CN107213206A - 一种具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物及制备方法和应用 - Google Patents

一种具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中医药领域，具体涉及一种具有止血作用的中药组合物。一种具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物，原料药由醋艾炭、白芷、醋制延胡索组成。醋艾炭中药组合物可作为止血药物，或作为止血药物中的主要组分。本发明以醋艾炭为主要成分，辅以白芷、醋制延胡索，经血浆复钙时间测定、血小板聚集率测定、凝血酶活性促进率测定、血小板粘附率测定，其止血效果明显优于单方醋艾炭，并和云南白药粉剂的止血效果相当，可以做为日常或临床上的止血药物。

Description

一种具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物及制备方法和 应用
技术领域
本发明属于中医药领域，具体涉及一种具有止血作用的中药组合物。
背景技术
艾叶为常用中药，是菊科植物艾草(Artemisia argyi H.Lév.＆Vaniot)的干燥叶，为历版药典收载品种。艾草在我国分布广泛，湖北薪州的艾草质量最好，其次是山东、安徽、河南等省份。艾叶的化学成分主要有挥发油、鞣酸类、黄酮类、三萜类、多糖类、桉树烷类、微量元素、绿原酸等。艾叶中所含鞣质属于综合型，在艾叶发挥止血作用的物质基础中有非常重要的地位。
艾叶性味苦、温、辛、无毒，有逐寒湿、理气血、温经、止血、安胎等功用，外治皮肤瘙痒。大量的药理研究证明艾叶具有抗菌抗病毒、促凝血与抗血小板聚集、平喘镇咳、抗肿瘤、抗过敏、降血压血糖、免疫调节、抗炎及补体激活等作用。根据文献介绍与实验探究确定鞣质具有涩性和收敛性，能与血液中的金属离子发生络合反应，形成大分子化合物，是艾叶中最有效的凝血物质，且含量很高，因此艾叶可作为止血凝血剂的理想原料。
艾叶的炮制始载于汉代，历代对艾叶的炮制方法多种多样，文献中记载的炮制方法有制炭、醋制、炒制、制艾绒、焙制等。现代对艾叶的炮制方法主要有醋蒸、醋炒、酒炒、炒炭、炒焦等。艾叶生品擅于理气血，散风寒湿邪；艾叶制炭后有止痛作用，并能增强温经止血的功效。醋艾炭为艾叶的炮制加工品，辛散之性与生艾叶相比减弱很多，温而不燥，用于虚寒性出血，具有散寒止痛，温经止血之功效。
目前常见的止血药物为云南白药粉剂，一般出血之后，在伤口清洗后使用云南白药粉剂来止血疗效显著，只要一两分钟就能止住一般的出血，遇到一些出血量相对较大的情况需要内服之后，十几分钟就能止住血。醋艾炭虽有较好的止血作用，但是止血效果逊于云南白药，且常用的中药成方制剂较少，为了开发艾草这一中国传统医药，有必要研发出一种以醋艾炭为主要成分的具有明显止血效果的复方中药。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有显著止血效果的醋艾炭复方中药组合物，并提供其应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物，原料药由醋艾炭、白芷、醋制延胡索组成。
所述醋艾炭、白芷、醋制延胡索的质量份数比为0.2~30: 0.2~30: 0.5~30。
优选的，所述醋艾炭、白芷、醋制延胡索的质量份数比为3:2:1。
一种上述具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物的应用，是作为止血药物，或作为止血药物中的主要组分。
一种上述具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物的制备方法，是将醋艾炭、白芷、醋制延胡索用水或30~80%乙醇进行提取， 提取液浓缩成干粉。
本发明具有如下有益效果：
本发明以醋艾炭为主要成分，辅以白芷、醋制延胡索，经血浆复钙时间测定、血小板聚集率测定、凝血酶活性促进率测定、血小板粘附率测定，其止血效果明显优于单方醋艾炭，并和云南白药粉剂的止血效果相当，可以做为日常或临床上的止血药物。
附图说明
图1为凝血酶活性标准曲线。
图2为血小板粘附率曲线。
图3为血小板聚集率曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和实验对本发明的效果进行详细说明。
实施例
一种具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物，其原料药由醋艾炭、白芷、醋制延胡索按照3:2:1的质量份数比组成。
下面结合实验对该实施例的效果进行说明。
实验方法
1.1 实验样品的制备
醋艾炭中药组合物提取物干粉的制备
称取15g醋艾炭、10g白芷、5g延胡索粗粉置于烧杯中，在固液比为1:10的条件下加入70%乙醇750mL浸泡1 h，将超声波清洗器温度设定为80 ℃，功率调到300 W，超声提取40min。利用纱布过滤后，残渣加入70%的乙醇250mL在同样条件下再次超声提取，合并两次滤液，冷却后用布氏漏斗抽滤得清亮的续滤液，置于蒸发皿中在70℃条件下水浴挥干乙醇，最后放入鼓风干燥烘箱中80℃烘干，制得醋艾炭中药组合物提取物干粉。
单味醋艾炭提取物干粉的制备
称取15g醋艾炭，按照上述步骤超声波提取、干燥，制得单味醋艾炭提取物干粉。
1.2体外止血效果评价
测定血浆复钙时间、凝血酶、血小板、纤维蛋白原等各项重要指标可用于探究止血效果，测定方法也多种多样。本实验通过测定血浆复钙时间、凝血酶活性促进率、血小板黏附率和聚集率4项止血指标，进而对醋艾炭中药组合物的体外止血活性进行评价。
1.2.1 血浆复钙时间的测定
通过查阅文献及CaCl2溶液浓度预试验，可以知道0.1mLM/40 CaCl2凝血时间最短，故本实验选用 0.2775% CaCl2溶液。
2溶液 称量0.1110 g无水CaCl2加入40mL蒸馏水溶解（现配现用）。
抗凝血液的制备 自制硅化采血管(柠檬酸钠：三黄鸡全血=1∶9 轻轻混匀)。
抗凝血浆的制备 抗凝血液在离心力 1000 r/min，15℃条件下离心 10 min。
实验样品液配制 称取醋艾炭中药组合物、单味醋艾炭提取物及云南白药，均加入蒸馏水溶解为质量分数为25mg/mL的溶液，利用长颈漏斗过滤得色泽清亮的样品溶液，再稀释成一系列分别为0.1、1.7、3.3、4.9、6.5mg/mL的浓度，备用。
血浆复钙时间测定 取洁净的内径 8 mm 的玻璃试管，于试管内各加入0.1 mL的生理盐水和 M/40 CaCl2溶液，摇匀，在 37℃水浴中预温1min后于试管内加入 0.1 mL去钙血浆，同时开动秒表计时，每隔 30 s 倾斜试管 1 次，一分钟后每隔10s倾斜试管1次。当混和液中出现白色纤维蛋白丝或胶状颗粒沉淀时，即为血浆复钙时间，重复试验3次，取其平均值。将生理盐水换为等量0.1、1.7、3.3、4.9、6.5mg/mL的醋艾炭中药组合物、单味醋艾炭及云南白药药液，利用上述方法测得不同浓度的各种药品的血浆复钙时间。以云南白药为阳性对照，并设生理盐水作为空白对照，计算P值。实验数据均以 ±s表示，采用t检验，以P＜0.05为显著差异，有统计学意义。
1.2.2 凝血酶活性促进率测定
PBS的配制 分别称取3.12g磷酸二氢钠和7.16g磷酸氢二钠，各加入适量蒸馏水，利用磁力搅拌器搅拌溶解，分别加蒸馏水定容至100 mL；取19 mL磷酸二氢钠溶液及81 mL磷酸氢二钠溶液混合即得0.2mol/L的PH=7.4的PBS，再将此溶液稀释至浓度为0.1mol/L。
培养温度条件的优化 取四支口径相同的洁净玻璃试管，量取适量的磷酸缓冲液，把凝血酶和纤维蛋白原溶解，在每个试管中加入0.1 mL 6.0U/mL的凝血酶溶液和0.9mL纤维蛋白原溶液并振荡混匀，将上述试管分别置于23℃，30℃，37℃，44℃的恒温水浴锅中观察并记录初凝时间，重复实验3次，取其平均值。
纤维蛋白原浓度的优化 用pH为7.40的磷酸缓冲液配备10.0mg/mL的牛纤维蛋白原溶液，再分别稀释至0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的浓度，用移液枪各移取0.9mL于玻璃试管中，接着加入0.1 mL 6.0U/mL的凝血酶溶液，混合均匀后将各试管置于37℃水浴锅中观察，记下初凝时间，重复实验3次，取均值。
凝血酶标准曲线的测定 量取3.0mL 4.0mg/mL的纤维蛋白原溶液，再用一次性注射器量取等体积2.5%的琼脂，在水平桌面上将二者倒入培养皿中混匀制备平板，静置待其冷却后开盖，在平板上选择恰当的间距打孔。利用PBS将凝血酶溶解成100.0 U/mL的浓度，再稀释至1.0、2.0、4.0、6.0、8.0U/mL的浓度。在每个板孔中各加入20μL各浓度凝血酶标准品，于37℃恒温培养箱中反应18 h后，取出计算反应孔溶圈面积。以凝血酶活性为横坐标，各浓度凝血酶标准品溶圈面积为纵坐标，绘制凝血酶的标准曲线，并进行方程回归计算。
凝血酶活性促进率的测定 利用上述方法制备三个平板，取适量凝血酶和药品溶液，将二者混合使其每毫升含6U凝血酶及10mg药品，分别取20μL加在各个板孔中，培养皿加盖后置于生化培养箱中，将温度设置为37℃反应18h。用油标卡尺测量各反应孔溶圈直径（mm），计算溶圈面积。重复实验3次，取平均值。计算各药液的凝血酶活性促进率（TPR），6.0U/mL凝血酶溶液作对照，比较各组差异，计算P值。实验数据均以 ±s表示，采用t检验，以P＜0.05为显著差异，有统计学意义。
说明：TPR：凝血酶活性促进率；A m : 药液和凝血酶混合液的溶圈面积mm2
A 0 ：6.0U/mL凝血酶溶液的溶圈面积mm2
1.2.3血小板粘附率的测定
在离心管中加入抗凝血液1mL，放到离心机中进行离心，转速3000r/min，时间15min。准备若干塑料离心管，分别加入0.1mL浓度各为0.1、1.7、3.3、4.9、6.5mg/mL的醋艾炭中药组合物、单味醋艾炭提取液，接着加入0.1mL上层清液即血小板溶液，并在各离心管中加入3个大小相等的小玻璃珠，振荡10min，最后在显微镜下用血球计数板进行计数。实验重复3次，取平均值，计算不同浓度的各种止血药血小板黏附率。云南白药为阳性对照，生理盐水组作空白对照，计算P值。实验数据均以 ±s表示，采用t检验，以P＜0.05为显著差异，有统计学意义。
说明：PAdR:血小板黏附率％；N 0 : 黏附前血小板数；N f ：黏附后血小板数
1.2.4血小板聚集率的测定
血小板聚集率测定 取离心管加入1mL抗凝血液，放到离心机中，以800r/min的转速离心10min，所得溶液为富血小板血浆。同理，吸取抗凝血液1mL， 以3500r/min的转速离心15min，制得贫血小板血浆。将贫富血小板血浆置于37℃恒温水浴锅中预温5min后，将分光光度计波长调节至600nm，用贫血小板血浆调节富血小板血浆，使其吸光度值在0.6~0.7之间。取干净的比色皿，加入2.55mL调好的富血小板血浆以及0.3mL生理盐水，比色皿放入分光光度计后再加入1U/mL的凝血酶溶液0.15mL，马上混匀并测吸光度。5min后，再次测定其吸光度。将生理盐水换成等量0.1、1.7、3.3、4.9、6.5mg/mL的醋艾炭中药组合物、单味醋艾炭提取液，计算聚集率[15,16]。实验重复3次，云南白药作阳性对照，生理盐水组作空白对照，比较差异，计算P值。实验数据均以 ±s表示，采用t检验，以P＜0.05为显著差异，有统计学意义。
说明： PAgR：血小板聚集率；A 0 : 刚开始加酶时血小板吸光度
A f ：加酶5min后血小板吸光度
2结果与分析
2.1实验样品的制备
实验运用最佳工艺超声波提取得到醋艾炭中药组合物提取物干粉3.0803g，醋艾炭单品提取物干粉为2.2232g，提取率分别为10.3%和14.8%。
2.2 血浆复钙时间的测定
实验测得的血浆复钙时间如表1。由该表可知，在0.1~6.5 mg/mL的浓度范围内，随着药品溶液浓度的上升，醋艾炭中药组合物、单味醋艾炭及云南白药的血浆复钙时间都逐渐缩短，说明药液浓度与血浆复钙时间有相关联系，浓度越高，止血效果越显著。分析醋艾炭中药组合物在不同浓度条件下的复钙时间，可知醋艾炭中药组合物的浓度与血浆复钙时间之间存在线性关系，其相关系数为-0.98877，由此可知醋艾炭中药组合物溶液的浓度越高，其血浆复钙时间越短，止血效果越好。
根据表1可知，以生理盐水作为空白对照，除了浓度为0.1 mg/mL的单味醋艾炭以外，实验组（醋艾炭中药组合物、单味醋艾炭）以及阳性对照组（云南白药）均可极显著缩短血浆复钙时间（P<0.01）。以云南白药作为阳性对照，醋艾炭中药组合物的血浆复钙时间比阳性对照组要短，说明醋艾炭中药组合物的止血效果比云南白药好，但是二者的止血效果没有显著性差异（P>0.05）。选取实验组中的醋艾炭中药组合物和单味醋艾炭对比差异，实验结果说明醋艾炭中药组合物比单味醋艾炭能极显著缩短血浆复钙时间（P<0.01），醋艾炭中药组合物有极显著的止血效果。
2.3凝血酶活性促进率的测定
培养温度 实验测得的不同温度下的初凝时间如表2。根据该表可知37℃温度条件下的初凝时间最短，说明在此温度下酶的活性最高。温度太低时酶的活性受到抑制，会使初凝时间延长，而温度过高则会破坏酶的空间结构使酶活性下降甚至失活，从而大幅度延长初凝时间。因此，本实验选取的最适培养温度为37℃。
表2 不同温度下初凝时间测定结果（ ±s）
纤维蛋白原浓度 将不同浓度的纤维蛋白平板放入37℃培养箱中恒温反应后发现，在0.5~4.0 mg/mL的浓度范围内，2.0、4.0mg/mL两组浓度的平板有溶圈出现，而其他两组没有明显实验现象。综合实验现象与节约材料两方面考虑，本实验选取浓度为2.0mg/mL的牛纤维蛋白原进行倒平板。
凝血酶标准曲线 实验说明，不同活性单位的凝血酶对溶圈面积存在影响，凝血酶浓度越高，纤维蛋白平板上出现的溶圈面积越大。以凝血酶活性为横坐标，各浓度凝血酶标准品溶圈面积为纵坐标，绘制凝血酶的标准曲线，并进行方程回归计算。结果如图1，凝血酶标准曲线方程为：Y=17.384X+0.7866，R2 =0.9924，说明凝血酶在1.0~8.0U/mL的活性范围内呈良好的线性关系。
凝血酶活性促进率 实验测得的凝血酶活性促进率结果如表3。以6.0 U/mL凝血酶溶液为空白对照，实验组（醋艾炭中药组合物、单味醋艾炭）及阳性对照组（云南白药）都能显著促进凝血酶的活性（P<0.05），并且随着药液浓度的增大，三者对凝血酶活性的促进作用越明显。醋艾炭中药组合物的促进作用比单味醋艾炭更显著（P<0.05）,而醋艾炭中药组合物对凝血酶活性的促进作用不如云南白药，但二者没有显著差异（P>0.05）。
血小板粘附率 本实验在显微镜下运用血球计数板计算血小板的数量，计算得出的血小板粘附率如表4，药物的浓度与粘附率关系见图2。由图表可知，在0.1~3.3 mg/mL的浓度范围内，以生理盐水作为空白对照，实验组（醋艾炭中药组合物、单味醋艾炭）与阳性对照组（云南白药）都能显著促进血小板的粘附（P<0.05），但是随着醋艾炭中药组合物及单味醋艾炭药液浓度的增加，血小板粘附率反而下降，说明高浓度的醋艾炭中药组合物及单味醋艾炭不利于血小板的粘附。以云南白药为阳性对照，低浓度的醋艾炭中药组合物溶液对血小板粘附的促进作用优于云南白药，但随着浓度逐渐升高，云南白药对血小板粘附的促进效果明显优于醋艾炭中药组合物，与醋艾炭中药组合物存在显著差异（P<0.05）。
血小板聚集率 实验运用分光光度计法测定不同浓度的各种药品溶液吸光度，计算血小板聚集率，结果见表5及图3。分析图表可知，以生理盐水为空白对照，在0.1~1.7 mg/mL的浓度范围内，醋艾炭中药组合物及单味醋艾炭对血小板的聚集有显著的促进作用（P<0.05），但随着溶液浓度的升高，二者促进效果均下降，当醋艾炭中药组合物浓度达到4.9mg/mL时，甚至对血小板聚集发生抑制作用，而单味醋艾炭在3.3mg/mL时已经开始抑制血小板的聚集。在0.1~6.5 mg/mL的浓度范围内，随着浓度的升高，阳性对照组云南白药对血小板聚集的促进作用越来越显著，说明血小板聚集率对云南白药的剂量存在依赖性。但在0.1~3.3mg/mL的浓度范围内，云南白药与醋艾炭中药组合物对血小板聚集的促进作用无显著差异（P>0.05）。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物，其特征在于：原料药由醋艾炭、白芷、醋制延胡索组成。
2.根据权利要求1所述的具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物，其特征在于：所述醋艾炭、白芷、醋制延胡索的质量份数比为0.2~30: 0.2~30: 0.5~30。
3.根据权利要求2所述的具 有较强止血作用的醋艾炭中药组合物，其特征在于：所述醋艾炭、白芷、醋制延胡索的质量份数比为3:2:1。
4.一种权利要求1或2或3所述具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物的应用，其特征在于：作为止血药物，或作为止血药物中的主要组分。
5.一种权利要求1或2或3所述具有较强止血作用的醋艾炭中药组合物的制备方法，其特征在于：是将醋艾炭、白芷、醋制延胡索用水或30~80%乙醇进行提取，提取液浓缩成干粉。
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