JPH06502624A

JPH06502624A - 可溶性ヒルジン複合体

Info

Publication number: JPH06502624A
Application number: JP3514479A
Authority: JP
Inventors: イトー，ラルフ　ケイ．; ロジェルフォ，フランク　ダブリュー．
Original assignee: ニュー　イングランド　ディーコネス　ホスピタル　コーポレイション
Priority date: 1990-10-04
Filing date: 1991-07-29
Publication date: 1994-03-24
Also published as: AU8440691A; EP0551286A4; WO1992005748A1; US5112615A; EP0551286A1; CA2092540A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】可溶性ヒルジン複合体発明の背景本発明の技術分野は、血栓形成阻害剤であり、特に、トロンビン生成及びトロンビン媒介凝固の阻止に有用な可溶性薬剤、並びにそれらの製造方法及び利用を含む。

血液を人工面にさらすことは、通常、内因性凝固システムの活性化を伴う粘着性血小板の層の付着を生じ、最終的に、血栓の形成に至る。実際、補綴用動脈移植片を一回通すことにより、有意の血液／物質相互作用を生じ得る。合成面に最初に吸着され又は結合される血中蛋白質の型は、接触性凝固に関与する蛋白質を含み得る。接触性凝固又は外因性経路の凝固は、フィブリン生成、血小板及び補体の活性化、走化性、キニン生成並びに繊維素溶解物質の活性化を誘導する複雑な経路の生化学的事象である。更に、これらの事象の各々は、しばしば正又は負のフィードバックループにより制御される後続の生化学的経路を増大する。それ故、人工物質との接触により誘導される血栓症は、人工血管及び人工器官、並びに心肺バイパス及び血液透析装置等の内在性プロテーゼ及び体外装置の開発及び利用における主要な障害である。

血栓抵抗性の程度が安定しない材料が血管プロテーゼにおいて用いられ、ある程度成功している。これらの材料は、腐食性（自浄性）金属、ポリジメチルシロキサン、テフロン、アクリレート及びメタクリレート（ポリエチレンテレフタレート等）、エレクトレット、アニオン性コポリマー並びにヒドロゲル等の合成高分子を含む（総説トシて、旺駐山田り五しユ匡吐坦匡」」」−シ」」且Ｕ已ユ１」すｄ　Ｃ１１ｎ上ｃａｔ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（Ｃｏｌａ＋ａｎ等編）、Ｊ、Ｂ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　（：ｏ、（ペンシルバニア　州、　Ｐｈ１ｌａ、在）　中の１３３５−１３４７頁、５ａｌｚａ＋ａｎ等、　（１９８７）を参照されたい）。

かかる人工材料との長期間の接触による血栓症の機会を減らすために、患者は、抗凝固剤、抗血小板剤及び血栓溶解剤の全身投与により処置された。これらは、プロスタサイクリン合成に影響を与えずにトロンボキサン合成を選択的に阻害し、血小板の粘着性並びに凝集及び遊離に影響を与え、血管のＰＧＩ□産生を増大し、そして／又はトロンビン及びトロンボキサン媒介性の血小板凝集の両者を阻害する任意の化合物を含む、そのような化合物はアスピリン、スルフィンピラゾン、ジビリダモール、チクロピジン及びスロクチジンを含む。しかしながら、これらの薬剤での治療はしばしば、全身の出血及び身体の至る所で必要な凝固を開始し完成することができな（成ることを含む好ましくない副作用を引き起こす。

この人工材料の血栓抑制性を改良するために、血栓崩壊性、抗凝血性、血栓形成阻害性及び／又は血小板阻害性を有する生物的に活性な分子がそれらと結合された。

例えば、ヘパリンは様々な内因性凝固システムの阻害物質の活性化によって凝固を軽減するために人工表面に結合された（　５ａｌｚ＋＋＋ａｎら（１９ｇ７）　Ｈｅａ＋ｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂ。

ｓｉｓ　Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｇ第２版ｆＣｏ１ｍａｎら編　）Ｌｔｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、、Ｐｈ１ｌａ、、ＰＡ　１３３５−１３４７頁）。しかしながら、ヘパリンは、血小板のＡＤＰ又はコラーゲンなどの刺激に対する応答を増大し、人工表面に対する２つの有害な初期血液応答：血小板の付着及び凝集を促進する。更に、たとえ表面結合したヘパリン／抗トロンビン複合体が血小板に対して作用しないとしても、内皮細胞成長因子との相互作用、平滑筋増殖の阻害及びリポ蛋白質リパーゼの活性化に対する非常に多様な影響が長期間の内に有害な影響を導くかも知れないので、疑問を生じさせる。

ＰＧＥ＋　、ＰＧＩ＊　（実験用の使用のみ）、環状ＡＭＰ及びアスピリンなどの抗血小板物質も又固体ポリマー表面に付着された。これらの物質は、血管移植片の近くでの有害な治癒応答を刺激する血小板因子の遊離を止めさせる。それらは血小板補助による血栓形成をも、血小板付着の阻害により軽減する。

多くの人工表面を血管と接触させる前にアルブミンにさらすとその結果、血小板との反応性が減少した（ＮＩＨ発表Ｎｏ、８５−２１８５．１９８５年９月、１９−６３頁）、それ故、アルブミンは、心肺バイパス外科手術の前に体外の表面を被覆するために用いられた。しかしながら、長期間の血栓抑制性は、この処置では達成されていない。

繊維素溶解活性を有するストレプトキナーゼ及びウロキナーゼが、Ｋｕｓｓｅｒｏｗらにより、単独で又はヘパリンと組み合わせて人工物表面に付着された（Ｔｒａｎｓ−。

Ａｍ、Ｓｏｃ、Ａｒｔｉｆ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒｇａｎ（１９７１）１７：ｌ　）　ａこれらの酵素は過度のフィブリン沈着及び／又は血栓症による閉塞を軽減する。しかしながら、それらの人工表面に血栓抑制性を与える能力の長期間における評価は決定していない。

Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８などの界面活性剤も又人工物表面に固定されたが、長期間の血液適合性を提供することはないようである（　５ａｌｙｅｒら、　（１９７１）Ｍｅｄｉｃａｌ、■」ユ暉−ユ上ｏｎｓ　ｏｆニヱ１ａｓｔｉｃｓ、Ｂｉａｓｅｄ、　ＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓ、　Ｓｙｍ、　（Ｇｒｅｇｏｒ１編）Ｎｏ、１，１０５頁）。

それ故、必要なものは、長期間にわたって血栓抑制性であり、その活性成分が有害な副作用を起こさない、より良い生体適合性の材料である。

この発明の目的は、体液と接触する移植可能な及び体外の装置にとって有用な合成の生体適合性の血栓抑制性の材料を提供することである。

他の目的は、生物的に活性な固定化された血栓形成阻害物質及びその製造方法を提供することである。

更に他の目的は、可溶性の安定化された血栓形成阻害物質を提供することである。

この発明の更に別の目的は、移植片又はプロテーゼと血液の界面の限局された部位における血小板凝集、血小板因子の遊離及び血栓形成を阻害する方法を提供し、それにより抗血小板及び抗血栓症薬剤の全身的な影響を避けることである。

１豆二ｌ尤血液と接触する移植可能な又は体外の装置の構成要素として有用な生体適合性の血栓抑制性の物質を供給するための材料と方法をここに開示する。過度のトロンビン生成及び血栓形成を阻止する可溶性の生体適合性薬剤をも又開示する。

合成の生体適合性の材料が、基底被膜層として血栓形成阻害物質ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ　）又はその活性なアナログ若しくは活性なフラグメントをそれに固定化することにより血栓抑制性の物質に成り得、そのような方法によってその阻害物質の血栓形成阻害活性は弱まることはないということが発見された。

基底被覆物質がそれに固定化した血栓形成阻害物質の可溶性の生体適合性キャリアーとして作用し得ることも又見出された。この血栓形成阻害物質／キャリアー複合体は、ヒルジンに比較して血管区画内で増大した半減期及びその活性を維持する能力を有する薬剤として有用である。これは、ヒルジンは急速に血管外空間へ拡散することが知られており又、この複合体は血管区画内で抗凝固作用を維持する潜在能力を有するので重要である。

「血栓形成阻害物質」という用語は、ここでは、ヒルジンの生物学的抗血栓形成活性を有するすべての天然の蛋白−質、該蛋白質の合成又は組換えアナログ、或は、それらの蛋白質若しくはアナログのフラグメントを表す。

この発明により意図された合成材料は、好ましくは、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリウレタン、架橋されたコラーゲン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリグリコール酸及びそれらの混合物などの高分子であり、最も好ましい高分子材料はポリエチレンテレフタレートである。他の合成材料も又用い得るであろう。

生体適合性の基底被膜層の少なくとも１層は、合成材料の少な（とも１つの面に付着する。この基底被膜層若しくはキャリアーば、血栓形成阻害物質に結合する成分を含む。そのような基底被覆若しくはキャリアー成分の例は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、リボ蛋白質、糖蛋白質、グリコサミノグリカン、ヒドロゲル、合成ポリマー及びそれらの混合物を含む。

この発明の好ましい面において、基底被膜層若しくはキャリアーは、例えば、ヒト、ウシ、細菌若しくはその他の源に由来する血清アルブミン、フィブロネクチン又はこれらの活性アナログ若しくは活性フラグメント等のポリペプチド成分を含む、この発明の他の面において、キャリアーは、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ若しくはウロキナーゼ又はそれらの活性フラグメント若しくは活性アナログ等の第２の蛋白質性血栓形成阻害物質である。他の物質も又、基底被膜層又はキャリアーを形成するために用い得る。

この発明の一つの面により、血栓形成阻害物質は、合成材料の少なくとも一つの表面に付着する基底被膜層を介して合成材料上に固定される。基底被膜層は、血栓形成阻害物質とその阻害物質の生物活性を弱めることなく結合し得る成分を含む。

この発明の模範的な面において、合成材料は、それに付着する基底被膜１を得る前に、その基底被膜層への結合性を強めるために活性化される。例えば、一つの好ましい面において、合成材料は、その材料中にあって二官能性の架橋剤（例えば、カルボジイミド）と結合性の少なくとも一つの化学的に活性な基（例えば、カルボン酸基）を利用可能にする溶液と接触させられる。こうして処理された材料を、それから、架橋剤カルボジイミドを含む溶液に、化学的に活性な基がそれに結合できるだけ十分な時間接触させる。

他の具体例において、合成材料を、この活性化ステップの前に、それらの内部及び／又は表面の不純物を取り除（溶液に接触させても良い、固定化ステップは、最初に血栓形成阻害物質を少な（とも−分子の二官能性架橋剤と、その薬剤を阻害物質と架橋させるのに十分な時間接触させ、それから、血栓形成阻害物質と結合した薬剤を合成材料に付着した基底被膜層若しくはキャリアーに結合させることにより行われる。この結合した血栓形成阻害物質はその血栓形成阻害活性を保持する。−かかる固定化の工程に有用な二官能性架橋剤は、ヘテロニ官能性（例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））、ホモニ官能性（例えば、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、（ＥＧＳ））、又は両者の混合物であって良い。

“二官能性の架橋剤”という用語は、ここでは、例えば、１分子上の又は２つの別個の分子上の２つの反応性の基と結合し、それにより架橋する能力を有する分子として定義される。もしこの二官能性架橋剤が２つの異なるタイプの基に結合するならば、それは“ヘテロニ官能性”架橋剤である。しかしながら、もしこの二官能性架橋剤が２つの類似の基にのみ結合するならば、それは“ホモニ官能性 ”である。有用な二官能性架橋剤は任意の数の既知のへテロニ官能性又はホモ三官能性薬剤、又は両者の混合物を含む。

結合ステップの前に、血栓形成架橋剤（ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｅｓｉｓ−１ｉｎｋｅｄ　ｒｅａｇｅｎｔ　）は、それに混入している不純物を取り除くためにクロマトグラフィー処理されても良い。

この発明の別の面において、合成材料に付着した基底被覆は、同時に少なくとも１分子の二官能性架橋剤に結合することが出来る。この具体例において、その方法は、血栓形成阻害物質に架橋した薬剤を更に基底被覆に結合された薬剤に詰合せ、それによって血栓形成阻害物質を材料に付着した基底被膜層に架橋結合することを含む。

この発明の更に他の面において、この基底被覆を、合成の生体適合性材料に架橋する前に、血栓形成阻害物質に架橋する。

可溶性薬剤又は複合体は、血栓形成阻害物質をキャリアーに固定化することにより製造される。この発明の好ましい面において、固定化は、阻害物質を、二官能性架橋剤の少なくとも１分子と、膣剤が阻害物質と架橋するのに十分な時間にわたって接触させることを含む、このキャリアーを、次いで、阻害物質が架橋した剤と結合させる。別法として、或は、更に、該キャリアーを架橋剤と接触させ、次いで、膣剤を介して阻害物質に又は剤と架橋した阻害物質に結合させる。

この発明の他の面において、基底被膜層と架橋した又はキャリアーと架橋した薬剤を、結合ステップの前に、還元する。その結果の露出したスルフヒドリル基を、次いで、阻害剤と架橋した剤と接触させる。還元は、阻害剤と架橋した二官能性架橋剤と、ジスルフィド結合を形成する置換反応により反応できるスルフヒドリル基の形成を基底被覆又はキャリアー上にもたらすが、そのジスルフィド結合により、血栓形成阻害物質が基底被膜層又はキャリアーに共有結合的に架橋される。

この発明は、次に、ある図解された具体例に関して述べられるであろう、しかしながら、様々な変更、追加及び削除が、この発明の趣旨又は範囲から離れずに行われ得ることは明らかであろう−０の　な１日この発明の前述の及び他の目的、それらの様々な特徴は、それらの発明と同様に、下記の記述を、付随する図面と共に読むことにより、より十分に理解されるであろう。

図１は、血栓形成に関係する経路の図解である。

図２は、血栓形成に関係する血小板の図解であり、図３は、天然のヒルジンのアミノ酸配列の図式であり、及び図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃは、ＨＰＬＣ分離したヒルジン−アルブミン複合体の光学的走査の図式であり、及び図５Ａは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの写真表示であり、図５Ｂは、ＨＰＬＣ精製して分離した可溶性ヒルジン−アルブミン複合剤のオートラジオグラムの写真表示である。

日の　ｔ　日この発明は、血管系に接触する移植可能な及び体外の装置に有用な生体適合性の血栓抑制性の物質、及びそれらの製造方法を提供する。

この発明により提供される物質は、その材料の表面に付着した生体適合性の基底被膜層を介してそれに架橋した血栓形成阻害物質を有する生体適合性の合成物質を含む。

人工器官の体外の又は移植可能な装置において有用な材料は、任意の、生体適合性の、合成の、好ましくは、血液循環の過酷な作業に耐えるために十分な引っ張り強さを持ち、基底被膜層が直接又は間接に結合し得る基を有する高分子材料から成るであろう。そのような合成材料の例は、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン）、ポリエチレンテレフタレート、ナイロンなどである。この材料は、用いられる目的に応じて適切な寸法を取り得るであろう。例えば、それは、移植された心臓弁又は血液透析や心肺バイパス外科手術に有用な体外の装置の不可欠な部分であり、又はカテーテルを被覆したり移植血管の内側を裏打ちするのに用いられるであろう。

この合成材料は、得られたときには、様々な非共有結合的に付着した不純物で被覆され又はそれらを含み、それらの除去が基底被膜層の付着の前に必要であろう。例えば、商業的品質のポリエチレンテレフタレート上の潤滑剤は、ポリエチレンテレフタレートを、例えば、様々な洗浄剤、溶剤又は塩を含む溶液に接触させることにより除かれ得るが、それらは不純物を解離させ、そして／又は可溶化する。

表１及び２は、生体適合性の血栓抑制性の物質の代表的な製造方法のあらましを示す、ここに、“Ｄａ”は、織られたポリエチレンテレフタレート繊維から成る合成材料を、“ＨＳＡ”は、ヒト血清アルブミンを、“ＥＤＣ”は、カルポジイオニドを、そして“Ｐ＝２−Ｔ”は、ピリジン−２−チオンのことを言う。

ステップ＃　工１）　Ｄａ　＋　ＮａＯＨ−−−−＞　Ｄａ−ＣＯＯＨ２）　Ｄａ−ＣＯＯＨ＋　ＥＤＣ−−−−＞　Ｄａ−ＥＤＣ３）Ｄａ−ＥＤＣ＋ＨＳＡ−−−−＞Ｄａ− Ｈ３Ａ十尿素（ＥＤＣ副生物）４）　Ｄａ−ＨＳＡ　＋　５ＰＤＰ　−−−−＞　Ｄａ−ＨＳＡ−３ＰＤＰ５）　Ｄａ−）１ｓＡ−３ＰＤＰ　＋　ＤＴＴ　−−−−＞　Ｄａ−ＨＳＡ−３Ｈ＋　Ｐ−２−７６）　阻害物質＋５ＰＤＰ−−−−＞阻害物質−３ＰＤＰ７）　Ｄａ−ＨＳＡ−３Ｈ÷阻害物質−３ＰＤＰ　−−−−＞Ｄａ−ＨＳＡ−３−３−＋　Ｐ−２−Ｔ罠ニステップ＃　工１）　ＨＳＡ　＋　５ＰＤＰ　−−−−＞　）ＩｓＡ−３ＰＤＰ２）　ＨＳＡ− ＳＰＤＰ　＋　ＤＴＴ　−−−−＞　ＨＳＡ−３Ｒ＋　Ｐ−２−Ｔ３）　阻害物質＋５ＰＤＰ−−−−＞阻害物質−５ＰＤＰ４１　ＨＳＡ−３Ｈ十　阻害物質− ３ＰＤＰ−−−−＞　ＨＳＡ−Ｓ−３−阻害物質十Ｐ−２−Ｔ５）　Ｄａ　＋　ＮａＯＨ−−−−＞　Ｄａ−ＣＯＯＨ６）　Ｄａ−ＣＯＯＨ＋　ＥＤＣ−−−− ＞　Ｄａ−ＥＤＣ７）　Ｄａ−ＥＤＣ＋’Ｈ３Ａ−３−３−阻害物質−−−−＞　Ｄａ−ＨＳＡ−３−５− ＋　尿素（ＥＤＣ副生物）最初に、材料を基底被膜層の結合を増大させるように活性化することが出来る。

この活性化ステップは材料中の化学的に活性な基の数を増す。例えば、アルカリ性の加水分解は、カルボジイミドなどの二官能性の架橋剤が結合するポリエチレンテレフタレート中の反応性のカルボン酸基の数を増すように行われる。最後に、基底被膜層が、材料上に結合したカルボジイミド基に付着する。

しかしながら、この方法は注意して行われなければ成らない。なぜなら、アルカリ性の加水分解は部分的に、ポリエチレンテレフタレートを分解し、その結果この材料の繊維をすり減らすからである。

少な（とも一つの基底被膜１を、合成材料の少なくとも一つの面に付着する。

この材料に付着した又は結合していない層は血栓形成阻害物質の付着のための成分を提供する。そのような成分は、阻害物質のための結合部位を合成材料単独よりも多く提供し、それによって、結合し得る阻害物質の量を増大させる。有用な成分は、蛋白質、ペプチド、リポ蛋白質、糖蛋白質、グリコサミノグリカン、合成ポリマー及びそれらの混合物を含む、血清アルブミン及びフィブロネクチンなどの蛋白質はそれら自身が抗血栓形成特性を持つことが知られているのでこの目的のために特に有用であり、基底被覆成分として非常に望ましい（Ｌｙｍａｎら　、（１９６５）Ｔｒａｎｓ、Ａｍ、Ｓｏｃ、Ａｒｔｉｆ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒｇａｎｓ、　１１巻　：３０１頁ＨＦａｌｂら（１９７１）Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　、　３０巻、１６８８頁）。例えば、ＨＳＡ分子は、結合部位として利用できる６５アミノ基を有する。

人工表面への基底被膜層の付着は、自然には、共有結合であろう。蛋白質のポリエチレンテレフタレートへの共有結合の方法は、架橋剤の遊離の反応性スクシンイミドエステル基の蛋白質上の一級アミノ基への攻撃を含む。表１の例に示されるように、基底被膜層をポリエチレンテレフタレートに共有結合的に付着させるために、ポリエチレンテレフタレートを、最初に、０．５ＮＮａＯＨで処理し、そして、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中においてＨＳＡ　（基底被覆）で被覆する前にカルボジイミドと反応させる。

血液、体液又は組織と接触する表面の被覆として有用な血栓形成阻害物質を、次いで、その成分を介して共有結合的に基底被膜層に付着する。阻害物質で被覆された物質は、直接血液と接触する装置において移植可能な利用に理想的である。

例λば、血管の代用に用いられるバイパス移植片は、しばしば、血液の塊即ち血栓で満たされ、その結果、血流が制限される。阻害物質で被覆された物質は血液の塊の形成に抵抗するので、血栓症及び続いて起こるバイパス移植片の閉塞が予防される。同様に、カテーテルが診断又は治療目的で血管系に入れられると、血塊がしばしばカテーテルの外側に形成される。

血塊は血流によりカテーテルから洗い落とされるか又はカテーテル操作により揺すり落とされ、塞栓症及び生体器官への循環の閉塞の可能性を増す。阻害物質で被覆された物質は、人工の心臓弁、大動脈内バルーンポンプ、全心臓即ち人工心臓、又は心臓補助装置、大静脈内装置、及び血流と接触する任意の装置に同様の利点を与える。更に阻害物質で被覆された装置は、腹腔内透析用カテーテル及び皮下移植片などの腔内装置に利点を与え、血栓形成による炎症反応が減少する。

同様にして、表３及び４に、可溶性の薬剤を製造する模範的方法を略述する。ここに、ｒＳＭＣＣＪは、「スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート」を示す。

１ニステップ＃　工１）　ＨＳＡ　＋　Ｔｒａｕｎｔ試薬　−−−−＞　ＨＳＡ−３Ｈ２）　阻害物質＋ＳＭＣＣ−−−−＞阻害物質−３ＭＣＣ３）　ＨＳＡ−５Ｈ十　阻害物質− ＳＭＣＣ−−−−＞−ＳＭＣＣ−ＨＳＡ憑二± ステップ＃　工ｌ）　阻害物質＋Ｔｒａｕｎｔ試薬　−−−−〉阻害物質−５Ｈ２）　ＨＳＡ　＋　ＳＭＣＣ−−−−＞　ＨＳＡ−ＳＭ（：Ｃ３）　阻害物質−３Ｈ＋　ＨＳＡ −ＳＭＣＣ−−−−＞　−ＳＭＣＣ−ＨＳＡこれらの目的に有用な血栓形成阻害物質は、ヒルジン及びその活性アナログ、活性フラグメント、活性誘導体及びそれらの活性融合生成物並びにそれらの混合物を含む。ヒルジンは、ヒルの唾液から単離された蛋白質であり、そのアミノ酸配列を図３に示す。ヒルジンは、血小板の粘着性を減少させることが示されたが、それは、恐らくトロンビンに対する作用の様式に帰される特性である。この特性は、単独で、ヒルジンを、合成表面を血液と調和させる場合に、最も魅力のある抗凝固剤にする。

それは又、蛋白質加水分解性であり、繊維芽細胞に対する分裂促進剤であり、血小板を活性化し、及び単核細胞及び多形核白血球に対する走化性を有するトロンビンの能力を選択的に阻害する。更に、固定化ヒルジン−トロンビン複合体は、トロンビン媒介の走化性の事象をダウンレギニレートすることが出来る。これは、慢性的炎症が、解剖学的部位において影響を示す移植片の至る所で、多形核白血球による分解酵素及びスーパーオキシドの放出によって起こり得るので、重要な事象であり、吻合増殖の原因となる。

多くの合成及び組換えのヒルジンアナログ（例えば、スイス国、　Ｂａ５ｅ１．Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙによる組換えＤＮＡ技術により生成されたＣＧＰ３９３９３；ＰＣＴ　ＷＯ７９１００６３８；ＰＣＴ　ＷＯ３６１０３５１７）があり、それらは、少なくとも、血栓形成阻害物質として同様に有用である。

更に、全天然型又は全アナログ型と同じ生物学的活性を有するヒルジンの天然型又はアナログ型の活性フラグメントも又有用である。ヒルジンのＣ−末端フラグメントの活性の検討については、例えば、Ｋｒ５ｔｅｎａｎ　Ｓｋｙ等（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８８）　５２：１３７−１４１　）を、他のフラグメントの内、ヒルジンのＮ−末端フラグメントの：２０９−２１２）を参照されたい。

血栓形成阻害物質は直接又は間接に基底被覆又はキャリアー上に、二官能性架橋剤の使用により固定化される。特に、線形分子の各末端に二つの異なる反応性の基を持ち、それ故、他の分子上の又は同じ分子の異なる領域の二つの異なる反応性の基に結合できるヘテロニ官能性の架橋剤は、二官能性架橋剤として最も有用である。

例えば、スルホスクシンイミジル２−（ｍ−アシド−０−ニトロ−ベンザミド） −エチル−１，３°−ジチオ−プロピオネート（ＳＡＮＤ）又はＮ−スクシンイミジル−６−（４−アゾイド−２°−ニトロフェニル−アミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）などの光反応性の架橋剤は光化学カップリングにより基底被覆のＣ−Ｈ結合に直接挿入し得る光反応性の基を持つが、他方、他の基は蛋白質への結合のために遊離のままでいる。

他の有用且つ好適な架橋試薬（ＳＰＤＰ及びＳＭＣＣ等）及びそれらの特性を表５に示す。各試薬に対して記された“二重薬剤番号”は、その試薬をＰｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａＩＣｏ、（イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）から購入するための商品名である。

艮旦１！！（Ａ部）２１５５１　ＡＮＢ−ＮＯＳ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２０１０６　ＡＰＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２０１０７　ＡＰＧ　Ｘ　Ｘ２１５５９　ＡＰＴＰ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２１５７９　ＢＳ’　Ｘ　Ｘ２２３１９　８ＭＩ（Ｘ　Ｘ２１５５４　Ｂ５０ＣＯＥＳ　Ｘ　Ｘ２１５２４　ＤＦＤＮＢ　Ｘ　Ｘ２００４７　ＤＩＤＳ　Ｘ　Ｘ２０６６４　ＤＭＡ　Ｘ　Ｘ２０６６６　ＤＭＰ　Ｘ　Ｘ２０６６８　ＤＭＳ　Ｘ　Ｘ２２５１１１５　ＤＳＰ　Ｘ　Ｘ２１５５５　ＤＳＳ　Ｘ　Ｘ２０５９０　ＤＳＴ　Ｘ　Ｘ２０６６５　ＤＴＢＰ　Ｘ　Ｘ２２５９０　ＤＴＢＰＡ　Ｘ　Ｘ２１５７７　ＤＴＳＳＰ　Ｘ　Ｘ２１５５０　ＥＡＤＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２１５６５　ＥＧＳ　Ｘ　Ｘ２３７００　ＦＮＰＡ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２１５６０　ＨＳＡＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ罠旦Ａへ皿工秋皇Ｌ２６０９５　ＭＡＢＩ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２２３１０　ＭＢＳ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２７７１５　Ｎ）Ｉｓ−ＡＳＡ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２０６６９　ＰＮＰ−ＤＴＰ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２１５５２　５ＡＤＰ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２１５４９　５ＡＮＤ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２２５８８　５ＡＮＰＡＨＸ　Ｘ　Ｘ２７７１６　５ＡＳＤ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２２３２５　５ＩＡＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２２３２０　ＳＭＣＣＸ　Ｘ　Ｘ２２３１５　ＳＭＰＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２１５５７　５ＰＤＰ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２１５５６　５ｕｌｆｏ− ＢＳＯＣＯＥＳ　Ｘ　Ｘ２０５９１　５ｕｌｆｏ− ＤＳＴ　Ｘ　Ｘ２１５５６　５ｕｌｆｏ− ＥＧＳ　ｘ　Ｘ２２３１２　Ｓｕｌｆｏ− ＭＢＳ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２１５５３　５ｕｌｆｏ− ＳＡＤＰ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２２５８９　５ｕｌｆｏ− ３ＡＮＰＡＨＸ　Ｘ　Ｘ２２３２７　５ｕｌｆｏ− ＳＩＡＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２２３２２　Ｓｕｌｆｏ− ＳＭＣＣＸ　Ｘ　Ｘ２２３１７　Ｓｕｌｆｏ− ＳＭＰＢ　Ｘ　Ｘ　Ｘ２６１０１　ＴＲＡＵＮＴ’Ｓ　Ｘ　Ｘ災Ｌｉ１（Ｂ部）ＡＮＢ−ＮＯＳ　Ｎ−５−７７ドー２−ニトロペンゾイルオキシスクシンイミドＡＰＢ　ｐ−ｙノドフェナシル１０ミドＡＰＧ　ｐ−７ノドフエニルクリオキサルＡＰＴＰ　ｎ−４−（アジドフエニルチオ）７タルイミドＢＳ”　ビス（スル本スクシンイミジル）スペレートＢＭＨビス７レイミドヘキサノＢ５０ＣＯＥＳ　ビス［２−（スクノンイミドオキシヵルボニルオキシ）−エチルｌスルホンＤＦＤＮＢ　１，５−シフＬｔＵ−２．４−ジニトａベンゼンＤＩＤＳ　４，４ ’−ジイソチオン１ノー２，２°−ジ１４本ン酸スチルベンＤＭＡ　ジメチル？７ピミデー１２　８ＣＩＤＭＰ　ジメチルビメリミデート−２８ＣＩＤＭＳ　ジメチルスベリミデート−２１（ＣＩＤＳＰ　ジチオビス（スクシンイミジル１ａと才７一ト）ＤＳＳ　ジスクシンイミジルスベレートＤＳＴ　ンスクシンイミジルタルタレートＤＴＢＰ　ジメチル　３，３°−ジチオビスプロピオンイミデート−２−ＨＣＩｒ）ＴＢＰＡ　４，４°−ジチオビスフェニルアジドＤＴＳＳＰ　３．３−ジチオビス（スルネスクシンイミジループロピオ１−ト）Ｅｉ　Ａ　Ｄ　Ｂ　エチル−４−アジドフェニル　１．４−ノチオープチルイミデートＦ’ ＧＳ　エテグリコールビス（スクシンイミンルースクノネート）Ｆ’ＮＰＡ　１ −アジドー４−フルオロ−３−二トロペン士ンＨＳＡＢ　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾ工−トＭＡＢＩ　メチル−４−１シトベンゾイミデ一トＭＢＳ　ｍ−？レイミドベンゾイルーＮ−ヒドロキシスル本−スクシンイミドエステルＮＨ３−ＡＳＡ　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミンルー４−１７ドサリチル　酸ＰＮＰ−ＤＴＰ　ｐ−ニトロフェニル−２−ジ１シー３．３．３−トリフルオロ− プロピオネート５ＡＤＰ　Ｎ−スクシンイミジル（４−１クシドフエニル）−１，３°−ジチオプロピオネート５ＡＮＤ　スル本スクシンイミジル　２−　（＋ｏ−７ンドー○−ニトローペンスアミド）−エチル−１，３°−ジチオプロピオネート５ＡＮＰＡＨＮ−スクシンイミジル−６（４°−アンド−２”−ニトロ−フェニル−アミノ）ヘキサノエート５ＡＳＤ　スル本スクシンイミジル　２−（ｐ−？ジＦサリチル−７ミド）エチル−１，３°−ジチオプロピオネート５ＩＡＢ　Ｎ−スクシンイミジル（４−イオドア七チル）１ミノ−ベンゾエートＳＭＣＣスクシンイミジル　４−（Ｎ−７レイミドメチル）−シクロヘキサンー１−カルボキシレートＳＭＰＨスクシンイミジル　４−１ｐ−７レイミドフエニル）−ブチレート５ＰＤＰ　Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート５ｕｌｆａ−ビス［２− （スル本スクシンイミドオキシ−カルボニル−ＢＳＯＣＯＥＳ　オキシ）エチルｌスルホン５ｕｌｆｏ−ＤＳＴ　ジスル本スクシンイミジルタルタレート５ｕｌｆａ−εＧＳ　１チレンクリコールビス（スルネスクシンイミジルースクシネート）Ｓｕｌｆａ−ＭＢＳ　ｍ−７レイミドペンゾイルーＮ−ヒドロ〜ノスル本− スクシンイミドエステル５ｕｌｆａ−ＳＡＤＰ　スル本スクシンイミジル（４−１ジドフエニルノチオ） −プロピオネート５ｕｌｆｏ−５ＡＮＰＡＨスル本スクシンイミジル　６−（４ °アソドー２°−ニトロ−フェニルアミノ）ヘキサノエート５ｕｌｆｏ−３ＩＡＢ　スル本スクシンイミジル（４−イオドアセチル）アミノ −ベンゾエートＳｕｌｆａ−５ＭＣＣスル本スクシンイミジル　４−（Ｎ−マレイミド−メチル）ンクロへ〜サンー１−カル５キンレートＳｕｌｆｏ−３ＭＰＢ　スル本スクシンイミジル　４−（ｐ−７レイミドーフエニル）ブチレートＴＲＡＵＮＴ試薬　２−イミノチオラン−ＭＣＩ架橋剤は、所望の結合部位密度が達成されるような量で基底被覆に加えることが出来る。結合部位密度は、基底被覆に結合して表面の融合性範囲を与える架橋剤のモル／ｇ合成材料による量である。

阻害物質を基底被覆又はキャリアーへ結合するために、架橋剤が最初に基底被覆又はキャリアー及び阻害物質の両方に別々に結合することが出来る。阻害物質の動力学定数（ｋｉｎｅｔｉｃ　ｃｏｎｓｔａｎｔ）が、その処理のそれらの動力学定数に対する影響を評価するために、結合の前と後とで比較される。阻害物質は結合の後で生物的に活性であるべきである。それ故、固定化される阻害物質に特異的な標準的活性試験が、その能力を評価するために標準トロンビン溶液を用いて行われる。

別法として、基底被覆の成分は、合成材料への付着に先立って血栓形成阻害物質に結合されて複合体を形成し、その複合体は、表２に示されるように合成材料に結合され得る。更に、血栓形成阻害物質複合体は、生物活性を保持し、容易に腎臓で除去されないので、循環において半減期を増大するための薬剤として用い得る。更に、血栓形成阻害物質の、基底被覆の蛋白質成分又は他の蛋白質又は化合物による誘導体の生成は、阻害物質の活性を制御するために用い得る。

ヒルジンの５ＰＤＰ誘導体化の特定の場合には、ヒルジン上のある種の基の５ＰＤＰへの架橋は、それらの基の少な（とも幾つかが活性のために必要であるのでヒルジンの生物学的活性を破壊し得る。しかしながら、ヒルジンの５ＰＤＰに対する反応比（１：１、モル：モル）を調節することにより及び、反応を生理的ｐＨの近くで行うことにより、５ＰＤＰは、ニブシロンアミノ基に対して幾分選択的となる。これらの条件の結果は、ヒルジンの生物学的活性を破壊せず、１：１　（モル：モル）の結合比でのヒルジンの５ＰＤＰへの共有結合に有利である。

５ＰＤＰは、末端並びにニブシロンアミノ基と反応するであろうが、末端アミン基の誘導体生成が生物的に活性な蛋白質を不活性化できるので、Ｔ−ＢＬＯＣＫ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）が、５ＰＤＰ−誘導体生成においてその基をブロックするのに用いられるであろう。Ｔ−ＢＬＯＣＫは、それから、生物活性を回復させるための誘導体生成の後で除去される。

可溶性ヒルジン複合体は、多（の利用を有する０例えば、可溶性ヒルジン複合体は、イン・ビトロ臨床分析用の血漿を得るための血液の凝固を防止するために用いることが出来る。血液の凝固防止は、静脈血栓症、肺動脈塞栓症、動脈血栓症を患った患者又は、血管形成術若しくは血管用デバイスの挿入を受けている患者において望ましい。ヒルジンで凝固を防止した血漿は、血漿分析をカルシウムの存在下で行なうことが出来、ヘパリンの有害作用がないという利点を有する。

更に、安定な可溶性分子に結合したヒルジンは、血流中でのヒルジンの安定性を増す。例えば、０．１抗トロンビン単位（ＡＴＵ）のヒルジン複合体標準（血液１ｍｌ中）は、正常トロンビン時間を４５秒に増加させる。

０．２ＡＴＵの未結合ヒルジン／ｍｌ含有血液試料は、患者のトロンビン時間を９０秒に増加させる。この知識を用いて、もし患者のトロンビン時間が６８秒と測定されたならば、患者の血漿中のヒルジンの量を０．１５ＡＴＵであると計算することが出来る。

ヒルジンは、組織プラスミノーゲン活性化剤、ストレプトキナーゼ又はその他の血栓形成阻害物質等の血栓崩壊剤と架橋することが出来る。この阻害物質／薬剤複合体は、その抗凝固作用を維持する利点を有し、強力な血栓崩壊の利益を有する。この発明は、ヒルジン複合体のトロンビンに対する強力な結合定数（Ｋ、＝ｌ　６Ｘ１０−１１Ｍ）及び多量のトロンビンが血栓のマトリックス中に含まれていることを利用している。このマトリックス結合トロンビンは、複合体のヒルジン成分を引きっけ且つ阻害される。−例において、ストレプトキナーゼ部分は、血栓崩壊を誘導し且つ血栓を溶解させる。

この発明は、下記の非制限的な実施例によって、更に、理解されるであろう。

大」１糺工Ａ、ポリエチレンテレフタレートの！　び゛ポリーエチレンテレフタレートポリエステル５２（ＤｕＰｏｎｔ）を１．Ｏｃｍ長に分割する。織物の表面及び内部の潤滑剤は、四塩化炭素で１時間１回及び１００％ＣＨ＊　ＯＨで２回洗うことにより除去する。メタノールを水で何度も洗い、次にりん酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７，４中で１回洗うことにより除去する。

この移植材料を、それから、利用できるＣ０ＯＨ基を増すためにアルカリで加水分解する。この材料を、０．５　Ｍ　ＮａＯＨで、５０℃で、１時間処理する。

それから、それをＨｇＯで繰り返し洗い、直ちに後続の工程を開始する。

Ｂ、　ポリエチレンテレフタレートのカルボジイミｊＪＩＪ本土活性化された材料を、脱イオン水中の、１００．０ｍｌの１０ｍＭ水溶性ＥＤＣ（ｐＨ４，６−５，０）中に、定速で攪拌しながら、１時間、室温に置く。この材料を取り出し、そしてＰＢＳ中で洗い、過剰の未結合ＥＤＣを除去する。

Ｃ９ン基底被覆をポリエチレンテレフタレート移植材料の内腔に塗布する。誘導体化されたポリエチレンテレフタレート材料を、ＰＢＳ中の５％Ｈ５Ａ溶液中で、１ｍｌ／　ｃ　ｍ　”移植材料で、室温で、定速攪拌しながら、２４時間インキュベートする。その移植片を取り出し、非特異的に結合したＨＳＡを除去するためにＰＢＳ中で洗う。ポリエチレンテレフタレート１ｍｇ当たり約２μｇの蛋白質が共有結合する。

Ｄ、５ＰＤＰの　への　ＡＨＳＡ−結合ポリエチレンテレフタレート材料を、ＰＢＳ中の５ＰＤＰの１．０ｍＭ溶液、ｐＨ７，４中でインキュベートし、５ＰＤＰをＨＳＡに結合させる（１００ｍＭ　５ＰＤＰ／ｃｍ”基底被覆）、インキュベーションを室温で３０− ４０分後に停止する。移植片をＰＢＳで洗い非特異的に結合した５ＰＤＰを除去する。

Ｅ、　の５ＰＤＰの゛　び　Ａｅｌ亡・　の■ ５ＰＤＰ架橋された材料を乾燥し、重量測定してその絶対重量（ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｗｅｉｇｈｔ　）を得る。それを、それから、５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液中に、室温で５分間置く。この反応は、Ｐ−２−Ｔを結合した５ＰＤＰから遊離させ、同時に、遊離のスルフヒドリル（ＳＨ）基を基底被覆上に形成する。遊離されたＰ−２−丁を、吸光係数（Ｅ＝８．０８ＸＩＯ”　）を用いて、３４３ｎｍにおける吸光分光分析（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）により定量するが、それは、結合した５ＰＤＰ又は結合部位の量に直接比例する。結合部位の数を計算し、部位のモル数／ポリエチレンテレフタレートのｇ数で表す。

この材料を、それから、ＰＢＳ中で５回、ｄＨ□Ｏ中で４回洗う。

Ｆ、５ＰＤＰのヒルジンへの　ム凍結乾燥されたヒルジンをＰＢＳ中に、１ｍｇ／ｍｌに再懸濁する＊　Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ　）をｉｏｏ％ＥｔＯＨに１０ｍＭに溶解する。１部ノヒルジンを４部の５ＰＤＰに混合しくモル：モル）、室温で３０分インキュベートする０次いで、５ＰＤＰ結合ヒルジンを遊離の５ＰＤＰ及び反応副産物からＧ−２５カラム上で分離する（誘導体化されたヒルジンは早く溶出す５ＰＤＰのとルジンへの結合は、Ｐ−２−Ｔをヒルジンに結合した５ＰＤＰから遊離させるＤＴＴの添加により定量できるが、それは３４３ｎｍにおいて分光測光により測定出来る。この測定から、ヒルジンに結合した５ＰＤＰのモル数を計算出来る。遊離される各Ｐ−２−Ｔの量は、１つの５ＰＤＰのヒルジンへの共有結合を表す。この研究において、１．２モルの５ＰＤＰ当り１モルのヒルジンが結合する。

Ｈｌ　゛　ヒルジンの　への　４（遊離のＳＨ基を持つ）還元５ＰＤＰ架橋基底被覆をＤＴＴを除去するためにＰＢＳで洗う、５ＰＤＰ架橋ヒルジンを、それから、移植片に約５０．０部ｇ　／　ｃ　ｍ　”ポリエチレンテレフタレートで加える。その溶液を、−晩、室温で、５ＰＤＰ−ヒルジンをポリエチレンテレフタレート移植片上のＳＨ基に結合させるためにインキュベートする。このヒルジンが共有結合的に固定化されたポリエチレンテレフタレート材料を、それからＰＢＳで洗い、ＰＢＳ中に保存する。

■、立逝１、分光測光分析：基底被覆上に固定化された５ＰＤＰ−ヒルジンの量を定量するために、５ＰＤＰ −ヒルジンをポリエチレンテレフタレートに加えたときの溶液の吸光度の読み取りを３４３ｎｍで行なう。−晩のインキュベーション期間の後に、別の吸光度の読み取りを行ない、吸光度の変化は５ＰＤＰ−ヒルジンから遊離されたＰ−２− Ｔの量によるものである。遊離されたＰ−２−Ｔの量は、基底被覆ＳＨ基と５ＰＤＰ−ヒルジンとの間に生じた５ＰＤＰ置換反応の数に直接比例する。

２、トロンビン阻害の分析既知のトロンビン量を用いて、ヒルジンをトロンビンに加え且つクロマトグラフィー基質Ｓ−２２３８を用いて残留トロンビン活性を測定することによりヒルジン又はヒルジンアナログの既知量について標準曲線を作成する。次いで、誘導体化したヒルジン（ヒルジン−５ＰＤＰ）又は固定化したヒルジン（固定化ヒルジンを有するポリエチレンテレフタレート材料）によるトロンビン阻害を、ｌ０ＮＩＨ単位／ｍｌのトロンビンを用いてＥＤ５０値を等しくし且つ残留トロンビン活性を測定することにより非誘導体化ヒルジンの値と比較する。

１１旦ユＡ、ヒルジン−ＳＭＣＣの−゛３ｍｇのヒルジンアナログ（スイス国、Ｂａ５ｅｌ在、Ｃ：ｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ社）を珪硼酸ガラス製試験管に入れる。

＋１ｆｉニーヒルジンの０．６２ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌを加λる（３ｍｇのヒルジン含有）、３．５３ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度をローリ−の蛋白質分析により測定し、６゜３４Ｘ　１０’　ｃｐｍ／ｍｇの比活性をガンマ−計数により計算する。５ｍｇのスルホスクシンイミジル４−　（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆａ−ＳＭＣＣ；イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ在、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｃｉｃａｌ　Ｃｏ、　）を、１ｍｌのリン酸緩衝液（０，１リン酸カリウム（二塩基性）、Ｏ，１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７，４）を含む珪硼酸ガラス製試験管に入れる。ＳＭ　ＣＣ溶液を時折攪拌して１５分間にわたって室温に置く。１：８（そル：モル）のヒルジンのＳＭＣＣに対する比を得るために、ヒルジン混合物を攪拌しながら、０．３６ｍ１のＳＭＣＣを１ｍｌの１２＠ニ一ヒルジン混合物に加える。ヒルジン−ＳＭＣＣ混合物を、時折攪拌して室温で３０分間インキュベートする。インキュベーション期間の間、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰＤ−１０５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃｏ１ｕｒｎｎにュージャージー州、　Ｐｉｓｃａｔｗａｙ在、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）をリン酸緩衝液で平衡化する０次いで、１時間のインキュベーション期間の後に、このカラムを用いて遊離のＳＭＣＣからヒルジン−ＳＭＣＣを分離する。ヒルジン−ＳＭＣＣ混合物を、次いで、旋回シェーカー（水浴温度＝３７℃）に入れて３０分間にわたって時折攪拌する。

カラム中の残留リン酸緩衝液を排出して、ヒルジン−８ＭＣＣ′ａ合物をカラムに加える。この混合物を、次いで、リン酸緩衝液で溶出する。国分を珪硼酸ガラス製試験管に集め、各画分の吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＤＯ−６４Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　（カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ在、Ｂｅｃｋｍａｎ社）を用いて２８０ｎｍで読む。最初のピーク画分（ヒルジン−ＳＭＣＣ）をプールして２８０ｎｍの吸光度を読む、プールした画分の蛋白質濃度を、ヒルジンについての消光係数（４，２５）及びガンマ−計数を用いて、１．４７＋／−０，１８ｍｇ／ｍｌ　（ｎ＝２）と測定する。

州、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ在、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、）を、１ｍｌのリン酸緩衝液を含む珪硼酸ガラス製試験管に入れる。９ｍｇの２−イミノチオラン−ＨＣｌ　（Ｔｒａｕｎｔ試薬、イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ在、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ＋ｏＬｃａｌ　Ｃｏ、　）を、１ｍｌのリン酸緩衝液を含む珪硼酸ガラス製試験管に入れる。１：２０（そルコそル）のＢＳＡのＴｒａｕｎｔ試薬ｉこ対試薬比を得るために、Ｏ，１ｍｌのＴｒａｕｎｔ溶液を、ＢＳＡ溶液を攪拌しなからＢＳＡ溶液に加える。このＢＳＡ−Ｔｒａｕｎｔ溶液を室温で３０分間インキュベートする。インキュベーション期間の間、ＰＤ−１０５ｅｐｈａｄｅｘカラムにュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ在、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を上−記と同じ平衡化を用いて平衡化するｅ　Ｂ　Ｓ　Ａ　−Ｔｒａｕｎｔ溶液を、次いで、旋回シェーカー（水浴温度＝３７℃）に移し、３０分間にわたって時折攪拌する。　ＰＤ−１０カラム中の残留リン酸緩衝液排出し、Ｂ　Ｓ　Ａ　−Ｔｒａｕｎｔ溶液をカラムに加える。この溶液を、次いで、リン酸緩衝液で溶出する。１２の１ｍ１画分を珪硼酸ガラス製試験管に集める。各画分の吸光度を分光光度計を用いて２８０ｎｍで読む。最初の３つのビーク画分（ＢＳＡ−３Ｈ）をプールし、２８０ｎｍの吸光度を読む、ＢＳＡの消光係数を用いて、９．６ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＳＨがプールしたＢＳＡ−ＳＨ画分中に存在すると計算する。

Ｃ，ＢＳＡ−ＳＭＣＣ−ヒルジン　Ａ　の−ＢＳＡ−ＳＨをヒルジン−ＳＭＣＣに結合するために、１：１　（モル：モル）比を用いる。１．５ｍｌのＢＳＡ− ＳＨを１．５ｍｌのヒルジン−３ＭＣＣ溶液に加える。この溶液を混合し、次いで、−晩室温に置（。

Ｄ、ＢＳＡ−ＳＭＣＣ−ヒルジン　人　の複合体を他の不純物（即ち、未結合ヒルジン−５ＭＣＣ１遊離ＳＭＣＣ及びＢＳＡ凝集物）から分離するために、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　にュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）の５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラムに接続した５ｈｉａ＋ａｄｚｕ　（マサチューセッツ州、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ　）のＬＣ６Ａ　ｌ（ｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒ＋＋＋ａｎｃｅ　ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ　（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）を用いてＨＰＬＣを行なった。このカラムを、ＨＰＬＣ等級のリン酸緩衝液（０゜１Ｍ　リン酸緩衝液、０．１Ｍ　塩化ナトリウム　ｐＨ７，４）で、流速０．４ｍｌ／分で１．５時間にわたって、平衡化する。平衡化の後に、１．５ｍｇ／ｍｌのアルドラーゼ（分子量＝１５０ｋＤ）　、６．０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ　（分子量＝６７ｋＤ）及び１．５ｍｇ／ｍｌのりポヌクレアーゼＡ（分子量＝１３ｋＤ）にュージャージー州、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ在、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）からなる１ｍｌの低分子量のトリー標準溶液を調製する。

図４Ｃは、ＨＰＬＣによる複合体の精製を、低分子量の標準（図４Ａ（７）ビーク１は１５０ｋＤ、ビーク２は６７ｋＤ、及びビーク３は１３ｋＤである）及び精製した組換えヒルジン標準（図４Ｂのビークｌは６９６５Ｄである）と比較して示している０図４Ｃのビーク１．２及び３から単離した物質は、分子量３００ｋＤ、１６０ｋＤ及び７０ｋＤを有する。ビーク１及び２の単離物質は、アルブミン複合体の凝集物であるが、他方、ビーク３の物質は、１：５のモル対モル比でアルブミン；ヒルジン複合体を形成している。誘導体化したヒルジンが予め表面に結合したアルブミンキャリアーに架橋しているので、ビークｌ及び２の物質におけるものと類似の凝集物は、プロテーゼ表面に形成し得ない。

ＨＰＬＣ分離の確認を、図５Ａ及び図５Ｂにそれぞれ示すように、ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーによって示すことが出来る０図５Ａに示すゲルにおいて、レーンＡは、動力学的研究に用いたＨＰＬＣのビーク３（図４０参照）であり、レーンＢは、ＨＰＬＣのビーク２（図４０参照）の約２００ｋＤの複合体凝集物であり、レーンＣは、ＨＰＬＣのビーク１　（図４０参照）の約１ｋＤの大部分のアルブミンと痕跡量のヒルジンとの凝集物であり、レーンＤは、ＨＰＬＣ分離前の　Ｉｔ％ニーヒルジンとアルブミンとの複合体混合物であり、レーンＥば、分子量標準（降順に、９６ｋＤ、６８ｋＤ、３６ｋＤ及び２９ｋＤ）であり、レーンＦは、ＨＰＬＣ分離前の　＋２”Ｊｆ−ヒルジンとアルブミンとの複合体混合物であり、レーンＧは、ウシ血清アルブミンであり、レーンＨは、低分子量標準であり、レーンエは、　１ｍｌニーヒルジンであり、及びレーンＪは、低分子量標準である。これらの分離分析は、何れの分析手段によっても遊離のヒルジンが検出されないので、優れた複合体安定性を示している。

これらの結果は、ヒルジン−アルブミン複合体がトロンビン媒介の血小板の凝集及び遊離を阻止することを示しており、血小板表面媒介の事象及びトロンビンの表面への吸着能を考えると重要な発見である。

動力学的研究と比較してヒルジン及び複合体によるトロンビン血小板凝集の阻止効力は、下記のＢ節の結果を生じる。これらの研究は、ヘテロ三官能性架橋剤でアル安定且つ永続的であり、２）トロンビンに強（且つ可逆的に結合し、３）トロンビン酵素活性を阻害する活性を殆ど失わず、及び４）トロンビン刺激された血小板凝集を阻止する活性を殆ど失わないことを示す。　−Ｅ、ヒルジン−アルブミン　ム　の　−　・ビーク３の複合物質（図４０及び図５ＡのレーンＡ参照）を動力学的分析によって評価する。ビーク３の複合体のトロンビン活性を阻害する能力の動力学的評価をヒルジン単独と比較する。ヒルジンは、線形混合型の非競争阻害剤であることが認められる。複合体は、純粋な非競争阻害剤であることが見出される。これらの測定は、ラインライ−バー−バーク及びディクソンプロットによって行なわれる。ヒルジンの阻害剤定数は、１．７×１０−目と測定される。複合体の阻害剤定数は、１．８×ｌ　Ｑ−Ｉ＋である。ヒルジンのに、値を複合体と比較すると結合親和性において１０倍の損失がある。生物系又は生理的系において、ヒルジンと複合体のトロンビンを阻害する能力の差は微々たるものである。

Ｆ、トロンビン　ハ　のアルブミンに共有結合したヒルジンの生物学的活性の研究を、トロンビン媒介血小板凝集を阻害することにより行なう。全血液血小板凝集針（ペンシルバニア州、Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ在、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ　Ｃａｒｐ、　）を用いて血小板凝集及び同時ＡＴＰ遊離を測定する。フィブリン生成以外のトロンビン事象の阻害を定量するために血小板凝集を選択する。結果を表６に示す。

Ｌ亙０、ＩＨ”１．１５　０　１００　０　１０００、Ｉ　Ｈｏ、１２　１５．７　５２　０．６０　５６０、ＩＣ’１．４６　０　１００　０　１０００、Ｉ　Ｃ０，７３０１（１００，２４８２０、Ｉ　Ｃ０，５５２６，６２０１，０８２１０、Ｉ　Ｃ０，３０２９，６１０１，１７１４ヒルジン単独及び＋１ｓｌ−ヒルジン−アルブミン複合体の両者により阻害されることを示している。同様に、ＡＴＰ遊離も又阻害される。（ヒルジンが０．１２ＡＴＵであり、複合体が０．５５ＡＴＬＩである結果を用いて）計算によれば、この複合体は、ヒルジン単独のときと比較して１０倍の阻害能力を失っている。これは、複合体化したヒルジンは、依然として、抗−トロンビン■（天然のトロンビン阻害物質）より約１０，０００倍強（トロンビンを阻害するので、小さい損失である。

この発明は、その精神又は本質的特性から離れることなく他の特定の形態で実施し得る０本願の具体例は、−れ故、すべての面で説明のためのものであり、制限す。

ものではないと解されるべきであり、この発明の範しは、前述の説明よりはむしろ添付の請求の範囲によっ一指定され、請求の範囲と等しい意味及び範囲に入るす・ての変形は、それ故、その中に含まれる。

トロンビン−コラーゲン−エピネフリン−表面時間（分）時間（分）Ｉ行〃ｔＩ槽吸光度１１１ｊｎｍノＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪＡＢＣＤＥＦＧ）Ｉ！、］国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．下記を含む、トロンビン生成及び血栓形成を阻止するための可溶性の生体適合性の薬剤；（ａ）蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、リポ蛋白質、糖蛋白質、グリコサミノクリカン、ヒドロゲル、合成ポリマー、及びそれらの混合物からなる群より選択する可溶性の生体適合性のキャリアー、及び（ｂ）前記のキャリアー上に共有結合的に固定化された血栓形成阻害物質（前記の阻害物質は、ヒルジン又はその活性アナログ若しくは活性断片である）。
２．前記の成分がポリペプチドを含む、請求項１に記載の剤。
３．前記のポリペプチドを、血清アルブミン、フィブロネクチン及びそれらの混合物からなる群より選択する、請求項２に記載の剤。
４．前記のポリペプチドが血清アルブミンを含む、請求項３に記載の剤。
５．前記のポリペプチドがフィブロネクチンを含む、請求項３に記載の剤。
６．前記の血栓形成阻害物質を前記のキャリアーに架橋させる二官能性架橋剤を更に含む、請求項１に記載の剤。
７．前記の二官能性架橋剤がヘテロ二官能性架橋剤を含む、請求項６に記載の剤。
８．前記のヘテロ二官能性架橋剤が３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを含む、請求項６に記載の剤。
９．前記の二官能性架橋剤がホモ二官能性架橋剤を含む、請求項６に記載の剤。
１０．トロンビン生成及び血栓形成を阻止するのに有用な可溶性の生体適合性の薬剤の製造方法であって、該方法は、血栓形成阻害物質を、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、リポ蛋白質、糖蛋白質、グリコサミノグリカン、ヒドロゲル、合成ポリマー及びそれらの混合物からなる群より選択する可溶性の生体適合性のキャリアー上に共有結合的に固定化する工程を含み、前記の阻害物質がヒルジン又はその活性アナログ若しくは活性断片である、上記の方法。
１１．前記の固定化の工程が下記の工程を含む、請求項１０に記載の方法：（ａ）前記の血栓形成阻害物質を少なくとも１分子の二官能性架橋剤と、該剤を前記の血栓形成阻害物質に架橋させるのに十分な時間接触させ、及び（ｂ）前記の血栓形成阻害物質と架橋した剤を前記のキャリアーに結合させる。
１２．前記の接触工程が下記を含む、請求項１１に記載の方法：（ａ）前記のキャリアーを少なくとも１分子の二官能性架橋剤と、該剤を前記のキャリアーに架橋させるのに十分な時間接触させ、及び（ｂ）前記のキャリアーと架橋した剤を前記の血栓形成阻害物質に結合させる。
１３．前記の接触工程が更に、前記の血栓形成阻害物質を少なくとも１分子の前記の二官能性架橋剤と、該剤と架橋するのに十分な時間接触させることを含み、及び前記の結合工程が更に、前記のキャリアーと架橋した剤を前記の血栓形成阻害物質と架橋した剤と結合させることを含む、請求項１２に記載の方法。
１４．前記の接触工程が、前記の血栓形成阻害物質をヘテロ二官能性架橋剤、ホモ二官能性架橋剤及びそれらの混合物からなる群より選択する二官能性架橋剤と接触させることを含む、請求項１１に記載の方法。
１５．前記の接触工程が、前記のキャリアーを、ヘテロ二官能性架橋剤、ホモ二官能性架橋剤及びそれらの混合物からなる群より選択する二官能性架橋剤と接触させることを含む、請求項１２に記載の方法。
１６．前記の接触工程が、前記の血栓形成阻害物質をヘテロ二官能性架橋剤、３ −（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと接触させることを含む、請求項１４に記載の方法。
１７．前記の接触工程が、前記の血栓形成阻害物質をヘテロ二官能性架橋剤、３ −（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
１８．更に、下記の工程を含む、請求項１１に記載の方法：（ａ）前記のキャリアーを還元してその上のスルフヒドリル基を露出させ、（ｂ）前記の露出したスルフヒドリル基を前記の阻害物質と架橋した剤と接触させ、及び（ｃ）前記のスルフヒドリル基と前記の阻害物質と架橋した剤との間の置換反応を誘導する（前記の反応は、前記のキャリアーの前記の阻害物質への架橋を生成する）。