CN107049907A - 燕窝的胰酶酶解物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明的胶原产生促进剂以燕窝的酶解物作为有效成分。根据本发明，提供了可以有效率地生产、并且安全性高、优异的I型胶原的产生促进剂，以及包含该I型胶原的产生促进剂的外用剂和化妆品。

Description

燕窝的胰酶酶解物的用途

本申请是中国专利申请201080028227.7的分案申请，原申请的申请日是2010年6月21日，发明名称是“胶原产生促进剂、包含该胶原产生促进剂的皮肤外用组合物和化妆品”。

相关申请的参照

本申请基于先提出的日本专利申请特愿2009-148754号(申请日：2009年6月23日)，并主张其优先权的利益，其公开内容整体通过参照并入本文中。

技术领域

本发明涉及以燕窝的酶解物作为有效成分的胶原产生促进剂。更具体而言，本发明涉及促进皮肤真皮成纤维细胞中的I型胶原产生的胶原产生促进剂。此外，本发明涉及包含作为其有效成分的燕窝的酶解物的皮肤外用组合物和化妆品。

背景技术

肌肤粗糙和/或皱纹、肌肤的松弛、弹性的降低等肌肤问题特别是对于女性而言是重要的关心的事情。认为这些肌肤问题通常是由环境因素、伴随老化等年龄增长的因素、以及压力等心理因素等引起的。特别是，可以说由伴随近年来的紫外线的增大、空调的大量使用等的生活环境的干燥化等引起的对肌肤带来不良影响的环境因素正在增大。

皮肤组织包括表皮、真皮、皮下组织。在真皮中大量地包含胶原、透明质酸，它们与皮肤的保水性、弹性密切相关。已知真皮中存在的真皮成纤维细胞产生胶原、透明质酸。

一般认为胶原在人的生物体内存在的蛋白质中约占30％，其70％存在于真皮中。作为存在于真皮的胶原，包含I型胶原、III型胶原，但主要是I型胶原。

以往，为了提高肌肤的弹性和/或光泽、预防改善皱纹，多采用以外用的方式使用配合了胶原的化妆品，向皮肤直接补充胶原的方法。然而，在以外用的方式补充胶原的情况下，由于难以使皮肤真皮中的胶原量增加，因此对于提高肌肤的弹性和/或光泽、预防改善皱纹而言，不能说一定是充分的。

已知如果皮肤暴露于包含紫外线的光中，则占据真皮的细胞外基质的大部分的胶原显著地减少，发生其纤维束的散乱。因此，使真皮的胶原量增加对于皱纹的改善、防止等是有用的(文献1(“機能性化粧品素材の開発のための実験法(用于开发功能性化妆品原材料的实验法)”(芋皮玄尔主编)，2007年发行，シーエムシー出版，第45～47页))。此外，在该文献中显示出，通过中波紫外线(UVB)的照射，真皮成纤维细胞的胶原合成大幅度降低。在该文献中，作为I型胶原合成促进剂的例子，例示了维生素C衍生物、乳清成分等。

另一方面，在文献2(Akiko Kojima-Yuasa,et al.,Fragrance Journal,April,2009,No.346(Vol.37,No.4),pp.103-)中显示出，抑制胶原产生能力的降低对于QOL的提高改善是有用的，皮肤中胶原量的降低成为皱纹、松弛等的原因。

作为I型胶原的产生促进剂，迄今为止，大量地报告了着眼于来源于特定的植物的成分并利用了该成分的I型胶原的产生促进剂(例如，日本特开2008-105984号公报、WO2004/085429)。

燕窝是穴燕(アナツバメ)使自己的唾液成为丝状而作成的巢，作为其成分，已知大量包含糖蛋白，几乎不含脂质。以往，在中国菜的食用原材料、中药的原料等中使用燕窝。近年来，还开发了将燕窝用作原料的健康食品等，但仅仅知道极少数对外用剂、化妆品那样的外用用途的适用例。

在日本特开2003-95961号公报中，公开了使用燕窝的酶解物的口服用美肌促进剂。然而，在该文献中，只不过仅显示了口服用途，关于在外用用途中的利用可能性既未记载也未暗示。此外，这里的效果是提高肌肤的湿润感、获得纹理细的肌肤，关于伴有肌肤的弹性和/或光泽的提高、皱纹的改善的I型胶原的产生促进能力，没有任何记载。

在WO99/022709中，公开了包含燕窝的含水溶剂提取物、特别是热水提取物的化妆品。该化妆品可以用于皮肤护理用途，是在外用用途中使用的化妆品。此外，在该文献中，还公开了燕窝的含水提取物显示皮肤细胞中的胶原合成促进效果。然而，这里所使用的提取物是将燕窝进行热水提取，除去了固体成分后的提取物，与将燕窝整体进行酶处理而直接使用的燕窝酶解物明显不同。此外，关于效果，在本发明人的考虑限度，认为有改善的余地。

发明内容

本发明人这次发现燕窝的酶解物具有皮肤真皮成纤维细胞中的I型胶原的优异的产生促进效果。该效果比在燕窝的热水提取物中表现的效果更显著，此外，在进一步进行了酶解的酶解物中，该效果更加显著。本发明是基于这些认识来完成的。

因此，本发明的目的是提供可以有效率地生产、并且安全性高、优异的I型胶原的产生促进剂，以及包含该I型胶原的产生促进剂的外用剂和化妆品。

本发明的胶原产生促进剂以燕窝的酶解物作为有效成分。

根据本发明的一个优选方式，上述酶解物是蛋白酶酶解物。

根据本发明的一个更优选方式，上述酶解物的分子量为70～200,000。

根据本发明的一个进一步优选方式，上述酶解物的平均分子量为300～15,000。

根据本发明的优选方式，本发明的胶原产生促进剂用于促进皮肤真皮成纤维细胞中的I型胶原产生。

根据本发明的其它方式，提供了包含本发明的胶原产生促进剂的皮肤外用组合物。该组合物优选用于皮肤护理，更优选用于提高肌肤的弹性和光泽、以及防止或改善皱纹。

根据本发明的其它更优选方式，本发明的皮肤外用组合物是化妆品。

根据本发明的其它方式，提供了用于制造包括人的哺乳动物的皮肤的胶原产生促进剂的燕窝的酶解物的应用。根据本发明的另一个方式，提供了用于制造皮肤护理用的皮肤外用组合物的燕窝的酶解物的应用。

根据本发明的其它方式，提供了皮肤中的胶原的产生促进方法，其包含将有效量的作为本发明的有效成分的酶解物应用于包括人的哺乳动物的皮肤。根据本发明的另一个方式，提供了皮肤护理方法，其包含将有效量的本发明的有效成分应用于包括人的哺乳动物的皮肤。同样地，还提供了使肌肤的弹性和光泽提高、防止或改善皱纹的方法，其包含将有效量的本发明的有效成分应用于包括人的哺乳动物的皮肤。

根据本发明，通过将燕窝的酶解物用作有效成分，与以往相比，可以显著地促进人皮肤真皮成纤维细胞的胶原的产生。此外，通过基于该真皮成纤维细胞的胶原的产生促进能力，将酶解物用于皮肤外用用途或化妆品用途，从而可以提高肌肤的弹性、提高肌肤的光泽、以及预防或减少皱纹。此外，可以在日晒后的肌肤中胶原合成降低了那样的状态的肌肤中促进胶原产生，从而提高肌肤的弹性和/或光泽、改善皱纹。这样，根据本发明，可以谋求消费者的QOL的提高。此外，由于所使用的酶解物使用作为食用原材料而众所周知的燕窝，因此安全性高，消费者也易于接受。此外，由于可以将燕窝直接进行酶处理来获得酶解物，因此可以有效率地制造，并且可以将制造成本也抑制得较低。

附图说明

图1是显示燕窝样品中的唾液酸量的测定结果的图。

图2是显示燕窝样品中的蛋白质量的测定结果的图。

图3是显示利用GPC-HPLC得到的燕窝酶解物1的测定结果的图。

图4是显示利用GPC-HPLC得到的燕窝酶解物2的测定结果的图。

图5是显示胶原的产生促进能力的测定结果的图。

具体实施方式

有效成分

关于本发明的胶原产生促进剂，如上所述，以燕窝的酶解物作为有效成分。

作为酶解物的原料的燕窝是穴燕使自己的唾液成为丝状而作成的巢，作为其成分，大量包含糖蛋白，几乎不包含脂质。这里，穴燕是指属于雨燕科(Apodidae)的金丝燕属(Collocalia)的燕类，可列举例如，雨燕科小灰腰金丝燕(Apodidae Collocalia francica)、雨燕科苔巢金丝燕(Apodidae Collocalia salangana)、雨燕科爪哇金丝燕(Apodidae Collocalia fuciphaga)、雨燕科灰腰金丝燕(Apodidae Collocalia inexpectata)、雨燕科褐腰金丝燕(Apodidae Collocalia vestita)、雨燕科白腹金丝燕(Apodidae Collocalia esculenta)、雨燕科大金丝燕(Apodidae Collocalia maximus)等。

在本发明中，燕窝可以使用市售品。在一般地市售的燕窝中，具有从仅除去毛、粪等污物并洗涤而得的燕窝到收集燕窝的碎料并反复漂白和洗涤而形成的燕窝等多个种类，但本发明所用的燕窝优选使用在前处理中没有进行过度的洗涤、漂白等的燕窝。

燕窝的酶解物是指应用酶反应将燕窝分解而得的物质，可以通过使用蛋白酶、包含蛋白酶的复合酶等进行分解来获得燕窝或其处理物。作为这里分解处理中使用的酶，优选为蛋白酶，更优选为胰酶。

通常可以通过首先实施加热杀菌处理，然后在水中进行酶处理来获得燕窝的酶解物。可以适当参考惯用的加热杀菌条件来设定杀菌处理的条件，还可以根据所使用的酶的种类、燕窝的状态来适当设定酶处理的条件。

如果列举更具体的例子，则可以如下调制燕窝的酶解物。

例如，向粉碎后的燕窝中添加其质量的10～50倍的水并使其溶胀，然后在60～130℃下加热杀菌处理5秒～30分钟。然后，直接添加适量的酶，在酶的最佳pH、最佳温度下进行酶反应0.5～48小时。酶反应结束之后，通过加热处理等使酶失活，过滤反应液而除去不溶物，从而可以获得燕窝的酶解物。此外，该酶解物可以根据需要干燥而粉末化。另外，在上述的各工序中，可以进行适当pH调整、脱色、脱臭等操作。

作为其它例子，在将燕窝的处理物酶解的情况下，向粉碎为粒径2mm以下、优选为150μm以下的燕窝中添加其质量的10～100倍的水，在1～60℃下静置或搅拌0.5～48小时使其溶胀，然后在60～130℃下加热杀菌处理5秒～30分钟，根据需要进行过滤，将所得的溶液与上述同样地进行酶处理，从而可以获得燕窝的酶解物。

在酶解物的调制法中，酶反应的时间越长，越促进蛋白质的分解，获得包含更低分子的蛋白质的酶解物。在本发明中，优选使酶反应时间为0.5～48小时左右，优选为3～36小时左右，更优选为约24小时左右，进一步进行了酶反应的酶解物。

这样获得的燕窝的酶解物的分子量优选为70～200,000，更优选为70～180,000。进一步优选分子量为70～150,000，进一步更优选为70～120,000。

此外，期望燕窝的酶解物的平均分子量(重均分子量)为300～100,000，优选为300～70,000。更优选的平均分子量为300～50,000，进一步优选为300～30,000，进一步更优选为300～20,000，特别优选为300～15,000。

皮肤外用组合物

本发明的胶原产生促进剂可以单独地直接使用，但也可以作为添加剂包含于化妆品、药品、准药品等各种皮肤外用组合物中，可以获得具有胶原产生促进效果的组合物。所得的组合物可以有效地用于皮肤护理，优选有效地用于提高肌肤的弹性和光泽、以及防止或改善皱纹。

作为本发明的有效成分的燕窝的酶解物具有人皮肤真皮成纤维细胞中的I型胶原的产生促进活性(后述的实施例的试验结果)。

因此，在本发明中，胶原的产生促进活性是指促进或改善人皮肤真皮的成纤维细胞的I型胶原的产生能力的作用，由此意味着可以增大人皮肤真皮中的胶原量。可以通过增加真皮的胶原量来获得皱纹的改善、防止效果、而且可以提高肌肤的弹性、提高肌肤的光泽是本领域技术人员众所周知的，这点在(例如，上述的文献(“機能性化粧品素材の開発のための実験法(用于开发功能性化妆品原材料的实验法)”(芋皮玄尔主编)，2007年发行，シーエムシー出版，第45～47页(非专利文献1))、文献(Akiko Kojima-Yuasa,et al.,Fragrance Journal,April,2009,No.346(Vol.37,No.4),pp.103-(非专利文献2))等中明确地显示出。因此，由于确认了本发明的有效成分具有真皮中的胶原产生促进活性，因此明确了本发明的有效成分在皮肤护理、优选在肌肤的弹性和光泽的提高、以及皱纹的防止或改善中是有效的。

另外，在本说明书中，肌肤的弹性和/或光泽、皱纹等肌肤或皮肤状态的“预防或改善”以包含该状态的调节、进行的延迟、缓和、预防发作、预防复发、抑制等的意思使用。

因此，如上所述，根据本发明的其它方式，提供了包含本发明的胶原产生促进剂的皮肤外用组合物。优选提供了皮肤外用组合物作为药品、准药品、或化妆品，更优选提供了皮肤外用组合物作为化妆品。

在本发明的皮肤外用组合物(特别是化妆品)中，作为有效成分的燕窝酶解物的含量(干物换算)没有特别地限制，根据组合物的形态不同而不同，但一般而言，作为固体成分，为0.001～20重量％的范围内，优选为0.005～5重量％的范围内，可以根据组合物的形态进行适当变更。

或者，本发明的皮肤外用组合物中的燕窝酶解物的含量(干物换算)优选以每日0.01mg以上、更优选为0.01mg～2mg、可以应用于每1平方cm的皮肤的方式包含。

只要本发明的皮肤外用组合物包含有效成分，并且不损害胶原的产生促进效果，则本发明的促进剂可以进一步包含其它任意成分。作为这样的任意成分，可列举例如，皮肤外用剂、化妆品中惯用的各种成分，例如，保湿剂、低级醇、多元醇、糖类、表面活性剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、抗氧化剂、防腐防菌剂、螯合剂、pH调节剂、香料、色素、紫外线吸收剂、紫外线散射剂、维生素类、氨基酸类、抗炎剂、水、肽、糖醇类、酶类、植物提取物类、抗氧化物质类、滑石、粘土、花粉、珍珠等。

这里，作为保湿剂，可列举例如，聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、丙二醇、山梨糖醇、透明质酸、硫酸软骨素等酸性粘多糖类、氨基酸、胶原、弹性蛋白等。

作为低级醇，可列举例如，乙醇、丙醇、异丙醇等。

作为多元醇，可列举例如，甘油、季戊四醇、二季戊四醇、乙二醇、丙二醇、聚丙二醇、1,3-丁二醇等。

作为糖类，可列举例如，葡萄糖、麦芽糖、乳糖、D-葡糖醛酸、蔗糖、D-山梨糖醇、失水山梨糖醇、纤维素、淀粉等糖类、寡糖类、多糖类和它们的衍生物等。

关于本发明的皮肤外用组合物，通过将包含燕窝酶解物的胶原产生促进剂和这些任意成分根据公知的方法适当配合进行调整，可以制成洗剂(lotion)、乳液、膏(cream)、保湿液、面膜剂、化妆水、洗面奶、爽身水、润体霜等各种化妆品中惯用的制品形态。本发明的皮肤外用组合物还可以用作粉底类、唇膏、眼影、腮红等彩妆化妆品，防晒用制品、防臭化妆品等药用化妆品，香波、护发素，发油等头发用化妆品，皮肤洗涤剂、浴用制剂的浴用化妆品等。

根据本发明的其它方式，如上所述，提供了用于制造包括人的哺乳动物的皮肤的胶原产生促进剂的燕窝的酶解物的应用。这里，皮肤中的胶原的产生促进优选促进皮肤真皮成纤维细胞中的I型胶原产生。

根据本发明的另一个方式，如上所述，提供了用于制造皮肤护理用的皮肤外用组合物的燕窝的酶解物的应用。这里，皮肤外用组合物优选用于提高肌肤的弹性和光泽、以及预防或改善皱纹。此外，皮肤外用组合物优选为化妆品。

根据本发明的其它方式，如上所述，提供了皮肤中的胶原的产生促进方法，其包含将有效量的作为本发明的有效成分的酶解物应用于包括人的哺乳动物的皮肤。另外，这里“有效量”是指，根据应用，在体内的期望区域内为对于能够发挥胶原的产生促进活性而言充分的量。此外，这里所谓的皮肤中的胶原的产生促进优选为促进皮肤真皮成纤维细胞中的I型胶原产生。

此外，根据本发明的另一个方式，提供了皮肤护理方法，其包含将有效量的本发明的有效成分应用于包括人的哺乳动物的皮肤。同样地，还提供了使肌肤的弹性和光泽提高、防止或改善皱纹的方法，其包含将有效量的本发明的有效成分应用于包括人的哺乳动物的皮肤。另外，这里“有效量”是指对于获得所需的效果而言充分的量。

另外，在本说明书中，使用了“约”和“左右”的值的表达意味着，为了达成设定该值的目的，包含本领域技术人员可以容许的值的变化。意味着例如，可以允许规定的值或范围的20％以内、优选为10％以内、更优选为5％以内的变化。

实施例

基于以下的例子具体地说明本发明，但本发明不限定于这些例子。

(1)燕窝样品的调制

(1-1)燕窝酶解物1

将市售的无漂白的燕窝用粉碎机进行粉碎，获得100目通过(粒径150μm以下)的燕窝粉末，向该燕窝粉末中添加约50倍量(质量)的水，在5℃下溶胀20小时，然后在121℃下加热杀菌处理15分钟。

冷却所得的处理液，然后调整pH，添加相对于燕窝粉末为2质量％的量的含有蛋白酶的酶(商品名“パンクレアチンF”，天野制药株式会社制)，在45℃下反应3小时。

将该酶反应液调整至pH7.0，然后在90℃下加热5分钟使酶失活，过滤，回收滤液。浓缩该滤液，然后冷冻干燥，获得“燕窝酶解物1”。

(1-2)燕窝酶解物2

除了使酶反应的时间为24小时以外，与上述(1-1)项的酶解物1同样地进行，获得“燕窝酶解物2”。

(1-3)燕窝热水提取物(比较例)

将市售的无漂白的燕窝(干燥物)40g用粉碎机进行粉碎，将该粉碎物添加至1000ml的蒸馏水中，在加热回流下进行提取处理2小时。加热回流后，静置，然后分离上清液并过滤，回收滤液。将残渣进一步与上述同样地添加至1000ml的蒸馏水中，在加热回流下进行再提取处理，然后将固体物质残渣通过过滤而除去，回收滤液。合并所得的滤液(提取液)，减压浓缩，冷冻干燥所得的浓缩物，获得黄白色的“燕窝热水提取物”(比较例)。

(2)燕窝样品的分析

如下测定所得的各燕窝样品(燕窝酶解物1、燕窝酶解物2和燕窝热水提取物)中的唾液酸量和蛋白质量。

关于唾液酸的量，在将各试料酸水解之后，采用高效液相色谱，作为游离N-乙酰神经氨酸进行测定。

关于蛋白质的量，使用基于Brad ford法的Bio Rad社的蛋白质测定试剂盒(Protein Assay Kit)测定。

结果如图1和图2所示。

接下来，为了测定燕窝酶解物1和燕窝酶解物2所包含的蛋白质的分子量及其分布，采用下述那样的条件利用GPC进行分析。

[HPLC的测定条件]

·柱：Shodex Asahipak GS320HQ(φ7.6×300mm)

·柱温度：35℃

·流动相：50mM CH₃COONH₃pH6.7

·流速：0.4ml/分钟

·试料进样量：10μl

·检测器：紫外分光检测器(在UV220nm下测定)

[使用的分子量标记]

·BSA MW 66,000

·Gly-gly MW 132.1

·Gly-gly-gly MW 189.17

·L-天冬氨酸MW133.1

·DL-天冬氨酸MW 150.1

·N-乙酰神经氨酸MW 309.3

测定结果如图3和图4所示。

此外，关于燕窝酶解物所包含的蛋白质的分子量，使用蛋白质印迹法进行评价。具体而言，首先，按照上述的测定法，确认燕窝酶解物中的蛋白质的量。使用SDS-PAGE，利用10～15％的聚丙烯酰胺分离来源于燕窝酶解物的蛋白质(100μg)。将展开于凝胶上的蛋白质转印至免疫印迹PVDF膜(聚偏二氟乙烯，由Bio-Lad Lab社获得)上。将PVDF膜在包含3％脱脂奶和0.1％吐温-20的PBS中封闭1小时，在视觉上判定。

另外，在蛋白质的分子量的评价时，还参考了公知文献(Guo,C.T.,Suzuki Y.,etal.,Antiviral Res.70,pp.140-146(2006)中显示的数据。

由这些结果可知，燕窝酶解物中所包含的蛋白质分子量在约70～120,000左右(另外根据评价条件，有时上限值为200,000左右)的范围内存在。

此外，由所得的结果可知，燕窝酶解物1中的蛋白质的平均分子量为约55,000。此外可知，燕窝酶解物2中的蛋白质的平均分子量为约33,000。

(3)胶原的产生促进能力的测定

使用含有0.5％小牛血清(FBS)的DMEM培养基(由SIGMA获得)，在96孔板上以2×10⁴个细胞的细胞密度接种正常人皮肤真皮成纤维细胞(KF-4109，由クラボウ社获得)。接种24小时之后，与含有规定浓度的各燕窝样品的含有0.5％FBS的DMEM培养基交换，再培养24小时。

另外，作为阳性对照(P.C.)，使用抗坏血酸磷酸镁(VC-PMg)。

培养后，回收培养基上清液，通过ELISA法测定上清液中的I型胶原量。另外，在ELISA法中，一抗使用抗人I型胶原抗体(兔)，二抗使用Histofine PO(兔)，以及显色剂使用2,2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，利用酶标仪测定405nm的吸光度。

通过将培养基中的I型胶原量除以全细胞的蛋白质量，作为每单位蛋白质量的I型胶原产生量来计算培养基中的I型胶原量。

结果如图5所示。

由结果可知，燕窝的酶解物显著地增加了人皮肤真皮成纤维细胞的I型胶原产生。

Claims (5)

1.燕窝的胰酶酶解物的用途，用于制造用来提高皮肤真皮的弹性的外用剂，其中所述酶解物的平均分子量为33000～55000。

2.权利要求1所述的用途，用来促进皮肤中胶原的产生。

3.权利要求2所述的用途，其中促进皮肤中胶原的产生是促进皮肤真皮成纤维细胞中I型胶原的产生。

4.权利要求1所述的用途，外用剂是化妆品。

5.权利要求1所述的用途，用来改善日晒后的肌肤的状态。