响小鼠的自主活动能力。

结论

本实验研究证明，荒漠肉苁蓉醇提物、管花肉苁蓉醇提物、管花肉苁蓉40％乙醇部位在连续给药7天后能够显著减少小鼠悬尾和强迫游泳实验中的不动时间，表现出一定的抗抑郁能力；同时旷场实验证明荒漠肉苁蓉醇提物、管花肉苁蓉醇提物、管花肉苁蓉40％乙醇部位不会影响小鼠的自主活动能力。

实施例3

管花肉苁蓉提取部位对慢性不可预知刺激所致的抑郁大鼠模型的药效学研究

建立大鼠慢性不可预知刺激所致的抑郁模型，采用强迫游泳实验、蔗糖偏好实验、旷场实验、新环境进食抑制实验评价管花肉苁蓉醇提液醇提液40％乙醇洗脱部位的抗抑郁作用。

实验动物：雄性SD大鼠，40只，体重180g-220g。

实验分组：

实验1组：空白组

实验2组：模型组

实验3组：10mg/kg氟西汀(阳性药)

实验4组：400mg/kg管花肉苁蓉醇提液40％乙醇洗脱部位高剂量组

实验5组：200mg/kg管花肉苁蓉醇提液40％乙醇洗脱部位低剂量组

实验方法：取健康雄性清洁级SD大鼠180-220g共40只，随机分为5组，每组8只，由上海交通大学实验动物中心负责从北京维通利华实验动物技术有限公司购买。大鼠适应一周后，经过72h的蔗糖水消耗训练，进行蔗糖水饮水水平测试。蔗糖水消耗训练为实验开始时在笼架上放置两瓶完全相同的1％(v/v)蔗糖水，24h后更换其中一瓶蔗糖水为纯净水，再过24h后拿掉另一瓶蔗糖水。禁食禁水14h后，单鼠单笼饲养，笼架上放置一瓶75mL水和一瓶75mL蔗糖水，进行蔗糖水饮水水平测试1h，剔除不合格大鼠，按蔗糖水平消耗均匀分组。空白组每笼4只，与其他组别大鼠在相互隔离的环境下饲养，按照需要正常给与饲料及饮水，不接受任何刺激。其余组每笼4只，在应激刺激1h前灌胃给药。除了空白组不给任何刺激外，其他组接受9种刺激，每种刺激被采用2-3次，同种刺激不连续出现，使其不可预知。

9种具体刺激为20-20KHz白噪音1-2h及频闪照明过夜12h、禁食24h、禁水24h、限制活动1-2h及通宵照明12h、夹尾1min、潮湿环境24h、强迫游泳5min、45°倾斜饲养、震荡摇晃30min。每种刺激随机进行，每天一种刺激，持续28天。在应激刺激期间，除了禁食禁水和蔗糖水水平测试外，自由饮食饮水。

评价方式：

(1)强迫游泳实验：大鼠在造模第三天进行强迫游泳测试，测试前一天，将大鼠放入直径20cm、高40cm，水深15cm的圆形透明树脂桶中适应15min。24h后，给药1h后，将各组大鼠分别放进上述强迫装置中，摄像记录游泳过程。游泳时间为6min，统计后4min内大鼠累计不动时间。

(2)蔗糖偏好实验：末次给药后1天，进行蔗糖偏好实验。测试前禁食禁水14h，分笼孤养，同时给予2瓶水，1瓶为纯净水，1瓶为1％蔗糖水(每瓶水的体积为150mL，给予前称重)。1h后将所有水瓶取下，称重。计算蔗糖偏好实验指数(蔗糖水饮用量/蔗糖水+正常水饮用总量)。

(3)旷场实验：末次给药后第3天，进行旷场实验。将大鼠放于旷场箱中，记录每只大鼠5min内活动总路程。

(4)新环境进食抑制时间：末次给药后第5天，进行新环境进食抑制时间实验。将大鼠放入长宽高分别为50cm，40cm，40cm的实验箱，箱底中央放置小块食物于白纸上。实验前禁食24h，记录大鼠5min内从进入实验箱到开始进食的时间间隔。

实验结果：

强迫游泳实验结果

由图4可以看出，连续给药3天后，与模型组相比，管花肉苁蓉40％乙醇部位低剂量组能够显著减少大鼠在强迫游泳实验中的不动时间，可以改善大鼠在强迫游泳过程中的绝望行为，具有积极的治疗作用。

蔗糖偏好实验结果

由图5可以看出，大鼠在经历28天慢性不可预知刺激之后，模型组大鼠的蔗糖偏好指数显著的低于空白组大鼠，表明慢性不可预知刺激致抑郁大鼠模型建立成功。氟西汀作为阳性药，和模型组相比显著的增加了大鼠的蔗糖偏好指数，进一步证明慢性不可预知刺激致抑郁大鼠模型评判抗抑郁药效学指标的有效性。相较于模型组，管花肉苁蓉40％乙醇部位高剂量组能够显著提高大鼠的蔗糖偏好指数，表示慢性长期给予管花肉苁蓉40％乙醇部位显示出良好的抗抑郁效果。

旷场实验结果

如图6所示，大鼠在经历28天慢性不可预知刺激之后，与空白组相比，模型组大鼠活动路程显著缩短，表明抑郁大鼠模型建立成功。氟西汀作为阳性药，和模型组相比显著的增加了大鼠的活动总路程，进一步证明该模型评判抗抑郁药效学指标的有效性。相较于模型组，管花肉苁蓉40％乙醇部位高剂量组和低剂量组，均能够显著延长大鼠的活动总路程，表示慢性长期给予管花肉苁蓉40％乙醇部位显示出良好的抗抑郁效果。

新环境进食抑制时间实验结果

由图7可以看出，大鼠在经历28天慢性不可预知刺激之后，与空白组相比，模型组大鼠的进食抑制时间显著延长，表明抑郁大鼠模型建立成功。氟西汀作为阳性药，尽管和模型组相比减少了进食抑制时间，但并无显著性差异。相较于模型组，管花肉苁蓉40％乙醇部位高剂量组，则能够显著缩短新环境的进食抑制时间，表示慢性长期给予管花肉苁蓉40％乙醇部位显示出良好的抗抑郁效果。

结论

本实验研究证明，管花肉苁蓉40％乙醇部位能够显著缩短慢性不可预知刺激致抑郁大鼠模型的强迫游泳不动时间，显著提高蔗糖偏好指数，显著延长旷场实验中的活动总路程，并且显著缩短新环境的进食抑制时间，表现出良好的抗抑郁能力。

鉴于上述药效实验结果，本发明中的肉苁蓉总提取物及其苯乙醇苷类活性部位具有显著抗抑郁活性，因此肉苁蓉总提取物和其苯乙醇苷类活性部位可用于制备抗抑郁药物或保健品。

实施例4

本实施例包括以下步骤：将实施例3制得管花肉苁蓉醇提液40％乙醇洗脱部位进行UPLC-Q-TOF-MS分析，总离子流图见图8。采用MassLynx质谱分析软件，分析管花肉苁蓉醇提液醇提液40％乙醇洗脱部位化合物峰，并比对标准品质谱信息，确认了3个成分，见表1，分别是松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷。其化学结构式及质谱裂解规律见图9。

表1管花肉苁蓉醇提液40％乙醇洗脱部位UPLC-Q-TOF-MS信息

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (7)

1.一种基于肉苁蓉提取物的应用，其特征在于，将肉苁蓉提取物用于制备抗抑郁药物；该肉苁蓉提取物，通过将肉苁蓉药材粉经过液体回流提取后得到浓缩液，最后经大孔吸附树脂柱层析分离得到的有效部位。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的药物，其形态采用颗粒剂、片剂、胶囊剂、贴剂或软膏剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的肉苁蓉药材粉是指：荒漠肉苁蓉和/或管花肉苁蓉药材粉。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的液体回流提取是指：将荒漠肉苁蓉和/或管花肉苁蓉药材粉以8-16倍重量的水或乙醇量大于0且小于等于95％的水-乙醇液回流提取三次，每次1-2小时，三层纱布过滤，合并三次药液，浓缩成荒漠肉苁蓉和/或管花肉苁蓉浓缩液。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的大孔吸附树脂柱层析是指：将浓缩液用大孔吸附树脂柱层析分离，先用水洗脱，得水洗脱部位，再用含量为40％的乙醇液洗脱，浓缩各部位，冷冻干燥后，得到水部位和40％乙醇洗脱部位。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的有效部位是指：荒漠肉苁蓉和/或管花肉苁蓉的40％乙醇洗脱部位，抗抑郁效果较为显著，可应用于制备用于治疗抑郁症的药物。

7.根据上述任一权利要求所述的应用，其特征是，所述的肉苁蓉提取物包括：松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷。