CN106918655B

CN106918655B - 一种远志uplc测定方法

Info

Publication number: CN106918655B
Application number: CN201511010555.5A
Authority: CN
Inventors: 夏忠庭; 刘筱筱; 何毅; 宋兆辉
Original assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: TIANJIN TASLY MODERN TCM RESOURCES CO Ltd
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2035-12-28
Also published as: CN106918655A

Abstract

本发明涉及一种远志UPLC测定方法，所述方法包括如下步骤：步骤1、对照品溶液制备：取西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、西伯利亚远志口山酮B、球腺糖A、远志口山酮Ⅲ、3,6'‑二芥子酰基蔗糖，甲醇定容制成混合对照品溶液；步骤2、供试品溶液制备：取远志药材含水低级醇提取后，滤过，得到供试品溶液；步骤3、将对照品溶液和供试品溶液分别注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中的有效成分含量。

Description

一种远志UPLC测定方法

技术领域：

本发明涉及一种中药材的检测方法，特别涉及一种远志UPLC测定方法

背景技术:

远志为远志科远志属植物远志Polygala.tenuifolia Willd.或卵叶远志Polygala.sibirica L.的干燥根，其味苦、辛、温，归心、肾、脾经，具有安神益智、祛痰、消肿之功效，用于心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸、神志恍惚等。市售远志药材品质参差不齐，polygalaxanthoneⅢ、3,6'-disinapoyl sucrose含量总体偏低，药材质量难以控制。近年来，针对远志质量评价等方面的研究也多为个别成分为指标的含量测定分析。姜勇等开展了远志指纹图谱研究，但所建立的HPLC指纹图谱检测时间为80min，耗时长，损耗试剂多，不利于高通量分析，同时存在共有峰数目较少、缺乏共有峰定性等问题。综上所述，建立一种全面、快速的远志药材质量评价方法很有必要。

本发明选取了有神经保护、抗抑郁等活性报道的6种成分(sibiricose A5、sibiricose A6、sibiricaxanthone B、glomeratose A、polygalaxanthoneⅢ、3,6'-disinapoyl sucrose)进行同时测定。同时，由于远志药材的化学成分复杂，仅以几种成分来控制药材质量较为片面，远志药材中其他成分同样有可能对药材质量产生影响。因此本发明采用指纹图谱进一步对远志质量进行表征和研究，并采用UPLC-Q-TOF质谱仪指认共有峰。本发明利用“指纹图谱+多成分定量”方法，对多个主产地的远志药材进行了较全面的快速质量分析，为临床合理使用提供更多科学依据。

发明内容：

本发明建立了一种远志药材超高效液相色谱(UPLC)多成分含量测定及指纹图谱建立方法。

本发明提供一种远志药材有效成分的含量检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、对照品溶液制备：取西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、西伯利亚远志口山酮B、球腺糖A、远志口山酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖，甲醇定容制成混合对照品溶液；

步骤2、供试品溶液制备：取远志药材含水低级醇提取后，滤过，得到供试品溶液；

步骤3、将对照品溶液和供试品溶液分别注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中的有效成分含量。

其中，步骤1所述混合对照品溶液，其中各组分的含量分别为：

每1ml含西伯利亚远志糖A5 35-40ug、西伯利亚远志糖A6 42-52ug、西伯利亚远志口山酮B20-26ug、球腺糖A 25-31ug、远志口山酮Ⅲ24-30ug、3,6'-二芥子酰基蔗糖234-286ug的混合对照品溶液，优选的，西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、西伯利亚远志口山酮B、球腺糖A、远志口山酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖的含量分别为39.8mg/L、47.7m g/L、23.9mg/L、28.2mg/L、27.4mg/L、263mg/L的混合对照品溶液。

其中，步骤2所述含水低级醇为甲醇或乙醇的水溶液。所述的提取方法包括回流法或超声波提取法。

优选步骤2供试品溶液配制方法如下：取远志药材用30-100％低级醇超声提取10-60分钟或回流提取2-3次每次1-1.5小时。其中的含水低级醇选自30％-100％甲醇或30％-100％乙醇溶液，优选30％-100％甲醇，最佳70％甲醇溶液超声提取30分钟。。

步骤3中所述的超高效液相色谱条件：UPLC色谱仪C18色谱柱、流动相酸水-乙腈溶液梯度洗脱、流速0.3-0.4mL/min、检测波长300-330nm、柱温25-35℃。

所述的梯度洗脱条件为0～1min，10％乙腈；1～2.5min，10％～14％乙腈；2.5～4min，14％～16％乙腈；4～9min，16％～25％乙腈；9～12min，25％乙腈；12～14min，25％～27％乙腈；14～16min，27％～30％乙腈；16～18min，30％～39.8％乙腈；18～21min，39.8％～40％乙腈；21～23min，40％～60％乙腈；23～24min，60％～100％乙腈；24～26min，100％～10％乙腈。

经过测定，所述远志药材中，西伯利亚远志糖A5含量0.4-1.7mg/g、西伯利亚远志糖A6含量0.4-1.6mg/g、西伯利亚远志口山酮B含量0.5-1.5mg/g、球腺糖A含量0.2-0.8mg/g、远志口山酮Ⅲ含量0.3-1.0mg/g、3,6'-二芥子酰基蔗糖含量1.9-6.9mg/g。

其中，步骤3、优选UPLC C18色谱柱为T3键合色谱柱，流速0.4mL/min、检测波长320nm、柱温30℃。

本发明进一步提供一种远志药材超高效液相指纹图谱建立方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

步骤1、供试品溶液制备：取多批次远志药材含水低级醇提取后，滤过，得到供试品溶液；

步骤2、将供试品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，对所有色谱图相似度评价得到含有37个共有峰的远志药材的参照指纹图谱

步骤3、采用质谱分析法；并对37个共有峰进行归属，鉴定出37个共有峰中的33个峰；

其中，超高效液相色谱的色谱条件如下：

UPLC色谱仪C18色谱柱、流动相酸水-乙腈溶液梯度洗脱、流速0.3-0.4mL/min、检测波长300-330nm、柱温25-35℃。

其中，所述的对共有峰进行归属，采用质谱分析法，其中质谱条件如下：采用电喷雾离子源ESI，负离子模式，质量扫描范围100-2000Da；毛细管电压为2.5-3kV；锥孔电压为10-50V；离子源温度为80-120℃；雾化温度为200-300℃；载气流速为400-1000L/h，碰撞能量(CE)40-100V,优选60-80V。

优选采用电喷雾离子源(ESI)，负离子MSE模式，雾化气体为高纯度氮气(N2)，碰撞气体为高纯度氩气(Ar)。质量扫描范围100～2000Da；毛细管电压为3kV；锥孔电压为40V；离子源温度为120℃；雾化温度为300℃；载气流速为800L/h，碰撞能量(CE)60～80V；采用亮氨酸-脑啡肽进行精确质量校正([M-H]-＝554.2615)。

其中，所述共有峰37个、相对保留时间及相对峰面积表1

表1 37个共有峰的相对保留时间和相对峰面积

其中，已经确认归属的共有峰33个，化学结构式、相对保留时间及相对峰面积结果见表2。

表2 基于UPLC-Q-TOF-MS^E的远志指纹图谱共有峰的归属

其中，步骤1供试品溶液配制方法中所述含水低级醇为甲醇或乙醇的水溶液。所述的提取方法包括回流法或超声波提取法。

优选取远志药材用30-100％低级醇超声提取10-60分钟或回流提取2-3次每次1-1.5小时。其中的含水低级醇选自30％-100％甲醇或30％-100％乙醇溶液，优选30％-100％甲醇，最佳70％甲醇溶液超声提取30分钟。

其中，步骤2所述的UPLC C18色谱柱为T3键合色谱柱，流速0.4mL/min、检测波长320nm、柱温30℃。

试验例

试验例一、指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器超高效液相色谱系统(Waters公司ACQUITY UPLC，包括真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、TUV检测器)，ACQUITY UPLC-Synapt G2 MS色谱-质谱联用仪(Waters公司)，电子天平(XS205，瑞士METTLER TOLEDO公司)，高速冷冻离心机(ST16R，美国Thermo公司)，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)，超声波清洗器(KQ-500DV，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2药品与试剂sibiricose A5(批号:AP0590，纯度98％)、sibiricose A6(批号：AP148S，纯度98％)、sibiricaxanthone B(批号AP046S，纯度98％)、glomeratose A(批号20150701，纯度98％)均购自天津一方科技有限公司，polygalaxanthoneⅢ(批号111850-201203，纯度95.7％)、3,6'-disinapoyl sucrose(批号111848-201303，纯度96.0％)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，甲酸(色谱纯，上海润捷公司)，超纯水(Milli-Q制备)。

2溶液制备

2.1对照品溶液制备分别取西伯利亚远志糖A5 sibiricose A5、西伯利亚远志糖A6 sibiricose A6、西伯利亚远志口山酮B sibiricaxanthone B、球腺糖A glomeratoseA、远志口山酮ⅢpolygalaxanthoneⅢ、3,6'-二芥子酰基蔗糖3,6'-disinapoyl sucrose对照品适量，精密称定，甲醇定容，制成质量浓度分别为每1ml含39.8mg/L、47.7mg/L、23.9mg/L、28.2mg/L、27.4mg/L、263mg/L的混合对照品贮备液，存贮于4℃冰箱中备用。

2.2供试品溶液制备样品干燥后粉碎，精密称定粉末(过三号筛)0.5g，置于25mL容量瓶中，加入30％-100％甲醇或30％-100％乙醇溶液20mL，超声提取30min(功率500W，频率40kHz)，放至室温，补足溶液稀释至刻度，摇匀，转移至离心管，4900r/min下高速离心10min，吸取上清液，0.22um微孔滤膜滤过即得。

3色谱条件及质谱条件

3.1色谱条件UPLC C18色谱柱(优选Waters ACQUITY UPLC T3，2.1mm×100mm，1.8μm色谱柱)。流动相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)：梯度洗脱条件为0～1min，10％B；1～2.5min，10％～14％B；2.5～4min，14％～16％B；4～9min，16％～25％B；9～12min，25％B；12～14min，25％～27％B；14～16min，27％～30％B；16～18min，30％～39.8％B；18～21min，39.8％～40％B；21～23min，40％～60％B；23～24min，60％～100％B；24～26min，100％～10％B。流速0.4mL/min；检测波长320nm；柱温30℃；进样量1μL。6种成分的理论塔板数均不低于6000，此色谱条件检测时间短，信息量丰富，亦用于指纹图谱的分析，对照品及样品图谱见图1。

3.2质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，负离子MSE模式，雾化气体为高纯度氮气(N2)，碰撞气体为高纯度氩气(Ar)。质量扫描范围100～2000Da；毛细管电压为3kV；锥孔电压为40V；离子源温度为120℃；雾化温度为300℃；载气流速为800L/h，碰撞能量(CE)60～80V；采用亮氨酸-脑啡肽进行精确质量校正([M-H]-＝554.2615)。

4指纹图谱

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对远志药材UPLC指纹图谱进行数据处理，确定共有峰37个，由于3,6'-disinapoyl sucrose在各批次远志中均有出现，分离度良好且峰面积较大，故选择3,6'-disinapoyl sucrose(10号峰)作为参照峰，以该参照峰计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，进行指纹图谱方法学考察。各图谱生成的参照图谱，其共有峰相对保留时间和相对峰面积见表3。

表3 37个共有峰的相对保留时间和相对峰面积

本发明依据对照品、文献质谱数据和色谱保留行为，对37个共有峰进行了鉴定归属，共鉴定出有33共有峰的化学式。其中1、2、4、5、6、10、15、32号峰采用对照品对照确定为sibiricose A5、sibiricose A6、sibiricaxanthone B、glomeratose A、polygalaxanthoneⅢ、3,6'-disinapoyl sucrose、tenuifoliside C、onjisaponin B。归属的33个共有峰包括18个糖酯类成分，12个皂苷类成分，以及3个双苯吡酮类成分，结果见表4。

表4 基于UPLC-Q-TOF-MSE的远志指纹图谱共有峰的归属

本发明的检测方法和指纹图谱的建立方法是经过筛选得到的，筛选过程如下：

试验例二条件摸索

5.1样品提取条件的考察

5.1.1提取方式考察

考察加热回流、超声提取两种提取方式对远志药材提取效果的影响。精密称取远志药材500mg，分别用50mL的70％甲醇-水(v/v)作为提取溶剂超声30min，加热回流90min，采用同样的预实验色谱条件进样(色谱图见图2)。结果表明，超声提取和加热回流提取效果相差不大，由于超声提取操作简便，因此选择超声提取作为提取方式。

5.1.2提取溶剂及比例、时间考察

考察甲醇和水作为提取溶剂的提取效果，精密称取远志药材500mg，分别用50mL的甲醇、水作为提取溶剂。结果表明，甲醇作为提取溶剂时色谱峰峰形好且峰数多，因此选择甲醇作为提取溶剂。

考察提取溶剂的比例及不同时间的提取效果，精密称取远志药材500mg，分别用50mL的30％甲醇-水(v/v)、50％甲醇-水(v/v)、70％甲醇-水(v/v)和100％甲醇-水(v/v)作为提取溶剂，分别在超声提取10min，30min和60min(标号顺序见表1)。采用同样的预实验色谱条件进样(色谱图见图3)。结果表明，70％甲醇-水作为提取溶剂提取的峰形及各峰分离度较好。超声时间提高对峰高和峰形没有明显的影响，考虑提取效率和色谱峰高度，选择30min作为药材提取时间。

表5 不同提取溶剂比例及不同时间实验设计顺序表

5.2色谱方法的选择

5.2.1检测波长的选择

考察检测波长对远志药材分离效果的影响。用PDA检测器对样品进行200-400nm全波长扫描，比较各波长下色谱图(图4)：在320nm处，远志药材中糖脂类、皂苷类、双苯吡酮类成分均有较好的响应，色谱峰个数较多，分离度好，因此选定320nm为测定波长。

5.2.2色谱柱的选择

考察不同UPLC C18色谱柱对远志药材分离效果的影响。取远志药材制备供试品溶液，使用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.7μm，美国Waters公司)，ACQUITY UPLCHSS C18柱(2.1×100mm，1.7μm，美国Waters公司)，ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×100mm，1.7μm，美国Waters公司)(色谱图见图5)。结果表明，HSS T3柱分离出的色谱峰数目多且对远志皂苷类成分分离效果明显优于其他色谱柱。

5.2.3流动相梯度洗脱条件的选择

筛选UPLC梯度洗脱条件对远志药材含量测定以及指纹图谱分离效果的影响。用乙腈-水溶液不同比例，不同洗脱程序进行筛选，不同方案如下，代表色谱图见图6。

方案1：

方案2：

方案3：

方案4：

方案5：

方案6：

方案7：

方案8：

方案9：

经过多次调整，从峰分离度，色谱图分布均匀性等综合考量，方案9明显优于其他方案。

5.2.4流动相条件的优化

考察流动相条件对远志药材分离效果的影响。由于远志药材的化学成分复杂，要在同一色谱条件下达到良好分离选择梯度洗脱系统。主要对水相进行考察：精密称取远志药材500mg，使用25mL的70％甲醇-水(v/v)作为提取溶剂超声提取30min，A相分别使用纯水、0.1％甲酸-水(v/v)、0.2％甲酸-水(v/v)，0.1％磷酸-水(v/v)、0.2％磷酸-水(v/v)。(色谱图见图7)。结果表明，A相单纯使用二纯水时，分离效果不佳，加入不同浓度的甲酸、磷酸分离度有所改善，在0.1％甲酸-水条件下峰形最好，尤其是对远志皂苷类成分分离度，以往常用磷酸水作为水相，但因磷酸的不挥发性，导致磷酸水的方法无法推广至质谱分析，具有使用的局限性，而甲酸水兼具良好的分离效果及液质联用的适用性；在保证色谱峰分离度及数目的情况下，0.1％甲酸水较0.2％甲酸水的PH值更有利于液相系统的保持，对色谱柱的维护、使用寿命的延长更有优势，且节约试剂。故选用0.1％甲酸-水。

5.2.5柱温的选择

考察色谱柱温度对远志药材分离效果的影响。在上述优化后的色谱系统、梯度下，分别考察了25℃、30℃和35℃三个柱温对峰形和分离的影响。结果(图8)表明，三种温度下的分离效果差异不大，考虑到温度控制，选择30℃作为检测温度。

5.2.6流速的选择

考察不同流速对远志药材分离效果的影响。在上述优化后的色谱系统、梯度下，分别考察了0.3ml/min、0.35ml/min、0.4ml/min三个流速对峰形和分离的影响。结果(图9)表明，0.4ml/min流速分离度合适，在高于0.4ml/min流速下，仪器系统压力高，容易超出UPLC警戒压力，故选择0.4ml/min为运行速度。

试验例三、6种成分含量测定及方法学验证

6.1线性关系考察精密吸取混合标准品贮备液适量，以甲醇逐级稀释，稀释倍数分别为1、2、4、8、16和32倍，摇匀。分别按3.1项下色谱条件进样分析，进样量均为1μL，测定峰面积。以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X(mg/mL)为横坐标，绘制各标准曲线，得到线性回归方程和线性范围，结果见表3，6种化合物在各浓度范围内的线性关系良好。

6.2定量限与检测限将对照品溶液逐级稀释后，按3.1项下色谱条件进样分析，信噪比(S/N)为3时的质量浓度(mg/L)为检测限(LOD)，信噪比(S/N)为10时的质量浓度(mg/L)为定量限(LOQ)，结果见表6。

表6 6种成分的标准曲线、定量限、检测限

6.3精密度试验分别精密吸取混合对照品溶液1μL，在3.1项色谱条件下重复进样6次，计算化合物sibiricose A5、sibiricose A6、sibiricaxanthone B、glomeratose A、polygalaxanthoneⅢ、3,6'-disinapoyl sucrose峰面积RSD值，分别为0.3％，0.2％，0.3％，0.3％，0.1％，0.2％，仪器精密度良好。

6.4重复性试验按2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，3.1项下色谱条件进样分析，计算sibiricose A5、sibiricose A6、sibiricaxanthone B、glomeratose A、polygalaxanthoneⅢ、3,6'-disinapoyl sucrose峰面积RSD值，分别为0.9％，2.2％，0.7％，0.9％，1.9％，0.5％，实验重复性良好。

6.5稳定性按2.2项下方法制备供试品溶液，室温下放置，按3.1项下色谱条件分别在0，2，4，8，12，18，24h时进样分析，计算6个化合物峰面积的RSD值，分别为1.0％，0.6％，0.7％，0.7％，1.5％，0.6％，样品在24h内稳定性良好。

6.6加样回收率试验取已知含量的样品6份，每份为0.25g，精密称定，置于25mL容量瓶中，分别精密加入相当于样品成分含量100％的各对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，3.1项下色谱条件进样分析，计算6种成分的加样回收率。平均回收率分别为97.74％，99.31％，97.20％，99.53％，96.97％，100.57％；RSD分别为1.57％，0.60％，0.88％，0.73％，0.97％，0.19％。

7指纹图谱的方法学验证

指纹图谱的方法学验证与第6项中相同。结果显示，同一样品溶液连续进样6次，各共有峰相对保留时间RSD<0.1％，相对峰面积RSD<2.2％，精密度良好。重复性考察各共有峰相对保留时间RSD<0.1％，相对峰面积RSD<3.6％；稳定性考察各共有峰相对保留时间RSD<0.3％，相对峰面积RSD<3.8％。

本发明的有益效果：

1、本发明采用UPLC法对远志药材的质量进行综合评价，在同一色谱条件下，完成了运用一张UPLC色谱图同时对远志药材6种成分含量进行测定和指纹图谱分析。在26min内即可完成分离和测定，极大地缩短了分析时间，对于样品的高通量分析具有显著优势。

2、现有技术均采用HPLC法对远志药材进行分析，然而HPLC的条件并不完全适用于UPLC。本发明在分析条件筛选研究中，对本发明的提取条件(提取方式、溶剂及比例、时间等)及UPLC色谱条件(色谱柱、流动相、梯度洗脱程序等)均进行了优化，利用质谱信息验证了各峰纯度，最终建立的分析方法可见峰数量明显增加，改善峰形和拖尾，分离度好，信息丰富且简单易行。

本发明采用UPLC-Q-TOF-MSE对指纹图谱共有峰进行归属，通过对正负离子模式、脱溶剂气温度、离子源温度及毛细管电压等质谱条件进行筛选，确定了准分子离子峰及碎片离子峰响应值均较高的条件，在该条件下，研究8个标准品及样品多级质谱信息，鉴定了37个共有峰中的33个峰，包括18个糖酯类成分，12个皂苷类成分以及3个双苯吡酮类成分，表明该分析条件从整体上可以涵盖远志具有活性的三大类成分，具有代表性全面性。

远志产地较多，但目前市场上流通的远志大货多产于山西陕西一带，故本发明收集了产量较高的山西、陕西、河北、内蒙等地产远志药材，本发明所用24批药材均扩增其psbA-trnH序列，鉴定为远志Polygala.tenuifolia Willd.，样品种属来源可靠，保证了本发明建立的分析模式的准确性及样本测定结果的可靠性。在多样本量的基础上，远志药材的6种成分含量通过SPSS主成分分析，结果发现含量在不同产地的药材中有差异，其中3,6'-disinapoyl sucrose与sibiricose A6较为明显。24批样品的UPLC指纹图谱，除7、12、17、20号以外，相似度均在0.9以上，说明从指纹图谱角度看，不同产地的远志药材质量有差异也有共性。综合定量与指纹图谱相似度数据，利用SPSS对不同产地样品进行聚类分析，结果显示有差异也有重叠现象，说明产地在远志药材质量方面有影响但可能不是主因素，可能与药材生长年限，采收季节等相关性较大。在本发明建立的分析条件下，可以对远志药材质量的影响因素进行进一步探讨。

UPLC“指纹图谱+多成分定量”评价方法综合多方面信息，系统探讨远志药材质量的差异，可在一定程度上表征药材在化学成分方面的差别，综合二者信息，可为远志的产地选择、质量快速评价及临床应用提供参考。在此基础上，如果将药效、毒性与物质基础等结合起来，深入开展谱效学研究，则更有利于阐明中药作用机制，完善远志质量评价体系，为临床用药提供科学依据。

附图说明

图1远志的UPLC色谱图

A.对照品色谱图；B.样品色谱图；

其中，1.取西伯利亚远志糖A5(sibiricose A5)；2.西伯利亚远志糖A6(sibiricose A6)；3.西伯利亚远志口山酮B(sibiricaxanthone B)；4.球腺糖A(glomeratose A)；5.远志口山酮Ⅲ(polygalaxanthoneⅢ)；3,6'-二芥子酰基蔗糖(6.3,6'-disinapoyl sucrose)

图2加热回流(下图)、超声提取(上图)对远志药材提取效果的影响

图3不同提取溶剂比例及不同时间的色谱图(从下到上依次为1-12号实验)

图4糖脂类、皂苷类、双苯吡酮类成分紫外吸收图谱

图5HSS T3、HSS C18、BEH C18柱的远志药材色谱图(从下到上依次为T3/HSS/BEH)

图6不同流动相梯度洗脱条件色谱图(从下到上依次为1-9号方案)

图7不同水相条件的色谱图(从下到上依次为纯水、0.1％甲酸-水、0.2％甲酸-水，0.1％磷酸-水、0.2％磷酸-水)

图8不同柱温下的色谱图(从下到上依次为25℃、30℃和35℃)

图9不同流速下的色谱图(从上到下依次为0.3ml/min、0.35ml/min和0.4ml/min)

图10 24批远志的UPLC指纹图谱

图11远志的对照指纹图谱

具体实施方式:

实施例

1仪器与试药

1.3药材样本采集24批远志药材分别来自各主产区，经山西医科大学高建平教授鉴定为远志Polygala tenuifolia Willd的根，且均通过DNA条形码技术(基于psbA-trnH序列)验证。药材来源见表4。

表5 24批远志药材样品来源

Table 1 The sources of 24 batches of Polygalae Radix

2溶液制备

2.1对照品溶液制备分别取sibiricose A5、sibiricose A6、sibiricaxanthoneB、glomeratose A、polygalaxanthoneⅢ、3,6'-disinapoyl sucrose对照品适量，精密称定，甲醇定容，制成质量浓度分别为39.8mg/L、47.7m g/L、23.9mg/L、28.2mg/L、27.4mg/L、263mg/L的混合对照品贮备液，存贮于4℃冰箱中备用。

2.2供试品溶液制备样品干燥后粉碎，精密称定粉末(过三号筛)0.5g，置于25mL容量瓶中，加入70％甲醇溶液20mL，超声处理30min(功率500W，频率40kHz)，放至室温，70％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，转移至离心管，4900r/min下高速离心10min，吸取上清液，0.22um微孔滤膜滤过即得。

3色谱条件

Waters ACQUITY UPLC T3(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱。流动相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)：梯度洗脱条件为0～1min，10％B；1～2.5min，10％～14％B；2.5～4min，14％～16％B；4～9min，16％～25％B；9～12min，25％B；12～14min，25％～27％B；14～16min，27％～30％B；16～18min，30％～39.8％B；18～21min，39.8％～40％B；21～23min，40％～60％B；23～24min，60％～100％B；24～26min，100％～10％B。流速0.4mL/min；检测波长320nm；柱温30℃；进样量1μL。6种成分的理论塔板数均不低于6000。

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，负离子MSE模式，雾化气体为高纯度氮气(N2)，碰撞气体为高纯度氩气(Ar)。质量扫描范围100～2000Da；毛细管电压为3kV；锥孔电压为40V；离子源温度为120℃；雾化温度为300℃；载气流速为800L/h，碰撞能量(CE)60～80V；采用亮氨酸-脑啡肽进行精确质量校正([M-H]-＝554.2615)。

4 24批远志样品的6种成分含量

计算24批远志样品的6种成分含量，并计算每批样品总和，结果见表7。

表7 24批远志中6种成分含量(n＝2,mg/g)及指纹图谱相似度

结果显示，不同产地的远志样品中6个成分均有不同程度的差异，其中3,6'-disinapoyl sucrose与sibiricose A6的差异较明显。

5相似度计算及对照指纹图谱的生成24批远志样品的色谱图见图10，生成对照指纹图谱见图11。各产地远志药材指纹图谱与对照指纹图谱比对，24批样品相似度在0.756～0.997之间，结果见表5。

结论：

采用UPLC，以乙腈-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，流速0.4mL/min，检测波长320nm，测定24批药材中6种成分(西伯利亚远志糖A5 sibiricose A5、西伯利亚远志糖A6sibiricose A6、西伯利亚远志口山酮B sibiricaxanthone B、球腺糖A glomeratose A、远志口山酮ⅢpolygalaxanthoneⅢ、3,6'-二芥子酰基蔗糖3,6'-disinapoyl sucrose)的含量，并建立远志药材指纹图谱，采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MSE)指认共有峰。结果不同产地远志药材中，3,6'-二芥子酰基蔗糖3,6'-disinapoyl sucrose与西伯利亚远志糖A6sibiricose A6含量差异较大；建立的药材UPLC指纹图谱共标定37个共有峰，指认出其中33个峰，24批样品相似度在0.756～0.997之间。成分含量及相似度综合分析结果表明，不同地区远志药材质量存在一定差异。

Claims

1.一种远志药材有效成分的含量检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤2、供试品溶液制备：取远志药材用30-100%低级醇提取后，滤过，得到供试品溶液；

步骤3、将对照品溶液和供试品溶液分别注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中的有效成分含量；

其中，所述的超高效液相色谱条件：UPLC色谱仪 C18色谱柱、流动相酸水-乙腈溶液梯度洗脱；

所述的梯度洗脱条件为0～1 min，10%乙腈；1～2.5 min，10%～14%乙腈；2.5～4 min，14%～16%乙腈；4～9 min，16%～25%乙腈；9～12 min，25%乙腈；12～14 min，25%～27%乙腈；14～16 min，27%～30%乙腈；16～18 min，30%～39.8%乙腈；18～21 min，39.8%～40%乙腈；21～23 min，40%～60%乙腈；23～24 min，60%～100%乙腈；24～26 min，100%～10%乙腈。

2.一种远志药材超高效液相指纹图谱建立方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1、供试品溶液制备：取多批次远志药材用30-100%低级醇提取后，滤过，得到供试品溶液；

其中，超高效液相色谱的色谱条件如下：

UPLC色谱仪 C18色谱柱、流动相酸水-乙腈溶液梯度洗脱，所述的梯度洗脱条件为0～1min，10%乙腈；1～2.5 min，10%～14%乙腈；2.5～4 min，14%～16%乙腈；4～9 min，16%～25%乙腈；9～12 min，25%乙腈；12～14 min，25%～27%乙腈；14～16 min，27%～30%乙腈；16～18min，30%～39.8%乙腈；18～21 min，39.8%～40%乙腈；21～23 min，40%～60%乙腈；23～24min，60%～100%乙腈；24～26 min，100%～10%乙腈。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中，所述的对37个共有峰进行归属，采用质谱分析法，其中质谱条件如下：采用电喷雾离子源ESI，负离子模式，质量扫描范围100-2000 Da；毛细管电压为2.5-3 kV；锥孔电压为10-50 V；离子源温度为80-120 ℃；雾化温度为200-300 ℃；载气流速为400-1000 L/h，碰撞能量40-100V。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中，所述共有峰为37个，它们的相对保留时间及相对峰面积如下：

。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中已经确认归属的共有峰33个，它们的化学结构式、相对保留时间及相对峰面积如下：

。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤1所述混合对照品溶液，其中各组分的含量分别为：每1ml含西伯利亚远志糖A5 35-40μ g，西伯利亚远志糖A6 42-52μ g，西伯利亚远志口山酮B 20-26μ g，球腺糖A 25-31μ g，远志口山酮Ⅲ 24-30μ g，3,6'-二芥子酰基蔗糖234-286μ g的混合对照品溶液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤1所述混合对照品溶液，其中西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、西伯利亚远志口山酮B、球腺糖A、远志口山酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖的含量分别为39.8 mg/L、47.7 mg/L、23.9 mg/L、28.2 mg/L、27.4 mg/L、263 mg/L的混合对照品溶液。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中，供试品溶液配制方法如下：取远志药材用30-100%低级醇超声提取10-60分钟或回流提取2-3次每次1-1.5小时。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述的低级醇选自30%-100%甲醇或30%-100%乙醇溶液。

10.根据权利要求1所述的一种远志药材有效成分的含量检测方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱条件UPLC C18色谱柱为T3键合色谱柱、流速0.3-0.4 mL/min、检测波长300-330nm、柱温25-35℃。