CN106555006A

CN106555006A - 一种鉴定沙棘性别的scar分子标记及其应用

Info

Publication number: CN106555006A
Application number: CN201611080352.8A
Authority: CN
Inventors: 周武; 索有瑞; 胡娜; 赵越
Original assignee: Qinghai University
Current assignee: Huzhou Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: CN106555006B

Abstract

本发明提供了一种鉴定沙棘性别的SCAR分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，此分子标记通过核酸序列分别如SEQ NO ID.3和SEQ NO ID.4所示的特异性引物对扩增获得。本发明还提供了此SCAR分子标记和特异性引物对及含有上述特异性引物对的试剂盒在沙棘性别鉴定中的应用。本发明进一步提供了一种鉴定沙棘性别的方法，其以沙棘基因组DNA为模板，利用上述的特异性引物对进行PCR扩增反应，并检测扩增产物，若扩增出了885bp的特异性条带，则为雌株，若无，则为雄株。本发明方法可在苗期进行沙棘性别鉴定，可大大提高沙棘林的经济价值。

Description

一种鉴定沙棘性别的SCAR分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种鉴定沙棘性别的SCAR分子标记及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

沙棘为沙棘植物及其果实的统称，是具有药、食、固沙等多种用途的特色经济植物，富含多种维生素，素有“维生素宝库”之称。沙棘果实具有止咳祛痰，消食化滞，活血散瘀等功效。我国是沙棘资源大国，占世界沙棘资源量的90％。

沙棘为颓子科沙棘属多年生落叶性灌木，幼苗需成长3～4年后才开始开花结果。由于雌雄植株幼苗在生长发育期形态相似度极高，一般仅能通过其3龄后苗木是否挂果来辨别雌雄。天然沙棘林中，沙棘雌雄株比例基本保持在31.8％～51.4％之间，而雄株除了发挥授粉的生物学功能外几乎没有经济价值。由于缺乏沙棘植株幼苗早期雌雄鉴定相关技术加之缺乏规划，目前人工沙棘林雌雄株比例基本与天然沙棘林无异，沙棘雄株从生长势、空间、水肥吸收上占据绝对优势，不到5年时间就可使高产值的产果型沙棘林颓变为低价值的柴薪林，既浪费了早期宝贵的育林资金，由于结实率较低也没有获得更高的经济回报，降低了农牧民的直接收入和生产积极性。

由于仅有沙棘雌株挂果结实，缺乏沙棘植株幼苗早期雌雄鉴定相关技术人工沙棘林也如天然沙棘林不可能有整齐划一的雌雄分布，因此也难以采用机械化采集方法，因此，沙棘果实的采收方法目前主要是人工采收。沙棘果实采集多数采用剪枝的方式，这样在剪取二年生果枝的同时，把当年生的部分新枝条也剪了，对今后的果实产量有明显的影响，直接削弱了沙棘雌株的长势，同时剪枝留下的伤口和疤痕极易感染病虫害，也间接造成了对沙棘雌株的危害。同时，由于沙棘果实属于小型浆果，果实小、果柄短，再加上枝条带刺，给采果带来了较大的困难。采收季节需要的人员较多，劳动量较大，采收效率较低，成本相对较高，而且由于采收的沙棘质量参差不齐，收购单价较低，严重挫伤了群众采果的积极性。

因此，亟需一种快捷方便的沙棘性别的鉴定方法。

发明内容

本发明提供了一种鉴定沙棘性别的SCAR分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为885bp的核苷酸序列。

本发明涉及的SCAR分子标记的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为：CATCCGTGCTTGCATAGAATCCGCGTGGCTTTCTGATGCGTATTTTCGCAAGTGTATGAATCGTTCAAGTAATAAAGTGTACAAAAGTATGGATATCGAACCCACAAGGAATGGCATTACTAAGTACCGAAATTGACTAATCCTAATTTTATTTGAAAACCGAATTTTTGAATTTGTTTAAAAAGTAAATTAACTTAAAACTAACGCAAATAACAAAATTTAATGTTGTTCACAAATGATTAAAAACGCTAAGGCATTTGATTTCGCTAAATCAATTCAATCCGATTTCAAGTCATGTAATATGAGAATCAAAGTTAAAAGTGATGGTTGAAAAACCCAAATTTACCTAATACTCTCTCTCGAGTTATATTAGAATTACTTATCTATGAAAACCGACTACATTTCTATGAAGATTTAATCACAAACAAGCACATTACGATTTATGGAATTTCTAGAATAACCACATACATCATGCATTAGTTCTCACACTCGCATTCAACATACGGTATTTATCACAAGAAGCGTTCATTACACATCTCCTCTCGGTCTCAATATAATGCAACAAATCATTTAAATCTTGATTGATAAGAGCTAAATTATTGCATTTTTGTTATGATTTAAATGTTGATATTTGTGTGAAAATTGTGTTTATTTGATTATTTAATCCACAAATGTCATTTCACGGGTATTTCGTGTTTAAAGTGCAATTTCAGGTAAAATCATGATTTTGGAGAAGTTAGGGACAAAGTACAATGATCGGGATTGAATCAAAGAAAAAGAAAACAAAATTTCAAAATTTGGAATTTCGCCGCCGGCGAGAATATTCTCGCCGCCGGTGAAAACCTTACGGAGAAAATGTTGAAAATCTTCCCGAGAGCACGGATG。

进一步地，上述分子标记通过以下特异性引物对扩增获得，特异性引物对的核酸序列分别如SEQ NO ID.2和SEQ NO ID.3所示，SEQ NO ID.2所示序列为上游引物，SEQ NOID.3所示序列为下游引物。

上游引物序列(SEQ NO ID.2)为：5'-CATCCGTGCTTGCATAGAAT-3'；

下游引物序列为(SEQ NO ID.3)为：5'-CATCCGTGCTCTCGGGAAGA-3'。

本发明还提供了上述的SCAR分子标记在沙棘性别鉴定中的应用。

本发明提供了用于检测上述SCAR分子标记的特异性引物对，该引物对的核苷酸序列如SEQ NO ID.3和SEQ NO ID.4所示，上游引物(正向引物)的核苷酸序列如SEQ NO ID.3所示，下游引物(反向引物)的核苷酸序列如SEQ NO ID.4所示。

本发明还提供了上述特异性引物对在沙棘性别鉴定中的应用。

本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒。

本发明还提供了上述试剂盒在沙棘性别鉴定中的应用。

本发明进一步提供了一种鉴定沙棘性别的方法，其包括以下步骤：

(1)提取沙棘的基因组DNA；

(2)以沙棘基因组DNA为模板，利用上述的特异性引物对进行PCR扩增反应；

(3)检测扩增产物，若扩增出了885bp的特异性条带，则为雌株，若无，则为雄株。

优选地，步骤(2)中，PCR扩增反应20μL反应体系为：10μM上下游引物各1μL，沙棘基因组DNA模板50ng，Taq DNA聚合酶1.0U，10×Buffer缓冲液2μL(含Mg²⁺20mM)，2.5mMdNTPs 2μL；扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃终延伸5min。

进一步地，步骤(3)中，885bp的特异性条带对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明在沙棘幼苗期即可对其性别进行鉴定，克服了现有技术只能在3龄后通过是否挂果来判断性别而导致培育磁雌苗效率低下、经济效益差的问题，可人为提高人工沙棘林中雌株的比例，大大增加了培育沙棘林的经济价值，提高了民众种植、采收沙棘的积极性，具有很好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1 SCAR分子标记用于沙棘雌雄株性别的鉴定

其中，M为marker，1～12为雄株，13～24为雌株

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明进一步进行说明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1沙棘基因组DNA的提取

1、取鲜嫩的沙棘叶片两枚，剪碎至2mL圆底EP管中，加钢珠3粒，用液氮冻透后，震碎，置于Tissuelyser-II高通量组织研磨仪中以1600rpm/min的频率研磨4min。向EP管中加入65℃预热的CTAB缓冲液1mL(3％CTAB，5％PVP-40，1.4M NaCl，100mM Tris-HCl，20mMEDTA，预热前按2％的体积比加入β-巯基乙醇)，轻轻震荡混匀，使材料完全分散，置于65℃水浴锅保温60min，每隔10min轻轻颠倒混匀。

2、水浴结束后，取出EP管，室温下，于离心机中以12000rpm离心10min；

3、离心结束后，取上清900μL转移至一新的圆底EP管，加入450μL Tris-饱和酚和450μL氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀，置于Tissuelyser-II高通量组织研磨仪中以150rpm/min的频率震荡10min，室温下，于离心机中以12000rpm离心10min。

4、取上清800μL转移至一新的圆底EP管中，加入800μL等体积氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀，置于Tissuelyser-II高通量组织研磨仪中以150rpm/min的频率震荡10min，室温下，于离心机中以12000rpm离心10min。

5、预冷离心机至4℃。取上清600μL转移至一新的尖底EP管中，加入400μL以-20℃预冷的异丙醇和60μL NaAc(pH5.2)，轻轻平放旋转混匀3次；置于-20℃冰箱中静置30min后，4℃下，于离心机中以12000rpm离心10min，倒掉上清留沉淀，倒扣在吸水纸上，吸去残留液体。

6、向EP管中加入1mL的70％乙醇溶液，颠倒洗涤沉淀3次后，轻轻倒掉上清，保留沉淀；4℃下以12000rpm离心1min，用吸头吸尽离心管底部残留的乙醇。

7、室温下干燥10min后，向离心管中加入50μL双蒸水，室温放置10min使其充分溶解，保存于-20℃冰箱中备用。

实施例2 RAPD反应体系的建立与优化

(1)RAPD-PCR反应程序的优化

RAPD是一种成熟的基因多态性分析技术，其经典的PCR反应扩增程序为94℃(预变性)5min；94℃(变性)1min，37℃(退火)1min，72℃(延伸)2min，共45个循环；72℃(终延伸)7min；4℃保存。但考虑到Taq酶在反应中的关键作用，参考所使用的TAKARA Ex Taq酶(大连宝生物)使用说明，设计了2个改进的PCR反应扩增程序。改进PCR程序1：98℃(变性)10sec，37℃(退火)1min，72℃(延伸)2min，共45个循环；72℃(终延伸)7min；4℃保存。改进程序2：94℃(变性)30sec，37℃(退火)1min，72℃(延伸)2min，共45个循环；72℃(终延伸)7min；4℃保存。PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5g/mL)与1×TAE(TrisElectrophoresis Buffer)缓冲液中，以100V的电压电泳1h，使用凝胶成像系统拍照记录结果。

通过中国沙棘在不同PCR反应扩增程序下的扩增产物电泳图比较分析，经典的PCR反应扩增程序较好，条带多态性丰富，且条带清晰易于区分。

(2)Taq DNA聚合酶对RAPD扩增的影响

在反应体系中,Taq DNA聚合酶一般用量为1.0～2.0U，浓度过高易造成非特异性扩增，浓度过低则导致效率降低，延伸不完全。在其他因素(50μL反应体系：10μM引物4μL，2.5mMdNTPs 4μL，沙棘基因组模板100ng，5μL 10×Buffer缓冲液含Mg²⁺20mM)不变情况下，分别比较了0.1μL、0.2μL、0.25μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL的6个不同Ex Taq聚合酶使用量(5U/μL)对RAPD扩增效果的影响。

发现Taq DNA聚合酶用量在0.1μL时扩增结果不明显，0.2μL时扩增明显加强，带型丰富，但不易辨别。0.25～0.5μL扩增结果相似，但从实验效果和实验成本上考虑，Ex TaqDNA聚合酶最佳使用量为0.25μL，即1.25U。

(3)dNTPs对RAPD扩增的影响

在其他因素(50μL反应体系：10μM引物4μL，沙棘基因组模板100ng，Ex Taq DNA聚合酶1.25U，5μL 10×Buffer缓冲液含Mg²⁺20mM)不变情况下，本文分别研究了2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL的6个不同dNTPs(2.5mM each)使用量对RAPD扩增效果的影响。dNTPs是PCR反应的直接原料，其加入量的多少直接影响到最终反应产物量的多少和条带的清晰度。但是，如果dNTPs浓度过高，其会竞争与Ex Taq酶结合的激活剂Mg²⁺，而Mg²⁺是Taq酶活性所必须的；如果dNTPs浓度过低，反应原料会不足，会降低反应产物的量，甚至会引起PCR反应的错配而引入碱基突变，直接影响实验的准确性。

经过比较得出dNTPs在5μL时RAPD扩增结果较好。

(4)模板对RAPD扩增的影响

模板DNA是RAPD反应研究的对象，在研究中，我们采用改良CTAB法提取了沙棘叶片的基因组DNA，并各取120个雌雄样本基因组DNA等量混合得到中国沙棘雌雄基因池。研究表明，RAPD多态性扩增对基因组DNA较为敏感，只有高质量的基因组DNA才是RAPD成功的关键，其纯度和浓度的高低都直接影响PCR产物的质量和条带的多态性。在其他因素(50μL反应体系：10μM引物4μL，2.5mMdNTPs 4μL，Ex Taq DNA聚合酶1.25U，5μL 10×Buffer缓冲液含Mg2+20mM)不变情况下，本文分别研究了50ng、100ng、250ng、500ng、750ng、1000ng的6个不同沙棘基因组DNA浓度梯度对RAPD扩增效果的影响。

经过6种浓度梯度扩增，其主带都较为清晰且差异不大，一方面说明基因组DNA的纯度符合RAPD反应的要求，另一方面说明模板浓度在一定范围内对RAPD扩增影响结果不明显。但从条带之间的能区分的角度出发，模板DNA在100ng时RAPD扩增出的条带更加清晰。

(5)引物对RAPD扩增的影响

RAPD片段多态性扩增的核心是通过对随机引物的筛选，扩增出中国沙棘雌雄株之间的特异性条带。同时，随机引物也是RAPD扩增的起始点，随机引物只有与不同的DNA模板稳定结合后才能扩增出片段大小不一的多态性条带。如果引物浓度过低，与不同模板结合的几率就会降低，带型就不丰富且会因为条带浓度过低而不易被分辨。而随机引物浓度过高，又会引起非特异性扩增，且易于形成引物二聚体。在其他因素(50μL反应体系：dNTP2.5mM 4μL，沙棘基因组模板100ng，Ex Taq DNA聚合酶1.25U，5μL 10×Buffer缓冲液含Mg²⁺20mM)不变情况下，本文分别研究了0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL的6个不同引物(10μM)浓度梯度对RAPD扩增效果的影响。

经过筛选，随机引物在4μL时RAPD扩增条带带型较为丰富，且易于区分，考虑到随机引物浓度过高会引起非特异性扩增，最终选取中国沙棘RAPD扩增的最佳随机引物(10μM)使用量为4μL(2.5mM each)。

(6)优化的RAPD反应体系

经过以上各单因素试验，中国沙棘RAPD扩增反应的最优体系(50μL)为：10μM引物4μL，沙棘基因组模板100ng，Ex Taq DNA聚合酶1.25U，5μL 10×Buffer缓冲液含Mg²⁺20mM，2.5mMdNTPs 4μL。最优PCR反应扩增程序为94℃(预变性)5min；94℃(变性)1min，37℃(退火)1min，72℃(延伸)2min，共45个循环；72℃(终延伸)7min；4℃保存。

实施例3 RAPD标记转化为特异SCAR标记

(1)特异性条带的回收、克隆和序列分析

应用长度为10bp的随机引物(共设计30条随机引物，见表1)对雌雄株基因池进行RAPD扩增，搜索其中雌雄株间表现出差异的条带。经过筛选，其中随机引物D15(CATCCGTGCT)在885bp处出现一条特异性条带。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收和纯化该差异性条带，采用TA克隆技术将回收片段连接插入pGEM-T Easy载体并转化感受态细胞，筛选阳性克隆送上海生工测序。

表1 30对随机引物碱基序列(10bp)

(2)转化为SCAR标记

根据测序得到的SCAR序列信息：“CATCCGTGCTTGCATAGAATCCGCGTGGCTTTCTGATGCGTATTTTCGCAAGTGTATGAATCGTTCAAGTAATAAAGTGTACAAAAGTATGGATATCGAACCCACAAGGAATGGCATTACTAAGTACCGAAATTGACTAATCCTAATTTTATTTGAAAACCGAATTTTTGAATTTGTTTAAAAAGTAAATTAACTTAAAACTAACGCAAATAACAAAATTTAATGTTGTTCACAAATGATTAAAAACGCTAAGGCATTTGATTTCGCTAAATCAATTCAATCCGATTTCAAGTCATGTAATATGAGAATCAAAGTTAAAAGTGATGGTTGAAAAACCCAAATTTACCTAATACTCTCTCTCGAGTTATATTAGAATTACTTATCTATGAAAACCGACTACATTTCTATGAAGATTTAATCACAAACAAGCACATTACGATTTATGGAATTTCTAGAATAACCACATACATCATGCATTAGTTCTCACACTCGCATTCAACATACGGTATTTATCACAAGAAGCGTTCATTACACATCTCCTCTCGGTCTCAATATAATGCAACAAATCATTTAAATCTTGATTGATAAGAGCTAAATTATTGCATTTTTGTTATGATTTAAATGTTGATATTTGTGTGAAAATTGTGTTTATTTGATTATTTAATCCACAAATGTCATTTCACGGGTATTTCGTGTTTAAAGTGCAATTTCAGGTAAAATCATGATTTTGGAGAAGTTAGGGACAAAGTACAATGATCGGGATTGAATCAAAGAAAAAGAAAACAAAATTTCAAAATTTGGAATTTCGCCGCCGGCGAGAATATTCTCGCCGCCGGTGAAAACCTTACGGAGAAAATGTTGAAAATCTTCCCGAGAGCACGGATG”，利用引物设计软件设计得到一对SCAR特异性引物XCR-15，上游引物(正向引物)为XCR-15-F，下游引物(反向引物)为XCR-15-R)，上、下游引物序列信息见表2。

表2沙棘雌雄鉴别SCAR(XCR-15)标记(885bp)引物序列

(3)SCAR标记的进一步验证

为了进一步验证该SCAR标记(XCR-15)(扩增产物为885bp)的可靠性，从已知性别的中国沙棘群体中随机抽取雌雄各33株进行鉴定。结果发现在扩增的33株雌性个体中有33株扩增出目的片段，而所有的雄性植株中均未出现(图1)。该扩增能准确区分中国沙棘雌雄植株，且扩增时间较短、扩增条件简单，可以作为利用PCR技术鉴定沙棘实生幼苗的雌雄性别的技术的引物。

实施例4 PCR鉴定中国沙棘雌雄株幼苗早期性别

PCR技术鉴定中国沙棘雌雄株幼苗早期性别的反应体系(20μL)为：10μM引物1μL(XCR-15-F：5'-CATCCGTGCTTGCATAGAAT-3'；XCR-15-R：5'-CATCCGTGCTCTCGGGAAGA-3')，沙棘基因组模板50ng，Taq DNA聚合酶1.0U，2μL 10×Buffer缓冲液(含Mg²⁺20mM)，2μL的2.5mMdNTPs，补双蒸水至20μL。

PCR反应扩增程序为：94℃(预变性)5min；94℃(变性)30s，55℃(退火)30s，72℃(延伸)1min，共30个循环；72℃(终延伸)5min；4℃保存。

判定性别方法为：PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5g/mL)与1×TAE(Tris Electrophoresis Buffer)缓冲液中，以100V的电压电泳1h，使用凝胶成像系统拍照记录电泳结果。如果在885bp位置处出现一条稳定、清晰的特异性片段则判断该样本为沙棘雌株，若无条带则判定为沙棘雄株。

SEQUENCE LISTING

<110> 青海大学

<120> 一种鉴定沙棘性别的SCAR分子标记及其应用

<130> 案号，如无可删除

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 885

<212> DNA

<213> 沙棘SCAR核苷酸序列

<400> 1

catccgtgct tgcatagaat ccgcgtggct ttctgatgcg tattttcgca agtgtatgaa 60

tcgttcaagt aataaagtgt acaaaagtat ggatatcgaa cccacaagga atggcattac 120

taagtaccga aattgactaa tcctaatttt atttgaaaac cgaatttttg aatttgttta 180

aaaagtaaat taacttaaaa ctaacgcaaa taacaaaatt taatgttgtt cacaaatgat 240

taaaaacgct aaggcatttg atttcgctaa atcaattcaa tccgatttca agtcatgtaa 300

tatgagaatc aaagttaaaa gtgatggttg aaaaacccaa atttacctaa tactctctct 360

cgagttatat tagaattact tatctatgaa aaccgactac atttctatga agatttaatc 420

acaaacaagc acattacgat ttatggaatt tctagaataa ccacatacat catgcattag 480

ttctcacact cgcattcaac atacggtatt tatcacaaga agcgttcatt acacatctcc 540

tctcggtctc aatataatgc aacaaatcat ttaaatcttg attgataaga gctaaattat 600

tgcatttttg ttatgattta aatgttgata tttgtgtgaa aattgtgttt atttgattat 660

ttaatccaca aatgtcattt cacgggtatt tcgtgtttaa agtgcaattt caggtaaaat 720

catgattttg gagaagttag ggacaaagta caatgatcgg gattgaatca aagaaaaaga 780

aaacaaaatt tcaaaatttg gaatttcgcc gccggcgaga atattctcgc cgccggtgaa 840

aaccttacgg agaaaatgtt gaaaatcttc ccgagagcac ggatg 885

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 沙棘SCAR正向引物核苷酸序列

<400> 2

catccgtgct tgcatagaat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 沙棘SCAR反向引物核苷酸序列

<400> 3

catccgtgct ctcgggaaga 20

<210> 4

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物A11核苷酸引物

<400> 4

caatcgccgt 10

<210> 5

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物A13核苷酸序列

<400> 5

cagcacccac 10

<210> 6

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物B06核苷酸序列

<400> 6

tgctctgccc 10

<210> 7

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物B07核苷酸序列

<400> 7

ggtgacgcag 10

<210> 8

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物B08核苷酸序列

<400> 8

gtccacacgg 10

<210> 9

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物D03核苷酸序列

<400> 9

gtcgccgtca 10

<210> 10

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物D07核苷酸序列

<400> 10

ttggcacggg 10

<210> 11

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物D08核苷酸序列

<400> 11

aatcgggctg 10

<210> 12

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物D10核苷酸序列

<400> 12

caagggcaga 10

<210> 13

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物D15核苷酸序列

<400> 13

catccgtgct 10

<210> 14

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物D16核苷酸序列

<400> 14

acttcgccac 10

<210> 15

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物E4核苷酸序列

<400> 15

gtgacatgcc 10

<210> 16

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物E07核苷酸序列

<400> 16

agatgcagcc 10

<210> 17

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物E14核苷酸序列

<400> 17

tgcggctgag 10

<210> 18

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物E15核苷酸序列

<400> 18

acgcacaacc 10

<210> 19

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物S101核苷酸序列

<400> 19

gggtaacgcc 10

<210> 20

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Af01核苷酸序列

<400> 20

gacggatcag 10

<210> 21

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Sv01核苷酸序列

<400> 21

ctagaggccg 10

<210> 22

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Sv02核苷酸序列

<400> 22

ctggctcaga 10

<210> 23

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Ac01核苷酸序列

<400> 23

aggagtcgga 10

<210> 24

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Ac02核苷酸序列

<400> 24

gacgcgaacc 10

<210> 25

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Ag01核苷酸序列

<400> 25

ggtgcgcact 10

<210> 26

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Cs01核苷酸序列

<400> 26

gtgacgtagg 10

<210> 27

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Cs02核苷酸序列

<400> 27

gttggtggct 10

<210> 28

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Cs03核苷酸序列

<400> 28

tgagcggaca 10

<210> 29

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Gb01核苷酸序列

<400> 29

tgatccctgg 10

<210> 30

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Gb02核苷酸序列

<400> 30

ctggtgctga 10

<210> 31

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Gb03核苷酸序列

<400> 31

ccgcatctac 10

<210> 32

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Pm01核苷酸序列

<400> 32

gtggtccgca 10

<210> 33

<211> 10

<212> DNA

<213> 随机引物Pv02核苷酸序列

<400> 33

cctccagtgt 10

Claims

1.一种鉴定沙棘性别的SCAR分子标记，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于：其通过以下特异性引物对扩增获得，特异性引物对的核酸序列分别如SEQ NO ID.2和SEQ NO ID.3所示。

3.权利要求1或2任意一项所述的分子标记在沙棘性别鉴定中的应用。

4.用于检测权利要求1或2所述分子标记的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ NO ID.2和SEQ NO ID.3所示。

5.权利要求4所述的引物对在沙棘性别鉴定中的应用。

6.含有权利要求4所述特异性引物对的试剂盒。

7.权利要求6所述的试剂盒在沙棘性别鉴定中的应用。

8.一种鉴定沙棘性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取沙棘的基因组DNA；

(2)以沙棘基因组DNA为模板，利用权利要求4所述的特异性引物对进行PCR扩增反应；

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，PCR扩增反应20μL反应体系为：10μM上下游引物各1μL，基因组DNA模板50ng，Taq DNA聚合酶1.0U，10×Buffer缓冲液2μL，2.5mMdNTPs 2μL；扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃终延伸5min。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，885bp的特异性条带对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。