CN106729968A - 适用于高龄冠状动脉的新型钛支架及该钛支架的处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于高龄冠状动脉的新型钛支架及该钛支架的处理方法，支架本体由钛材料制成；支架本体的表面吸附有纳米颗粒组合物；支架本体的表面抛光和清洗处理后，浸入NaOH溶液中，在70℃条件下反应10小时，单蒸水超声清洗后，浸入双蒸水中，70℃条件下反应10小时，单蒸水超声清洗后，37℃烘干；将支架本体浸泡于PLL中，在4℃条件下静置反应20小时，然后用磷酸盐缓冲液清洗支架本体。支架本体表面GDP与HEP、PLL、LN或SDF‑1α组合，构建具有冠脉免疫调节、血液相容性、抗冠脉血栓形成、冠脉内皮损伤修复和抗冠脉介入治疗再狭窄的生物功能性微环境，因而将可能解决高龄冠脉多支病变、复杂病变介入治疗所致的冠脉血栓形成和冠脉再狭窄的问题。

Description

适用于高龄冠状动脉的新型钛支架及该钛支架的处理方法

技术领域

本发明涉及一种医疗用具，更具体地说，它涉及一种适用于高龄冠状动脉的新型钛支架及该钛支架的处理方法。

背景技术

70岁以上高龄冠状动脉（冠脉）多支病变、复杂病变的介入治疗所致冠脉血栓形成和冠脉再狭窄发生率明显高于年轻冠心病患者。钛合金材料具有良好的生物相容性已广泛应用于外周血管支架。但尚无将钛合金材料作为冠脉支架材料，用于高龄冠脉多支病变和复杂病变介入治疗的研究。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种解决上述问题的适用于高龄冠状动脉的新型钛支架及该钛支架的处理方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种适用于高龄冠状动脉的新型钛支架，包括支架本体，所述支架本体由金属钛材料制成；

所述支架本体的表面吸附有用于构建冠状动脉免疫调节、血液相容性、抗冠状动脉血栓形成、冠状动脉内皮损伤修复及抗冠状动脉介入治疗再狭窄的生物功能性微环境的纳米颗粒组合物。

本发明进一步设置为：所述纳米颗粒组合物包括GDP、HEP、PLL、LN、SDF-1α。

本发明进一步设置为：GDP的制备，

采用冰水清洗新鲜扁玉螺，去除扁玉螺的外壳和杂质，然后通过高速粉碎机粉碎，制成均匀浆保持于90%乙醇中两周；

用1:20的蒸馏水在85-87℃温度中每4小时提取一次，共三次，混合物离心20分钟，去除不溶性残留物；

收集上清液，通过真空旋转蒸发器浓缩成适当量，通过Sevag, Lackman、Smolens 和无水乙醇去除蛋白，并于4℃过夜；

沉淀物离心20分钟提取GDP。

本发明进一步设置为：通过色谱法DEAE-52和葡聚糖凝胶G-100依次纯化GDP；

GDP通过层析柱DEAE-52纤维素纯化，然后，纤维素柱用0、0.4和1.2m的氯化钠在流速为60ml/h下分步洗脱；

最后，通过G-100葡聚糖凝胶柱进一步纯化，获得纯化GDP。

本发明进一步设置为：采用无菌磷酸盐作为配制溶液，配制浓度为0.5mg/mL的HEP溶液，并在3～5℃环境下保存。

本发明进一步设置为：采用无菌磷酸盐 作为配制溶液，配制浓度为0.5mg/mL的PLL溶液，并在3～5℃环境下保存。

本发明进一步设置为：在中性条件下PLL与HEP通过自发静电组装作用形成具有三维结构的纳米颗粒，该纳米颗粒通过静电作用吸附于碱活化的支架本体表面。

处理适用于高龄冠状动脉的新型钛支架的方法，其特征是：纯钛材料制成的支架本体，其表面经过抛光和清洗处理后，浸入浓度为1～5mol/L的NaOH溶液中，在60～90℃条件下反应8～16小时，单蒸水超声清洗后，浸入双蒸水中，60～90℃条件下反应8～12小时，单蒸水超声清洗后，37℃烘干；

将支架本体浸泡于0.5～3mg/ml的PLL溶液中，在4℃条件下静置反应8～24小时，然后用磷酸盐缓冲液清洗支架本体。

通过采用上述技术方案，支架本体表面GDP与HEP、PLL、LN或SDF-1α组合，形成GDP与HEP、PLL、LN或SDF-1α纳米颗粒组合物多功能涂层。从而构建具有冠脉免疫调节、血液相容性、抗冠脉血栓形成、冠脉内皮损伤修复和抗冠脉介入治疗再狭窄的生物功能性微环境，因而将可能解决高龄冠脉多支病变、复杂病变介入治疗所致的冠脉血栓形成和冠脉再狭窄的问题。

具体实施方式

参照实施例对本发明做进一步说明。

中药GDP制备

冰水清洗新鲜扁玉螺。去除外壳和杂质，高速粉碎机粉碎，制成均匀浆保持于90%乙醇两周。用1:20的蒸馏水在85-87℃温度中提取每4小时一次，共三次。混合物离心20分钟，去除不溶性残留物。收集上清液，通过真空旋转蒸发器浓缩成适当量，通过Sevag, Lackman、Smolens 和无水乙醇去除蛋白，并于4℃过夜。沉淀物离心20分钟提取GDP。

中药GDP的纯化

通过色谱法DEAE-52和葡聚糖凝胶G-100依次纯化GDP。GDP （3ml,15mg/ml）通过层析柱（2.6cm × 30cm）DEAE-52纤维素纯化，然后，纤维素柱用0、0.4和1.2m的氯化钠在流速为60ml/h下分步洗脱。通过G-100葡聚糖凝胶柱（2.6cm× 60cm)进一步纯化，获得纯化GDP。

GDP的体外免疫活性

脾细胞增殖试验：小鼠脾脏在无菌条件下取出，存于4℃ PBS缓冲液。获取单细胞悬液后离心，细胞悬浮在3ml裂解液中 (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3 , 1 mM EDTA-Na2 , pH7.2) 中轻振2-3分钟后，移去红细胞层。再用PBS缓冲液（0.1 M, pH 7.2）清洗两次，脾细胞悬浮在RPMI-1640培养基中，密度为1× 10⁷ /mL。然后，细胞悬浮液培养在96孔板子和不同密度 (25–100 mg/L) 纯化多糖加到100μL刀球蛋白A（最终浓度为5mg/L），脂多糖（最终浓度为10mg/L）作为阳性对照， RPMI-1640培养基为空白对照组。于37℃，湿度5%的二氧化碳培养箱72小时，MTT原液（10 μL，5mg/L）加入培养箱培养4小时。100ul，10%的SDS在0.01N盐水加入到每个孔里。保持培养皿过夜。用ELISA在570nm吸光度条件下读取光度值，测定细胞增殖指数。

腹腔巨噬细胞吞噬功能研究：诱导和获取腹膜巨噬细胞，细胞悬浮液接种到96孔板。在37℃，湿度5%的二氧化碳培养箱中孵育3小时。用PBS缓冲液连续冲洗两次洗去非贴壁细胞。采用不同浓度纯化多糖培养腹膜巨噬细胞，设阳性对照和空白对照。培养孔中巨噬细胞孵育1小时，移去上清液，置入PBS缓冲液。培养皿中加入细胞裂解液室温下过夜。采用ELISA测定培养皿，确定巨噬细胞指数。

GDP的体外免疫活性测定研究表明，脾细胞增殖和增强巨噬细胞吞噬作用。GDP可增强免疫调节。

肝素（HEP)

HEP钠（Haperin Sodium, Sigma)。HEP溶液配制：采用无菌PBS 作为配制溶液，配制HEP溶液浓度为0.5mg/mL, 4℃保存备用。HEP常用于材料表面的抗凝修饰。HEP可与多种内皮细胞生物因子及细胞外基质蛋白结合，延长这些蛋白质在体内的活性和半衰期，促进内皮损伤修复。通过同位素标记的HEP测量涂层支架吸附HEP的量及峰时间，HEP在涂层中的载药量约为160μg/枚，扫描电镜显示涂层厚度5-10μm。

多聚赖氨酸 (PLL)

PLL (Poly-1-lysine, MW150.000-300.000, Sigma)。PLL溶液配制：采用无菌PBS 作为配制溶液，配制PLL溶液浓度为0.5mg/mL, 4℃保存备用。PLL是一种富含-NH2的粘性分子，等电点为10.5。能够与带阴离子的物质产生强静电交互作用，并对生物膜具有良好穿透力。因此，将PLL用于药物载体。在中性条件下PLL与HEP通过自发静电组装作用形成具有三维结构的纳米颗粒，在该种结构下HEP可保持其良好的构象和生物学活性。PLL在PBS溶液中呈正电性,通过静电作用可将PLL吸附于碱活化的冠脉TI支架表面。

PLL是一种富含氨基的氨基酸聚合物，在中性环境下呈强正电性，通过静电作用可牢固结合于碱热活化后呈负电性的TI表面，并在表面引入大量具有反应活性的氨基。通过EDC/NHSMES偶联剂的作用，可将LN/HEP复合物共价固定于氨基化的TI表面。利用HEP特异性结合SDF-1α的特点，可在共固定LN/HEP的表面进一步引入SDF-1α。

动物模型采用新西兰家兔、小型猪、老龄大鼠，制作前降支、回旋支及右冠脉狭窄模型。

研究材料，优异生物相容性的冠脉纯TI支架材料。研制一种理想的材料表面理化性质和生物功能的组合,适用于高龄冠脉多支病变、复杂病变的介入治疗。

冠脉TI支架材料处理

纯TI经表面抛光和清洗处理后，浸入浓度为1～5mol/L的NaOH溶液中，在60～90℃条件下反应8～16小时，单蒸水超声清洗后，浸入双蒸水中，60～90℃条件下反应8～12小时，单蒸水超声清洗后，37℃烘干。表面氨基化：将TI支架材料浸泡于0.5～3mg/ml的PLL（MW150～300KDa）溶液中，在4℃条件下静置反应8～24小时，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗TI支架材料。

LN、HEP及PLL的共固定

首先将浓度为30～300μg/ml的LN溶液与浓度为3～10mg/ml的HEP钠溶液等体积共混，37℃条件下静置孵育1～3小时；配置摩尔比为2:1:1的EDC/NHS/MES（0.05mol）缓冲液，以1:10的体积比加入至LN/HEP的混合液中，室温下静置1～5分钟；然后将PLL浸泡于LN/HEP混合液中，37℃条件下静置反应3～6小时；最后用PBS漂洗样品，保存待用。

SDF-1α的装载

SDF-1α溶液4℃条件下静置反应8～24小时，PBS漂洗。最后利用SDF-1α能够与HEP发生特异性结合的作用，将SDF-1α装载于LN/HEP修饰的表面，从而构建具有抗凝/诱导内皮再生的生物功能性微环境。

冠脉TI支架材料表面GDP、HEP、PLL、LN、SDF-1α纳米颗粒组合物

利用中药多糖可以作为药物窄载体特点结合PLL。然后利用LN和HEP之间的特异性结合作用，制备出LN/HEP复合物，最后利用SDF-1α能够与HEP发生特异性结合的作用，将SDF-1α装载于LN/HEP修饰的表面，从而构建冠脉TI支架材料表面GDP/HEP/PLL/LN/SDF-1α纳米颗粒组合物涂层。

中药多糖作为给药载体

中药多糖在具有多种生物功的同时，本身可以作为新型、无毒、有效的新药载体和药物运载工具 。

冠脉支架GDP、HEP、PLL、LN、SDF-1α纳米颗粒组合物涂层

免疫调节失调参与冠脉高龄冠脉多支病变、复杂病变的机制。TI支架材料表面GDP与HEP、PLL、LN、SDF-1α组合，形成GDP、HEP、PLL、LN、SDF-1α纳米颗粒组合物多功能涂层。从而构建具有冠脉免疫调节、血液相容性、抗冠脉血栓形成、冠脉内皮损伤修复和抗冠脉介入治疗再狭窄的生物功能性微环境，因而将可能解决高龄冠脉多支病变、复杂病变介入治疗所致的冠脉血栓形成和冠脉再狭窄的问题。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种适用于高龄冠状动脉的新型钛支架，包括支架本体，其特征是：所述支架本体由金属钛材料制成；

所述支架本体的表面吸附有用于构建冠状动脉免疫调节、血液相容性、抗冠状动脉血栓形成、冠状动脉内皮损伤修复及抗冠状动脉介入治疗再狭窄的生物功能性微环境的纳米颗粒组合物。

2.根据权利要求1所述的适用于高龄冠状动脉的新型钛支架，其特征是：所述纳米颗粒组合物包括GDP、HEP、PLL、LN、SDF-1α。

3.根据权利要求2所述的适用于高龄冠状动脉的新型钛支架，其特征是：GDP的制备，

采用冰水清洗新鲜扁玉螺，去除扁玉螺的外壳和杂质，然后通过高速粉碎机粉碎，制成均匀浆保持于90%乙醇中两周；

用1:20的蒸馏水在85-87℃温度中每4小时提取一次，共三次，混合物离心20分钟，去除不溶性残留物；

收集上清液，通过真空旋转蒸发器浓缩成适当量，通过Sevag, Lackman、Smolens 和无水乙醇去除蛋白，并于4℃过夜；

沉淀物离心20分钟提取GDP。

4.根据权利要求3所述的适用于高龄冠状动脉的新型钛支架，其特征是：通过色谱法DEAE-52和葡聚糖凝胶G-100依次纯化GDP；

GDP通过层析柱DEAE-52纤维素纯化，然后，纤维素柱用0、0.4和1.2m的氯化钠在流速为60ml/h下分步洗脱；

最后，通过G-100葡聚糖凝胶柱进一步纯化，获得纯化GDP。

5.根据权利要求2所述的适用于高龄冠状动脉的新型钛支架，其特征是：采用无菌磷酸盐作为配制溶液，配制浓度为0.5mg/mL的HEP溶液，并在3～5℃环境下保存。

6.根据权利要求2所述的适用于高龄冠状动脉的新型钛支架，其特征是：采用无菌磷酸盐 作为配制溶液，配制浓度为0.5mg/mL的PLL溶液，并在3～5℃环境下保存。

7.根据权利要求2所述的适用于高龄冠状动脉的新型钛支架，其特征是：在中性条件下PLL与HEP通过自发静电组装作用形成具有三维结构的纳米颗粒，该纳米颗粒通过静电作用吸附于碱活化的支架本体表面。

8.一种处理权利要求1所述的适用于高龄冠状动脉的新型钛支架的方法，其特征是：纯钛材料制成的支架本体，其表面经过抛光和清洗处理后，浸入浓度为1～5mol/L的NaOH溶液中，在60～90℃条件下反应8～16小时，单蒸水超声清洗后，浸入双蒸水中，60～90℃条件下反应8～12小时，单蒸水超声清洗后，37℃烘干；

将支架本体浸泡于0.5～3mg/ml的PLL溶液中，在4℃条件下静置反应8～24小时，然后用磷酸盐缓冲液清洗支架本体。