CN107130059A - 一种新型的21种人乳头瘤病毒亚型分型试剂盒和方法 - Google Patents

一种新型的21种人乳头瘤病毒亚型分型试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种能够通过数列组合与纳米金探针法检测方法相结合、实现以较少的检测反应管数区分更多的HPV亚型的试剂盒和方法。通过一种特定的数列组合，实现以6个检测管区分21种分型人乳头瘤病毒亚型。本发明将这种数学排列组合算法与分子诊断技术相结合，在不增加检测反应通量的情况下，实现以最少的反应管数区分更多的人乳头瘤病毒亚型，以降低检测操作难度和检测成本。

Description

一种新型的21种人乳头瘤病毒亚型分型试剂盒和方法
技术领域
本发明属于分子生物技术和基因检测领域，具体是一种用于21种人乳头瘤病毒亚型分型的试剂盒和方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papilloma virus,HPV)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。人乳头瘤病毒通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。
对于感染生殖道和肛门的人乳头瘤病毒，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。在有性生活史的女性中生殖道人乳头瘤病毒感染具有普遍性，据统计70％～80％的女性在其一生中会有至少一次的人乳头瘤病毒感染，但大多数感染为自限性，超过90％的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在6到24个月之间可以清除感染。而持续性的高危型人乳头瘤病毒感染则是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型人乳头瘤病毒DNA的存在，其中人乳头瘤病毒16型、18型、45型和31型感染占80％。低危型人乳头瘤病毒一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌。国家CFDA也已经颁布了人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型试剂技术审查指导原则，说明人乳头瘤病毒检测具有十分重要的临床意义。
根据HPV的同源性，已发现120多种型别。目前，市场上已经存在一些对人乳头瘤病毒进行检测的试剂盒，但是这些试剂盒通常是借助于荧光或者膜杂交的方式完成检测。
纳米金探针法区分不同亚型的病毒的步骤主要有以下三个阶段，而这三个阶段均是在同管闭管条件下完成的。第一阶段：模板扩增，通过引物对、扩增酶的参与，实现对目标模板的高灵敏扩增；第二阶段：通过探针和内切酶的参与，实现对目标模板向信号分子的的高效率转化；第三阶段：通过纳米金探针实现对信号分子的高分辨识别。但由于涉及到多种型别的区分，检测时复杂，耗时耗力。
目前，市场上尚没有将数学排列组合的算法与纳米金探针法检测方法相结合的人乳头瘤病毒分型方法，只需要普通的PCR循环仪器就能以较少的管数分型更多的人乳头瘤病毒亚型数，如以7管检测反应实现21种亚型的人乳头瘤病毒分型。
发明内容
基于此，本发明的目的提供一种21种HPV亚型的分型试剂盒和分型方法，其为将数学排列组合的算法与纳米金探针法检测方法相结合，在无需增加通量的情况下、实现以较少的检测反应管数区分21种的HPV亚型。
实现以上目的的技术方案如下。
一种21种HPV亚型的分型试剂盒，包括以下至少6个检测管，其中，
第一管包含有对应的检测引物和针对6种型号的探针；
第二管包含有对应的检测引物和针对6种型号的检测探针，第二管中所针对的探针的型号只有一种与第一管中的型号相同；
第三管包含有对应的检测引物和针对6种型号的探针，第三管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同；
第四管包含有对应的检测引物和针对6种型号的检测探针，第四管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同；
第五管包含有对应的检测引物和针对6种型号的检测探针，第五管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一或两种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同；
第六管包含有对应的检测引物和针对6种型号的检测探针，第六管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同，只有一种与第五管中的型号相同。
在其中一个实施例中，还包括有对照管，第七管，所述第七管包含对应的检测引物和针对阳性对照的检测探针。
在其中一个实施例中，所述21种HPV亚型为6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58、59、66、68、81、82、和83。
在其中一个实施例中，所述第一管包含11、16、31、35、59、68的检测探针；第二管包含6、16、52、53、56、68的检测探针；第三管包含31、33、45、52、58、81的检测针；第四管包含35、39、42、53、58、83的检测探针；第五管包含18、39、43、45、56、68的检测探针；第六管包含18、33、59、66、82、83的检测探针；第七管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针；
或
所述第一管包含18、33、56、83、59、68的检测探针；第二管包含31、39、42、43、82、68的检测探针；第三管包含16、35、43、53、59、66的检测针；第四管包含6、35、42、45、56、58的检测探针；第五管包含18、39、52、53、58、81的检测探针；第六管包含6、11、31、33、66、81的检测探针；第七管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针。
本发明具有以下有益效果：
采用本发明中人乳头瘤方法实现了不同学科的交叉，将数学排列组合的数学模型与体外诊断方法相结合实现高灵敏、低成本且简便的人乳头瘤病毒分型检测。不仅整个检测无需使用荧光探针，试剂存放无需避光，不必担心荧光衰减的问题，因此存放条件更加稳定。
本发明所述分型试剂盒采用的数学排列组合理论可为21种人乳头瘤病毒亚型分型提供很多种实现检测的方式，因此为人乳头瘤病毒分型检测提供了很多种后备检测方案。
利用本发明中的分型方法和分型试剂盒能分型能够在不增加检测反应通量的情况下，实现以较少的检测反应管数分21种人乳头瘤病毒亚型，降低了操作的复杂度和检测成本。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。
图1是本实施例1中21种HPV亚型的分型试剂盒各管中亚型分布的示意图。
图2是实施例2中7管检测反应区分21乳头瘤病毒亚型的检测特异性结果。
图3是实施例3中7管检测反应区分21种人乳头瘤病毒亚型的检测灵敏度结果。
图4是实施例4中7管检测反应区分21种人乳头瘤病毒亚型的检测结果。
图5实施例5中7管检测反应区分21种人乳头瘤病毒亚型组合方式。
图6是实施例5中7管检测反应区分21种人乳头瘤病毒亚型的检测样本结果。
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
本发明所述的一种新型人乳头瘤病毒亚型分型方法，通过一种特定的数列组合，实现以最少的管数尽可能多的分型人乳头瘤病毒亚型。借助于一种定性的纳米金探针法检测方法，将这种数学排列组合算法与分子诊断技术相结合，在不增加检测反应通量的情况下，实现以最少的反应管数区分更多的人乳头瘤病毒亚型，以降低检测操作难度和检测成本。这一方式在分型数量越多时所起到的作用就越显著。
以7管区分21亚型的人乳头瘤病毒为例，对本发明的检测原理进行描述。对于待检测的21亚型人乳头瘤病毒，其中，人乳头瘤病毒亚型可以是以下亚型6、11、16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82、40、42、43、54、61、70、72、81、55、62、64、67、69、71、73、83、84中的任意21种，以下实施例选择其中6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58、59、66、68、81、82、83等21种亚型。
实施例1 21种HPV亚型的分型试剂盒
一种21种HPV亚型的分型试剂盒，包括有以下6个检测管和1个对照管，其中，
第一管包含有6种型号的检测引物和探针，具体为包含11、16、31、35、59、68的检测引物和探针；
第二管包含有6种型号的检测引物和探针，第二管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，具体为第二管包含6、16、52、53、56、68的检测引物和探针；
第三管包含有6种型号的检测引物和探针，第三管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，具体地，第三管包含31、33、45、52、58、81的检测引物和探针；
第四管包含有6种型号的检测引物和探针，第四管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，具体为第四管包含35、39、42、53、58、83的检测引物和探针
第五管包含有6种型号的检测引物和探针，第五管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一或两种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同，具体为第五管包含18、39、43、45、56、68的检测引物和探针
第六管包含有6种型号的检测引物和探针，第六管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同，具体为第六管包含18、33、59、66、82、83的检测引物和探针；
第七管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针，针对样本中的β-actin基因模板。
所述七管检测引物和6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58、59、66、68、81、82、83等21种亚型的检测探针如下：
名称序列(5’→3’)
管1引物组合
F1 ACTGTGGTAGATACCACMCGYAGTACMAAYATGWC SEQ ID NO.1
R1 CATAATTGAAAAATAAAYTGTAAATCRWAYTCYTC SEQ ID NO.2
管2引物组合
F2 ACTGTGGTAGATACCACCCGTAGTACYAACWTKAC SEQ ID NO.3
R2 CATAATTGAAAAATAAATTGYAMATCATAYTCYTC SEQ ID NO.4
管3引物组合
F3 ACTGTGGTAGATACCACYMGWAGTACWAAYTTAAC SEQ ID NO.5
R3 CATAATTGAAAAATAAAYTGYARWTCATAYTCTTC SEQ ID NO.6
管4引物组合
F4 ACTGTGGTAGATACCACYAGRARYACHAACATGAC SEQ ID NO.7
R4 CATAATTGAAAAATAAAYTGTARTTCATATTCCTC SEQ ID NO.8
管5引物组合
F5 ACTGTGGTAGATACCACTCSCAGYACCAATYTWWC SEQ ID NO.9
R5 CATAATTGAAAAATAAAYTGCAAATCAWATTCCTC SEQ ID NO.10
管6引物组合
F6 ACTGTGGTAGATACCACYAGAAGCACYAATTTTWC SEQ ID NO.11
R6 CATAATTGAAAAATAAACTGWAAATCAWAYTCYTC SEQ ID NO.12
管7引物组合
F7 CTG CT GCT ATG CCT CAT；SEQ ID NO.13
R7 TAG AGG ACA AAC GGG CAA CAT；SEQ ID NO.14。
亚型探针
人乳头瘤分型分管检测方式还受到各分型的引物探针本身相互干扰的影响，检测过程中需要考虑到实际分型检测中的试剂干扰，通过本发明所设计的探针和引物，可以实现6管检测管对21种人乳头瘤病毒亚型分型。
实施例2实施例1所述21种HPV亚型的分型试剂盒七管检测反应区分21种人乳头瘤病毒亚型的检测特异性
本实施例中分别采用实施例1中的引物和探针配制反应液，总体积为20μL，每样本检测分为7管进行，每管的检测组分分别为：1μM引物、1μM探针和Hairpin probe、1μL AuNP-1和AuNP-2、0.5U Taq DNA聚合酶，2U内切酶A，0.2mM dNTP，分别向该体系中加入对应人乳头瘤病毒亚型的待测靶标分子，其浓度为104拷贝，最后一管加入β-actin片段，反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
本发明方法检测利用了一种对设施条件要求低、结果判读简单、成本低廉的新型体外诊断方法(纳米金可视化检测方法)，将数学排列组合的数学模型与体外诊断方法相结合，实现了高灵敏、低成本、闭管且简便的人乳头瘤病毒分型检测。
反应结束后拍照，结果示于图2中。图2的结果显示，管1中加入了18、33、56、83、59、68的检测探针，该体系同时检测21种亚型的靶标分子，结果仅有18、33、56、83、59、68亚型呈阳性；管2中加入了31、39、42、43、82、68的检测探针，该体系同时检测21种亚型的靶标分子，结果仅有31、39、42、43、82、68亚型呈阳性；管3中加入了16、35、43、53、59、66的检测探针，该体系同时检测21种亚型的靶标分子，结果仅有16、35、43、53、59、66亚型呈阳性；管4中加入了6、35、42、45、56、58的检测探针，该体系同时检测21种亚型的靶标分子，结果仅有6、35、42、45、56、58亚型呈阳性；管5中加入了18、39、52、53、58、81的检测探针，该体系同时检测21种亚型的靶标分子，结果仅有18、39、52、53、58、81亚型呈阳性；管6中加入了6、11、31、33、66、81的检测探针，该体系同时检测21种亚型的靶标分子，结果仅有6、11、31、33、66、81亚型呈阳性；管7中加入了β-actin的检测引物和探针，该体系同时检测β-actin基因的靶标分子，结果均呈阳性。本发明试剂盒7管检测反应结果均与预期相符，这表明能够特异性的检测出对应的人乳头瘤病毒亚型，表明检测特异性良好。
实施例3七管检测反应区分21种人乳头瘤病毒亚型的检测灵敏度
本实施例中分别采用实施例1中的引物和探针配制反应液，总体积为20μL，每样本检测分为7管进行，每管的检测组分分别为：1μM引物、1μM探针和Hairpin probe、1μL AuNP-1和AuNP-2、0.5U Taq DNA聚合酶，2U内切酶A，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入105、104、103、102、10、1及0拷贝的不同亚型的待测靶分子，管1分别加入18、33、56、83、59、68亚型不同浓度的模板分子；管2分别加入31、39、42、43、82、68亚型不同浓度的模板分子；管3分别加入16、35、43、53、59、66亚型不同浓度的模板分子；管4分别加入6、35、42、45、56、58亚型不同浓度的模板分子；管5分别加入18、39、52、53、58、81亚型不同浓度的模板分子；管6分别加入6、11、31、33、66、81亚型不同浓度的模板分子。反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果示于图3中。图3的结果显示本发明试剂盒检测人乳头瘤病毒亚型的检测灵敏度，检测灵敏度可达到100-1000拷贝之间。
实施例4七管检测反应区分21种人乳头瘤病毒亚型的检测临床样本结果
本实施例中分别采用实施例1中的引物和探针配制反应液，总体积为20μL，每样本检测分为7管进行，每管的检测组分分别为：1μM引物、1μM探针和Hairpin probe、1μL AuNP-1和AuNP-2、0.5U Taq DNA聚合酶，2U内切酶A，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入不同亚型的待测样本，其浓度为104拷贝，最后一管加入β-actin片段，反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果示于图4中。图4的结果表明本发明试剂盒能够通过7管检测反应区分待检样本中21种人乳头瘤病毒亚型。
实施例5七管检测反应区分21种人乳头瘤病毒亚型的区别于实施例1的组合方式及检测样本结果
本实施例中举例了另一种组合方式，如图5所示。
所述第一管包含18、33、56、83、59、68的检测探针；第二管包含31、39、42、43、82、68的检测探针；第三管包含16、35、43、53、59、66的检测针；第四管包含6、35、42、45、56、58的检测探针；第五管包含18、39、52、53、58、81的检测探针；第六管包含6、11、31、33、66、81的检测探针；第七管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针。具体参见图5。
所述七管检测引物和6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58、59、66、68、81、82、83等21种亚型的检测探针与是实施例1相同。
本实施例中分别采用实施例1中的引物和探针配制反应液，总体积为20μL，按照图5的组合方式，每样本检测分为7管进行，每管的检测组分分别为：1μM引物、1μM探针和Hairpin probe、1μL AuNP-1和AuNP-2、0.5U Taq DNA聚合酶，2U内切酶A，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入不同亚型的待测样本，其浓度为104拷贝，反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果示于图6中。图6的结果表明本发明试剂盒能够通过7管检测反应区分待检样本中21种人乳头瘤病毒亚型。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市宝创生物技术有限公司
<120> 一种新型的21种人乳头瘤病毒亚型分型试剂盒和方法
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cataattgaa aaataaactg waaatcaway tcytc 35
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctgctgctat gcctcat 17
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tagaggacaa acgggcaaca t 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgcgccgagg cattatgtgc atcc 24
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgcgccgagg cactatgtgc atc 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgcgccgagg cattatgtgc tgcc 24
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgcgccgagg caatatgtgc ttcta 25
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cgcgccgagg ctgtgtgtgc 20
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cgcgccgagg ctttatgcac acaagta 27
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgcgccgagg ctgtgtgttc t 21
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgcgccgagg ccttatctac ctctata 27
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cgcgccgagg ctttgtgtgc 20
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cgcgccgagg cgttatgtgc ct 22
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cgcgccgagg cattatgtgc ctct 24
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cgcgccgagg ctttatgtgc tga 23
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cgcgccgagg ctctttctgc aa 22
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cgcgccgagg ctattagtac tgctaca 27
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cgcgccgagg cattatgcac tgaagtaa 28
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cgcgccgagg ctgtgtgtgc tt 22
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cgcgccgagg ctattaatgc agctaa 26
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cgcgccgagg ctttgtctac tactactg 28
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
cgcgccgagg ctatttgcac agct 24
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
cgcgccgagg ccattagcac t 21
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cgcgccgagg ctatttcagc tgc 23
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cgcgccgagg acttcttggt tgttc 25
<210> 37
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gtggtactgc actcgtctcg gttttccgag acgagtcctc ggcgcgaata ttgat 55
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
aaaaaaaaat gattatc 17
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ccacaagaca aaaaaaa 17

Claims (10)

1.一种21种HPV亚型的分型试剂盒，其特在在于，包括以下至少6个检测管，其中，
第一管包含有对应的检测引物和针对6种型号的探针；
第二管包含有对应检测引物和针对6种型号的检测探针，第二管中所针对的探针的型号只有一种与第一管中的型号相同；
第三管包含有对应的检测引物和针对6种型号的探针，第三管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同；
第四管包含有对应的检测引物和针对6种型号的检测探针，第四管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同；
第五管包含有对应的检测引物和针对6种型号的检测探针，第五管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一或两种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同；
第六管包含对应的检测引物和针对6种型号的检测探针，第六管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一或两种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同，只有一种与第五管中的型号相同。
2.根据权利要求1所述的21种HPV亚型的分型试剂盒，其特在在于，
还包括有第七管，所述第七管包含有对应的检测引物和针对阳性对照的检测探针。
3.根据权利要求1所述的21种HPV亚型的分型试剂盒，其特在在于，
所述21种HPV亚型为6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58、59、66、68、81、82、和83。
4.根据权利要求3所述的21种HPV亚型的分型试剂盒，其特在在于，
所述第一管包含11、16、31、35、59、68的检测探针；第二管包含6、16、52、53、56、68的检测探针；第三管包含31、33、45、52、58、81的检测针；第四管包含35、39、42、53、58、83的检测探针；第五管包含18、39、43、45、56、68的检测探针；第六管包含18、33、59、66、82、83的检测探针；第七管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针；或
所述第一管包含18、33、56、83、59、68的检测探针；第二管包含31、39、42、43、82、68的检测探针；第三管包含16、35、43、53、59、66的检测针；第四管包含6、35、42、45、56、58的检测探针；第五管包含18、39、52、53、58、81的检测探针；第六管包含6、11、31、33、66、81的检测探针；第七管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针。
5.根据权利要求4所述的21种HPV亚型的分型试剂盒，其特在在于，
针对HPV亚型的检测探针为
针对6型的检测探针为SEQ ID NO.15；
针对11型的检测探针为SEQ ID NO.16；
针对16型的检测探针为SEQ ID NO.17；
针对18型的检测探针为SEQ ID NO.18；
针对31型的检测探针为SEQ ID NO.19；
针对33型的检测探针为SEQ ID NO.20；
针对35型的引检测探针为SEQ ID NO.21；
针对39型的检测探针为SEQ ID NO.22；
针对42型的检测探针为SEQ ID NO.23；
针对43型的检测探针为SEQ ID NO.24；
针对45型的检测探针为SEQ ID NO.25；
针对52型的检测探针为SEQ ID NO.26；
针对53型的检测探针为SEQ ID NO.27；
针对56型的检测探针为SEQ ID NO.28；
针对58型的检测探针为SEQ ID NO.29；
针对59型的检测探针为SEQ ID NO.30；
针对66型的检测探针为SEQ ID NO.31；
针对68型的检测探针为SEQ ID NO.32；
针对81型的检测探针为SEQ ID NO.33；
针对82型的检测探针为SEQ ID NO.34；
针对83型的检测探针为SEQ ID NO.35；
针对β-actin的检测探针为SEQ ID NO.36。
6.根据权利要求3-5任一项所述的21种HPV亚型的分型试剂盒，其特在在于，所述第一管的检测引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
所述第二管的检测引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
所述第三管的检测引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
所述第四管的检测引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
所述第五管的检测引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；
所述第六管的检测引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；
所述第七管的检测引物为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
7.一种21种HPV亚型的分型方法，其特在在于，包括以下步骤：
设定以下至少6个检测管，其中，
第一管包含有6种型号的检测引物和探针；
第二管包含有6种型号的检测引物和探针，第二管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同；
第三管包含有6种型号的检测引物和探针，第三管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同；
第四管包含有6种型号的检测引物和探针，第四管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同；
第五管包含有6种型号的检测引物和探针，第五管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一或两种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同；
第六管包含有6种型号的检测引物和探针，第六管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一或两种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同，只有一种与第五管中的型号相同；
每管加入有检测引物和相应型号的探针以及金标记通用探针，进行扩增反应。
8.根据权利要求7所述的21种HPV亚型的分型方法，其特在在于，
还包括有第七管，所述第七管包含有阳性对照的检测引物和探针。
9.根据权利要求8所述的21种HPV亚型的分型方法，其特在在于，
所述21种HPV亚型为6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58、59、66、68、81、82、和83；所述第一管包含11、16、31、35、59、68的检测引物和探针；第二管包含6、16、52、53、56、68的检测引物和探针；第三管包含31、33、45、52、58、81的检测引物和探针；第四管包含35、39、42、53、58、83的检测引物和探针；第五管包含18、39、43、45、56、68的检测引物和探针；第六管包含18、33、59、66、82、83的检测引物和探针；第七管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针；或
所述第一管包含18、33、56、83、59、68的检测探针；第二管包含31、39、42、43、82、68的检测探针；第三管包含16、35、43、53、59、66的检测针；第四管包含6、35、42、45、56、58的检测探针；第五管包含18、39、52、53、58、81的检测探针；第六管包含6、11、31、33、66、81的检测探针；第七管包含阳性对照，为β-actin的检测引物和探针。
10.根据权利要求9所述的21种HPV亚型的分型方法，其特在在于，
针对HPV亚型的检测探针为：
针对6型的检测探针为SEQ ID NO.15；
针对11型的检测探针为SEQ ID NO.16；
针对16型的检测探针为SEQ ID NO.17；
针对18型的检测探针为SEQ ID NO.18；
针对31型的检测探针为SEQ ID NO.19；
针对33型的检测探针为SEQ ID NO.20；
针对35型的引检测探针为SEQ ID NO.21；
针对39型的检测探针为SEQ ID NO.22；
针对42型的检测探针为SEQ ID NO.23；
针对43型的检测探针为SEQ ID NO.24；
针对45型的检测探针为SEQ ID NO.25；
针对52型的检测探针为SEQ ID NO.26；
针对53型的检测探针为SEQ ID NO.27；
针对56型的检测探针为SEQ ID NO.28；
针对58型的检测探针为SEQ ID NO.29；
针对59型的检测探针为SEQ ID NO.30；
针对66型的检测探针为SEQ ID NO.31；
针对68型的检测探针为SEQ ID NO.32；
针对81型的检测探针为SEQ ID NO.33；
针对82型的检测探针为SEQ ID NO.34；
针对83型的检测探针为SEQ ID NO.35；
针对β-actin的检测探针为SEQ ID NO.36；
所述第一管的检测引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
所述第二管的检测引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
所述第三管的检测引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
所述第四管的检测引物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
所述第五管的检测引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；
所述第六管的检测引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；
所述第七管的检测引物为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
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