CN106456616A - 小分子C‑Myc抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了小分子Myc抑制剂。本发明还提供了这些化合物用于治疗Myc驱动的癌症的治疗应用和其他相关的方法。

Description

小分子C-Myc抑制剂
相关申请的交叉引用
本专利申请要求美国临时专利申请号61/914590(2013年12月11日提交的)的优先权权益。优先权申请的全部公开内容在此通过引用整体并入本文并用于所有目的。
关于政府支持的声明
本发明是部分由美国政府支持进行，依据美国国立卫生研究院批准号CA078230。因此，美国政府可拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明公开内容提供了为c-Myc抑制剂的一类化合物。本发明公开内容进一步提供了用于治疗肿瘤的方法，包括施用有效量的公开的c-Myc抑制剂。
背景技术
原癌基因c-myc编码控制细胞增殖的转录因子(Myc)。Myc还在调控细胞周期、细胞生长、血管生成、细胞凋亡和肿瘤形成上起作用。几乎在所有的癌症中都有Myc参与，并且几乎在所有人类癌症中均见到Myc功能的增强。作为突变、染色体重排、增加的表达或基因扩增的结果，肿瘤中Myc活性可增强。升高或失调的c-Myc表达已在许多人类癌症中检测到，并通常与侵略性、低分化的肿瘤相关。此类癌症包括结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病。
由于其广泛的病原性意义，Myc是重要的癌症靶标。然而，Myc已经是小分子抑制剂的挑战性目标。构思和实际上的困难二者阻碍了鉴别强力和有效的Myc小分子抑制剂。构思上的障碍反映出对抑制控制基本的细胞活性的基因的考虑。靶向Myc的主要实际困难是没有可用作小分子的结合位点的口袋或凹槽。本领域中已知的小分子Myc抑制剂缺少体内应用的效能和合适的药代动力学性质。
本领域中存在对用于抑制c-Myc介导的致癌活性和信号通路的更好方式以及用于治疗和预防癌症的更有效的疗法的需求。本发明公开内容解决了本领域中这个和其他未实现的需求。
发明内容
在一个方面，本发明公开内容提供了具有式1结构的化合物：
其中R1、R2和R3各自独立地选自呋喃-2-基、呋喃-3-基、呋喃-4-基、4-卤代苄基、3-卤代苄基、5-卤代苄基、二卤代苄基、三卤代苄基、四卤代苄基、五卤代苄基、
其中卤素是氟、氯、溴或碘；并且前提是当R3是呋喃基时，R1不可能是
优选地，R1是R3是或呋喃基；R2选自呋喃基、
本发明公开内容进一步提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包含具有式1结构的化合物：
其中R1、R2和R3各自独立地选自呋喃-2-基、呋喃-3-基、呋喃-4-基、4-卤代苄基、3-卤代苄基、5-卤代苄基、二卤代苄基、三卤代苄基、四卤代苄基、五卤代苄基、
其中卤素是氟、氯、溴或碘。
优选地，R1是R3是或呋喃基；R2选自呋喃基、
本发明公开内容进一步提供了用于治疗癌症的方法，其包括施用有效量的具有式1结构的化合物：
其中R1、R2和R3各自独立地选自呋喃-2-基、呋喃-3-基、呋喃-4-基、4-卤代苄基、3-卤代苄基、5-卤代苄基、二卤代苄基、三卤代苄基、四卤代苄基、五卤代苄基、
其中卤素是氟、氯、溴或碘。
优选地，R1是R3是或呋喃基；R2选自呋喃基、和
本专利说明书的其余部分和所附权利要求书中描述了本发明的其他方面和实施方式以及本发明的具体特性和优点。
附图说明
图1示出了KJ-Pyr-9通过禽逆转录病毒预防原代细胞的Myc依赖性转化。鸡胚胎成纤维细胞被感染含有Myc(RCAS(A)-ATG-Myc)的禽病毒的102、103或104倍的稀释液。将细胞铺在营养琼脂培养基上并保持10天。上图：KJ-Pyr-4、KJ-Pyr-6、KJ-Pyr-9和KJ-Pyr-10的荧光偏振数据，将和MYC-MAX的结合与和MAX-MAX的相互作用进行对比。下图：四种化合物的结构。
图2示出了KJ-Pyr-9的剂量响应与MYC、N-MYC、v-Src、PI3KH1047R和v-Jun诱导的致癌性转化的关系。数据来自利用单个鸡胚胎来源的细胞进行代表性实验。
图3A-3C示出了KJ-Pyr-9对细胞增殖的影响。KJ-Pyr-9对(A)NCI-H460(ATCC)、(B)MDA-MB-231(NCI)和(C)SUM-159PT(Asterand)增殖的影响的剂量响应曲线。
图4示出了KJ-Pyr-9对MDA-MB-231和NCI-H460细胞中NDRG的表达的影响。NCI-H460细胞在RPMI培养基中生长，而MDA-MB-231细胞在DMEM培养基中生长；两种培养基均含有10％FBS。KJ-Pyr-9和10058-F4以20μM的浓度加入，并在Western印迹分析之前处理细胞持续24h。
图5A-5C示出了KJ-Pyr-9干扰MDA-MB-231细胞的异种移植物的生长。向小鼠的左右侧翼皮下注射5×106个MDA-MB-231细胞。当肿瘤体积达到100mm3时，向一半小鼠每日腹膜内注射10mg/kg的KJ-Pyr-9，而另一半仅接受载体。观察肿瘤的生长持续31天。(A)治疗和未经治疗的动物的肿瘤体积。(B)治疗和未经治疗的动物的肿瘤重量。(C)肿瘤体积的时间过程。
图6A-6C显示，Burkitt淋巴瘤源细胞系被KJ-Pyr-9抑制。(A)Akata、(B)Ramos、(C)Raji。以每孔103个细胞接种于96孔板中，并用所示浓度的KJ-Pyr-9处理72h。通过刃天青荧光法测定细胞增殖。
图7A-7B示出了KJ-Pyr-9对y-myc转化的鹌鹑胚胎成纤维细胞(A)和人白血病和癌细胞系(B)的增殖的影响。将化合物以所示浓度加入到原代鹌鹑胚胎成纤维细胞(QEF)；由癌基因v-myc基因(Q8、QEF/MC29)、v-jun(VJ)或由甲基胆蒽(QT6)转化的鹌鹑细胞系以及人皮肤成纤维细胞(HFB)；非粘附生长的白血病细胞系K-562、MOLT-4、HL-60或腺癌细胞系SW-480中。作为对照，将化合物的二甲基亚砜(DMSO)溶液加入到细胞中。加入化合物后24h拍显微照片。
图8A-8C示出了第一系列化合物(CG-RS-44至-103)的细胞毒性功效，在2个人癌细胞系Daudi(A)和K562(B)中进行试验。图8C示出了化合物的非特异性细胞毒性，如在人包皮成纤维细胞(HFF)中测试。
图9A-9C示出了第二个系列化合物的细胞毒性功效，在Daudi(A)和K562(B)中进行测试。图9C示出了化合物的非特异性细胞毒性，如在HFF中测试。
图10示出了当在递增浓度的所选化合物的存在下培养时4个不同细胞系的细胞活力。
图11示出了筛选抑制CEF病灶测定中ATG-Myc的KJ-Pyr-9类化合物的结果。如该图所示，各化合物以10μM浓度检测。化合物浓度后面列出的最后两位数字对应于不同的化合物的内部名称。在研究中测试了两批化合物CG-RS-44(在图中标注“44”)。
具体实施方式
I.概述
本发明涉及c-Myc抑制性化合物及其在抑制c-Myc信号传导通路和治疗癌症中的用途。Myc是转录调控因子，属于利用bHLH-LZ蛋白MAX二聚化以变得具有功能的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH-LZ)蛋白家族。MYC-MAX异二聚体优先结合至E-Box基序、回文DNA序列。MYC影响在两个分子水平的转录。作为转录因子，它可以结合至靶基因的启动子上以刺激或抑制转录活性。作为显示MYC功能增强的癌细胞中转录的放大器，它增强了现有转录程序的活性。在这两种情况下，MYC必须利用MAX二聚化以有效。人类基因组包含三个MYC基因和相应的蛋白、c-MYC、N-MYC和L-MYC。除非另有说明，否则MYC在本文中用于表示c-MYC蛋白。c-Myc也可用作转录抑制因子。通过结合Miz-1转录因子并移位p300共激活因子，它抑制Miz-1靶基因的表达。此外，Myc在DNA复制的控制中具有直接作用。
Myc被不同的有丝分裂信号例如Wnt信号、Shh和EGF(通过MAPK/ERK通路)激活。通过修饰其靶基因的表达，Myc激活导致许多生物学作用。首先被发现的是它驱动细胞增殖(上调细胞周期蛋白、下调p21)，但是它也在调控细胞生长(上调核糖体RNA和蛋白质)、细胞凋亡(下调Bcl-2)、分化和干细胞自我更新中起着非常重要的作用。Myc是非常强的原癌基因，并且非常经常发现其在许多类型的癌症中均上调。Myc过度表达刺激基因扩增，推测是通过DNA过度复制。如本文所用的，c-Myc信号传导通路或c-Myc介导的细胞活性是指将作为Myc激活的结果发生的任何生化效应或细胞反应。
总之，c-Myc驱动多种促生长和抗凋亡基因，并且在癌症中经常过度表达。因此，对c-Myc导致的致癌性转化的抑制将代表强效的化疗策略，在治疗实体瘤和白血病中具有广泛用途。本发明提供了抑制MYC-MAX相互作用的一类化合物，并且因而能够治疗广泛的癌症。本发明还提供了在各种治疗应用中使用本文所述的Myc抑制剂化合物和衍生物化合物的方法。
II.c-Myc抑制剂化合物
如下文示例中所述，本发明部分地预测通过若干已知化合物的c-Myc抑制活性的本发明发明人的发现。这些化合物来自最初为溶液相生物学筛选制备的吡啶化合物的组合文库(Fujimori et al.,J.Combinatorial Chem.5:627-631,2003)。通过用于MYC-MAX相互作用的荧光偏振筛选鉴别一些化合物的新的c-Myc抑制活性。所鉴别的化合物能抑制细胞培养物的Myc诱导的致癌性转化，干扰Myc过度表达人和禽细胞的增殖，并降低Myc介导的转录调控。此外，该化合物能有效阻断Myc过度表达的人癌细胞的异种移植物的生长。本文所列举的具体Myc抑制剂化合物是4-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)苯甲酰胺(KJ-Pyr-9)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-10)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-甲氧基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-6)、4’-(2-(呋喃-2-基)-6-苯基吡啶-4-基)-[1,1’-联苯基]-4-甲酰胺(KJ-Pyr-4)。它们的结构示于图1中。
除了本文例举的c-Myc抑制剂化合物，可由这些化合物修饰和合成的衍生物化合物也可适用于本发明的方法的实施。由这些已知的化合物衍生的一些具体的c-Myc抑制剂化合物在下面详细描述。例如，相对于KJ-Pyr-9、10、6或4，它们的一些衍生物化合物可具有被不同的单价或多价基团取代的一个或更多个单价或多价基团。取代基可以是例如H；卤素；直链、环状或支链烷基；直链、环状或支链烯基；直链，环状或支链炔基；卤代烷基、烯基或炔基；CN；CF3；芳基和其中芳基环中任意或所有H基团被不同的基团取代的取代芳基；其中芳基环中任意或所有基团被不同的基团取代的杂环和取代杂环基团；羧基；羰基、烷氧基；烷氧基烷烃；烷氧基羰基；芳氧基、杂环氧基；羟基；胺；酰胺；氨基；季氨基；硝基；磺酰基；烷基胺；硅烷基、甲硅烷氧基；饱和C-C键；不饱和C-C键；酯、醚、氨基；酰胺、氨基甲酸乙酯、羰基、乙酰基和羰自由基；杂原子包括N、S和O；聚合物基团和氨基酸。在一些衍生物化合物中，一个或更多个氢可被低级烷基取代。各种衍生物化合物可进行功能测试(例如，如本文所列举的增殖抑制试验)，以确定其c-Myc抑制活性。
在一些实施方式中，具有相似或改善的性能的变体或衍生物化合物可通过所例举的c-Myc抑制剂化合物(先导化合物)的合理优化来获得。任选地，通过合理设计所产生的化合物可进一步进行功能测试或筛选以鉴别具有改善的活性的化合物。下文描述用于设计和筛选这些变体化合物的详细方法。本文所列举的各种c-Myc抑制剂化合物及其变体或衍生物均可使用有机化学的常规实施方法或本文或Fujimori et al.,J.CombinatorialChem.5:627-631,2003所述的方案容易地制备。
在一个方面，本发明提供了用于鉴别具有改进的性能的c-Myc信号传导通路的抑制剂的方法。该方法包括(a)合成先导c-Myc抑制剂化合物的一种或更多种结构类似物，所述先导c-Myc抑制剂化合物选自4-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)苯甲酰胺(KJ-Pyr-9)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-10)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-甲氧基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-6)和4’-(2-(呋喃-2-基)-6-苯基吡啶-4-基)-[1,1’-联苯基]-4-甲酰胺(KJ-Pyr-4)，和(b)对所述类似物进行功能测定以鉴别相对于先导抑制剂化合物而言具有改进的生物学或药物特性的类似物。在一些优选的方法中，所采用的先导c-Myc抑制剂化合物是4-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)苯甲酰胺(KJ-Pyr-9)或5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-10)。待筛选的改进的生物学或药物特性可以是例如抑制c-Myc介导的信号活性的增强的活性。可替代地，改进的生物学或药物特性可以是抑制肿瘤细胞生长的增强的活性，例如结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤或髓细胞性白血病的生长的增强的抑制活性。
作为示例，从上述已知的化合物衍生的一些类似物或变体化合物的合成和活性如下文所述。
III.一些例举的c-Myc抑制剂化合物的合成方案和活性
下表示出了已被合成并利用所示的检测数据测定的示例性结构，以及其代码名称。
应当注意的是，CG-RS-44也被称为KDJ-Pyr-9，而CG-RS-50也被称为KDJ-Pyr-10。
如上述化合物所证明的，本发明提供了一系列新的MYC-MAXPPI小分子拮抗剂。该化合物家族的最强效的成员可结合Myc和MYC-MAX二者，亲和力为纳摩尔。这些化合物还抑制MYC驱动的致癌性转化以及Myc依赖性转录调控。它们表现出对若干人癌细胞系的存活率和增殖能力具有强的影响。在白血病细胞的情况下这些影响特别显著，但是它们也扩展到由实体瘤衍生的细胞系。这些分子的有希望的药动学特性也允许进一步体内研究。发现MYC-MAX PPI的这些抑制剂可有效地干扰Myc驱动的异种移植肿瘤的生长并阻断肿瘤生长。
下文示出了用于在固体载体上制备一些类似物化合物的步骤。
方案1.在Rink酰胺固体支持物上制备化合物
在固体支持物SJ2-86上固定化合物
4-羧基苯甲醛(0.72g，4.8mmol，3.0当量)、羟基苯并三唑(HOBt)(0.74g，4.8mmol，3.0当量)和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.76mL，0.61g，4.8mL，3.0当量)加入到在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的脱保护Rink酰胺树脂(2.2g，0.73mmol/g，1.6mmol)的混悬液(8.0mL)中。剧烈摇动12h后，通过抽滤除去溶剂，用DMF、MeOH和CH2Cl2(3×3×10mL)依次洗涤树脂。通过阴性游离胺TNBS试验证实树脂上的胺的定量酰化。
化合物SJ2-90
将苯甲醛官能树脂SJ2-86(1.0g，0.66mmol/g，0.66mmol)悬置在2-乙酰基呋喃(0.17g，1.5mmol，2.0当量)和粉末状LiOH(36mg，1.5mmol，2.0当量)在二甲氧基乙烷(DME)(9.8mL)和H2O(0.20mL)的混合物中。剧烈摇动36h后，通过抽滤除去溶剂，用乙酸、DMF、MeOH和CH2Cl2(4×3×10mL)依次洗涤树脂。该反应的完成是通过用三氟乙酸(TFA)裂解1h的小树脂样品的LC-MS分析证实。重复不完全的反应。由于其强大的固有荧光，化合物SJ2-90在紫外可见色谱中于214nm处呈现特性阴性吸光度信号。
利用化合物SJ2-97的以下合成所示的方法得到苯甲酰甲基溴吡啶鎓。
化合物SJ2-97
在剧烈搅拌下将吡啶(80μL，1.0mmol，2.0当量)加入到在无水四氢呋喃(2.0mL)中的2-溴-4’-氟苯乙酮(0.11g，0.50mmol)的溶液中。约20分钟后观察到无色沉淀的形成并继续搅拌20h。通过过滤分离沉淀物，用最小量的冷乙醚洗涤并在真空下干燥得到SJ2-97，为无色结晶固体(0.147g，定量)。
化合物SJ2-116
将苯甲酰甲基溴吡啶鎓SJ2-97(89mg，0.30mmol)加入到在DMF(2.0mL)、乙酸(1.3mL)和NH4OAc(0.23g，3.0mmol，30当量)中的树脂SJ2-90树脂(0.17g，0.10mmol)的混悬液中。将该混悬液在90℃下搅拌60h。将树脂依次用DMF、MeOH和CH2Cl2(3×3×5mL)洗涤。产物用TFA(4.0mL)从树脂裂解持续2h，真空下蒸发干燥，并通过制备TLC在硅胶上纯化。Rf＝(CH2Cl2/MeOH，93:7)0.55，得到SJ2-116(4.59mg，12.8％)，为淡黄色固体，其纯度和身份通过LC-MS进一步证实。
使用上述步骤制备用于构效关系研究的不同类似物。
在溶液中制备化合物的步骤
方案2.KDJ-9和类似物的溶液相合成
化合物SJ2-123
将2-乙酰基呋喃(55mg，0.50mmol)和LiOH(12mg，0.50mmol)在MeOH(2.5mL)中搅拌1h，然后加入4-甲酰基苯甲酸甲酯(82mg，0.50mmol)。约45分钟后，形成粘稠的无色沉淀物，将混悬液剧烈搅拌另外1小时45分钟。然后通过离心分离沉淀物，将乙酸(3％，3.0mL)加入到上清液中，并通过进一步离心分离其他沉淀物。将合并的固体在真空下干燥得到SJ2-123，为无色固体(88.5mg，69.1％)。
化合物SJ2-136
将查耳酮SJ2-123(0.60g，2.4mmol)、苯甲酰甲基溴吡啶鎓SJ2-127(0.76g，2.4mmol)和NH4OAc(5.4g，71mmol，30当量)在乙酸(24mL)和DMF(36mL)的混合物在90℃搅拌24h。加入饱和NaHCO3(20mL)，然后分份加入粉末状的NaHCO3直到气体释放停止。将混合物在真空干燥并将残余物用CH2Cl2/丙酮(1:1)洗涤直到无色。将该溶液在真空中蒸发并通过硅胶层析(8.0×4.5cm)纯化所得固体，使用纯CH2Cl2，Rf＝0.57，洗脱得到SJ2-136(0.463g，48.2％)，为淡黄色固体。
化合物SJ2-140
将在H2O(5.0mL)中的LiOH(96mg，4.0mmol)加入到SJ2-136(0.40g，1.0mmol)在THF(45mL)中的溶液中并搅拌72h。将溶剂蒸发并通过快速硅胶(6.5×4.5cm)层析纯化，用CH2Cl2/MeOH作为洗脱剂，Rf(CH2Cl2/MeOH，95:5)＝0.26，得到SJ2-140，为淡黄色固体(0.38g，98.4％)。
化合物KDJ-9
将草酰氯(0.39mL，0.57g，4.5mmol，5.0当量)加入到在CH2Cl2(27mL)和DMF(0.13mL)中的SJ2-140(0.35g，0.90mmol)溶液中并搅拌20h。加入浓NH3(20mL)并将该混合物剧烈搅拌30分钟。通过旋转蒸发将有机相蒸发，并通过过滤将所得沉淀物从水相中分离出来。通过快速硅胶(5×4.5cm)层析纯化真空干燥的残余物，使用MeOH/CH2Cl2(3.0→5.0％)作为洗脱剂，Rf(CH2Cl2/MeOH，95:5)＝0.34，得到KDJ-9(0.34g，97.9％)，为淡黄色固体。
IV.治疗应用
本文所述的c-Myc抑制剂化合物可用于多种治疗或预防(例如，抗肿瘤)应用。它们可容易地用于阻抑或抑制c-Myc介导的细胞活性，以及治疗癌症或预防肿瘤的进展(特别是Myc依赖性肿瘤)。因此，本发明提供了用于抑制细胞(例如，肿瘤细胞)中c-Myc介导的生物化学活性或c-Myc信号传导通路的方法。在一些实施方式中，细胞存在于受试者(例如，患有癌症的受试者)。在一些实施方式中，本发明的治疗应用涉及在受试者预防肿瘤的进展或治疗癌症。通常，本发明的治疗方法包括向受试者施用药物组合物，其包含本文所述的有效量的C-Myc-抑制剂(例如，KJ-Pyr-9或其衍生物)。也可以使用根据本发明的筛选方法鉴别的新c-Myc抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了抑制细胞中c-Myc信号通路的方法。所述方法包括使细胞与本文所公开的有效量的化合物接触，例如，选自以下的化合物：4-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)苯甲酰胺(KJ-Pyr-9)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-10)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-甲氧基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-6)和4’-(2-(呋喃-2-基)-6-苯基吡啶-4-基)-[1,1’-联苯基]-4-甲酰胺(KJ-Pyr-4)，其衍生物或类似物(例如，如本文所例举的类似化合物)和其药学上可接受的盐。在本发明的一些方法中，所用的化合物是4-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)苯甲酰胺(KJ-Pyr-9)或5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-10)。在一些其他方法中，所用的化合物是母体化合物KJ-Pyr-9、KJ-Pyr-10、KJ-Pyr-6或KJ-Pyr-4的衍生物或变体。在它们的衍生物或变体化合物中，母体化合物的一个或更多个单价或多价基团可被不同的单价或多价基团取代。所述取代基可以独立地选自：H；卤素；直链、环状或支链烷基；直链、环状或支链烯基；直链，环状或支链炔基；卤代烷基、烯基或炔基；CN；CF3；芳基和其中芳基环中任意或所有H基团被不同的基团取代的取代芳基；其中芳基环中任意或所有基团被不同的基团取代的杂环和取代杂环基团；羧基；羰基、烷氧基；烷氧基烷烃；烷氧基羰基；芳氧基、杂环氧基；羟基；胺；酰胺；氨基；季氨基；硝基；磺酰基；烷基胺；硅烷基、甲硅烷氧基；饱和C-C键；不饱和C-C键；酯、醚、氨基；酰胺、氨基甲酸乙酯、羰基、乙酰基和羰自由基；杂原子N、S和O；聚合物基团和氨基酸。在一些方法中，母体化合物的一个或更多个氢被低级烷基取代。
本发明的一些方法涉及抑制肿瘤细胞中c-Myc信号传导通路。例如，所述方法可用于抑制结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤或髓细胞性白血病的细胞中c-Myc信号传导通路。在其中一些方法中，肿瘤细胞存在于受试者体内。所述化合物可以本文所述的药物组合物施用给受试者。
在相关的方面，本发明提供了抑制受试者中细胞生长或增殖的方法。这些方法包括向受试者施用有效量的抑制c-Myc信号活性的化合物。所施用的化合物选自4-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)苯甲酰胺(KJ-Pyr-9)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-10)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-甲氧基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-6)和4’-(2-(呋喃-2-基)-6-苯基吡啶-4-基)-[1,1’-联苯基]-4-甲酰胺(KJ-Pyr-4)，其衍生物或类似物(例如，如本文所例举的类似化合物)和其药学上可接受的盐。
在一些方法中，所施用的化合物是4-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)苯甲酰胺(KJ-Pyr-9)或5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-10)。在一些其他方法中，所施用的化合物是母体化合物KJ-Pyr-9、KJ-Pyr-10、KJ-Pyr-6或KJ-Pyr-4的衍生物或变体。在它们的衍生物或变体化合物中，母体化合物的一个或更多个单价或多价基团可被不同的单价或多价基团取代。所述取代基可以独立地选自：H；卤素；直链、环状或支链烷基；直链、环状或支链烯基；直链，环状或支链炔基；卤代烷基、烯基或炔基；CN；CF3；芳基和其中芳基环中任意或所有H基团被不同的基团取代的取代芳基；其中芳基环中任意或所有基团被不同的基团取代的杂环和取代杂环基团；羧基；羰基、烷氧基；烷氧基烷烃；烷氧基羰基；芳氧基、杂环氧基；羟基；胺；酰胺；氨基；季氨基；硝基；磺酰基；烷基胺；硅烷基、甲硅烷氧基；饱和C-C键；不饱和C-C键；酯、醚、氨基；酰胺、氨基甲酸乙酯、羰基、乙酰基和羰自由基；杂原子N、S和O；聚合物基团和氨基酸。在一些方法中，母体化合物的一个或更多个氢可被低级烷基取代。
本发明的一些方法涉及抑制受试者中肿瘤细胞生长或增殖。例如，所述方法可用于抑制结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤或髓细胞性白血病的细胞的生长。
在另一个相关方面，本发明提供了用于治疗受试者中癌症或预防肿瘤进展的方法。这些方法包括向受试者施用治疗有效量的抑制c-Myc信号传导通路的化合物。所述化合物选自4-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)苯甲酰胺(KJ-Pyr-9)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-10)、5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-甲氧基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-6)和4’-(2-(呋喃-2-基)-6-苯基吡啶-4-基)-[1,1’-联苯基]-4-甲酰胺(KJ-Pyr-4)，其衍生物或其类似物(例如，如本文所例举的模拟化合物)，以及它们的药学上可接受的盐。在其中一些方法，所用的化合物是4-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)苯甲酰胺(KJ-Pyr-9)或5-(2-(呋喃-2-基)-6-(4-硝基苯基)吡啶-4-基)呋喃-2-甲酰胺(KJ-Pyr-10)。在一些其他方法中，使用化合物KJ-Pyr-9、KJ-Pyr-10、KJ-Pyr-6或KJ-Pyr-4的类似物、衍生物或变体。一些方法涉及治疗患有肿瘤的受试者，所述肿瘤选自结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤和髓细胞性白血病。
适合使用本发明的组合物和方法治疗的癌症和肿瘤可以是存在于多种组织和器官中的那些。它们还包括癌细胞、肿瘤细胞，其包括恶性肿瘤细胞以及这些组织和/或器官的成分细胞中发现的那些。示例包括脑肿瘤(胶质母细胞瘤等)、脊柱肿瘤、上颌窦癌、胰腺癌、牙龈癌、舌癌、唇癌、鼻咽癌、鼻咽癌、下咽癌、喉癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肺癌、胸膜肿瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胆囊癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、睾丸肿瘤、肾上腺癌、宫颈癌、内膜癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、纤毛上皮癌、恶性骨肿瘤、软组织肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、基底细胞瘤、白血病、伴随骨髓化生的骨髓纤维化、恶性淋巴瘤肿瘤、霍奇金病、浆细胞瘤和神经胶质瘤。
通常，治疗应对受试者、组织或细胞产生影响以获得所需的药理学和/或生理学效果。就预防性方面而言，效果可以是完全或部分预防疾病或其迹象或症状。就与异常c-Myc表达或生化活性相关或由其介导或归因于疾病的不良效果的改善的疾病或病症(例如，肿瘤生长)的部分或完全治愈而言，它也可以是治疗性的。合适的受试者包括无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物，特别是人。本发明所述的c-Myc抑制剂化合物可单独使用或与任何多种药物组合使用，包括已知的抗肿瘤药物(抗肿瘤药)、肿瘤转移抑制剂、血栓形成抑制剂、关节破坏的治疗药物、止痛药、消炎药、免疫调节剂(或免疫调节剂)和/或免疫抑制剂，其可不限于特定的种类使用，只要它们有效地或有利地起作用即可。
所述化合物可单独施用给需要治疗的受试者。更优选地，它们以与任何不同的药理学上可接受的添加剂混合的药物组合物或制剂的形式施用。例如，所述化合物可以方便的适于口服、局部、肠胃外等形式的药物组合物或制剂形式施用。可以根据众所周知的并且本领域中常规实践的方法制备本发明的药物组合物。参见，例如Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,20th ed.,2000；和Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下生产。用于肠胃外施用的制剂可例如含有赋形剂、无菌水或盐水、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯/共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。用于本发明的分子的其他潜在地有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可含有赋形剂例如乳糖或者可以是含水溶液，包含例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐，或者可以是滴鼻剂形式施用的油性溶液，或作为凝胶。
含有c-Myc抑制化合物的药物组合物可以治疗有效量或剂量局部或全身性施用。它们可以肠胃外施用、肠溶、注射、快速输液、鼻咽吸收、皮肤吸收、直肠和口服施用。用在本发明方法中的c-Myc抑制剂应以足以实现所期望的治疗效果的量施用给有需要的受试者(例如，消除或改善与肿瘤进展和生长相关的症状)。通常，用在本发明的药物组合物中的治疗有效量或有效剂量的c-Myc抑制剂应抑制细胞中c-Myc信号传导活性或减慢或抑制受试者中的肿瘤生长。如下面所指出的，本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得可有效实现所需的治疗响应而对受试者无毒的活性成分的量。
所选的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明的具体组合物的活性，施用途径、施用时间和所用的具体化合物的排泄速率。它也取决于治疗的持续时间，其他药物，与所用的具体组合物的组合使用的化合物和/或材料，患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和待治疗受试者以前的病史等因素。用于确定最佳剂量的方法在本领域中进行了描述，例如，Remington:The Science and Practice ofPharmacy,MackPublishing Co.,20th ed.,2000。对于给定的c-Myc抑制剂化合物，本领域技术人员可通过使用常规实践的药学方法容易地确定抑制c-Myc的试剂的有效量。体外或原位研究中所用的剂量可为药物组合物体内施用量提供有用的指导，并且动物模型可用于确定治疗特定疾病的有效剂量。通常，药物有效剂量为约0.001至100mg/kg待治疗受试者体重。
所述c-Myc抑制剂化合物和本文中所述的其他治疗方案通常在多个场合施用给受试者。单剂量之间的间隔可以是每日、每周、每月或每年。如通过测量受试者中使用的c-Myc抑制剂化合物和其他治疗剂的血液水平所指示的，时间间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调整剂量以达到1-1000μg/ml的血浆化合物浓度，并且在一些方法中为25-300μg/ml或10-100μg/ml。可替代地，治疗剂可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较不频繁的施用。剂量和频率变化取决于c-Myc抑制剂化合物的半衰期和受试者中的其它药物。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性而不同。在预防性应用中，相对低的剂量以相对不频繁的间隔长时间内施用。一些受试者可能会在他们的剩余生命中继续接受治疗。在治疗应用中，有时需要相对较短的间隔内相对高的剂量直至疾病的进展减轻或停止，并且优选直至受试者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，受试者可施用预防性方案。
苯甲酰甲基吡啶鎓盐的合成的一般步骤：在室温和氮气下将4’-硝基-2-溴苯乙酮(4.9g，20mmol)加入到THF(80mL)中。逐滴加入吡啶(6.4mL，80mmol)。将所得浑浊溶液搅拌约6小时，过滤。滤饼用乙醚(40×3)洗涤，真空干燥得到6.0g吡啶鎓盐。按照类似的方法制备CG-RS-46(2.6g)、CG-RS-52(1.2g)、CG-RS-53(1.2g)、CG-RS-56(1.0g)、CG-RS-57(1.0g)、CG-RS-60(690mg)、CG-RS-63(1.05g)、CG-RS-65(286mg)、CG-RS-69(400mg)、CG-RS-71(570mg)、CG-RS-80(2.6g)和CG-RS-81(2.4g)。
苯甲酰甲基吡啶鎓盐的合成的一般方案
示例
以下示例可供来举例说明，但不限制本发明。
示例1.新的Myc抑制剂的鉴别和生化活性
筛选：通过利用MYC-MAX二聚化抑制的荧光偏振对小分子化合物的吡啶库(Fujimori et al.,J.Combinatorial Chem.5:625-631,2003)进行筛选来鉴别有效的Myc抑制剂。在大肠杆菌(E.coli)中表达人MYC和MAX bHLH-LZ结构域并与用Alexa Fluor594标记的E柱DNA双螺旋结合。当混合这3种组分时，MYC和MAX异源二聚化并结合在E柱DNA上。这种结合导致Alexa Fluor 594的荧光偏振信号增强。抑制该复合物的形成的化合物导致荧光偏振降低，并且该活性用在MYC-MAX二聚化抑制剂的筛选中。初始文库筛选用混合物进行。将显示出最强抑制的那些混合物再次合成为单独的化合物并重新筛选，得到图1所示的4个有效的分子。重新评估这些化合物中每一种对MYC-MAX和MAX-MAX的相对结合亲和力，见上文，并且所选的4个结构表现出对MYC-MAX比MAX-MAX二聚体显著更高的亲和力。
抑制的特异性：鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中Myc诱导的致癌性转化的测定用作二次筛选以确定生物学环境中Myc的抑制。CEF被感染逆转录病毒表达载体RCAS，调节ATG-Myc的表达，具有被ATG起始密码子替换的非规范的CTG起始密码子的人Myc变体。ATG起始密码子介导致癌性转化中较高的表达和较大的效力，导致细胞单层中形成病灶微肿瘤。在此第二次筛选中，仅KJ-Pyr-9和KJ-Pyr-10有效对抗Myc的致癌活性(表1)。我们推测，未能显示出细胞效力可能是培养基介质中化合物溶解性差的结果。因为KJ-Pyr-9是所选4个化合物中水溶性最好的，所以所有进一步的实验均用KJ-Pyr-9进行。
表1：抑制剂化合物对Myc诱导的致癌性转化的效力的影响。
化合物 EOT1)
KJ-Pyr-4 1.12
KJ-Pyr-6 0.79
KJ-Pyr-9 0.00083
KJ-Pyr-10 0.00017
1)EOT(转化效率)＝在抑制剂存在下的病灶计数对比对照板上病灶计数
CEF中致癌基因诱导的细胞转化的测定被用于测定KJ-Pyr-9对Myc的选择性。测试了KJ-Pyr-9抑制磷脂酰肌醇3-激酶的ATG-Myc、N-Myc和3个不相关的致癌蛋白即v-Src、v-Jun和H1047R突变体(图2)。N-Myc和ATG-Myc的致癌活性被KJ-Pyr-9显著抑制，而不相关的致癌蛋白要么不受影响(v-Src)或在显著较高的浓度受到抑制(v-Jun，PI3K H1047R)。
KJ-Pyr-9与Myc的结合：KJ-Pyr-9在水中的溶解度低(12.5μM)。由于此限制，许多常用的方法例如分析超速离心、等温量热法和非共价质谱不能提供直接结合的确切证据。但是，我们使用背散射干涉(BSI)(Baksh et al.,Nat.Biotech.29:357-360,2011)能够证明直接相互作用并测定KJ-Pyr-9和Myc的结合常数。表2所示的结果表明，KJ-Pyr-9直接结合Myc(6.5nM)和MYC-MAX异二聚体(13.4nM)，但与MAX同二聚体的结合较弱(>1μM)。数据表明，KJ-Pyr-9能够结合无序单体形式的MYC并且它可离解完整的MYC-MAX复合物。相反，同一个库的另一成员，KJ-Pyr-1，它缺少硝基取代基并无Myc抑制活性，与Myc的结合较弱(230nM)。在转化测定中也测试了该化合物并发现作为Myc抑制剂是无效的。
表2.通过背散射干涉(BSI)测定的KJ-Pyr-9和MYC、MAX和MYC-MAX二聚体的离解常数。
蛋白质 Kd
MYC 6.5±1.0nM
MYC-MAX 13.4±3.9nM
MAX >1.0nM
为了测试KJ-Pyr-9进入细胞并特异性干扰官能MYC-MAX复合物的形成的能力，我们应用了基于海肾荧光素酶(Rluc)的蛋白质片段互补测定(PCA)。基于Rluc的PCA标记已经被设计并用于研究PPI的体内动力学(Bachmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,110:8531-8536,2013；和Stefan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:16916-16921,2007)。该测定的优点是，它实时报告蛋白复合物形成的绝对值。我们使用有效和灵敏的PCA生物传感器，其基于涉及MYC中全长MAX蛋白和C-末端MAX-相互作用结构域的PPI(MYC332-439)。该试验表明，KJ-Pyr-9选择性地降低MYC332-439与MAX复合物的形成，与基于本文用作对照的的蛋白激酶A的同二聚体(PKA)调节亚基(RII:RII)对不相关的生物传感器的影响进行对比。KJ-Pyr-9还干扰MAX同源二聚化，尽管比干扰MYC-MAX异二聚化的程度小。这些数据表明，本文所公开的抑制剂化合物进入细胞并特异性干扰MYC-MAX复合物的形成。
示例2.Myc抑制剂拮抗Myc介导的细胞活性
对细胞增殖的影响：Myc的活性升高是许多癌细胞系的增殖所必需的。针对已知依赖于增强的Myc活性抑制3种细胞系：NCI-H460、MDA-MB-231和SUM-159PT，我们测试了KJ-Pyr-9。虽然KJ-Pyr-9的浓度不同(图3)，所有3种细胞系的增殖均被抑制。此外，显示c-Myc的组成型高表达的伯基特淋巴瘤细胞系对KJ-Pyr-9非常敏感(图6)。针对所选的增殖禽和人细胞还评估了KJ-Pyr-9(图7)。而正常鹌鹑胚胎成纤维细胞(QEF)和由v-jun致癌基因或由化学致癌物甲基胆蒽致癌性转化的QEF在它们的生长中仅轻微受损，由v-myc转化的细胞显著影响更大(图7A)。利用人成纤维细胞和不同的人癌细胞系得到类似的结果。值得注意的是，白血病细胞系K-562、MOLT-4和HL-60，其表达高水平的Myc原癌基因，显著抑制其增殖，而人成纤维细胞或结肠癌细胞系SW-480并未受影响(图7B)。
生长培养基中高浓度的血清降低抑制剂的抗增殖活性。该影响不是化合物与血清蛋白结合造成的，因为补充牛血清白蛋白的低血清培养基不影响抑制剂活性。相反，降低的抑制剂活性可能是由用血清补充的生长因子引起的。
干扰Myc的Myc转录活性：Myc影响大量的靶基因的转录并且可作为激活剂或阻遏剂。我们通过在Myc抑制的存在下和不存在下测定了NDRG 1(N-myc下调基因1)的表达检测了KJ-Pyr-9对Myc转录活性的影响。NDRG 1是用作该基因的阻遏剂的Myc的直接转录靶标。为了比较，我们使用了之前鉴定的结合无序单体并防止Myc采用需要与MAX相互作用的构象的MYC-MAX二聚化抑制剂(Wang et al.,Mol.Cancer Ther.6:2399-2408,2007；和Huang etal.,Exp.Hematol.34:1480-1489,2006)。KJ-Pyr-9和10058-F4都导致NDRG1的表达增加(图4)。然而，KJ-Pyr-9仅对Myc的水平有轻微影响，而10058-F4导致Myc水平显著降低。这一观察表明这两种Myc抑制剂通过不同的机制发挥作用。
KJ-Pyr-9的体内活性：之前的Myc抑制剂在动物模型研究中无效。这些失败是由于对Myc的亲和力不足和药代动力学性能差造成的。我们研究了KJ-Pyr-9在小鼠和大鼠中的药物动力学性质，并且发现KJ-Pyr-9的浓度在血液中达到足以导致c-Myc体外抑制(参见示例3)。在10mg/kg的剂量下我们未观察到急性毒性症状。相当出乎意料地，KJ-Pyr-9透过血脑屏障并且在脑组织中浓度比血液中的更高。
为了测试KJ-Pyr-9的体内有效性，使裸鼠接受混悬于Matrigel中的MDA-MB-231细胞的异种移植物并皮下注射到左和右两翼。当肿瘤达到100mm3的平均体积时，每日腹膜内注射10mg/kg的KJ-Pyr-9或载体对照持续31天处理小鼠。处理8天之后表现出KJ-Pyr-9抑制肿瘤生长。在31天，KJ-Pyr-9处理的动物中肿瘤体积未显著增加(图5)。在实验结束时，提取肿瘤并称重。重量测量与体积测定一致，并确认KJ-Pyr-9制止肿瘤生长的能力(图5)。用KJ-Pyr-9处理对动物体重没有影响。
为了测定肿瘤细胞中的药物活性，从冷冻的肿瘤样品制备蛋白裂解物并通过Western印迹进行分析。这些印迹表明Myc抑制靶标NDRG 1的表达通过用KJ-Pyr-9处理显著增强。增强程度因肿瘤而不同。NDRG 1的免疫荧光染色和组织学分析表明，该不同是由于不同肿瘤内的坏死区域的量不同引起的。这些观察表明，KJ-Pyr-9进入肿瘤组织并抑制Myc的转录活性。
示例3.本发明中使用的一些材料和方法
荧光偏振测定。MYC和MAX的His标记bHLH-LZ结构域在大肠杆菌中表达，并通过His-trap纯化。荧光偏振测定法描述在Kiessling et al.,Chemistry&biology 13(7):745-751,2006中，除了用Alexa Fluor-594代替5-羧基荧光素。
基于海肾荧光素酶的蛋白质片段互补检测。HEK293细胞生长在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。所示的Rluc-PCA表达构建体在24孔板形式中瞬时过量表达。转染24或48小时后，汇合的细胞用20μM KJ-Pyr-9处理。处理后，更换生长培养基并将细胞重新混悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将细胞混悬液转移至白色壁的96孔板中并用LMAX II 384光度计(Molecular Devices公司)进行生物发光分析。在将Rluc基底苄基腔肠荧光素加入到完整细胞(5μM；Nanolight)中之后集成Rluc生物发光信号持续10秒。对于免疫印迹(IB)分析，使用了抗海肾萤光素酶抗体检测F[1]融合(Millipore公司，MAB4410)或F[2]融合(Millipore公司，MAB4400)的杂交蛋白。
细胞培养物中致癌转化的测定。致癌转化是在鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中测定的，如之前Duff&Vogt,Virology 39:18-30,1969和Bos et al.,Genes&Dev.4:1677-1687,1990所描述。CEF被感染一系列所示病毒的10倍稀释液。将化合物加入到营养琼脂覆盖物中。每3天加入另外的含化合物的覆盖物直到实验结束点。通过将人c-Myc的CTG启动密码子变为ATG的定点诱变创建ATG-Myc。然后将其插入到逆转录病毒表达载体RCAS(A).sfi中(Aoki et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14950-14955,1998)。
将背散射干涉数据收集在Molecular Sensing Inc.,Nashville,TN37203组建的仪器上。His-标记的MYC和MAX bHLH-LZ结构域的麦芽糖结合蛋白融合体进行克隆并在大肠杆菌中表达。通过Ni-NTA柱色谱法纯化这些融合蛋白质并通过在Slide-a-Lyzer柱(Thermo-Scientific)中透析将缓冲液交换为60mM Tris盐酸(pH 7.5)、150mM NaCl、9mMMgCl2、3mMEDTA。将恒定量的MYC、MAX或MYC-MAX异二聚体与递增量的KJ-Pyr-9混合并通过背散射干涉进行分析。对所得的折射率变化作图并拟合成逻辑曲线以测定Kd值。
细胞系。人癌细胞系是NCI-H460(ATCC)(大细胞肺癌)，MDA-MB-231(NCI)(乳腺腺癌)、SUM-159PT(Asterand)(雌激素非依赖性乳腺癌)和SW-480(ATCC)(大肠癌)。K-562、MOLT-4和HL-60分别来源于慢性骨髓性白血病原始细胞危象、急性淋巴细胞性白血病和急性骨髓性白血病。人永生化成纤维细胞(hFB)由J.Troppmair(Medical UniversityInnsbruck,Austria)提供。鹌鹑(日本鹌鹑Coturnixjaponica)胚胎成纤维细胞(QEF)和所建立的鹌鹑细胞系Q8、QEF/MC29、VJ、QT6的细胞培养如在Hartl et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:5604-5609,2009中所描述的进行。
细胞增殖测定。测定使用氧化还原染料刃天青染色以根据制造商的方案(Promega,Madison WI)测量细胞存活率。将细胞以103个每100μl孔接种在96孔板种并在2.5％FBS的存在下生长。将MDA-MB-231细胞培养在DMEM中，SUM-159PT细胞培养在HAM’sF12中，以及NCI-H460细胞培养在RPMI中。将MDA-MB-231细胞在KJ-Pyr-9中暴露216小时，在120和192小时供给新鲜的含化合物的培养基；将SUM-159PT细胞在化合物中暴露120小时，在48小时供给含有适当的化合物浓度的新鲜培养基；以及NCI-H460细胞用化合物生长72小时。
利用KJ-Pyr-9处理人细胞K-562、MOLT-4、HL-60和SW-480以及鹌鹑细胞。对于测试粘附细胞类型，将1.5×103个细胞接种在MP-24盘中并在37℃下孵育过夜。第二天，将培养基替换为含有135mM NaCl、5mMKC1、10mM HEPES pH7.4、1mM MgCl2和1mM CaC的200μl ECB缓冲液，和最终浓度为25μM或50μM的KJ-Pyr-9化合物(将储备液稀释在DMSO中)。细胞在37℃孵育30分钟。然后，加入800μl含有该化合物的细胞培养基，并将细胞在37℃进一步孵育24小时。对于生长在混悬液中的细胞(K-562、MOLT-4、HL-60)而言，通过离心收集1.5×103个细胞并再混悬在含有化合物的200μl ECB缓冲液中。在37℃孵育30分钟后，加入含有化合物的800μl培养基中，并如上文所述孵育细胞。用化合物处理后24小时拍摄细胞显微照片。
药代动力学。给3只小鼠腹膜内注射10mg/kg KJ-Pyr-9溶解在10:10:80吐温80:DMSO:5％葡萄糖/水。4小时时血浆和大脑中KJ-Pyr-9的浓度分别为3.5和12.4μM。大鼠静脉内给予1mg/kg；血浆中消除半衰期为约1.84小时(大鼠)。
异种移植实验。给10只8周龄雌性裸鼠(HSD：无胸腺裸鼠)左右侧翼皮下注射5×106个MDA-MB-231细胞。在注射前将细胞混悬在高浓度的Matrigel(BD Biosciences公司)。允许异种移植肿瘤生长到通过外部卡尺测量肿瘤的平均体积达到100mm3。此时，将小鼠分成两组。一组接受10mg/kg KJ-Pyr-9，而另一组仅接受载体，通过腹膜内注射每日施用。每天测量肿瘤体积和小鼠体重。在所有情况下使用的载体均为10:10:80DMSO:吐温80:5％右旋糖在水中。将小鼠进行处理31天时间段。在实验结束时，将小鼠安乐死并切除肿瘤。对肿瘤称重。将每个肿瘤的样品固定在福尔马林中用于组织学和冷冻Western印迹。按照TSRIIACUC批准进行所有脊椎动物实验。
NDRGl的免疫荧光染色。将肿瘤组织固定在4％多聚甲醛中过夜，脱水并包埋于石蜡中。所有样品均切成5μm切片。按照细胞信号传导免疫荧光一般方案对蛋白质局部切片进行加工。抗NDRG l的第一抗体来自细胞信号传导(#5196)。使用来自细胞信号传导免疫荧光一般方案的指令应用多克隆第一抗体的标准免疫组织化学步骤。利用FITC缀合的山羊抗兔IgG(Sigma F-0382)作为第二抗体进行NDRGl和核染色，并固定在具有DAPI的ProLong GoldAntifade(分子探针，#8961S)。用滨松数字CCD照相机拍摄放大40倍的显微照片(显微镜物镜)。
统计学方法。使用(长度)×(宽度)2来计算肿瘤体积。利用在R统计程序中实施的Efron’s Bootstrap(ISBN:0412042312)评估肿瘤体积(Wu和Houghton,J.Biopharma.Stat.19:755-762,2009)。使用106随机化自举重复采样并使用ggplot2包(ISBN：0387981403)作图来测定平均体积和90％置信区间。使用带有106随机化重复采排列组合方法测定P值。
示例4.细胞增殖测定
K562、Daudi、NCI-H460和/或HFF均从ATCC获得并按照制造商的推荐培养。处理前1天，将K562、Daudi、NCI-H460和/或HFF分别以3000、10000、3000、4000个细胞/孔以100μl接种在组织培养处理的96孔板中。在37℃孵育所述板过夜。在高级DMSO(SIGMA，D8418)中制备Myc抑制剂。在无血清培养基中制备连续或单次稀释的化合物稀释液，并以一式三份加入到细胞中(50μl/孔)。在37℃培养3天后，如下分析细胞增殖：将10μl染料溶液(非放射性细胞增殖测定，Promega)加入到每个孔中。在37℃孵育板2-4h。然后将100μl增溶/终止液加入到各孔中，并将板在室温下孵育并搅拌1h。用96孔板读数器(Flexstation 3,Molecular Device)记录570nm吸光度。在GraphPad棱镜中进行数据分析，并且使用非线性回归拟合(Log(抑制剂)对比响应-可变斜率方程式)计算IC50值。
测试的单剂量(20μM)化合物的试验结果示于图8和9中。所选化合物的剂量响应示于图10中。HFF是Myc非依赖性正常细胞。它们被用在此情形中用作非特异性细胞杀伤的对照。这举例说明了Myc抑制剂作为抗癌细胞增殖剂的潜力。
示例5.一些CG-RS-44衍生物化合物的抑制活性的验证
使用ATG-Myc的CEF病灶测试，我们首先确定了该化合物CG-RS-44(KJ-Pyr-9)提供对ATG-Myc的抑制和特异性。该数据表明在0-20μM的浓度范围内化合物呈剂量依赖性抑制(在0、1.25、2.5、5、10和20μM测试)。然后，我们测定了15种CG-RS-44类似物抑制ATG-Myc病灶形成的活性。结果示于图11中。具体地，化合物CG-RS-47、CG-RS-70和CG-RS-129(除了化合物CG-RS-44本身之外)导致在10μM的浓度没有病灶形成。这些化合物在10μM完全抑制病灶形成使它们的作用等于或可能优于CG-RS-44。此外，化合物CG-RS-50、CG-RS-54、CG-RS-55和CG-RS-56还显示出一些抑制活性，而使用化合物CG-RS-58、-61、-64、-90、-91、-106、-123或-128时没有抑制。另外，观察到化合物CG-RS-70或-129略微减慢细胞生长。通过在CEF测定法中测量IC50值还检测了几种化合物的Myc抑制活性。该研究的结果表明，化合物CG-RS-44相比所测试的所有类似物(包括化合物CG-RS-47、-70以及-109B)而言更强地抑制ATG-Myc病灶形成。
也检测了类似物化合物的抑制活性的特异性。简言之，在CEFI特异性测定法中分析了化合物CG-RS-47、-70、-129和-109B对几个Myc类似物(包括v-src、H1047R和v-jun)的抑制活性。结果表明这些CG-RS-44衍生物化合物均显示出对Myc比Myc类似物抑制更强的一定程度的特异性。
示例6.羟醛产物和目标化合物的合成
CG-RS-40的合成
在氮气气氛下将下列化合物4-甲酰基苯甲酰胺(7.0g，47mmol)和2-乙酰呋喃(3.9mL，39mmol)加入到RB烧瓶中。加入THF(280mL)，并且然后加入粉末LiOH(934mg，39mmol)。将所得混浊混合物在室温下搅拌过夜。此时，LC主要显示2-乙酰呋喃和所希望的产物和4-甲酰基苯甲酰胺(约20％)的痕迹。用在20mL水中的2.2mL乙酸淬灭。加入水和乙酸乙酯，分离各层。水层用在乙酸乙酯中的20％IPA萃取两次。合并有机部分并浓缩。将所得固体用乙醚(70mL)处理，加热并滗析。这样重复两次以上。将固体用10％MeOH/DCM(30mL)研磨，过滤并用10％MeOH DCM(10mL)洗涤。固体重量为4.4g。将滤液浓缩并在isco 220g二氧化硅柱中纯化。这得到另外的550mg白色固体。ESI(m/z)＝(M+H)242。
CG-RS-48的合成
在氮气气氛下将下列化合物5-甲酰呋喃-2-甲酰胺(2.6g，18mmol)和2-乙酰呋喃(1.5mL，15mmol)加入到RB烧瓶中。加入THF(106mL)，并且然后加入粉末LiOH(360mg，15mmol)。将所得混浊混合物在室温下搅拌过夜。28h后，用在10mL水中的1mL乙酸淬灭。加入另外的水和乙酸乙酯，分离各层。用在乙酸乙酯(100mL)中的20％IPA萃取水层两次。合并有机部分，用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将所得固体用10％MeOH/DCM(30mL)研磨，过滤并用10％MeOH/DCM(10×3)洗涤。干燥固体的重量为2.0g，约90％纯。未进行进一步纯化。ESI(m/z)＝(M+H)232。
5-甲酰基呋喃-2-甲酰胺的合成
在室温下将5-羟甲基呋喃-2-甲酰胺(470mg，3.3mmol)加入到DCM(6mL)和THF(6mL)中，并加入Des-Martin试剂(1.6g，3.7mmol)。继续搅拌过夜。此时，TLC主要显示所希望的产物(相对于起始材料而言为非极性的)。在甲醇中进行常规的水性处理和分离得到300mg所希望的产物。
5-羟甲基呋喃-2-甲酰胺的合成
将甲基(5-羟甲基)呋喃羧酸酯(12g)，MeOH(50mL)和浓NH4OH(70mL)加入到压力反应器中。加热至100℃，24小时后，TLC显示主要有两个极性斑并且不存在起始原料。在旋转蒸发仪中浓缩，将所得固体加入到约55mL IPA中并加热至完全溶解。冷却至室温，固体开始析出，过滤并干燥(2.4g)，然后将母液浓缩至一半体积，得到1.3g第二批产物。
CG-RS-86的合成
在氮气气氛下将下列化合物4-甲酰基苯甲酰胺(1.49g，10mmol)和4’-溴苯乙酮(1.7g，8.3mmol)加入到RB烧瓶中。加入THF(60mL)，并且然后加入粉末LiOH(200mg，8.3mmol)。将所得混浊混合物在室温下搅拌过夜。此时，LC主要显示所希望的产物。加入乙酸水溶液淬灭反应。加入水和乙酸乙酯，分离各层。水层用在乙酸乙酯中的20％IPA萃取两次。合并有机部分，并用水洗涤。浓缩得到白色固体；将所得固体用乙醚(50mL)处理，超声并预留用于沉淀。过滤并用更多的乙醚(60mL×3)洗涤，干燥得到1.54g，纯度为90-95％。未进行进一步纯化。ESI(m/z)＝(M+H)330。
CG-RS-89的合成
根据如CG-RS-86的合成所述的相似步骤进行4-甲酰基苯甲酰胺(2.3g，15.6mmol)和2’-溴苯乙酮(2.4g，12mmol)的反应，得到1.83g产物。ESI(m/z)＝(M+H)330。
CG-RS-105的合成
根据如CG-RS-86的合成所述的相似步骤进行4-甲酰基苯甲酰胺(1.5g，10mmol)和6-溴吡啶-2-基甲基酮(1.5g，7.5mmol)的反应，得到羟醛产物650mg。ESI(m/z)＝(M+H)331。
CG-RS-107的合成
根据如CG-RS-86的合成所述的相似步骤进行4-甲酰基苯甲酰胺(745mg，5mmol)和5-溴吡啶-2-基甲基酮(800mg，4mmol)的反应，所得320mg羟醛产物。ESI(m/z)＝(M+H)331。
CG-RS-112的合成
根据如CG-RS-86的合成所述的相似步骤进行4-甲酰基苯甲酰胺(450mg，3mmol)和4-乙酰基吡啶(290mg，2.4mmol)的反应，得到300mg羟醛产物。ESI(m/z)＝(M+H)253。
CG-RS-122的合成
根据如CG-RS-86的合成所述的相似步骤进行4-甲酰基苯甲酰胺(1g，6.7mmol)和3-乙酰基吡啶(650mg，5.4mmol)的反应，得到450mg羟醛产物。ESI(m/z)＝(M+H)253。
CG-RS-124的合成
根据如CG-RS-86的合成所述的相似步骤进行4-甲酰基苯甲酰胺(1g，6.7mmol)和2-乙酰基吡啶(650mg，5.4mmol)的反应，得到600mg羟醛产物。ESI(m/z)＝(M+H)253。
CG-RS-145的合成
在氮气气氛下将下列化合物甲基4-甲酰基苯酸酯(1.64g，10mmol)和2-乙酰基呋喃(0.84mL，8.3mmol)加入到RB烧瓶中。加入THF(50mL)，并且然后加入粉末LiOH(200mg，8.3mmol)。将所得混浊混合物在室温下搅拌5h。此时，LC主要表现起始原料，然后加入若干mLMeOH并继续搅拌另外3小时。加入乙酸水溶液淬灭反应。加入水和乙酸乙酯，分离各层。用乙酸乙酯萃取水层。将合并的有机部分用水洗涤两次，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩得到2.8g粗产物。使用220g硅胶柱纯化。ESI(m/z)＝(M+H)257。
目标化合物合成的一般步骤：
CG-RS-44的合成
在氮气下将固体CG-RS-40和CG-RS-32加入到RB烧瓶中。加入DMF，固体变为微红混浊的溶液，然后加入乙酸变成淡黄色。最后加入NH4OAc，溶液变成淡红色，有点透明的溶液。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持2h。此时，LC主要显示所希望的产物并且不存在起始原料。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体分离出来，过滤并用水洗涤几次。将固体溶解在最小量的DCM中并加载在220g硅胶柱上，用100％DCM洗脱达5分钟，然后在5-25分钟提高到0-5％MeOH/DCM，从25至45分钟保持5％MeOH/DCM。合并150至173的级分并浓缩，加入几mL MeOH并研磨，过滤固体并干燥，褐色固体10.5g。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm6.72(dd,J＝3.51,1.76Hz,1H)7.39(d,J＝3.22Hz,1H)7.48(s,1H)7.92(s,1H)8.02-8.07(m,2H)8.08-8.16(m,4H)8.29-8.40(m,3H)8.57(d,J＝9.08Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)386。
目标化合物的代表性合成方案：
CG-RS-50的合成
在氮气下将固体CG-RS-48(2.0g，8.6mmol)和CG-RS-32(3.1g，9.5mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(40mL)，随后加入乙酸(20mL)，然后加入乙酸铵(16.6g，215mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持1.5h。此时，LC主要显示所希望的产物并且不存在起始原料。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体分离出来，过滤并用水洗涤几次。高真空下干燥并然后将固体溶解在DCM(约5mL)中并加载在220g硅胶柱上，用100％DCM洗脱达10分钟，然后在10-30分钟提高到0-4％MeOH/DCM，从30至45分钟保持4％MeOH/DCM。合并185至230的级分并浓缩，加入剩余的异丙醇(约50mL)并研磨，过滤固体并干燥，黄色固体1.04g。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm6.73(dd,J＝3.51,1.76Hz,1H)7.25(d,J＝3.51Hz,1H)7.35(d,J＝2.63Hz,1H)7.64(d,J＝3.51Hz,1H)7.67(br.s.,1H)7.92(s,1H)8.18-8.28(m,2H)8.38(d,J＝8.78Hz,2H)8.46(s,1H)8.54(d,J＝9.08Hz,2H)8.46(s,1H)8.54(d,J＝9.08Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)376。
CG-RS-47的合成
在氮气下将固体CG-RS-40(241mg,1mmol)和CG-RS-46(333mg,1.1mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(5mL)，然后加入乙酸(2.5mL)，然后加入乙酸铵(2.3g，25mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持1h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体分离出来，过滤并用水洗涤几次。用乙醚洗涤(30mL×3)，高真空干燥。将固体溶解在最小量的DCM中并加载在40g硅胶柱上，用0-5％MeOH/DCM洗脱0-20分钟。合并15至55的级分并浓缩，褐色固体120mg。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm 6.72(dd,J＝3.22,1.76Hz,1H)7.38(d,J＝3.51Hz,1H)7.47(br.s.,1H)7.86-7.94(m,1H)7.96-8.16(m,8H)8.32(d,J＝1.17Hz,1H)8.51(d,J＝8.49Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)366。
CG-RS-54的合成
在氮气下将固体CG-RS-40(150mg，0.62mmol)和CG-RS-52(237mg，0.68mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(4mL)，然后加入乙酸(2mL)，并且然后加入乙酸铵(1.2g，15.5mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持2h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体分离出来，过滤并用水洗涤几次，干燥。将固体加入到DCM中并且然后加入IPA(10mL)，在旋转蒸发仪中浓缩。将黑色残余物溶解在最小量的DCM中并加载在40g的硅胶柱上，用100％DCM洗脱达10分钟，从10-25分钟用0-4％MeOH/DCM，从25-30分钟用4％MeOH/DCM。合并49至55的级分并浓缩，淡褐色固体120mg。数据：1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm 6.72(d,J＝l.76Hz,1H)7.37(d,J＝2.93Hz,1H)7.47(br.s.,1H)7.82-7.97(m,3H)8.00-8.19(m,6H)8.29(s,1H)8.51(d,J＝7.90Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)409。
CG-RS-55的合成
在氮气下将固体CG-RS-40(150mg，0.62mmol)和CG-RS-53(246mg，0.68mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(4mL)，然后加入乙酸(2mL)，并且然后加入乙酸铵(1.2g，15.5mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持4h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。后处理和纯化过程类似于CG-RS-54，淡黄色固体，95mg。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm6.71(dd,J＝3.37,1.61Hz,1H)7.35(d,J＝3.22Hz,1H)7.51(d,J＝8.20Hz,3H)7.90(s,1H)7.99-8.17(m,6H)8.22(s,1H)8.41(d,J＝8.78Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)425。
CG-RS-58的合成
在氮气下将固体CG-RS-40(150mg，0.62mmol)和CG-RS-57(243mg，0.68mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(4mL)，然后加入乙酸(2mL)，并且然后加入乙酸铵(1.2g，15.5mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持1h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。后处理和纯化步骤类似于CG-RS-54，淡黄色固体，125mg。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm 3.28(d,J＝10.54Hz,3H)6.72(br.s.,1H)7.39(d,J＝3.22Hz,1H)7.43-7.57(m,1H)7.92(s,1H)7.99-8.22(m,8H)8.31(s,1H)8.55(d,J＝8.20Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)419。
CG-RS-61的合成
在氮气下将固体CG-RS-40(150mg，0.62mmol)和CG-RS-60(258mg，0.68mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(4mL)，然后加入乙酸(2mL)，并且然后加入乙酸铵(1.2g，15.5mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持2h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。后处理和纯化步骤类似于CG-RS-54，褐色固体，120mg。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm6.62-6.77(m,1H)7.37(d,J＝2.93Hz,1H)7.47(br.s.,1H)7.81-7.97(m,3H)8.00-8.19(m,6H)8.27(s,1H)8.43(d,J＝8.20Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)441。
CG-RS-64的合成
在氮气下将固体CG-RS-40(150mg，0.62mmol)和CG-RS-63(229mg，0.68mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(4mL)，然后加入乙酸(2mL)，并且然后加入乙酸铵(1.2g，15.5mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持1h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。后处理和纯化步骤类似于CG-RS-54，淡褐色固体，100mg。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm 3.89(s,3H)6.63-6.81(m,1H)7.37(d,J＝3.51Hz,1H)7.42-7.53(m,1H)7.91(s,1H)7.99-8.19(m,8H)8.28(s,1H)8.45(d,J＝8.49Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)399。
CG-RS-66的合成
在氮气下将固体CG-RS-40(150mg，0.62mmol)和CG-RS-65(243mg，0.68mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(4mL)，然后加入乙酸(2mL)，并且然后加入乙酸铵(1.2g，15.5mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持2h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体分离出来，过滤并用水洗涤几次，用乙醚洗涤3次，干燥。将残余物溶解在最小量的DCM(约1mL)中并加载在40g硅胶柱上，用100％DCM洗脱达5分钟，然后在5-30分钟提高到0-5％MeOH/DCM。合并49至54的级分并浓缩，淡褐色固体70mg。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm6.72(d,J＝1.46Hz,1H)7.38(d,J＝3.22Hz,1H)7.44(s,3H)7.88-7.99(m,3H)8.00-8.15(m,6H)8.27(s,1H)8.48(d,J＝8.49Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)420。
CG-RS-67A和CG-RS-67B的合成
将CG-RS-64(50mg，0.12mmol)加入到加压容器中，加入MeOH(2mL)和锥。加入浓NH4OH(2mL)。将所得溶液加热至100℃并保持过夜。此时，LC显示酸和酰胺两者，无酯存在。将内容物浓缩，将残余物溶解在DCM中，并加入数滴乙酸，再次浓缩。将残余物在12g硅胶柱上纯化，用100％DCM洗脱5分钟，5至30分钟用0-20％MeOH/DCM，30至35分钟用20％MeOH/DCM。顶部级分是酰胺(重量为10mg)。数据：CG-RS-67A：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)μ ppm 6.71(br.s.,1H)7.37(s,1H)7.41-7.50(m,2H)7.90(s,1H)7.98-8.15(m,8H)8.25(s,1H)8.37(d,J＝7.61Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)384。极性级分是酸(重量为19mg)。CG-RS-67B：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm 6.68-6.75(m,1H)7.37(d,J＝2.64Hz,1H)7.46(br.s.,1H)7.91(s,1H)8.00-8.15(m,8H)8.26(s,1H)8.41(d,J＝8.20Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)385。
CG-RS-70的合成
在氮气下将固体CG-RS-40(262mg，1.1mmol)和CG-RS-69(400mg，1.1mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(6mL)，然后加入乙酸(2mL)，并且然后加入乙酸铵(2.1g，27.5mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体分离出来，过滤并用水洗涤几次，干燥。将固体溶解在DCM中，然后加入IPA(10mL)，在旋转蒸发仪中浓缩。将褐色残余物溶解在最小量的DCM中并加载在40g硅胶柱上，用100％DCM洗脱达10分钟，10-25分钟用0-5％MeOH/DCM，25-30分钟用5％MeOH/DCM。合并含有产物的级分并浓缩，淡褐色固体20mg以及略微不纯的100mg。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm 3.90(s,3H)6.67-6.77(m,1H)7.34(d,J＝2.64Hz,1H)7.46(br.s.,1H)7.69(t,J＝7.76Hz,1H)7.91(s,1H)8.00-8.15(m,7H)8.23(s,1H)8.55(d,J＝7.61Hz,1H)8.81(s,1H)。ESI(m/z)＝(M+H)399。
CG-RS-72的合成
在氮气下将固体CG-RS-40(150mg，0.62mmol)和CG-RS-71(218mg，0.68mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(4mL)，然后加入乙酸(2mL)，并且然后加入乙酸铵(1.2g，15.5mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。后处理和纯化步骤类似于CG-RS-54，淡褐色固体，120mg。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)μ ppm 6.09(s,2H)6.69(dd,J＝3.22,1.76Hz,1H)7.05(d,J＝8.20Hz,1H)7.32(d,J＝2.93Hz,1H)7.45(br.s.,1H)7.84-7.90(m,3H)7.92(d,J＝1.17Hz,1H)7.99-8.08(m,4H)8.10(s,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)385。
CG-RS-73的合成
将CG-RS-70(100mg，0.24mmol)加入到加压容器中，加入MeOH(5mL)和浓NH4OH(5mL)。将所得溶液加热至100℃并保持过夜。此时，LC显示酸和酰胺两者，无酯存在。将内容物浓缩，将残余物溶解在IPA中，并加入数滴乙酸，再次浓缩。将残余物在40g硅胶柱上纯化，用100％DCM洗脱达5分钟，5至25分钟用0-20％MeOH/DCM，25至32分钟上升达到30％MeOH/DCM。
级分48-60含有酰胺和酸两者，因此合并并浓缩，采取下一个步骤。合并仅含酸的少量馏分并浓缩得到8mg酸。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ ppm 6.71(br.s.,1H)6.75-7.11(m,1H)7.34(d,J＝3.81Hz,1H)7.46(br.s.,1H)7.61-7.72(m,1H)7.91(s,1H)8.00-8.14(m,7H)8.22(s,1H)8.51(s,1H)8.79(s,1H)。ESI(m/z)＝(M+H)385。
CG-RS-75的合成
在室温下并在氮气下将来自CG-RS-73(60mg)的酸和酰胺的混合物加入到THF(4mL)和MeOH(1mL)的混合物中。加入三甲基硅烷化重氮甲烷(在乙醚中的2M溶液，150μL)并继续搅拌1h。此时，TLC主要显示酰胺和酯，因此，加入数滴乙酸，继续搅拌10分钟。将溶液浓缩并在12g硅胶柱上纯化。得到酰胺，为淡褐色固体(5mg)。数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm 6.68-6.75(m,1H)7.38(d,J＝3.22Hz,1H)7.49(br.s.,2H)7.61(t,J＝7.76Hz,1H)7.90(s,1H)7.96(d,J＝7.91Hz,1H)8.00-8.18(m,7H)8.24(s,1H)8.43(d,J＝8.49Hz,1H)8.68(s,1H)。ESI(m/z)＝(M+H)384。
CG-RS-90的合成
在氮气下将固体CG-RS-86(10.54g，4.7mmol)和CG-RS-87(1.67g，5.17mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(30mL)，然后加入乙酸(15mL)，并且然后加入乙酸铵(约9g，118mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体分离出来，过滤并用水洗涤几次，干燥，红褐色固体1.76g。将粗物质125mg溶解在DCM(1mL)中并加载在12g硅胶柱上。用100％DCM洗脱柱达10分钟，10至25分钟用0-5％MeOH/DCM，25至30分钟用5％MeOH/DCM。得到产物为淡褐色固体(45mg)。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm7.47(s,1H)7.71-7.75(m,2H)7.91(s,1H)8.04(d,J＝8.49Hz,2H)8.11(br.s.,1H)8.17(d,J＝8.49Hz,2H)8.32(d,J＝8.49Hz,2H)8.34-8.40(m,3H)8.44(s,1H)8.61(d,J＝9.08Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)474。
CG-RS-91的合成
在氮气下将固体CG-RS-89(1.54g，4.7mmol)和CG-RS-87(1.67g，5.17mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(30mL)，然后加入乙酸(15mL)，并且然后加入乙酸铵(约9g，118mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。后处理和纯化如CG-RS-90中所述。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm 7.41(td,J＝7.69,1.61Hz,1H)7.46(s,1H)7.54(t,J＝7.47Hz,1H)7.73(dd,J＝7.61,1.46Hz,1H)7.79(d,J＝8.20Hz,1H)8.03(d,J＝7.61Hz,3H)8.06-8.14(m,3H)8.34(d,J＝9.08Hz,2H)8.48(d,J＝1.17Hz,1H)8.55(d,J＝8.78Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)474。
CG-RS-106的合成
在氮气下将固体CG-RS-105(650mg，1.96mmol)和CG-RS-87(698mg，2.2mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(12mL)，然后加入乙酸(6mL)，并且然后加入乙酸铵(3.8g，49mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体分离出来，过滤并用水洗涤几次，用二乙醚洗涤多次，干燥。如上文所述将固体在40g硅胶柱上纯化。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)μ ppm 7.25-7.35(m,1H)7.47(br.s.,1H)7.77(d,J＝7.61Hz,1H)7.97(t,J＝7.76Hz,1H)8.03-8.14(m,5H)8.36(d,J＝8.78Hz,2H)8.54(s,2H)8.59-8.68(m,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)475。
CG-RS-109的合成
在惰性气氛下在室温下将CG-RS-90(120mg，0.25mmol)、N-甲基哌嗪(70μL，0.625mmol)、BINAP(31mg，0.05mmol)和二噁烷(3mL)加入到微波反应容器中。加入NaOtbu(60mg，0.625mmol)，然后加入催化剂Pd2dba3(23mg，0.025mmol)，将所得暗红色溶液用氮气进行真空和压力循环3次。放置在微波反应器中并在105℃加热4h，将2mL DMF加入到所述暗色溶液中，过滤，用20％MeOH/DCM(10mL×3)冲洗，将滤液浓缩并在40g硅胶柱上纯化。得到产率低的产物，5mg。数据：HPLC RT＝3.66，ESI(m/z)＝(M+H)494。
CG-RS-115的合成
在惰性气氛下在室温下将CG-RS-106(120mg，0.25mmol)、吗啉(55μL，0.625mmol)、BINAP(31mg，0.05mmol)和二噁烷(4.5mL)加入到微波反应容器中。加入NaOtbu(60mg，0.625mmol)，然后加入Pd2dba3(23mg，0.025mmol)，将所得暗红色溶液用氮气进行真空和压力循环3次。放置在微波反应器中并在105℃加热4h，将2mL DMF加入到所述暗色溶液中，过滤，用20％MeOH/DCM(10mL×3)冲洗，将滤液浓缩并在40g硅胶柱上纯化。得到产率低的产物，4mg，为淡黄色固体。数据：HPLC RT＝4.22，ESI(m/z)＝(M+H)482。
CG-RS-116的合成
在惰性气氛下在室温下将CG-RS-90(120mg，0.25mmol)、吗啉(55μL，0.625mmol)、BINAP(31mg，0.05mmol)和二噁烷(5mL)加入到干燥的两颈RB烧瓶中。加入NaOtbu(60mg，0.625mmol)，然后加入催化剂Pd2dba3(23mg，0.025mmol)，将所得暗红色溶液用氮气进行真空和压力循环3次。在100℃加热36h，停止加热，使其冷却至室温。将反应内容物通过硅藻土垫过滤，用DCM(30mL)、乙酸乙酯(30mL)和1:1DCM/EA(30mL)冲洗。将滤液浓缩并在12g硅胶柱上纯化。得到产物16mg，为淡黄色固体。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm 3.19-3.24(m,4H)3.71-3.79(m,4H)7.07(d,J＝8.78Hz,2H)7.45(s,1H)8.03(d,J＝8.49Hz,3H)8.13(d,J＝8.20Hz,4H)8.21-8.27(m,4H)8.29(s,1H)8.36(d,J＝9.08Hz,3H)8.60(d,J＝9.08Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)481。
CG-RS-123的合成
在氮气下将固体CG-RS-121(1.3g，3.9mmol)和CG-RS-87(1.4g，4.3mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(20mL)，然后加入乙酸(10mL)，并且然后加入乙酸铵(7.5g，97.5mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体分离出来，过滤并用水洗涤几次，干燥，棕褐色的固体。将粗物质250mg溶解在DCM/MeOH/DMF的混合物(约1mL)中，并加载在40g硅胶柱上。用100％DCM洗脱柱达5分钟，5-25分钟用0-5％MeOH/DCM，25-32分钟用5％MeOH/DCM。得到产物，为淡褐色固体(38mg)。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6):ppm 7.47(br.s.,1H)8.01-8.14(m,5H)8.26(dd,J＝8.49,2.05Hz,1H)8.36(d,J＝8.49Hz,2H)8.50-8.58(m,2H)8.60-8.68(m,3H)8.86(d,J＝2.05Hz,1H)。ESI(m/z)＝(M+H)475。
CG-RS-125的合成
在氮气下将固体CG-RS-122(100mg，0.39mmol)和CG-RS-87(140mg，0.43mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(3mL)，然后加入乙酸(1.5mL)，并且然后加入乙酸铵(800mg，10.4mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体中分离出来，过滤并用水洗涤几次，干燥，最终得到暗色残余物。将残余物用DCM/MeOH的混合物处理，过滤，用相同的溶剂体系冲洗几次。浓缩并在12g硅胶柱上纯化，得到所希望的产物24mg，为褐色固体。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm 6.79(br.s.,1H)7.04(br.s.,1H)7.48(br.s.,1H)7.58(dd,J＝7.76,4.83Hz,1H)8.06(d,J＝8.20Hz,2H)8.12(br.s.,1H)8.20(d,J＝8.20Hz,2H)8.37(d,J＝8.49Hz,2H)8.48(d,J＝13.47Hz,2H)8.61-8.74(m,3H)9.53(s,1H)。ESI(m/z)＝(M+H)397。
CG-RS-128的合成
在氮气下将固体CG-RS-124(252mg，1mmol)和CG-RS-87(355mg，1.1mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(8mL)，然后加入乙酸(4mL)，并且然后加入乙酸铵(1.93g，25mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。如CG-RS-125中所述进行类似的后处理和纯化步骤得到目标化合物。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm 7.47(br.s.,1H)7.52(d,J＝12.30Hz,1H)7.99-8.15(m,6H)8.38(d,J＝8.78Hz,2H)8.53(s,1H)8.63(d,J＝7.91Hz,1H)8.66(d,J＝8.78Hz,2H)8.71-8.77(m,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)397。
CG-RS-129的合成
在氮气下将固体CG-RS-127(252mg，1mmol)和CG-RS-87(355mg，1.1mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(8mL)，然后加入乙酸(4mL)，并且然后加入乙酸铵(1.93g，25mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。如CG-RS-125中所述进行类似的后处理和纯化步骤得到目标化合物。数据：HPLC RT＝3.46，ESI(m/z)＝(M+H)397。
CG-RS-130的合成
在0℃氮气下将固体CG-RS-44(100mg，0.26mmol)加入到DMF(3mL)中。搅拌几分钟后，加入NaH(16mg，60％混悬液，0.39mmol)，继续搅拌5分钟，此时加入Mel(16μl，0.26mmol)。继续搅拌，同时升温至室温。2h后，TLC显示三个点，包括起始原料。用水淬灭，进行常规的后处理和纯化得到所希望的产物(7mg)。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm2.80(d,J＝4.10Hz,3H)6.72(br.s.,1H)7.39(d,J＝3.22Hz,1H)7.89-7.94(m,1H)8.00(d,J＝8.20Hz,2H)8.08-8.16(m,3H)8.32-8.41(m,3H)8.58(d,J＝8.20Hz,3H)。ESI(m/z)＝(M+H)400。
CG-RS-131的合成
在0℃氮气下将固体CG-RS-44(193mg，0.5mmol)加入到DMF(6mL)中。搅拌几分钟后，加入NaH(96mg，60％混悬液，2mmol)，继续搅拌5分钟，此时加入MeI(125μl，2mmol)。继续搅拌，同时升温至室温。搅拌过夜后，TLC主要显示是单点。用水淬灭，进行常规处理得到170mg粗产物，其中纯化50mg并将其余部分进行下一个步骤。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm 2.84-3.09(m,6H)6.72(br.s.,1H)7.39(d,J＝3.22Hz,1H)7.57(d,J＝7.91Hz,2H)7.91(s,1H)7.99-8.16(m,3H)8.26-8.44(m,3H)8.57(d,J＝8.49Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)414。
CG-RS-134的合成
在室温和氮气下将CG-RS-44(77mg，0.2mmol)加入到DCM(2mL)中。搅拌几分钟后，加入TFAA(44μl)，然后加入TEA(60μl)。在室温下搅拌2小时后，TLC和LC均显示所希望的产物。加入DCM并然后加入水，分离各层。用DCM萃取水层，将合并的有机部分用水洗涤两次，干燥(Na2SO4)。将粗产物在12g硅胶柱上纯化，得到43mg所希望的化合物，为黄色固体。数据：1HNMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm6.72(br.s.,1H)7.40(d,J＝3.22Hz,1H)7.92(s,1H)8.03(d,J＝8.20Hz,2H)8.11(s,1H)8.22(d,J＝8.20Hz,2H)8.31-8.41(m,3H)8.57(d,J＝8.49Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)368。
CG-RS-136的合成
在惰性气氛下在室温下将CG-RS-123(240mg，0.5mmol)、吗啉(109μL，1.25mmol)、BINAP(62mg，0.1mmol)和二噁烷(7mL)加入到干燥的两颈RB烧瓶中。加入NaOtbu(120mg，1.25mmol)，然后加入催化剂Pd2dba3(46mg，0.05mmol)，将所得暗红色溶液用氮气进行真空和压力循环3次。在100℃下加热24h，停止加热，使其冷却至室温。通过棉塞过滤反应内容物，用DCM/MeOH混合物冲洗几次。浓缩滤液，溶解在DMF(2mL)中，并在40g硅胶柱上纯化。得到产物32mg，为黄色固体。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm 3.28-3.51(m,4H)3.76(br.s.,4H)6.64-7.16(m,1H)7.36-7.60(m,2H)8.05(s,5H)8.30-8.52(m,4H)8.52-8.69(m,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)482。
CG-RS-137的合成
在惰性气氛下在室温下将CG-RS-123(240mg，0.5mmol)、N-甲基哌嗪(139μl，1.25mmol)、BINAP(62mg，0.1mmol)和二噁烷(7mL)加入到干燥的两颈RB烧瓶中。加入NaOtbu(120mg，1.25mmol)，然后加入催化剂Pd2dba3(46mg，0.05mmol)，将所得暗红色溶液用氮气进行真空和压力循环3次。在100℃加热24h，停止加热，使其冷却至室温。通过棉塞过滤反应内容物，用DCM/MeOH混合物冲洗几次。浓缩滤液，溶解在DMF(2mL)中，并在40g硅胶柱上纯化。得到产物28mg，为黄色固体。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm 2.33(br.s.,3H)2.61(br.s.,4H)3.32-3.41(m,4H)7.45(br.s.,1H)7.51(d,J＝2.34Hz,1H)8.05(s,4H)8.10(br.s.,1H)8.33-8.40(m,3H)8.41-8.47(m,2H)8.55-8.65(m,3H)。ESI(m/z)＝(M+H)495。
CG-RS-143的合成
将在乙醇(3mL)中的NH4OH.HC1(70mg，1mmol)和K2CO3(276mg，2mmol)加入到干燥的RB烧瓶中。搅拌5分钟，然后加入CG-RS-140(100mg，0.27mmol)，并且然后加热回流。回流6h后，将反应混合物在旋转蒸发仪中浓缩。加入MeOH，过滤，并且然后用更多的MeOH冲洗，浓缩。向残余物中加入原甲酸三乙酯(约5mL)，并加热至140-150℃过夜。停止加热，使其冷却并浓缩。将残余物在12g硅胶柱上纯化；得到约3mg所希望的产物。数据：HPLC RT＝4.32，ESI(m/z)＝(M+H)411。
CG-RS-147的合成
在氮气下将固体CG-RS-145(512mg，2mmol)和CG-RS-87(711mg，2.2mmol)加入到RB烧瓶中。加入DMF(10mL)，然后加入乙酸(5mL)，并且然后加入乙酸铵(4.6g，60mmol)。放置在预热至50℃的油浴中，并且然后加热至90℃，在该温度保持3h。此时，LC主要显示所希望的产物。停止加热，使其冷却至室温。通过加入过量的水淬灭，并搅拌一会儿。将固体中分离出来，过滤并用水洗涤几次，干燥。将固体溶解在DCM(10mL)中并加入8g硅胶，浓缩。将固体加载在硅胶塞上并纯化。得到产物，为黄色固体(300mg)，数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm3.88(s,3H)6.71(dd,J＝3.22,1.76Hz,1H)7.38(d,J＝3.22Hz,1H)7.91(s,1H)8.03-8.21(m,5H)8.35(d,J＝9.66Hz,3H)8.56(d,J＝8.78Hz,2H)。ESI(m/z)＝(M+H)401。
CG-RS-148的合成
将固体CG-RS-147(60mg，0.15mmol)溶解在THF(3mL)中并加入1M LiOH水溶液(0.3mL，0.3mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。此时，LC仅显示起始原料，因此加入另外一部分1M LiOH水溶液(0.3mL，0.3mmol)。在50℃加热3h。此时，TLC显示无起始原料残留，因此停止加热。使其冷却至室温。加入乙酸乙酯和水，分离各层。用乙酸乙酯洗涤水层，然后酸化至pH为约5。用DCM萃取两次，因为两个有机层均具有化合物，合并，干燥并浓缩。在12g硅胶柱上纯化得到32mg所希望的化合物，为白色固体。数据：1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ ppm6.71(dd,J＝3.22,1.46Hz,1H)7.39(d,J＝3.22Hz,1H)7.91(s,1H)8.02-8.20(m,5H)8.28-8.42(m,3H)8.57(d,J＝8.78Hz,2H)13.15(br.s.,1H)。ESI(m/z)＝(M+H)387。
应当理解的是，本文所述的示例和实施方式仅用于说明的目的，其各种修改或改变将被建议给本领域技术人员并且被包括在本申请的精神和范围内，并且被包括在所附权利要求书的范围内。虽然类似或等同于本文所述的任何方法和材料均可用在本发明的实施或测试中，但是描述了优选的方法和材料。
本文引用的所有出版物、GenBank序列、ATCC保藏物、专利和专利申请均在此通过引用明确地整体并入本文并且用于所有目的，如同每个均单独地指明一样。

Claims (6)

1.一种具有式1结构的化合物：
其中R1、R2和R3各自独立地选自呋喃-2-基、呋喃-3-基、呋喃-4-基、4-卤代苄基、3-卤代苄基、5-卤代苄基、二卤代苄基、三卤代苄基、四卤代苄基、五卤代苄基、
其中卤素是氟、氯、溴或碘；并且前提是当R3是呋喃基时，R1不能是
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是R3是或呋喃基，且R2选自呋喃基、
3.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含具有式1结构的化合物：
其中R1、R2和R3各自独立地选自呋喃-2-基、呋喃-3-基、呋喃-4-基、4-卤代苄基、3-卤代苄基、5-卤代苄基、二卤代苄基、三卤代苄基、四卤代苄基、五卤代苄基、
其中卤素是氟、氯、溴或碘。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中R1是R3是或呋喃基，并且R2选自呋喃基、
5.一种用于治疗癌症的方法，其包括施用有效量的具有式1结构的化合物：
其中R1、R2和R3各自独立地选自呋喃-2-基、呋喃-3-基、呋喃-4-基、4-卤代苄基、3-卤代苄基、5-卤代苄基、二卤代苄基、三卤代苄基、四卤代苄基、五卤代苄基、
其中卤素是氟、氯、溴或碘。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，R1是R3是或呋喃基，并且R2选自呋喃基、
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