CN107198227A - 一种牛樟芝酵素及其制备方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明公开了一种牛樟芝酵素的制备方法，步骤如下：(1)取牛樟芝，加入1～4倍量水，浸泡10～30分钟，破碎打浆，得浆液，果胶酶酶解，分离取汁，灭菌，得酶解液；(2)在步骤(1)所得酶解液中，按重量比0.05～0.15％加入酵母菌，在温度为20～30℃的条件下发酵12～36小时，得药液；再在药液中，按重量比2～6％加入乳酸菌，然后在温度为30～40℃的条件下发酵12～60小时，得原液；(3)取步骤(2)所得原液，冷冻干燥，粉碎，即可。本发明还公开了前述方法制备得到的牛樟芝酵素及其用途。本发明方法制备得到的牛樟芝酵素口感优良，抗氧化性能也显著高于牛樟芝药材，应用前景优良。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛樟芝酵素及其制备方法。
背景技术
牛樟芝学名为Antrodia camphorata，又名为樟芝，牛樟菇、樟菇，是中国台湾特有的真菌。牛樟芝生长于牛樟树干腐朽的中空内部或倒伏树干的潮湿表面，子实体形态多变化，有板状、锺状、马蹄状或塔状；初生时鲜红色，渐长变为白色、淡红褐色、淡褐色或淡黄褐色。牛樟芝气芳香味辛苦、平，有祛风行气、化淤活血、温中消结、解毒消肿、镇静止痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、提升机体免疫力之效；对于治疗胃肠疼痛、腹泻呕吐、食物中毒、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、肝硬化、肝癌等更是有独特功能。现代分离分析技术证实，樟芝主要生理活性物质为多糖体(β-D-葡聚糖)和三萜类化合物。樟芝所含有的三萜类成分为灵芝的数倍之多，为樟芝最重要的化学成分之一。其功效除了有抗癌的效果外，同时可以增强人体免疫力，提升肝脏运作功能，对乙肝病毒等肝炎具有很好的改善效果。此外，三萜类亦有降血压，降低中风几率的作用。樟芝多糖属于杂多糖，具有提升人体免疫力，调整血压、降血脂、抑制病毒、抗过敏及抗辐射等作用。樟芝所含次要活性物质则包括超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷、小分子蛋白质(含免疫蛋白)、维生素、固醇类、木质素、不饱和长链脂肪酸、麦角甾醇、微量元素锗以及凝集素、氨基酸、薄孔菌酸(Antrodia acid)等。腺苷是人体遗传基因的主要成分之一，可以抑制血小板凝聚，改善血液循环；超氧化物歧化酶是一种血蛋白，具有移除超氧阴离子的作用等。由于樟芝在中国台湾被视为独特而珍贵的药用真菌，因此具有极高的研究和商业价值，也是目前中国台湾最昂贵的野生真菌，在港澳被称为“神芝”，中国台湾民间称之为“森林中的红宝石”。
酵素指以一种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、中草药等为原料，经多种有益菌发酵而产生的，含有丰富的维生素、酶、矿物质和次生代谢产物等营养成分的功能性微生物发酵产品。酵素不但保存了发酵原料中所固有的营养物质，而且可以改善发酵原料原有的一些不良风味，更重要的是在发酵过程中产生了一些新的功能成分，对人体有效好的保健效果。然而，微生物发酵是一个复杂的过程，影响酵素产品质量的因素较多，比如，发酵菌种、接种量等工艺参数对酵素质量的影响尤为明显，确定适宜的发酵条件，从而得到一种风味良好且功能性成分含量较高的酵素产品对技术人员来说十分困难。
随着社会经济的发展，人们生活水平得到提高，但切伴随着现代文明病、富贵病及人类普遍亚健康状态的出现。在物质丰裕的现代，人们越来越注重养生，“中医不治已病治未病”的保健理念深入人心，近几年来以具有很好的防癌、抗癌、保肝功效的樟芝真菌为原材料研发的保健食品更是受人追捧，市场对其需求量非常大。樟芝菌丝体在中国台湾已被中国台湾卫生部门批准为保健食品，且樟芝保健食品在中国台湾、日本和香港都已上市多年，并外销大陆、日本、东南亚等地。
发明内容
本发明研发了一种牛樟芝酵素产品，能够改善牛樟芝的口感，提高牛樟芝的抗氧化性能，且服用更加方便，应用前景广阔。本发明提供了一种牛樟芝酵素及其制备方法。
本发明首先提供了牛樟芝酵素的制备方法，步骤如下：
(1)取牛樟芝，加入1～4倍量水，浸泡10～30分钟，破碎打浆，得浆液，果胶酶酶解，分离取汁，灭菌，得酶解液；
(2)在步骤(1)所得酶解液中，按重量比0.05～0.15％加入酵母菌，在温度为20～30℃的条件下发酵12～36小时，得药液；再在药液中，按重量比2～ 6％加入乳酸菌，然后在温度为30～40℃的条件下发酵12～60小时，得原液；
(3)取步骤(2)所得原液，冷冻干燥，粉碎，即可。
步骤(1)中，所述牛樟芝是牛樟芝Antrodia camphorata的干燥体。3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，加入4倍量的水。
步骤(1)中，所述灭菌的方式是煮沸10分钟。
步骤(1)中，所述果胶酶酶解的方法是：调解浆液pH至3～4，在45～ 50℃条件下，按重量比加入0.2～0.5％的果胶酶，酶解2～4小时；优选地，所述分离取汁的分离方法是过滤。
步骤(2)中，所述酵母菌为葡萄酒·果酒专用酵母RW。所述葡萄酒·果酒专用酵母RW可以购自安琪酵母股份有限公司，编号：80000877。
步骤(2)中，所述乳酸菌是保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌中一种或数种混合菌。
其中，保加利亚乳杆菌可以是来自北京北纳创联生物技术研究院的编号：BNCC223619的保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌可以是来自北京北纳创联生物技术研究院的编号：BNCC134430的嗜热链球菌；嗜酸乳杆菌可以是来自北京北纳创联生物技术研究院的编号：BNCC185342的嗜酸乳杆菌；青春双歧杆菌可以是来自北京北纳创联生物技术研究院的编号：BNCC186535的青春双歧杆菌。
步骤(2)中，所述乳酸菌是保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌中一种或数种混合菌；或者，所述酵母菌按照重量比0.10％的比例加入；或者，所述酵母菌发酵的温度为20～28℃，优选28℃；或者，所述酵母菌发酵的发酵时间可以为24～36h，优选24h。
步骤(2)中，所述乳酸菌发酵的接种量为优选3～6％，最优选4％；或者，所述乳酸菌发酵的发酵时间是30～60h，最优选36h；或者，所述乳酸菌发酵的发酵温度是35～40℃，优选35℃。
步骤(3)中，所述冷冻干燥的方法是-12～-36℃低温预冷冻12-24小时，再在真空度20-30pa、温度20-30℃条件下干燥24-48小时。
本发明还提供了前述方法制备得到的牛樟芝酵素。
本发明还提供了前述牛樟芝酵素在制备抗氧化或者提高免疫力的药品、食品或者保健食品中的用途。
本发明方法制备得到的牛樟芝酵素口感优良，具有抗氧化性能和提高机体免疫力的作用，而且效果均显著高于牛樟芝药材，应用前景优良。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明牛樟芝酵素的制备方法
一、制备方法
取牛樟芝，除去杂质，洗净，加入4倍量煮沸灭菌后冷却的纯净水，浸泡30分钟，破碎打浆。调节pH至3～4，在45～50℃条件下，按重量比加入0.2～0.5％的果胶酶，酶解2～4小时，分离取汁(过滤分离)，煮沸10 分钟灭菌，冷却至室温；
按重量比0.05～0.15％加入酵母菌(采用的酵母菌为葡萄酒·果酒专用酵母RW，物料编号：80000877，来源：安琪酵母股份有限公司)，在温度为 20～30℃的条件下发酵12～36小时，分离上清液，再在药液中，按重量比2～ 5％接种乳酸菌(嗜酸乳杆菌与青春双歧杆菌的混合菌，嗜酸乳杆菌：编号:BNCC185342，来源：北京北纳创联生物技术研究院；青春双歧杆菌： BNCC186535，来源：北京北纳创联生物技术研究院)，在温度为30～35℃的条件下发酵12～60小时，离心，取上清液，灌装，于4℃条件下保存，即得本发明的酵素原液；
取原液，在-12～-36℃低温预冷冻12～24小时，再在真空度20～30pa、温度20～30℃条件下干燥24～48小时，粉碎，即得酵素冻干粉。
实施例2本发明牛樟芝酵素的工艺筛选实验
一、制备方法
1、酵母菌发酵工艺研究
取牛樟芝，除去杂质，洗净，加入4倍量煮沸灭菌后冷却的纯净水，浸泡30分钟，破碎打浆。调节pH至3～4，在45～50℃条件下，按重量比加入0.2～0.5％的果胶酶，酶解2～4小时，分离取汁，煮沸10分钟，灭菌，冷却至室温，按下法进行酵母菌单独发酵工艺研究。
1.1发酵时间对酵母菌数量和SOD活性的影响
发酵时间影响着酵母菌的数量和SOD的活性，在保证充分溶氧的条件下，将发酵温度设为25℃，酵母菌的接种量为0.1％，分别研究了在0，6， 12，24，36，48和72h发酵后酵母菌数量、SOD活性、糖度和pH的变化，结果如表1。
表1 发酵时间对酵母菌数量和SOD活性的影响
从表1可知，随着发酵时间的延长，发酵液中的SOD活性和酵母菌的数量不断增加，发酵时间达到24h时酵母菌数量最大，此时SOD活性为 401.7U/g，糖度为12.0，随后发酵液中的酵母菌数量开始下降，此时SOD活性增趋于稳定，而在此过程中pH一直在缓慢减少。
实验结果说明，本发明发酵方法中，酵母菌发酵的发酵时间可以为 12～36h，优选24～36h，最优选24h。
1.2酵母菌接种量对酵母菌发酵的影响
接种量会影响发酵液中酵母菌的生长，合适的接种量可以使生产菌在发酵过程中迅速生长，从而减少杂菌的生长机会，但是接种量过大也可能使菌种生长过快，导致培养液黏度过大，从而使溶氧不足，影响产物的合成。试验在保证充分溶氧的条件下，将发酵温度设为25℃，发酵时间设为24h，酵母菌的接种量
分别为0.05％，0.08％，0.10％，0.12％和0.15％，研究了在不同接种量时酵母菌数量、SOD活性等相关指标的变化，结果如表2。
表2 酵母菌接种量对酵母菌数量和SOD活性的影响
由表2可知，当接种量在0.05％～0.10％时，酵母菌数量和SOD活性明显呈上升趋势，当接种量在0.10％时达到最大值，此时SOD活性为401.7U/g，当接种量在0.10％～0.15％时两者有明显下降，在整个发酵过程中pH和糖度变化趋势不明显，因此酵母菌的最佳接种量为0.10％。
实验结果说明，本发明发酵方法中，酵母菌发酵的接种量可以为 0.05～0.15％，优选0.10％。
1.3发酵温度对酵母菌发酵的影响
温度会影响微生物细胞的生长的速率和产物形成、产物合成方向，因此它对酵母菌数量和SOD活性有直接的影响。在保证充分溶氧的条件下，接种 0.10％的酵母菌，发酵时间设为24h，研究不同发酵温度下20℃，25℃，28℃， 30℃和33℃酵母菌数量、SOD活性等相关指标的变化，结果如表3。
表3 发酵温度对酵母菌数量和SOD活性的影响
由表3可知，在一定温度范围内随着温度的升高，酵母菌数量和SOD 活性随之增加，28℃下达到最大，此时SOD活性为351.3U/g，在28℃～33℃ 2种显著下降，但在整个温度范围内糖度、pH趋于稳定，变化不明显。此时 28℃可设为最佳发酵温度。
实验结果说明，本发明发酵方法中，酵母菌发酵的发酵温度可以是 20～28℃，优选28℃。
2、乳酸菌发酵工艺研究
取牛樟芝，除去杂质，洗净，加入4倍量煮沸灭菌后冷却的纯净水，浸泡30分钟，破碎打浆。调节pH至3～4，在45～50℃条件下，按重量比加入0.2～0.5％的果胶酶，酶解2～4小时，分离取汁，煮沸10分钟，灭菌，冷却至室温，按下法进行乳酸菌单独发酵工艺研究。
2.1发酵时间对乳酸菌数量和酸度的影响
在发酵温度为35℃，接种量为3％的条件下，采用6，12，18，24，30， 36，48和60h不同的发酵时间对牛樟芝液进行发酵，根据产酸量和乳酸菌数量确定最佳发酵时间，结果见表4。
表4 发酵时间对乳酸菌数量和酸度的影响
由表4可知，在发酵前12h内产酸较慢，此时植物乳杆菌生长比较缓慢，可能与植物乳杆菌接种到新的环境有关，随着发酵时间延长，乳酸含量不断增加，在36h时，乳酸菌数开始下降，当发酵36h时酸度达到最大值0.58％，可能是因为营养物质有限，细胞进入生长后期，基本停止产酸。
实验结果说明，本发明发酵方法中，乳酸菌发酵的发酵时间可以是 12～60h，优选30～60h，最优选36h。
2.2乳酸菌接种量的确定
适当增加接种量可以缩短甚至消除迟缓期，加快产酸速度，在发酵温度为35℃，发酵时间为36h的条件下，采用1％，2％，3％，4％，5％和6％不同的接种量对枣液进行发酵，结果如表5。
表5 乳酸菌接种量对乳酸菌数量和酸度的影响
由表5可知，随着接种量的增加，发酵液中乳酸含量呈上升趋势，接种量为1％，2％和6％时的牛樟芝液经36h发酵后产酸量小于0.30％，产酸较慢，达不到饮料生产的要求。接种量为3～5％时的牛樟芝液经发酵后酸度能达到 0.50％，随后酸度呈下降趋势，最佳接种量为4％。
实验结果说明，本发明发酵方法中，乳酸菌发酵的接种量可以为2～6％，优选3～6％，最优选4％。
2.3发酵温度对乳酸菌发酵的影响
在接种量为3％，发酵时间36h的条件下，研究25℃，30℃，35℃，40℃和43℃不同的发酵温度对枣液进行发酵，结果如表6。
表6 发酵温度对乳酸菌数量和酸度的影响
由表6可知，在整个温度范围内，发酵液中乳酸含量随着温度的升高呈先升高后下降的趋势，乳酸菌发酵牛樟芝液的最适温度为30℃～35℃左右，此时乳
酸含量都超过0.40％，在35℃下酸度高达0.58％，发酵温度低，乳酸菌产酸缓慢，达到要求酸度的时间比较长；发酵温度过高会抑制植物乳杆菌的生产，会产生刺激性较强的酸味，综合考虑乳酸菌发酵的最适温度为35℃。
实验结果说明，本发明发酵方法中，乳酸菌发酵的发酵温度可以是 30～40℃，优选35～40℃，最优选35℃。
3、结论
根据上述试验结果，确定牛樟芝酵素的最佳发酵工艺为：按重量比0.1％加入酵母菌，在温度为28℃的条件下发酵24小时，分离上清液，再在药液中，按重量比4％接种乳酸菌，在温度为35℃的条件下发酵36小时，离心，取上清液，灌装，于4℃条件下保存，即得本发明的酵素原液。
实施例3本发明牛樟芝酵素的制备方法
一、制备方法
取牛樟芝，除去杂质，洗净，加入4倍量煮沸灭菌后冷却的纯净水，浸泡30分钟，破碎打浆。调节pH至3～4，在45～50℃条件下，按重量比加入0.2～0.5％的果胶酶，酶解2～4小时，分离取汁(过滤分离)，煮沸10 分钟，灭菌，冷却至室温；
按重量比0.1％加入酵母菌，在温度为28℃的条件下发酵24小时，分离上清液，再在药液中，按重量比4％接种乳酸菌，在温度为35℃的条件下发酵36小时，离心，取上清液，灌装，于4℃条件下保存，即得本发明的酵素原液；
取原液，在-12～-36℃低温预冷冻12～24小时，再在真空度20～30pa、温度20～30℃条件下干燥24～48小时，粉碎，即得酵素冻干粉。
二、性质检测
表7本发明牛樟芝酵素质量评价结果
*注：％指g/100g牛樟芝药材。
测定结果表明，本发明酵素与原药材相比，口感更好，服用更方便，总多糖、乳酸菌等有益成分显著增加，并且增加了SOD活性。
以下通过实验例的方式来证明本发明的有益效果：
实验例1本发明牛樟芝酵素的药效活性
1.抗氧化功能
1.1材料与仪器
实验动物清洁级ICR 10月龄小鼠30只，体重(45±5)g，由广东省医学实验动物中心提供；牛樟芝酵素冻干粉(自制)；牛樟芝菌，批号160701，由中山安荞生物科技有限公司提供；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)测试盒由南京建成生物工程研究所提供。动物台秤，常熟双杰测试仪器厂；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；TU-1810DP型紫外-可见分光光度仪，北京普析通用；TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂。
1.2实验方法
1.2.1供试药物溶液的制备
(1)牛樟芝酵素冻干粉溶液：取冻干粉(按照实施例3的方法制备)，加蒸馏水适量溶解，制成每1ml含1g牛樟芝的混悬液，备用。
(2)牛樟芝药材溶液：取牛樟芝药材，粉碎成粗粉，加8倍量水煎煮2 次，每次30分钟，滤过，合并滤液，浓缩成每1ml含1g牛樟芝的混悬液，备用。
1.2.2动物分组及给药方法
实验前，小鼠称重后眼眶取血，分离血清，按试剂盒说明书测定血清中的MDA含量。按MDA水平将小鼠分为老龄对照组、牛樟芝酵素组、牛樟芝药材组(5g/kg·bw剂量的牛樟芝液给老龄小鼠灌胃)三个组。实验时按所设剂量进行灌胃给药，连续30d。
1.2.3观察指标及检测方法
(1)一般体征观察。实验期间观察小鼠的精神、活动和毛色。
(2)血清脂质过氧化指标的测定。末次给药后小鼠摘眼球取血，置于试管中，离心(4000r/min，10min)，分离血清测MDA含量。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。
(3)组织匀浆抗氧化酶活力的测定。末次给药后，小鼠摘眼球取血后处死小鼠，立即取新鲜肝脏组织块(0.2～1g)，除去血液，滤纸拭干，称重，加入9倍重量的冷生理盐水，用组织匀浆机制成10％匀浆液，检测SOD活力。 SOD活力测定采用邻苯三酚氧化法。
1.2.4实验数据统计
所测定指标均采用均数±标准差表示，使用SPSS10.0软件中的t检验进行分析。
1.3结果与分析
1.3.1一般体征观察结果
给予牛樟芝酵素和牛樟芝提取液30d的组，小鼠反应灵敏、行动灵活、毛色光亮；老龄对照组反应迟滞、行动缓慢、毛色粗糙。
1.3.2牛樟芝对老龄小鼠血清过氧化脂质的影响
给予牛樟芝药材和牛樟芝酵素30d后，各组与对照组比较血清MDA含量降低，差异有显著性；牛樟芝酵素与牛樟芝药材组比较，差异也具显著性，见表8。
表8 牛樟芝提取物对老龄小鼠血清MDA含量的影响
注：与对照组比较，**p＜0.01；与牛樟芝药材组比较△p＜0.05
1.3.3牛樟芝对老龄小鼠肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响
给予牛樟芝药材和牛樟芝酵素30d后，各组与对照组比较，肝组织中SOD 活力升高差异有显著性；牛樟芝酵素与牛樟芝药材组比较，差异也具显著性，见表9。
表9 牛樟芝提取物对老龄小鼠血清MDA含量的影响
| 剂量组 | 动物数(只) | SOD活力(NU/ml) |
| 对照组 | 10 | 90.83±8.23 |
| 牛樟芝药材组 | 10 | 120.13±6.27** |
| 牛樟芝酵素组 | 10 | 145.76±7.52**△ |
注：与对照组比较，**p＜0.01；与牛樟芝药材组比较△p＜0.05
1.4结论
本发明制得的牛樟芝酵素，能显著增强衰老小鼠的抗氧化能力，延缓小鼠的衰老。效果也明显优于牛樟芝药材。
2.增强免疫力功能
2.1材料与仪器
实验动物清洁级昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，由广东省医学实验动物中心提供；牛樟芝酵素冻干粉(自制)；牛樟芝菌，批号160701，由中山安荞生物科技有限公司提供；二硝基氟苯(DNFB)，丙酮，麻油，硫化钠，0.1％Na2CO3溶液，印度墨水，血清白介素－2(IL－2)ELISA测定试剂盒 (RapidBio公司产品)。
动物台秤，常熟双杰测试仪器厂；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；TU-1810DP型紫外-可见分光光度仪，北京普析通用；TDL-40B离心机，上海安亭科学仪器厂。
2.2实验方法
2.2.1供试药物溶液的制备
(1)牛樟芝酵素冻干粉溶液：取冻干粉，加蒸馏水适量溶解，制成每 1ml含1g牛樟芝的混悬液，备用。
(2)牛樟芝药材溶液：取牛樟芝药材，粉碎成粗粉，加8倍量水煎煮2 次，每次30分钟，滤过，合并滤液，浓缩成每1ml含1g牛樟芝的混悬液，备用。
2.2.2动物分组及给药方法
实验前，小鼠随机分为3组，分别为空白对照组、牛樟芝酵素组、牛樟芝药材组，每组10只。牛樟芝酵素组、牛樟芝药材组按5g/kg·bw剂量灌胃给药，空白对照组给予等体积的生理盐水。连续给药10d。
2.2.3观察指标及检测方法
(1)免疫器官指数：颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠胸腺和脾脏，电子天平称重，计算胸腺指数和脾脏指数。胸腺指数＝胸腺重量/体重；脾脏指数＝脾脏重量/体重。
(2)免疫功能检测:①小鼠碳廓清试验:按100mL/kg体重从小鼠尾静脉注入稀释4倍的印度墨汁，注入墨汁后2、10min分别从眼内眦静脉丛取血20 μL，并将其加到0.1％Na2CO3溶液2mL中，在600nm波长处测光密度值(OD)，以 0.1％Na2CO3溶液作空白对照。按下式分别计算廓清指数(K)。K＝(lgOD1－ lgOD2)/(t2－t1)。
②迟发型变态反应测定:小鼠腹部用硫化钠脱毛，范围约3cm×3cm，用 10mg/mLDNFB溶液50μL均匀涂抹致敏。5d后用10mg/mLDNFB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm耳片，称重，以左右两耳片重量之差为迟发型变态反应值。
(3)血清IL－2测定：眼眶取血1.5mL，静置30min，2500r/min离心 15min，取上置血清。采用ELISA测定法测定血清IL－2的含量，所有操作严格按照说明书进行。
2.2.4实验数据统计
所测定指标均采用均数±标准差表示，使用SPSS10.0软件中的t分析进行检验。
2.3结果与分析
2.3.1免疫器官指数比较
与空白对照组比较，牛樟芝药材组、牛樟芝酵素组胸腺和脾脏脏器指数均有增加(P＜0.01，P＜0.05)；与牛樟芝药材组比较，牛樟芝酵素胸腺和脾脏脏器指数明显增加(P＜0.05),结果见表10。表明牛樟芝酵素组作用最优。
表10 各组小鼠胸腺和脾脏脏器指数比较
| 组别 | 动物数(只) | 胸腺脏器指标(mg/g) | 脾脏脏器指数(mg/g) |
| 空白对照组 | 10 | 3.27±0.35 | 7.35±0.11 |
| 牛樟芝药材组 | 10 | 4.57±0.42** | 8.43±0.22** |
| 牛樟芝酵素组 | 10 | 5.37±0.35**△ | 9.16±0.40**△ |
注：与对照组比较，**p＜0.01；与牛樟芝药材组比较△p＜0.05
2.3.2碳廓清能力比较
与空白对照组比较，牛樟芝药材组碳廓清指数无明显差异(P＞0.05)，而酵素组碳廓清指数则显著提高(P＜0.05)。表明酵素组促进小鼠碳粒廓清的能力明显高于其它各组，即明显提高小鼠的非特异性免疫功能，见表11。
表11 各组小鼠碳廓清能力比较
| 组别 | 动物数(只) | 廓清指数 |
| 空白对照组 | 10 | 5.26±1.02 |
| 牛樟芝药材组 | 10 | 6.01±0.22 |
| 牛樟芝酵素组 | 10 | 7.8±0.43*△ |
注：与对照组比较，*p＜0.05；与牛樟芝药材组比较△p＜0.05
2.3.3迟发型变态反应测定结果
与空白对照组比较，牛樟芝药材组和牛樟芝酵素组小鼠左右耳廓差重明显缩小(P＜0.05，P＜0.01)；与牛樟芝药材组比较，牛樟芝酵素组小鼠左右耳廓差重明显缩小(P＜0.05)，见表12。结果显示牛樟芝药材及牛樟芝酵素组均能促进小鼠迟发型变态反应，牛樟芝酵素组效果最优。
表12 左右耳廓重量之差比较
| 组别 | 动物数(只) | 耳廓增重(mg) |
| 空白对照组 | 10 | 1.77±1.02 |
| 牛樟芝药材组 | 10 | 1.01±0.31* |
| 牛樟芝酵素组 | 10 | 0.61±0.25**△ |
注：与对照组比较，*p＜0.05，*p＜0.05；与牛樟芝药材组比较△p＜0.05
2.3.4血清IL－2含量比较
与空白对照组比较，牛樟芝药材组、牛樟芝酵素组血清IL-2含量明无明显差异(P＞0.05；P＞0.01)；与牛樟芝药材组比较，牛樟芝酵素组血清IL-2 含量明显增加(P＜0.05)，见表13。结果显示牛樟芝酵素组效果最优。
表13 血清IL-2含量比较
| 组别 | 动物数(只) | 血清IL-2含量(ng/ml) |
| 空白对照组 | 10 | 12.34±3.75 |
| 牛樟芝药材组 | 10 | 15.82±0.93* |
| 牛樟芝酵素组 | 10 | 17.94±2.17*△ |
注：与对照组比较，*p＜0.05；与牛樟芝药材组比较△p＜0.05
2.4结论
本发明制得的牛樟芝酵素，能显著增强小鼠的免疫能力，效果也明显优于牛樟芝药材。
综上，本发明方法制备得到了牛樟芝酵素，其口感优良，抗氧化作用强，可以提高机体免疫力，且显著优于传统的牛樟芝药材，可用于制备具有抗氧化作用和提高机体免疫力的药品、食品或者保健食品，应用前景优良。
Claims (10)
1.一种牛樟芝酵素的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取牛樟芝，加入1～4倍量水，浸泡10～30分钟，破碎打浆，得浆液，果胶酶酶解，分离取汁，灭菌，得酶解液；
(2)在步骤(1)所得酶解液中，按重量比0.05～0.15％加入酵母菌，在温度为20～30℃的条件下发酵12～36小时，得药液；再在药液中，按重量比2～6％加入乳酸菌，然后在温度为30～40℃的条件下发酵12～60小时，得原液；
(3)取步骤(2)所得原液，冷冻干燥，粉碎，即可。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述牛樟芝是牛樟芝Antrodia camphorata的干燥体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，加入4倍量的水；
或者，步骤(1)中，所述灭菌的方式是煮沸10分钟。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述果胶酶酶解的方法是：调解浆液pH至3～4，在45～50℃条件下，按重量比加入0.2～0.5％的果胶酶，酶解2～4小时；优选地，所述分离取汁的分离方法是过滤。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述酵母菌为葡萄酒·果酒专用酵母RW：或者，步骤(2)中，所述乳酸菌是保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌中一种或数种混合菌。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述乳酸菌是保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌中一种或数种混合菌；或者，所述酵母菌按照重量比0.1％的比例加入；或者，所述酵母菌发酵的温度为20～28℃，优选28℃；或者，所述酵母菌发酵的发酵时间可以为24～36h，优选24h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述乳酸菌发酵的接种量为优选3～6％，最优选4％；或者，所述乳酸菌发酵的发酵时间是30～60h，最优选36h；或者，所述乳酸菌发酵的发酵温度是35～40℃，优选35℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述冷冻干燥的方法是-12～-36℃低温预冷冻12-24小时，再在真空度20-30pa、温度20-30℃条件下干燥24-48小时。
9.根据权利要求1～8任意一项所述方法制备得到的牛樟芝酵素。
10.权利要求9所述的牛樟芝酵素在制备抗氧化或者提高免疫力的药品、食品或者保健食品中的用途。
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