KR20160122123A - 저분자 c-myc 억제제들 - Google Patents

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KR20160122123A
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pyr
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피터 케이. 보그트
프란시스 엑스. 타바레스
김 디. 잔다
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더 스크립스 리서치 인스티튜트
소렌토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 저분자 Myc-억제제들을 제공한다. 또한 Myc-유래 암을 치료하기 위한 이들 화합물들의 치료적 적용 예들 및 다른 관련된 방법들이 본 발명에서 제공된다.

Description

저분자 C-MYC 억제제들{SMALL MOLECULE C-MYC INHIBITORS}
본 개시는 c-Myc 억제제들인 화합물들의 군을 제공한다. 본 개시는 또한 유효한 양의 개시된 c-Myc 억제제 투여를 포함하는 종양 치료를 위한 방법들을 제공한다.
원발암유전자 (proto-oncogene) c-myc는 세포 증식을 제어하는 전사 인자 (Myc) 를 인코딩한다. Myc는 또한 세포 주기, 세포 성장, 혈관형성, 세포사멸, 및 발암을 조절하는 역할을 한다. Myc는 거의 모든 암들에 수반되고, Myc의 기능의 획득 (gain of function) 은 거의 모든 인간의 암들에서 나타난다. Myc의 활성은 돌연변이들, 염색체 재배열, 증가된 발현, 또는 유전자 증폭의 결과로서 종양들에서 증가할 수 있다. c-Myc의 상승된 발현 또는 해제된 발현은 광범위한 인간의 암들에서 검출되고, 종종 공격적이고, 악성으로 분화된 종양들과 연관된다. 이러한 암들은 결장 (colon), 유방 (breast), 자궁경부 (cervical), 소세포 폐암 (small cell lung carcinomas), 골육종 (osteosarcomas), 교모세포종 (glioblastomas), 흑색종 (melanoma) 및 골수성 백혈병 (myeloid leukemias) 을 포함한다.
광범위한 병원성 중요도로 인해, Myc는 중요한 암 타깃이다. 그러나, Myc는 저분자 억제제들에 대해 저항하는 타깃이다. 개념적인 어려움들 및 실제적인 어려움들 양자는 Myc의 강력하고 효과적인 저분자 억제제들을 식별하는데 걸림돌이었다. 이 개념적인 장애물들은 근본적인 셀의 활성들을 제어하는 유전자를 억제하는 것에 관한 우려를 반영한다. Myc를 타깃팅하는데 있어서 주요 실제적인 어려움은 저분자들에 대한 바인딩 사이트들로서 기능할 수 있는 포켓들 또는 홈들의 부재이다. 당업계에 공지된 저분자 Myc-억제제들은 효능 및 인 비보 (in vivo) 적용을 위한 적절한 약동학 속성들이 결여되었다.
당업계에는 c-Myc 매개 종양 활성들 및 시그널링 경로들을 억제하기 위한 보다 나은 수단뿐만 아니라 암을 치료하고 방지하기 위한 보다 효과적인 치료법들에 대한 요구가 있다. 본 개시는 당업계의 이러한 그리고 다른 충족되지 않은 요구들을 해결한다.
일 양태에서, 본 발명은 화학식 1의 구조를 갖는 화합물에 있어서,
Figure pct00001
여기서 R1, R2, R3은 푸란-2-일, 푸란-3-일, 푸란-4-일, 4-할로벤질, 3-할로벤질, 5-할로벤질, 디할로벤질, 트리할로벤질, 테트라할로벤질, 펜타할로벤질,
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
및
Figure pct00010
로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
할로는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오드이고, 단,
R3가 푸라닐일 때, R1은
Figure pct00011
일 수 없는, 화합물을 제공한다.
바람직하게, R1은
Figure pct00012
이고, R3은 또는 푸라닐이고, 그리고 R2는
Figure pct00014
, 푸라닐,
Figure pct00015
및
Figure pct00016
로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 개시는, 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물로서,
Figure pct00017
여기서 R1, R2, R3은 푸란-2-일, 푸란-3-일, 푸란-4-일, 4-할로벤질, 3-할로벤질, 5-할로벤질, 디할로벤질, 트리할로벤질, 테트라할로벤질, 펜타할로벤질,
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
및
Figure pct00026
로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
할로는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오드인, 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
바람직하게, R1은
Figure pct00027
이고, R3은
Figure pct00028
또는 푸라닐이고, 그리고 R2는
Figure pct00029
, 푸라닐,
Figure pct00030
및
Figure pct00031
로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 개시는, 암들을 치료하기 위한 방법에 있어서,
유효한 양의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 투여하는 단계를 포함하고,
Figure pct00032
여기서 R1, R2, R3은 푸란-2-일, 푸란-3-일, 푸란-4-일, 4-할로벤질, 3-할로벤질, 5-할로벤질, 디할로벤질, 트리할로벤질, 테트라할로벤질, 펜타할로벤질,
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
및
Figure pct00041
로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
할로는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오드인, 암 치료 방법을 또한 제공한다.
바람직하게, R1은
Figure pct00042
이고, R3은
Figure pct00043
또는 푸라닐이고, 그리고 R2는
Figure pct00044
, 푸라닐,
Figure pct00045
및
Figure pct00046
로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 부가적인 양태들 및 실시예들, 뿐만 아니라 본 발명의 특정한 속성들 및 장점들은 본 특허 명세서의 나머지 부분들 및 첨부된 청구항들에 기술된다.
도 1은 KJ-Pyr-9가 조류 레트로바이러스 (Avian retroviruses) 에 의한 1차 세포들의 Myc-의존성 형질변환을 방지하는 것을 나타낸다. 닭 배아 섬유아세포는 Myc (RCAS(A)-ATG-Myc) 를 포함하는 조류 바이러스의 102, 103, 또는 104 배 희석물에 감염되었다. 이 세포들은 영양 한천 배지 (nutrient agar media) 를 씌워 10 일간 유지되었다. 상단: MAX-MAX와의 상호작용으로 MYC-MAX에 바인딩하는 경우와 비교한 KJ-Pyr-4, KJ-Pyr-6, KJ-Pyr-9 및 KJ-Pyr-10의 형광 편광 데이터이다. 하단: 4 가지 화합물들의 구조이다.
도 2는 MYC, N-MYC, v-Src, PI3K H1047R, 및 v-Jun에 의해 유도된 KJ-Pyr-9 대 종양 형질변환의 용량-반응 (dose response) 을 도시한다. 단일 닭 배아로부터 유도된 세포들을 사용하여 수행된 대표적인 실험으로부터의 데이터이다.
도 3a 내지 도 3c는 세포 증식에 대한 KJ-Pyr-9의 영향을 도시한다. (A) NCI-H460 (ATCC), (B) MDA-MB-231 (NCI), 및 (C) SUM-159PT (Asterand) 의 증식에 대한 KJ-Pyr-9의 용량 반응 곡선들이다.
도 4는 MDA-MB-231 및 NCI-H460 세포들에서 NDRG의 발현에 대한 KJ-Pyr-9의 영향을 도시한다. NCI-H460 세포들은 RPMI 배지에서 성장되고, MDA-MB-231 세포들은 DMEM 배지에서 성장되고; 양 배지는 10 ％ FBS 내에 담긴다. KJ-Pyr-9 및 10058-F4는 20 μM의 농도로 첨가되고 세포들은 웨스턴 블롯 분석 (Western blot analysis) 전에 24 시간 동안 처리된다.
도 5a 내지 도 5c는 KJ-Pyr-9가 MDA-MB-231 세포들의 이종 이식 성장을 간섭하는 것을 도시한다. 마우스의 좌우 옆구리 피하에 5×106 MDA-MB-231 세포들이 주입된다. 종양이 100 ㎣의 부피에 이를 때, 마우스들 중 반은 10 ㎎/㎏ KJ-PYR-9를 매일 복강 내 주사되고, 나머지 반은 전파체 (vehicle) 만 수용한다. 31 일간 종양 성장이 이어졌다. (A) 치료된 동물들과 치료되지 않은 동물들의 종양 부피를 나타낸다. (B) 치료된 동물들과 치료되지 않은 동물들의 종양 중량을 나타낸다. (C) 시간에 따른 종양 부피를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6c는 버킷 림프종 유도 세포 라인들이 KJ-Pyr-9에 의해 억제된다는 것을 도시한다. (A) Akata, (B) Ramos, (C) Raji. 96-웰 (well) 플레이트 상에서 웰 당 103 개의 세포들이 파종되고 (seed), 나타낸 농도의 KJ-Pyr-9로 72 시간 동안 치료되었다. 세포 증식은 레자주린 형광 (resazurin fluorescence) 에 의해 결정되었다.
도 7a 및 도 7b는 v-myc-형질변환된 메추리 배아 섬유아세포의 증식 (A) 및 인간 백혈병 및 암 세포 라인들 (B) 의 증식에 대한 KJ-Pyr-9의 영향을 도시한다. 화합물들은 나타낸 농도로 초기 메추리 배아 섬유아세포들 (QEF), 종양 유전자들 v-myc (Q8, QEF/MC29), v-jun (VJ), 또는 메틸콜란트렌 (QT6) 에 의해 형질변환된 메추리 세포 라인들 및 인간 피부 섬유아세포들 (hFB), 비유착 (non-adherently) 성장하는 백혈병 세포 라인들 K-562, MOLT-4, HL-60, 또는 선암 세포 라인 SW-480에 첨가되었다. 대조구 (cotrol) 로서, 화합물의 용매 DMSO (dimethyl sulfoxide) 가 세포들에 첨가되었다. 화합물의 첨가 후 24 시간 후에 현미경 촬영되었다.
도 8a 내지 도 8c는 2 가지 인간 암 세포 라인들: Daudi (A) 및 K562 (B) 에서 테스트된 제 1 일련의 화합물들 (CG-RS-44 내지 CG-RS-103) 의 세포 독성 효능을 도시한다. 도 8c는 인간 포피 섬유아세포들 (HFF) 에서 테스트된 화합물들의 비특이적 세포 독성을 도시한다.
도 9a 내지 도 9c는 Daudi (A), 및 K562 (B) 에서 테스트된 제 2 일련의 화합물들의 세포 독성 효능을 도시한다. 도 9c는 HFF에서 테스트된 화합물들의 비특이적 세포 독성을 도시한다.
도 10은 선택된 화합물들의 농도가 증가하는 동안 배양될 때 4 개의 상이한 세포 라인들의 세포 생존율을 도시한다.
도 11은 CEF 병소 분석들에서 ATG-Myc의 억제를 위한 KJ-Pyr-9 유사 화합물들의 검진 (screening) 결과들을 도시한다. 도면에 나타낸 바와 같이, 화합물 각각은 10 μM의 농도에서 시험되었다. 화합물 농도 뒤에 열거된 마지막 두 자리는 상이한 화합물들의 내부 명칭에 대응한다. 화합물 CG-RS-44 (도면에서 "44"로 표기됨) 의 2 배치들이 연구 동안 테스트되었다.
관련 출원들의 교차 참조
본 특허 출원은 미국 특허 가 출원 번호 제 61/914,590 호 (2013년 12월 11일 출원) 의 우선의 이익을 주장한다. 우선권 출원의 전체 개시는 모든 목적들을 위해 전체가 참조로서 본 명세서에 인용된다.
정부지원에 관한 선언문
본 발명은 미국 국립 보건원 허가 제 CA078230 호에 의해 미합중국 정부의 일부 지원으로 이루어졌다. 따라서 미합중국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
I. 개요
본 발명은 c-Myc-억제 화합물들 및 c-Myc 시그널링 경로 억제 및 암 치료 시 이들의 용법들에 관한 것이다. Myc는 bHLH-LZ (basic helix-loop-helix leucine zipper) 단백질 MAX와 작용성이 되도록 중합하는 (dimerize) bHLH-LZ 단백질군에 속하는 전사 조절기 (transcriptional regulator) 이다. MYC-MAX 헤테로다이머는 E-Box 모티프, 회귀성 DNA 시퀀스에 우선적으로 바인딩한다. MYC는 2 분자 레벨들에서 전사에 영향을 준다. 전사 인자로서, MYC는 전사 활성을 자극하거나 억제하도록 타깃 유전자들의 촉진제들에 바인딩할 수 있다. MYC 기능 획득을 나타내는 암 세포들의 전사 증폭제로서, MYC는 기존의 전사 프로그램들의 활성을 향상시킨다. 양자의 상황들에서, MYC는 효과적이 되도록 MAX와 중합되어야 한다. 인간 게놈은 3 개의 MYC 유전자들 및 대응하는 단백질들, c-MYC, N-MYC 및 L-MYC를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, MYC는 본 명세서에서 c-MYC 단백질을 나타내도록 사용된다. c-Myc는 또한 전사 억제제로서 역할을 할 수 있다. Miz-1 전사 인자를 바인딩하고 p300 보조활성제를 대체함으로써, MYC는 Miz-1 타깃 유전자들의 발현을 억제한다. 부가적으로, Myc는 DNA 복제의 제어에서 직접적인 역할을 갖는다.
Myc는 (MAPK/ERK 경로를 통해) Wnt, Shh 및 EGF와 같은 다양한 미토겐 신호들에 활성화된다. 타깃 유전자들의 발현을 변경함으로써, Myc 활성화는 다양한 생물학적 효과들을 발생시킨다. 발견되는 첫번째 효과는 세포 증식을 구동하는 (사이클린들을 상향조절하고 (upregulate), p21을 하향조절하는 (downregulate)) 능력이지만, 또한 세포 성장 (리보솜 RNA 및 단백질들을 상향조절), 세포사멸 (Bcl-2을 하향조절), 분화 및 줄기 세포 자기-재생을 조절하는 매우 중요한 역할을 한다. Myc는 매우 강한 원생-종양 유전자이고 많은 타입들의 암들에서 상향조절되는 것이 매우 자주 발견되었다. Myc 과발현은 아마도 DNA 과복제를 통해 유전자 증폭을 자극한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, c-Myc 시그널링 경로 또는 c-Myc 매개 세포 활성은 Myc 활성화의 결과로서 발생할 모든 생화학적 효과 또는 세포 반응을 지칭한다.
요약하면, c-Myc는 다양한 성장 유전자들 (pro-growth) 및 세포사멸 방지 유전자들을 구동하고, 암에서 빈번하게 과발현된다. 따라서, c-Myc에 의해 유발된 종양 형질변환의 억제는 고형 종양 및 백혈병 양자의 치료에 광범위한 활용도를 갖는 강력한 화학 요법 전략을 대표할 것이다. 본 발명은 MYC-MAX 상호작용을 억제하고 따라서 넓은 스펙트럼의 암들을 치료할 수 있는 화합물들의 속 (genus) 을 제공한다. 본 발명은 또한 다양한 치료적 적용들에 본 명세서에 기술된 Myc 억제제 화합물들 및 유도성 화합물들을 채용하는 방법들을 제공한다.
II. c- Myc 억제제 화합물들
이하의 예들에 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명은 적어도 부분적으로 본 발명자들에 의한 몇몇 공지의 화합물들의 c-Myc 억제 활성들의 발견을 예측하였다. 이들 화합물들은 액상 (solution-phase) 생물학적 검사를 위해 처음 조제된 Krohnke 피리딘 화합물들의 조합 라이브러리의 화합물이다 (Fujimori et al., J. Combinatorial Chem. 5:627-631, 2003). 이 화합물들 중 일부의 신규한 c-Myc 억제 활성들은 MYC-MAX 상호작용에 대한 형광 편광 검사를 통해 식별되었다. 식별된 화합물들은 세포 배양 시 Myc-유도 종양 형질변환을 억제하고, Myc-과발현 인간 및 조류 세포들의 증식을 방해하고, Myc-매개 전사 조절을 감소시킬 수 있다. 부가적으로, 이 화합물들은 Myc-과발현 인간 암 세포들의 이종 기관 이식의 성장을 효과적으로 차단할 수 있다. 본 명세서에 예시된 특이 Myc-억제제 화합물들은, 4-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)벤즈아미드 (KJ-Pyr-9), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-10), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-메톡시페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-6), 4'-(2-(푸란-2-일)-6-페닐피리딘-4-일)-[1,1'-비페닐]-4-카복사미드 (KJ-Pyr-4) 이다. 이들의 구조는 도 1에 도시된다.
본 명세서에 예시된 c-Myc 억제제 화합물들에 부가하여, 이들 화합물들로부터 개질되고 합성될 수 있는 유도성 화합물들은 또한 본 발명의 방법들의 실시예 적합할 수 있다. 이들 공지의 화합물들로부터 유도된 일부 특이 c-Myc 억제제 화합물들은 이하에 상세히 기술된다. 예를 들어, KJ-Pyr-9, KJ-Pyr-10, KJ-Pyr-6 또는 KJ-Pyr-4에 대하여, 일부 이들의 유도성 화합물들은, 상이한 일원자기 (mono-valent group) 또는 다원자기 (multi-valent group) 로 대체된 하나 이상의 일원자기 또는 다원자기를 가질 수 있다. 대체된 기는 예를 들어, H; 할로겐; 직쇄형 또는 고리형 또는 분기형 체인 알킬기; 직쇄형 또는 고리형 또는 분기형 체인 알케닐기; 직쇄형 또는 고리형 또는 분기형 체인 알키닐기; 할로-알킬기 또는 할로-알케닐기 또는 할로-알키닐기; CN; CF3; 아릴기 및 아릴 링의 임의의 또는 모든 H 기들이 상이한 기로 치환되는 치환된 아릴기들; 헤테로 고리형 기들 및 아릴 링의 임의의 또는 모든 H 기들이 상이한 기로 치환되는 치환된 헤테로 고리형 기들; 카르복실기; 카르보닐기, 알콕실기; 알킬옥시알케인기들; 알콕시카르보닐기; 아릴옥실기, 헤테로사이클릴옥실기; 하이드록실기; 아민기; 아미드기; 아미노기; 4차 아미노기; 니트로기; 술포닐기; 알킬아민기; 시릴기, 실록실기; 포화된 C-C 결합들; 포화되지 않은 C-C 결합들; 에스테르기, 에테르기, 아미노기; 아미드기, 우레탄, 카르보닐기, 아세틸기 및 케틸기; N, S 및 O를 포함하는 헤테로 원자들; 폴리머기; 및 아미노산들일 수 있다. 일부 유도성 화합물들에서, 하나 이상의 수소들이 보다 적은 알킬기로 치환될 수 있다. 다양한 유도성 화합물들은 이들의 c-Myc 억제 활성을 확인하기 위해 기능 검사 (예를 들어, 본 명세서에 예시된 바와 같은 증식 억제 분석) 를 받을 수 있다.
일부 실시예들에서, 유사하거나 개선된 속성들을 갖는 변종 화합물들 또는 유도성 화합물들은 예시된 c-Myc 억제제 화합물들 (리드 화합물들) 의 추론적인 최적화에 의해 얻어질 수 있다. 선택가능하게, 추론적 설계를 통해 생성된 화합물들은 개선된 활성들을 갖는 화합물들을 식별하기 위해 기능 검사 또는 스크리닝을 더 받을 수 있다. 이러한 변종 화합물들을 설계하고 스크리닝하기 위한 상세한 방법들은 이하에 기술된다. 본 명세서에 예시된 다양한 c-Myc 억제제 화합물들 및 이들의 변종들 또는 유도체들은 모두 본 명세서 또는 Fujimori et al., J. Combinatorial Chem. 5:627-631, 2003에 기술된 유기 화학 또는 프로토콜들의 일상적으로 실시된 방법들을 사용하여 용이하게 준비될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 개선된 속성들을 갖는 c-Myc 시그널링 경로의 억제제를 식별하기 위한 방법들을 제공한다. 방법들은 4-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)벤즈아미드 (KJ-Pyr-9), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-10), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-메톡시페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-6), 및 4'-(2-(푸란-2-일)-6-페닐피리딘-4-일)-[1,1'-비페닐]-4-카복사미드 (KJ-Pyr-4) 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 구조적으로 유사한 리드 c-Myc 억제제 화합물의 합성하는 것, 및 (b) 리드 억제제 화합물에 비해 개선된 생물학적 속성 또는 약학적 속성을 갖는 유사성을 식별하기 위해 유사물들에 대한 기능 분석을 수행하는 것을 수반할 수 있다. 일부 바람직한 방법들에서, 채용된 리드 c-Myc 억제제 화합물은 4-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)벤즈아미드 (KJ-Pyr-9) 또는 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-10) 이다. 스크리닝될 개선된 생물학적 속성 또는 약학적 속성은 c-Myc 매개 시그널링 활성들을 억제하는 향상된 활성일 수 있다. 대안적으로, 개선된 생물학적 속성 또는 약학적 속성은 종양 세포의 성장을 억제하는 향상된 활성 예를 들어, 대장암, 유방암, 자궁경부암, 소세포 폐암, 골육종, 교모세포종, 흑색종, 또는 골수성 백혈병의 성장에 대한 향상된 억제 활성일 수 있다.
예시로서, 상기 공지의 화합물들로부터 유도된 다수의 유사한 화합물들 또는 변종 화합물들의 합성 및 활성은 이하에 기술된다.
III. 일부 예시된 c- Myc 억제제 화합물들의 합성 스킴 및 활성
이하의 표는 나타낸 분석 데이터를 사용하여 분석되고 합성된 예시적인 구조들을 코드명과 함께 나타내었다.
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
CG-RS-44는 또한 KDJ-Pyr-9로 명명되고, CG-RS-50은 또한 KDJ-Pyr-10으로 명명된다는 것을 주의해야 한다.
상기 기술된 화합물들에 의해 명백한 바와 같이, 본 발명은 신규한 일련의 MYC-MAX PPI의 소분자 길항제를 제공한다. 이들 화합물들의 군의 가장 강력한 부재들은 나노몰 친화도로 Myc 및 MYC-MAX 양자에 바인딩될 수 있다. 이들 화합물들은 또한 MYC-구동 종양 형질변환 뿐만 아니라 Myc-종속 전사 조절을 억제한다. 이들은 몇몇 인간 암 세포 라인들의 생존력 및 증식 능력에 대한 강한 영향을 보인다. 이들 영향들은 특히 백혈병 세포들의 경우에 두드러지지만, 또한 고형 종양으로부터 유도된 세포 라인들까지 연장한다. 이들 분자들의 유망한 약물동태학적 속성들은 또한 추가의 인 비보 연구들에 허용된다. MYC-MAX PPI의 이들 억제제들은 Myc-구동 이종 이식 종양의 성장을 효과적으로 방해하고 종양 성장을 차단할 수 있다는 것을 알았다.
고형 지지체에 대한 일부 유사한 화합물들의 조제 절차들은 이하에 도시된다.
Figure pct00056
스킴 1. RAM (Rink amide) 고형 지지체 상의 화합물들 조제
고형 지지체 SJ2-86 상의 화합물들의 고정
4-카르복시벤즈알데하이드 (0.72 g, 4.8 mmol, 3.0 eq), 하이드록시벤조트리아졸 (HOBt) (0.74 g, 4.8 mmol, 3.0 eq.) 및 N,N'-디이소프로필카보디이미드 (DIC) (0.76 ㎖, 0.61 g, 4.8 ㎖, 3.0 eq.) 가 N,N-디메틸포름아미드기 (DMF) (8.0 ㎖) 내의 보호해제된 (deprotected) RAM 수지 (2.2 g, 0.73 mmol/g, 1.6 mmol) 현탁액에 첨가된다. 12 시간의 격렬한 진동 (shaking) 후에, 용매는 흡입 여과 (filtration under suction) 에 의해 제거되고 수지는 DMF, MeOH, 및 CH2Cl2 (3 x 3 x 10 ㎖) 로 연속적으로 세척된다. 이 수지 상의 아민기의 정량적 아실화는 네거티브 프리-아민 TNBS 검사에 의해 확인되었다.
화합물 SJ2-90
벤즈알데하이드 기능화된 수지 SJ2-86 (1.0 g, 0.66 mmol/g, 0.66 mmol) 은 디메톡시에탄 (DME) (9.8 ㎖) 및 H2O (0.20 ㎖) 내의 2-아세틸푸란 (0.17 g, 1.5 mmol, 2.0 eq) 및 분쇄된 LiOH (36 ㎎, 1.5 mmol, 2.0 eq) 의 혼합물에 현탁된다. 36 시간의 격렬한 진동 후에, 용매는 흡입 여과에 의해 제거되고, 수지는 아세트산, DMF, MeOH, 및 CH2Cl2 (4 x 3 x 10 ㎖) 로 연속적으로 세척된다. 반응의 완료는 1 시간 동안 트리플루오로아세트산 (TFA) 을 사용하여 쪼개진 수지의 적은 샘플의 LC-MS 분석으로 확인되었다. 불완전한 반응들이 반복되었다. 강한 자기 형광 (intrinsic fluorescence) 으로 인해, 화합물 SJ2-90은 UV-Vis 크로마토그램의 214 ㎚에서 네거티브 흡수 신호 특성을 나타낸다.
펜아실피리디늄 브로마이드들이 이하의 화합물 SJ2-97의 합성으로 예시된 방법을 사용하여 얻어진다.
화합물 SJ2-97
피리딘 (80 ㎕, 1.0 mmol, 2.0 eq.) 이 격렬한 교반 하에서 건조 테트라하이드로푸란 (2.0 ㎖) 내 2-브로모-4'-플루오로아세토페논 (0.11 g, 0.50 mmol) 용액에 첨가된다. 무색 침전물의 형성이 최대 20 분 후에 가시적이 되고, 교반이 20 시간 동안 계속된다. 침전물은, 무색 결정성 고체 (0.147 g, quant.) 로서 SJ2-97을 산출하도록 여과, 최소량의 저온 디에틸에테르를 사용한 세척 및 진공 하 건조로 분리된다.
화합물 SJ2-116
펜아실피리디늄 SJ2-97 (89 ㎎, 0.30 mmol) 이 DMF (2.0 ㎖), 아세트산 (1.3 ㎖) 및 NH4OAc (0.23 g, 3.0 mmol, 30 eq.) 내 수지 SJ2-90 수지 (0.17 g, 0.10 mmol) 의 현탁액에 첨가된다. 현탁액은 90 ℃에서 60 시간 동안 교반되었다. 수지는 DMF, MeOH, 및 CH2Cl2 (3 x 3 x 5 ㎖) 로 연속적으로 세척되었다. 생성물은 2 시간 동안 TFA (4.0 ㎖) 를 사용하여 수지로부터 쪼개지고, 진공 하에서 건조물로 탈수되고 (evaporate), 실리카 상의 TLC 조제에 의해 정제된다. 연노랑색 고체로 SJ2-116 (4.59 ㎎, 12.8 ％) 을 산출하기 위해, Rf = (CH2Cl2/MeOH, 93:7) 0.55이고, 이는 LC-MS에 의해 순도 및 아이덴티티가 더 확인되었다.
구조-활성 관계 연구를 위한 다른 유사체들이 상기 기술된 절차들을 사용하여 조제되었다.
용액 내 화합물들의 조제 절차들
스킴 2. KDJ -9 및 유사체들의 용액 상 합성
화합물 SJ2-123
2-아세틸푸란 (55 ㎎, 0.50 mmol) 및 LiOH (12 ㎎, 0.50 mmol) 는 메틸 4-포르밀벤조에이트 (82 ㎎, 0.50 mmol) 가 첨가되기 전에 1 시간 동안 MeOH (2.5 ㎖) 내에서 교반되었다. 최대 45 분 후에 두꺼운 무색 침전물이 형성되었고 추가 1 시간 45 분 동안 현탁액이 격렬하게 교반되었다. 이어서 침전물은 원심분리에 의해 분리되고, 아세트산 (3 ％, 3.0 ㎖) 이 상청액 (supernatant) 에 첨가되고 부가적인 침전물은 추가 원심분리에 의해 분리된다. 결합된 고체들은 무색 고체 (88.5 ㎎, 69.1 ％) 로서 SJ2-123을 산출하기 위해 진공 하에서 건조되었다.
화합물 SJ2-136
캘콘 SJ2-123 (0.60 g, 2.4 mmol), 펜아실피리디늄 브로마이드 SJ2-127 (0.76 g, 2.4 mmol) 및 NH4OAc (5.4 g, 71 mmol, 30 eq) 는 아세트산 (24 ㎖) 및 DMF (36 ㎖) 의 혼합물 내에서 90 ℃에서 24 시간 동안 교반되었다. 가스 릴리즈가 중단될 때까지 NaHCO3 포화 (20 ㎖) 가 첨가되고 부분적으로 NaHCO3가 분쇄된다. 혼합물은 진공 하에서 건조되고 잔여물은 무색이 될 때까지 CH2Cl2/아세톤 (1:1) 으로 세척된다. 용액은 진공에서 기화되고 발생된 고체는 연노랑색 고체로 SJ2-136을 산출하기 위해 용출제로서 순수 CH2Cl2, Rf = 0.57을 사용하여 실리카겔 크로마토그래피 (8.0 x 4.5 ㎝) 에 의해 정제된다.
화합물 SJ2-140
H2O (5.0 ㎖) 내 LiOH (96 ㎎, 4.0 mmol) 는 THF (45 ㎖) 내 SJ2-136 (0.40 g, 1.0 mmol) 용액에 첨가되고 72 시간 동안 교반되었다. 용매는 기화되고 잔여물은 연노랑색 고체로 SJ2-140 (0.38 g, 98.4 ％) 을 산출하기 위해 용출제로서 CH2Cl2/MeOH (95:5), Rf (CH2Cl2/MeOH, 95:5) = 0.26을 사용하여 실리카겔 (6.5 x 4.5 ㎝) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
화합물 KDJ -9
옥사릴 클로라이드 (0.39 ㎖, 0.57 g, 4.5 mmol, 5.0 eq) 가 CH2Cl2 (27 ㎖) 및 DMF (0.13 ㎖) 내 용액 SJ2-140 (0.35 g, 0.90 mmol) 에 첨가되고 20 시간 동안 교반되었다. 농축된 NH3 (20 ㎖) 가 첨가되고 혼합물은 30 분 동안 격렬하게 교반되었다. 유기 상 (organic phase) 이 회전 기화에 의해 기화되고 발생된 침전물은 여과에 의해 액상 (aqueous phase) 으로부터 분리된다. 진공 건조된 잔여물은 연노랑색 고체로 KDJ -9 (0.34 g, 97.9 ％) 를 산출하기 위해 용출제로서 MeOH/CH2Cl2 (3.0 → 5.0 ％), Rf (CH2Cl2/MeOH, 95:5) = 0.34를 사용하여 실리카겔 (5 x 4.5 ㎝) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
Figure pct00057
IV. 치료 상 적용 예 들
본 명세서에 기술된 c-Myc 억제제 화합물들은 다양한 치료 상 또는 예방적 (예를 들어, 항-종양) 적용 예들에 유용할 수 있다. 이들은 c-Myc 매개 세포 활성화를 억누르거나 억제하고, 암들을 치료하거나 종양 (특히 Myc-의존성 종양) 의 발생을 방지하기 위해 용이하게 채용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 c-Myc 매개 생물학적 활성 또는 세포 (예를 들어, 종양 세포) 내 c-Myc 시그널링 경로를 억제하기 위한 방법들을 제공한다. 일부 실시예들에서, 세포는 연구 대상 (subject) (예를 들어, 암을 앓는 (afflicted) 연구 대상) 내에 존재한다. 일부 실시예들에서, 본 발명의 치료 상 적용 예들은 종양의 발생 방지 또는 연구 대상 내 암의 치료를 지향한다. 통상적으로, 본 발명의 치료 방법들은 본 명세서에 기술된 유효한 양의 c-Myc-억제제 (예를 들어, KJ-Pyr-9 또는 이의 유도체) 를 포함하는 약학적 조성물을 연구 대상에게 투여하는 것을 수반한다. 본 발명의 스크리닝 방법들에 따라 식별될 수 있는 신규한 c-Myc 억제제들이 또한 채용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 c-Myc 시그널링 경로를 억제하는 방법들을 제공한다. 방법들은 유효한 양의 본 명세서에 개시된 화합물들, 예를 들어, 4-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)벤즈아미드 (KJ-Pyr-9), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-10), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-메톡시페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-6), 및 4'-(2-(푸란-2-일)-6-페닐피리딘-4-일)-[1,1'-비페닐]-4-카복사미드 (KJ-Pyr-4), 이들의 유도체 또는 유사체 (예를 들어, 본 명세서에 예시된 바와 같은 유사 화합물), 및 이들의 약학적으로 용인가능한 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물과 세포를 콘택팅하는 것을 수반한다. 본 발명의 일부 방법들에서, 채용된 화합물은 4-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)벤즈아미드 (KJ-Pyr-9) 또는 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-10) 이다. 일부 다른 방법들에서, 채용된 화합물은 모 화합물 (parent compound), KJ-Pyr-9, KJ-Pyr-10, KJ-Pyr-6, 또는 KJ-Pyr-4의 유도체 또는 변종이다. 이들 유도체 또는 변종 화합물들에서, 하나 이상의 모 화합물의 일원자기 또는 다원자기들이 상이한 일원자기 또는 다원자기들로 치환된다. 치환기는: H; 할로겐; 직쇄형 또는 고리형 또는 분기형 체인 알킬기; 직쇄형 또는 고리형 또는 분기형 체인 알케닐기; 직쇄형 또는 고리형 또는 분기형 체인 알키닐기; 할로-알킬기 또는 할로-알케닐기 또는 할로-알키닐기; CN; CF3; 아릴기 및 아릴 링의 임의의 또는 모든 H 기들이 상이한 기로 치환되는 치환된 아릴기들; 헤테로 고리형 기들 및 아릴 링의 임의의 또는 모든 H 기들이 상이한 기로 치환되는 치환된 헤테로 고리형 기들; 카르복실기; 카르보닐기, 알콕실기; 알킬옥시알케인기들; 알콕시카르보닐기; 아릴옥실기, 헤테로사이클릴옥실기; 하이드록실기; 아민기; 아미드기; 아미노기; 4차 아미노기; 니트로기; 술포닐기; 알킬아민기; 시릴기, 실록실기; 포화된 C-C 결합들; 포화되지 않은 C-C 결합들; 에스테르기, 에테르기, 아미노기; 아미드기, 우레탄, 카르보닐기, 아세틸기 및 케틸기; N, S 및 O를 포함하는 헤테로 원자들; 폴리머기; 및 아미노산들로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 방법들에서, 모 화합물의 하나 이상의 수소들이 보다 적은 알킬기로 치환된다.
본 발명의 일 방법들은 종양 세포 내에서 c-Myc 시그널링 경로를 억제하는 것을 지향한다. 예를 들어, 이 방법들은 대장암, 유방암, 자궁경부암, 소세포 폐암, 골육종, 교모세포종, 흑색종, 또는 골수성 백혈병의 세포 내에서 c-Myc 시그널링 경로를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법들 중 일부에서, 종양 세포는 연구 대상에 인 비보 존재한다. 화합물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 약학적 조성으로 연구 대상에게 투여될 수 있다.
관련된 양태에서, 본 발명은 연구 대상 내에서 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법들을 제공한다. 이들 방법들은 c-Myc 시그널링 활성을 억제하는 유효한 양의 화합물을 연구 대상에게 투여하는 것을 수반한다. 투여된 화합물은 4-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)벤즈아미드 (KJ-Pyr-9), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-10), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-메톡시페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-6), 및 4'-(2-(푸란-2-일)-6-페닐피리딘-4-일)-[1,1'-비페닐]-4-카복사미드 (KJ-Pyr-4), 이들의 유도체 또는 유사체 (예를 들어, 본 명세서에 예시된 유사한 화합물), 및 이들의 약학적으로 용인가능한 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일부 방법들에서, 투여된 화합물은 4-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)벤즈아미드 (KJ-Pyr-9) 또는 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-10) 이다. 일부 다른 방법들에서, 투여된 화합물은 모 화합물 KJ-Pyr-9, KJ-Pyr-10, KJ-Pyr-6, 또는 KJ-Pyr-4의 유도체 또는 변종이다. 이들 유도체 또는 변종 화합물들에서, 하나 이상의 모 화합물의 일원자기 또는 다원자기들이 상이한 일원자기 또는 다원자기들로 치환된다. 치환기는: H; 할로겐; 직쇄형 또는 고리형 또는 분기형 체인 알킬기; 직쇄형 또는 고리형 또는 분기형 체인 알케닐기; 직쇄형 또는 고리형 또는 분기형 체인 알키닐기; 할로-알킬기 또는 할로-알케닐기 또는 할로-알키닐기; CN; CF3; 아릴기 및 아릴 링의 임의의 또는 모든 H 기들이 상이한 기로 치환되는 치환된 아릴기들; 헤테로 고리형 기들 및 아릴 링의 임의의 또는 모든 H 기들이 상이한 기로 치환되는 치환된 헤테로 고리형 기들; 카르복실기; 카르보닐기, 알콕실기; 알킬옥시알케인기들; 알콕시카르보닐기; 아릴옥실기, 헤테로사이클릴옥실기; 하이드록실기; 아민기; 아미드기; 아미노기; 4차 아미노기; 니트로기; 술포닐기; 알킬아민기; 시릴기, 실록실기; 포화된 C-C 결합들; 포화되지 않은 C-C 결합들; 에스테르기, 에테르기, 아미노기; 아미드기, 우레탄, 카르보닐기, 아세틸기 및 케틸기; N, S 및 O를 포함하는 헤테로 원자들; 폴리머기; 및 아미노산들로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 방법들에서, 모 화합물의 하나 이상의 수소들이 보다 적은 알킬기로 치환된다.
일부 방법들은 연구 대상의 종양 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것을 지향한다. 예를 들어, 방법들은 대장암, 유방암, 자궁경부암, 소세포 폐암, 골육종, 교모세포종, 흑색종, 또는 골수성 백혈병의 세포의 성장을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 관련된 양태에서, 본 발명은 암을 치료하거나 연구 대상의 종양의 발생을 방지하기 위한 방법들을 제공한다. 이들 방법들은 c-Myc 시그널링 경로를 억제하는 화합물의 치료상 유효한 양의 화합물을 연구 대상에게 투여하는 것을 수반한다. 치환기는: 4-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)벤즈아미드 (KJ-Pyr-9), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-10), 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-메톡시페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-6), 및 4'-(2-(푸란-2-일)-6-페닐피리딘-4-일)-[1,1'-비페닐]-4-카복사미드 (KJ-Pyr-4), 이들의 유도체 또는 유사체 (예를 들어, 본 명세서에 예시된 유사한 화합물), 및 이들의 약학적으로 용인가능한 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이들 방법들 중 일부에서, 채용된 화합물은 4-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)벤즈아미드 (KJ-Pyr-9) 또는 5-(2-(푸란-2-일)-6-(4-니트로페닐)피리딘-4-일)푸란-2-카복사미드 (KJ-Pyr-10) 이다. 일부 다른 방법들에서, KJ-Pyr-9, KJ-Pyr-10, KJ-Pyr-6, 또는 KJ-Pyr-4 화합물의 유사체, 유도체 또는 변종이 사용된다. 일부 방법들은 대장암, 유방암, 자궁경부암, 소세포 폐암, 골육종, 교모세포종, 흑색종 및 골수성 백혈병으로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양을 앓는 연구 대상들을 치료하는 것을 지향한다.
본 발명의 조성물들 및 방법들을 사용한 치료를 위해 적합한 암들 및 종양은 다양한 조직들 및 장기들에 존재할 수 있다. 이들은 또한 암 세포들, 악성 종양 세포들을 포함하는 종양 세포들, 및 이들 조직들 및/또는 장기들의 구성 세포들에서 발견되는 것들을 포함한다. 예들은 뇌종양 (교모세포종 다형성 등), 척추 종양, 상악동암, 췌장 샘 (pancreatic gland) 암, 잇몸암, 설암, 입술암, 상인두 (nasopharyngeal) 암, 중인두 (mesopharyngeal) 암, 하인두 (hypopharyngeal) 암, 후두암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 늑막 종양, 암성 복막염, 암성 늑막염, 식도암, 위암, 대장암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 간암, 신장암, 방광암, 전립선암, 음경암, 고환 종양, 부신암, 자궁경부암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 난소암, 섬모 상피암, 악성 골 종양, 연조직 육종 (soft-tissue sarcomas), 유방암, 피부암, 악성 흑색종, 기저 세포 종양, 백혈병, 골수성 화생이 있는 골수 섬유증, 악성 림프 종양, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 형질세포종, 및 신경교종을 포함한다.
일반적으로, 치료는 목표된 약학적 및/또는 생리적 효과를 얻기 위해 연구 대상, 조직 또는 세포에 영향을 줄 것이다. 이 효과는 질병 또는 이의 징후 또는 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 면에서 예방적일 수도 있다. 이는 또한 비정상적 c-Myc 발현 또는 생화학적 활성과 연관되거나 매개된 질병 또는 장애 (예를 들어, 종양 성장) 의 부분적인 또는 완전한 치유 또는 장애의 원인이 되는 부작용의 개선의 관점에서 치료일 수 있다. 적합한 연구 대상들은 무척추동물, 척추동물, 포유 동물, 특히 인간을 포함한다. 본 발명에 기술된 c-Myc 억제제 화합물들은, 효과적으로 또는 유리하게 기능하는 한 특정한 종으로 제한되지 않고 채용될 수 있는, 공지의 항암 약물들 (항종양 약물들), 종양 전이 억제제들, 혈전형성 억제제들, 관절 괴사 (joint destruction) 치료 약물들, 진통제들, 항염증 약물들, 면역 조절제들 (immunoregulators 또는 immunomodulators), 및/또는 면역 억제제들을 포함하는 임의의 다양한 약물들 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.
화합물들은 단독으로 치료를 필요로 하는 연구 대상에 투여될 수 있다. 보다 바람직하게, 화합물들은 임의의 다양한 약학적으로-용인가능한 첨가제들과 혼합된 약학적 조성 또는 조제의 형태로 투여된다. 예를 들어, 화합물들은 경구, 국소적, 비경구, 등에 적합한 편리한 약학적 조성물 또는 제제의 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물들은 공지의 방법들을 따라 조제될 수 있고 당업계에서 관례적으로 실시될 수 있다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조하라. 약학적 조성물들은 바람직하게 GMP 조건들 하에서 제조된다. 비경구 투여를 위한 제제들은, 예를 들어, 부형약들, 멸균수, 또는 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜들, 채소 유래 오일들, 또는 수소화된 나프탈렌들을 함유할 수도 있다. 생체에 적합한, 생분해성, 락티드 폴리머, 락티드/글리콜라이드 코폴리머, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머들이 화합물들의 릴리즈를 제어하도록 사용될 수도 있다. 본 발명의 분자들을 위한 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템들은 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머 입자들, 삼투압 펌프들, 이식가능 주입 시스템들 (implantable infusion systems), 및 리포솜들을 포함한다. 흡입용 제제들은 부형약, 예를 들어, 락토오스를 함유할 수도 있고 또는 수용성 용액들, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르기, 글리코콜레이트 및 디옥시콜레이트를 함유할 수도 있고, 또는 점비액 형태 또는 겔로서 투여를 위한 지용성 용액들일 수도 있다.
c-Myc-억제 화합물을 함유하는 약학적 조성물은 치료적으로 유효한 양 또는 도즈로 국부적으로 또는 체계적으로 투여될 수 있다. 이들은 주입에 의해 국소적으로, 전체적으로, 고속 확산, 비인두 흡수, 피부 흡수, 직장으로 또는 경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법들에서의 사용을 위한 c-Myc 억제제들은 이들을 필요로 하는 연구 대상에서의 목표된 치료적 효과 (예를 들어, 종양 발생 및 성장과 연관된 증상들을 제거하거나 개선하는) 를 달성하기에 충분한 양으로 연구 대상에 투여되어야 한다. 통상적으로, 본 발명의 약학적 조성물들에 채용된 치료적으로 유효한 양 또는 효과적인 도즈의 c-Myc 억제제는 세포에서의 c-Myc 시그널링 활성을 억제하거나 연구 대상에서의 종양 성장을 둔화시키거나 억눌러야 한다. 이하에 주지된 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물들의 활성 성분들의 실제 투여량 레벨들은 연구 대상에게 유독하지 않은 목표된 치료적 반응을 달성하기에 유효한 양의 활성 성분을 얻도록 가변될 수 있다.
선택된 투여량 레벨은 채용된 본 발명의 특정한 조성물들의 활성, 투여 루트, 투여 시간, 및 채용될 특정한 화합물의 분비물의 비율을 포함하는 다양한 약물동태적 인자들에 따라 결정된다. 이는 또한 처리의 지속기간, 채용된 특정한 화합물들과 조합하여 사용된 다른 약물들, 화합물들 및/또는 재료들, 치료될 연구 대상의 나이, 성별, 몸무게, 컨디션, 일반적인 건강 및 이전의 병력 등과 같은 인자들에 따라 결정된다. 최적의 투여량들을 결정하기 위한 방법들은 당업계, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000에 기술되었다. 소정의 c-Myc-억제제 화합물에 대해, 당업자는 관례적으로 실시된 약학적 방법들을 사용함으로써 c-Myc를 억제하는 제제의 유효한 양을 용이하게 식별할 수 있다. 인 비트로 (in vitro) 또는 인 시츄 (in situ) 연구들에 사용된 투여량들은 약학적 조성의 인 비보 투여에 유용한 양들에 유용한 모범을 제공할 수도 있고, 동물 모델들은 특정한 장애들의 치료를 위한 효과적인 투여량들을 결정하는데 사용될 수도 있다. 통상적으로, 약학적으로 효과적인 투여량은 치료될 연구 대상의 체중의 약 0.001 내지 100 ㎎/㎏일 것이다.
본 명세서에 기술된 c-Myc 억제제 화합물들 및 다른 치료적 식이요법들은 보통 복수 회 (occasion) 연구 대상들에 투여된다. 단일 투여량들 간의 인터벌들은 일간, 주간, 월간 또는 연간일 수 있다. 인터벌들은 또한 c-Myc 억제제 화합물들의 혈액 레벨들 및 연구 대상에서 사용된 다른 치료 제제들을 측정함으로써 나타낸 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법들에서, 투여량은 1 내지 1000 ㎍/㎖, 일부 방법들에서 25 내지 300 ㎍/㎖ 또는 10 내지 100 ㎍/㎖의 플라즈마 화합물 농도를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, 치료제들은 보다 덜 빈번한 투여가 요구되는 경우에서 서방성 제제 (sustained release formulation) 로서 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 c-Myc 억제제 화합물 및 다른 약물들의 반감기에 따라 가변한다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부에 따라 가변할 수 있다. 예방적 적용 예들에서, 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 덜 빈번한 인터벌들로 긴 시간 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 연구 대상들은 이들의 여생 동안 치료를 계속 받을 수도 있다. 치료적 적용 예들에서, 질병의 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 그리고 바람직하게 연구 대상이 질병의 증상들의 부분적인 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지, 상대적으로 짧은 인터벌들로 상대적으로 높은 투여량이 요구된다. 그 후, 연구 대상은 예방적 레짐으로 투여될 수 있다.
펜아실 피리디늄 염들의 합성을 위한 일반적인 절차: 질소 하 상온에서 4'-니트로-2-브로모아세토페논 (4.9 g, 20 mmol) 이 THF (80 ㎖) 에 넣어진다. 피리딘 (6.4 ㎖, 80 mmol) 이 몇 방울 (dropwise) 첨가된다. 발생된 탁한 용액은 최대 6 시간 교반되고, 여과된다. 필터 케익은 에테르 (40 ㎖ x 3) 로 세척되고, 6.0 g의 피리디늄 염을 산출하도록 진공 하에서 건조된다. 유사한 절차가 CG-RS-46 (2.6 g), CG-RS-52 (1.2 g), CG-RS-53 (1.2 g), CG-RS-56 (1.0 g), CG-RS-57 (1.0 g), CG-RS-60 (690㎎), CG-RS-63 (1.05 g), CG-RS-65 (286㎎), CG-RS-69 (400㎎), CG-RS-71 (570㎎), CG-RS-80 (2.6 g), 및 CG-RS-81 (2.4 g) 의 조제를 위해 이어진다.
펜아실 피리디늄 염들의 합성을 위해 일반화된 스킴.
Figure pct00058
예들
이하의 예들은 예시를 위해 본 발명을 제한하지 않도록 제공된다.
예 1. 신규한 Myc 억제제들의 식별 및 생화학적 활성
스크리닝: 효과적인 Myc 억제제들은 MYC-MAX 다이머의 억제를 위한 형광 편광을 사용하여 소분자 화합물들 (Fujimori et al., J. Combinatorial Chem. 5:625-631, 2003) 의 Kroehnke 피리딘 라이브러리를 스크리닝함으로써 식별된다. 인간 MYC 및 MAX bHLH-LZ 도메인은 E. coli에서 발현되고 Alexa Fluor 594로 라벨링된 E-box DNA 복식 (duplex) 과 조합된다. 이들 3 개의 컴포넌트들이 혼합될 때, MYC 및 MAX는 헤테로다이머화되고 E-box DNA에 바인딩된다. 이 바인딩은 Alexa Fluor 594 신호의 형광 편광에서의 상승을 발생시킨다. 이 복합체의 형성을 억제하는 화합물들은 형광 편광의 감소를 유발하고, 이 활성은 MYC-MAX 다이머의 억제제들에 대한 스크린에 사용되었다. 최초의 라이브러리 스크리닝은 혼합물들을 사용하여 수행되었다. 가장 강한 억제를 나타낸 이들 혼합물들은 개별 화합물들로서 재합성되고 재스크리닝되고, 도 1에 도시된 4 개의 유효 분자들을 산출하였다. MYC-MAX 및 MAX-MAX에 대한 이들 화합물들 각각의 상대적인 바인딩 친화도들은 재평가되고, 상기 참조 (vide supra), 그리고 4 개의 선택된 구조체들은 MAX-MAX 다이머들에 비해 MYC-MAX에 대해 상당히 보다 높은 친화도를 나타내었다.
억제 특이성: 닭 배아 섬유아세포들 (CEF) 에서 Myc-유도 종양 형질변환의 분석은 생물학적 설정에서 Myc의 억제를 결정하기 위한 2차 스크린으로서 사용되었다. CEF는 레트로바이러스 발현 벡터 RCAS, ATG-Myc의 매개 발현, ATG 개시 코돈 (start codon) 으로 대체된 비표준 (non-canonical) CTG 개시 코돈을 갖는 인간 Myc의 변종에 감염된다. ATG 개시 코돈은 세포 모노레이어에서 병소의 미세종양의 형성을 발생시키는 보다 높은 발현 및 보다 큰 종양 형질변환 가능성을 조정한다. 이러한 2차 스크리닝에서, KJ-Pyr-9 및 KJ-Pyr-10만이 Myc의 종양 활성에 대응하는데 효과적이다 (표 1). 세포의 효과를 나타내는데 실패하는 것은 배양액에서의 불량한 화합물 용해도의 결과일 것이라고 추측한다. KJ-Pyr-9가 선택된 4 개의 화합물들 중 최고의 수용성 용해도를 갖기 때문에, 모든 추가 실험들이 KJ-Pyr-9을 사용하여 수행되었다.
Figure pct00059
CEF에서 종양 유전자-유도 세포의 형질변환의 분석은 또한 Myc에 대한 KJ-Pyr-9의 선택도를 결정하도록 사용된다. KJ-Pyr-9는 ATG-Myc, N-Myc 및 3 개의 관련 없는 종양 단백질들, v-Src, v-Jun 및 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (ehy 2) 의 돌연변이 H1047R에 대해 테스트되었다. N-Myc 및 ATG-Myc의 종양 활성은 KJ-Pyr-9에 의해 강력하게 억제되고, 한편 관련 없는 종양 단백질들은 영향을 받지 않거나 (v-Src), 상당히 보다 높은 농도들에서 억제되었다 (v-Jun, PI3K H1047R).
Myc로의 KJ- Pyr -9 구축: KJ-Pyr-9는 물에 낮은 용해도를 갖는다 (12.5 μM). 이러한 제한때문에, 분석적 초원심분리, 등온선 열량 측정법, 및 비공유결합 질량 스펙트럼과 같은 많은 일반적으로 사용된 방법들이 직접적인 바인딩에 대한 확정적인 증거를 제공하는데 실패한다. 그러나, 본 발명자들은 BSI (backscattering interferometry) (Baksh et al., Nat. Biotech. 29:357-360, 2011) 를 사용하여 직접적인 상호작용을 시연하고 KJ-Pyr-9 및 Myc에 대한 바인딩 상수를 결정할 수 있다. 표 2에 나타낸 결과들은 KJ-Pyr-9는 Myc (6.5 nM) 뿐만 아니라 MYC-MAX 헤테로다이머 (13.4 nM) 에 직접적으로 바인딩하지만 MAX 호모다이머 (1 μM 초과) 에만 약하게 바인딩한다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 KJ-Pyr-9는 장애가 있는 단량체 형태의 MYC에 바인딩할 수 있고, 온전한 MYC-MAX 복합체를 해리할 수 있다는 것을 암시한다. 반대로, 동일한 라이브러리의 또 다른 부재, KJ-Pyr-1은 니트로 치환기가 결여되고 Myc-억제 활성을 갖지 않고, Myc에 훨씬 보다 약하게 (230 nM) 바인딩한다. 이 화합물은 또한 형질변환 분석에서 검사되고 Myc의 억제제로서 효과가 없다는 것을 알았다.
Figure pct00060
KJ-Pyr-9의 세포들에 들어가고 특히 작용성 MYC-MAX 복합체의 형성을 방해하는 능력을 검사하기 위해, 본 발명자들은 Rluc (Renilla Luciferase) 에 기초하여 PCA (protein fragment complementation assay) 를 적용하였다. Rluc-기반 PCA 표지들 (sentinels) 은 인 비보 PPI의 다이나믹스를 연구하기 위해 설계되고 사용되었다 (Bachmann et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 110:8531-8536, 2013; 및 Stefan et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 104:16916-16921, 2007). 이 분석의 이점은 단백질 복합체 형성의 절대 값들을 실시간으로 보고한다는 것이다. 본 발명자들은 MYC 내 전체 (full length) MAX 단백질 및 C-터미널 MAX-상호작용-도메인 (MYC332-439) 을 수반하는 PPI에 기초한 효율적이고 센서티브한 PCA 바이오센서를 사용하였다. 이 분석은 KJ-Pyr-9는 대조구로서 본 명세서에 사용된 PKA (protein kinase A) 조절 소단위의 호모다이머 (RII:RII) 에 기초하여 관련 없는 바이오센서에 대한 효과와 비교할 때, MAX와 MYC332 -439의 복합체 형성을 선택적으로 감소시켰다는 것을 보여준다. KJ-Pyr-9는 또한 MYC-MAX 헤테로다이머화보다 보다 낮은 정도이기는 하지만, MAX 호모다이머화를 방해한다. 이들 데이터는 본 명세서에 개시된 억제제 화합물들이 세포들로 들어가고 특히 MYC-MAX 복합체 형성을 방해한다는 것을 암시한다.
예 2. Myc 억제제들은 Myc 매개 세포 활성을 상쇄시킨다 (antagonize)
세포 증식에 대한 영향: Myc의 상승된 활성은 다수의 암 세포 라인들의 증식의 본질이다. 본 발명자들은 상승된 Myc 활성에 대해 의존성으로 공지된 3 개의 세포 라인들에 대해 KJ-PYR-9를 테스트하였다: NCI-H460, MDA-MB-231 및 SUM-159PT. KJ-Pyr-9의 농도를 가변하였지만, 모든 3 개의 세포 라인들의 증식은 억제되었다 (도 3). 부가적으로, 본질적으로 c-Myc의 고발현을 보이는 Burkitt의 림프종 세포 라인들은 KJ-Pyr-9에 매우 센서티브하다 (도 6). KJ-Pyr-9는 또한 선택된 증식하는 조류 세포들 및 인간 세포들에 대해 평가되었다 (도 7). 정상 메추리 배아 섬유아세포들 (QEF) 및 종양 유전자에 의해 또는 화학적 발암물질 메틸콜란트렌에 의해 종양으로 형질변환된 QEF는 이들의 성장에 겨우 약간만 손상을 받지만, v-myc에 의해 형질변환된 세포들은 상당히 보다 많은 영향을 받았다 (도 7a). 유사한 결과들이 인간 섬유아세포들 및 별개의 인간 암 세포 라인들로 얻어졌다. 특히, 고레벨의 Myc 원생-종양 유전자를 발현하는, 백혈병 세포 라인들 K-562, MOLT-4, 및 HL-60은 이들의 증식이 강력하게 억제되고, 한편 인간 섬유아세포들, 또는 대장 암 세포 라인들 SW-480은 영향을 받지 않았다 (도 7b).
성장 배지 내 혈청의 고농도는 억제제의 반증식활성으로 하강되었다. 이 효과는, 소혈청 알부민을 갖는 저혈청 배양액의 보충이 억제제 활성에 영향을 주지 않기 때문에, 혈청 단백질들에 대한 화합물의 바인딩으로 발생하는 것이 아니다. 오히려, 감소된 억제제 활성은 혈청으로 공급된 성장 인자들로 인한 것일 수 있다.
Myc의 Myc 전사 활성 방해: Myc는 많은 수의 타깃 유전자들의 전사에 영향을 주고 활성제 또는 억제제로서 기능할 수 있다. 본 발명자들은 Myc 억제의 존재 및 부재시 NDRG1 (N-myc 하향조절된 유전자 1) 의 발현을 결정함으로써 Myc의 전사 활성에 대한 KJ-Pyr-9의 영향을 검토하였다. NDRG1은 이 유전자의 억제제로서 작용하는 Myc의 직접적인 전사 타깃이다. 비교하면, 본 발명자들은 장애가 있는 단량체에 바인딩하고 Myc가 MAX와의 상호작용을 위해 필요한 배좌를 채택하는 것을 방지하는 이전에 식별된 MYC-MAX 중합 억제제를 사용하였다 (Wang et al., Mol . Cancer Ther. 6:2399-2408, 2007; 및 Huang et al., Exp . Hematol. 34: 1480-1489, 2006). KJ-Pyr-9 및 10058-F4 양자는 NDRG1 발현의 상승을 유발한다 (도 4). 그러나, KJ-Pyr-9는 단지 Myc 레벨들에 대한 약간의 영향을 갖지만, 10058-F4는 Myc의 레벨들의 강한 감소를 유발한다. 이러한 관찰은 2 개의 Myc 억제제들이 상이한 메커니즘들에 의해 기능한다는 것을 암시한다.
KJ- Pyr -9의 인 비보 활성: 이전의 Myc 억제제들은 동물 모델 연구들에서 효과적이지 않았다. 이들 실패들은 Myc에 대한 불충분한 친화되 및 불량한 약물동태적 속성들로부터 발생한다. 본 발명자들은 마우스와 쥐 (rat) 에서 KJ-Pyr-9의 약물동태적 속성들을 조사하고, 혈액에서 달성가능한 KJ-Pyr-9의 농도는 인 비트로 c-Myc의 억제를 유발하기에 충분하다는 것을 알았다 (예 3 참조). 본 발명자들은 10 ㎎/㎏의 도즈에서 급성 독성의 징후를 관찰하지 못했다. 오히려 놀랍게도, KJ-Pyr-9는 혈액 뇌 관문과 교배되어 (cross) 혈액보다 뇌 조직에서 보다 높은 농도로 존재하였다.
KJ-Pyr-9의 인 비보 유효성을 검사하기 위해, 누드 마우스에 Matrigel에 현탁된 MDA-MB-231 세포들이 이종 이식되고 좌우 옆구리들에 피하 주사되었다. 종양이 평균 체적 100 ㎣에 도달할 때, 마우스는 31일 동안 복강 내 주사에 의해 10 ㎎/㎏ KJ-Pyr-9 또는 전파체 대조구로 매일 치료되었다. KJ-Pyr-9에 의한 종양 성장의 억제는 8일간 치료 후에 나타났다. 31일까지, KJ-Pyr-9 치료된 동물들 내의 종양 체적은 상당히 증가하지 않았다 (도 5). 실험의 종료시 종양이 추출되고 평가되었다. 중량 측정치들은 체적 결정과 일치하고 종양 성장을 중단시키는 KJ-Pyr-9의 능력이 확인되었다 (도 5). KJ-Pyr-9를 사용한 치료는 동물들의 체중에는 영향을 주지 않았다.
종양 세포들에서 약물 활성을 결정하기 위해, 단백질 용해물들이 동결된 종양 샘플들로부터 준비되고 웨스턴 블롯으로 분석되었다. 이들 블롯들은 Myc 억제 타깃 NDRG1의 발현이 KJ-Pyr-9를 사용한 치료로 상당히 향상되었다는 것을 보여준다. 이 향상 정도는 종양 간에 가변한다. NDRG1의 면역 형광 염색 및 조직 분석은 변이성은 상이한 종양 내 괴사 영역들의 양의 차로 인한 것이라는 것을 암시한다. 이들 관찰들은 KJ-Pyr-9가 종양 조직으로의 액세스를 얻고 Myc의 전사 활성을 억제한다는 것을 암시한다.
예 3. 본 발명에서 사용된 일부 재료들 및 방법들
형광 편광 분석. MYC 및 MAX의 히스티딘-태그된 bHLH-LZ 도메인들은 대장균 (E.coli) 으로 발현되고 히스티딘-트랩으로 정제된다. 형광 편광 분석들은 5-카복시플루오레신이 Alexa Fluor-594로 대체된 것을 제외하고 Kiessling et al., Chemistry & biology 13(7):745-751, 2006에 기술된 바와 같이 수행되었다.
레닐라 루시페라아제-계 단백질 분획물 보상 분석. HEK293 세포들은 10 ％ FBS (fetal bovine serum) 보충된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 내에서 성장되었다. 나타난 Rluc-PCA 발현 구성물들은 일시적으로 24-웰 플레이트 포맷으로 과발현된다. 형질주입 후 24 또는 48 시간에, 융합 세포들이 20 μM KJ-Pyr-9로 치료된다. 치료 후에, 성장 배지가 교환되고 세포들은 PBS (phosphate buffered saline) 에 재현탁된다. 세포 현탁액들은 백색 벽 96-웰 플레이트로 이동되고 LMax II 384 광도계 (Molecular Devices) 를 사용하여 생체 발광 분석을 받는다. Rluc 기질 벤질-코엘렌테라진의 온전한 세포들 (5 μM; Nanolight) 로의 첨가에 이어 Rluc 생체 발광 신호들은 10 초 동안 통합되었다. 면역-블록 (IB) 분석들을 위해, 안티-레니랄 루시페라제 항체들이 F[1]-융합 (Millipore, MAB4410) 하이브리드 단백질 또는 F[2]-융합 (Millipore, MAB4400) 하이브리드 단백질을 검출하기 위해 사용되었다.
세포 배양 시 종양 형질변환 분석. 종양 형질변환은 앞서 Duff & Vogt, Virology 39:18-30, 1969; 및 Bos et al., Genes & Dev . 4:1677-1687, 1990에 기술된 바와 같이 닭 배아 섬유아세포 (CEF) 의 배양액들에서 결정된다. CEF는 일련의 표시된 바이러스의 10 배 희석물들에 감염되었다. 화합물들은 영양 배양액 오버레이에 첨가되었다. 부가적인 화합물 함유 오버레이는 실험이 끝날 때까지 3 일마다 첨가되었다. ATG-Myc는 인간 c-Myc의 CTG 개시 코돈을 ATG로 변경하는 부위 특이적 돌연변이 생성 (site-directed mutagenesis) 에 의해 생성되었다. 이어서 이는 레트로 바이러스 발현 벡터 RCAS(A).sfi에 삽입된다 (Aoki et al., Proc . Natl . Acad. Sci. USA 95:14950-14955, 1998).
BSI ( Backscattering Interferometry) 데이터가 Nashville, TN 37203 소재 Molecular Sensing Inc.에 의해 구축된 장비 상에서 수집되었다. MYC 및 MAX bHLH-LZ 도메인의 히스티딘-태그된 말토오스-바인딩 단백질 융합은 클로닝되고 (cloned) 대장균으로 발현된다. 이들 융합 단백질들은 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되고 버퍼는 Slide-a-Lyzer 카세트 (Thermo-Scientific) 에서 투석에 의해 60 mM Tris/HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 9 mM MgCl2, 3 mM EDTA로 교환된다. 일정한 양의 MYC, MAX 또는 MYC-MAX 헤테로다이머는 증가하는 양의 KJ-Pyr-9와 혼합되고, BSI로 분석된다. 발생하는 굴절률의 변화들은 플롯팅되고 Kd를 결정하기 위해 로지스틱 곡선에 피팅된다.
세포 라인들. 인간 암 세포 라인들은 NCI-H460 (ATCC) (대세포 폐암), MDA-MB-231 (NCI) (유방의 선암), SUM-159PT (Asterand) (에스트로겐-비의존성 유방암), 및 SW-480 (ATCC) (결장직암) 이다. K-562, MOLT-4, 및 HL-60은 각각 아구악화 (blast crisis) 의 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 및 급성 골수성 백혈병으로부터 유도된다. 인간 불멸 섬유아세포들 (hFB) 은 J. Troppmair (Medical University Innsbruck, Austria) 에 의해 제공되었다. 메추리 (Coturnix japonica) 배아 섬유아세포들 (QEF) 의 세포 배양 및 확립된 메추리 세포 라인들 Q8, QEF/MC29, VJ, QT6의 세포 배양은 Hartl et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 106:5604-5609, 2009에 기술된 바와 같이 수행되었다.
세포 증식 분석. 분석은 제조사 (Promega, Madison WI) 의 프로토콜에 따른 세포 생존율을 측정하기 위해 레독스 염료 레자주린으로 염색하는 것을 사용하였다. 세포들은 96 웰 플레이트에서 100 ㎕ 웰 당 103 개로 파종되고 2.5 ％ FBS의 존재시 성장된다. MDA-MB-231 세포들은 DMEM 내에서 배양되고, SUM-159PT 세포들은 HAM's F12에서 배양되고, 그리고 NCI-H460 세포들은 RPMI 내에서 배양된다. MDA-MB-231 세포들은 120 시간 및 192 시간에 후레시 화합물 함유 배지를 공급하면서 216 시간 동안 KJ-Pyr-9에 노출되고; SUM-159PT 세포들은 120 시간 동안 이 화합물에 노출되고, 48 시간에 적절한 화합물 농도로 후레시 배지가 공급되고; 그리고 NCI-H460 세포들은 이 화합물을 사용하여 72 시간 동안 성장되었다.
KJ- Pyr -9를 사용한 인간 세포들 K-562, MOLT-4, HL -60 및 SW-480 및 메추리 세포들의 치료. 부착 세포 타입들을 검사하기 위해, 1.5 x 105 세포들이 MP-24 디시들에 파종되고, 37 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이팅되었다. 다음 날, 배양 배지는 135 mM NaCl, 5 mM Cl, 10 mM HEPES pH 7.4, 1 mM MgCl2, 및 1 mM CaCl2를 함유하는 200 ㎕의 ECB 버퍼, 그리고 25 μM 또는 50 μM 최종 농도의 KJ-Pyr-9 화합물 (DMSO의 모액으로부터 희석됨) 로 대체된다. 세포들은 30 분 동안 37 ℃에서 배양된다. 이어서, 이 화합물을 함유하는 800 ㎕의 세포 배양 배지가 첨가되고 세포들은 37 ℃에서 24 시간 동안 더 인큐베이팅된다. 현탁액 (K-562, MOLT-4, HL-60) 에서 성장한 세포들에 대해, 1.5 x 105 세포들이 원심분리로 수집되고 이 화합물을 함유하는 200 ㎕의 ECB 버퍼에 재현탁된다. 37 ℃에서 30 분의 인큐베이팅 후에, 이 화합물을 함유하는 800 ㎕의 배양 배지가 첨가되고, 상기와 같이 세포들이 인큐베이팅된다. 화합물을 사용한 치료 24 시간 후에 세포 현미경 사진들이 촬영된다.
약물동태 ( Pharmacokinetics). 마우스 3 마리에 10:10:80 Tween-80:DMSO:5 ％ 텍스트로오스/물에 용해된 10 ㎎/㎏ KJ-Pyr-9가 복강 내 주사되었다. 플라즈마 및 뇌에서 KJ-Pyr-9의 4 시간 농도는 각각 3.5 μM 및 12.4 μM이었다. 쥐들은 1 ㎎/㎏ 정맥 주사로 도즈되고, 플라즈마 내 제거 반감기는 대략 1.84 시간 (쥐들) 이었다.
이종 이식 실험들. 10 마리의 생후 8 주된 암컷 누드 마우스들 (HSD:무흉선 누드) 은 5 x 106 MDA-MB-231 세포들이 좌우 옆구리에 피하 주사되었다. 세포들은 주사 전에 고농도 Matrigel (BD Biosciences) 에 현탁되었다. 이종 이식 종양은 외부 캘리퍼스로 측정될 때 종양의 평균 체적이 100 ㎣에 도달할 때까지 성장하게 된다. 이 때, 마우스는 2 그룹으로 나눠진다. 일 그룹은 10 ㎎/㎏ KJ-PYR-9를 수용하고 다른 그룹은 전파체만 수용하고, 매일 복강 내 주사로 도즈된다. 종양 체적 및 마우스 중량은 매일 측정되었다. 모든 경우들에서 사용된 전파체는 10:10:80 DMSO:Tween-80:물 내 5 ％ 덱스트로오스였다. 마우스는 31 일의 기간 동안 치료되었다. 실험의 종료 시, 마우스는 안락사되고 종양이 절제되었다. 종양은 무게가 측정되었다. 종양 각각의 샘플들은 조직학을 위해 포르말린에 고정되고 웨스턴 블롯을 위해 동결되었다. 모든 척추동물 실험들은 TSRI IACUC의 승인으로 수행되었다.
NDRG1의 면역 형광 염색. 종양 조직들은 4 ％ 파라포름알데히드에서 하룻밤 동안 고정되고, 탈수되고 파라핀에 임베딩된다. 모든 샘플들은 5 ㎛로 절단되었다. 단백질 국부화를 위한 섹션들에 대한 프로세싱은 세포 시그널링 면역 형광 일반 프로토콜 (Cell Signaling Immunofluorescence General Protocol) 을 따른다. NDRG1에 대한 1차 항체는 세포 시그널링 (#5196) 으로부터 였다. 다클론성 항체들에 대한 표준 면역 조직 화학 절차들은 세포 시그널링 면역 형광 일반 프로토콜로부터 인스트럭션을 사용하여 적용되었다. NDRG1 및 핵생성 염색은 2차 항체로서 FITC-컨쥬게이티드 염소 항체 IgG (Sigma F-0382) 를 사용하여 수행되고 ProLong Gold Antifade with DAPI (Molecular Probes, #8961S) 를 사용하여 장착되었다. Hamamatsu 디지털 CCD 카메라를 사용하여 40 배 배율 (현미경 대물렌즈) 로 현미경 사진이 촬영되었다.
통계적 방법들. 종양 체적들은 (길이)x(폭)2을 사용하여 계산되었다. 종양 체적은 R 통계 프로그램 (Wu and Houghton, J. Biopharma. Stat. 19:755-762, 2009) 에서 구현된 바와 같은 Efron의 부트스트랩 (ISBN:0412042312) 절차를 사용하여 평가되었다. 평균 체적 및 90 ％ 신뢰 인터벌들이 106 랜덤화로 부트스트랩 재샘플링을 사용하여 결정되고 ggplot2 패키지 (ISBN:0387981403) 를 사용하여 그래프화되었다. P-값들은 106 랜덤화를 사용하는 재샘플링 치환 (permutation) 방법을 사용하여 결정되었다.
예 4. 세포 증식 분석
K562, Daudi, NCI-H460, 및/또는 HFF는 모두 ATCC로부터 획득되고 제조사의 권장사항에 따라 성장되었다. 치료 하루 전, K562, Daudi, NCI-H460, 및/또는 HFF는 각각 3,000, 10,000, 3,000, 4,000 세포들/웰로 100 ㎕ 내의 조직-배양-치료된 96-웰 플레이트들 내에 파종되었다. 플레이트들은 37 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이팅되었다. Myc 억제제들은 고등급 DMSO (SIGMA, D841 8) 내에서 조제되었다. 화합물들의 연속 희석물 또는 단일 희석물은 무혈청 배양 배지에서 조제되고, 세포들 (50 ㎕/웰) 에 3 번 첨가되었다. 37 ℃에서 3 일간 인큐베이팅 후, 세포들 증식은 다음과 같이 분석되었다: 10 ㎕의 염료 용액 (CellTiter 96® 비방사성 세포 증식 분석, Promega) 이 웰 각각에 첨가되었다. 플레이트들은 2 내지 4 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이팅되었다. 이어서, 100 ㎕의 가용화 (Solubilization)/중단 용액이 웰 각각에 첨가되고 플레이트들은 1 시간 교반과 함께 상온에서 인큐베이팅되었다. 흡광도는 96-웰 플레이트 판독기 (Flexstation 3, Molecular Device) 를 사용하여 570 ㎚에서 기록되었다. 데이터는 GraphPad 프리즘에서 분석되고, 비선형 회귀 피팅을 사용하여 적용될 때 IC50 값들이 계산되었다 (Log (억제제) 대 응답 내지 변수 기울기 식).
단일 도즈 (20 μM) 의 화합물들의 검사 결과들이 도 8 및 도 9에 도시된다. 선택된 화합물들에 대한 도즈 응답들은 도 10에 도시된다. HFF는 Myc에 의존하지 않는 정상 세포들이다. 이들은 비특정 세포 사멸을 위한 대조구로서 이 설정에서 사용되었다. 이는 항암 세포 증식제로서 Myc 억제제의 잠재력을 예시한다.
예 5. 일부 CG- RS -44 유도체 화합물들의 억제 활성 검증
ATG-Myc에 대한 CEF 병소 분석을 사용하여, 본 발명자들은 먼저 화합물 CG-RS-44 (KJ-PYR-9) 가 ATG-Myc에 대한 억제 및 특이성을 제공하는 것을 확인하였다. 데이터는 화합물의 0 내지 20 μM 범위의 농도에서 도즈-의존성 억제를 나타낸다 (0, 1.25, 2.5, 5, 10, 및 20 μM에서 검사됨). 이어서 본 발명자들은 ATG-Myc 병소 형성 억제를 위해 15 개의 CG-RS-44 유사체들의 활성을 검토하였다. 이 결과들은 도 11에 도시되었다. 특히, (화합물 CG-RS-44 자체에 부가하여) 화합물들 CG-RS-47, CG-RS-70 및 CG-RS-129는 10 μM의 농도에서 병소 형성을 야기하지 않는다. 이들 화합물들은 CG-RS-44과 동일하거나 가능하면 보다 낫게 작용하게 함으로써 10μM에서 병소 형성을 완전히 억제하였다. 부가적으로, 화합물들 CG-RS-50, CG-RS-54, CG-RS-55 및 CG-RS-56은 또한 다소 억제 활성을 보인 반면, 화합물 CG-RS-58, CG-RS-61, CG-RS-64, CG-RS-90, CG-RS-91, CG-RS-106, CG-RS-123 또는 CG-RS-128이 사용될 때 억제가 일어나지 않았다. 또한, 화합물들 CG-RS-70 또는 CG-RS-129에 대해 세포 성장이 약간 감소된 것을 관찰하였다. 몇몇 화합물들의 Myc-억제 활성은 또한 CEF 분석에서 IC50 값들을 측정함으로써 검토되었다. 이 연구로부터의 결과들은 화합물 CG-RS-44가 화합물들 CG-RS-47, CG-RS-70, 및 CG-RS-109B를 포함하는, 모든 검사된 유사체들보다 보다 우수하게 ATG-Myc 병소 형성을 억제하였다는 것을 보여준다.
유사 화합물들의 억제 활성의 특이성이 또한 검토되었다. 간략히 말하면, 화합물들 CG-RS-47, CG-RS-70, CG-RS-129 및 CG-RS-109B는 v-src, H1047R 및 v-jun을 포함하여 몇몇 Myc 유사체들에 대한 이들의 억제 활성에 대한 CEFI 특이성 분석에서 분석되었다. 이 결과들은 이들 CG-RS-44 유도체 화합물들 모두 Myc 유사체들보다 Myc를 억제하기 위한 어느 정도의 특이성을 보여준다는 것을 나타낸다.
예 6. 알돌 생성물 및 타깃 화합물들의 합성
CG-RS-40의 합성
다음 화합물들 4-포르밀벤즈아미드 (7.0 g, 47 mmol) 및 2-아세틸푸란 (3.9 ㎖, 39 mmol) 은 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어졌다. THF (280 ㎖) 가 첨가되고 이어서 분말 LiOH (934 ㎎, 39 mmol) 가 첨가된다. 발생되는 탁한 혼합물은 하룻밤 동안 상온에서 교반된다. 이때 LC는 미량의 2-아세틸푸란, 및 주로 목표된 생성물 및 4-포르밀벤즈아미드 (최대 20 ％) 를 나타낸다. 20 ㎖의 물에서 2.2 ㎖의 아세트산으로 퀀칭된다. 물과 에틸 아세테이트가 첨가되고, 층들이 분리된다. 수용성 층은 에틸 아세테이트의 20 ％ IPA를 사용하여 2 번 추출된다. 유기 부분들이 조합되고 농축된다. 발생되는 고체들은 에테르 (70 ㎖) 를 사용하여 처리되고, 가열되고 디켄팅된다. 이는 2 회 이상 반복된다. 이 고체들은 10 ％ MeOH/DCM (30 ㎖) 을 사용하여 빻아지고, 10 ％ MeOH DCM (10 ㎖) 을 사용하여 여과되고 세척된다. 고체들은 4.4 g 중량이었다. 여과액들은 농축되고 isco 220 g 실리카 카트리지에서 정제된다. 이는 백색 고체로서 부가적으로 550 ㎎을 발생시킨다. ESI (m/z) = (M+H) 242.
Figure pct00061
CG-RS-48의 합성
Figure pct00062
이하의 화합물들 5-포르밀푸란-2-카복사미드 (2.6 g, 18 mmol) 및 2-아세틸푸란 (1.5 ㎖, 15 mmol) 은 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어졌다. THF (106 ㎖) 가 첨가되고 이어서 분말 LiOH (360 ㎎, 15 mmol) 가 첨가된다. 발생되는 탁한 혼합물은 하룻밤 동안 상온에서 교반된다. 28 시간 후에, 10 ㎖의 물에서 1 ㎖의 아세트산으로 퀀칭된다. 부가적인 물 및 에틸 아세테이트가 첨가되고, 층들이 분리된다. 수용성 층은 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 내에서 20 ％ IPA를 사용하여 2 번 추출된다. 유기 부분들은 조합되고, 물, 소금물로 세척되고, 건조되고 (Na2SO4), 여과되고 농축된다. 발생되는 고체들은 10 ％ MeOH/DCM (30 ㎖) 를 사용하여 빻아지고, 여과되고 10 ％ MeOH/DCM (10 ㎖ x 3) 로 세척된다. 건조된 고체들은 중량이 2.0 g이고 약 90 ％ 순수성이다. 추가의 정제는 시도되지 않았다. ESI (m/z) = (M+H) 232.
5-포르밀푸란-2-카복사미드의 합성
5-하이드록시메틸푸란-2-카복사미드 (470 ㎎, 3.3 mmol) 가 상온에서 DCM (6 ㎖) 및 THF (6 ㎖) 에 넣어지고 Des-Martin 시약 (1.6 g, 3.7 mmol) 이 첨가되었다. 하룻밤 동안 교반이 계속되었다. 이때, TLC는 주로 목표된 생성물 (시작 재료에 비해 비극성) 을 나타낸다. 메탄올에서 통상적인 수용성 여기 (work up) 및 분리는 300 ㎎의 목표된 생성물을 유도한다.
5-하이드록시메틸푸란-2-카복사미드의 합성
압력에서 반응기는 메틸 (5-하이드록시메틸)푸란카르복실레이트 (12 g), MeOH (50 ㎖) 를 취하고, NH4OH (70 ㎖) 를 농축하였다. 100 ℃까지 가열되고, 24 시간 후에, TLC는 주로 2 개의 극성 스폿들을 나타내고 시작 재료가 남아 있지 않았다. 회전 기화기에서 농축되고, 발생되는 고체들은 최대 55 ㎖의 IPA에 넣어지고 완전히 용해되도록 가열된다. 상온까지 냉각되고, 고체들은 분리되기 시작하고, 여과되고 건조된다 (2.4 g). 이어서, 모액 (mother liquor) 이 1/2 체적으로 농축되고 1.3 g의 제 2 수확물이 얻어졌다.
CG-RS-86의 합성
Figure pct00063
다음 화합물들 4-포르밀벤즈아미드 (1.49 g, 10 mmol) 및 4'-브로모아세토페논 (1.7g, 8.3 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. THF (60 ㎖) 가 첨가되고 이어서 분말 LiOH (200 ㎎, 8.3 mmol) 가 첨가된다. 발생되는 탁한 혼합물은 하룻밤 동안 상온에서 교반된다. 이때, LC는 목표된 생성물을 주로 보여준다. 수용성 아세트산이 반응을 퀀칭하도록 첨가된다. 물과 에틸 아세테이트가 첨가되고, 층들이 분리된다. 수용성 층은 에틸 아세이트의 20 ％ IPA를 사용하여 2 번 추출된다. 유기 부분들은 조합되고 물로 세척된다. 백색 고체들을 제공하도록 농축되고, 발생된 고체들은 에테르 (50 ㎖) 로 처리되고, 초음파 처리되고 침전 (precipitation) 을 위해 따로 챙겨둔다. 여과되고 보다 많은 에테르 (60 ㎖ x 3) 로 세척되고, 1.54 g이 건조되고, 이는 90 내지 95 ％ 순수성이다. 추가 정제는 이루어지지 않는다. ESI (m/z) = (M+H) 330.
CG-RS-89의 합성
Figure pct00064
4-포르밀벤즈아미드 (2.3 g, 15.6 mmol) 및 2'-브로모아세토페논 (2.4 g, 12 mmol) 의 반응은 1.83 g의 생성물을 제공하는 기술된 CG-RS-86의 합성과 유사한 절차를 따른다. ESI (m/z) = (M+H) 330.
CG-RS-105의 합성
Figure pct00065
4-포르밀벤즈아미드 (1.5 g, 10 mmol) 및 6-브로모피리딘-2-일 메틸 케톤 (1.5 g, 7.5 mmol) 의 반응은 650 ㎎의 알돌 생성물을 제공하는 CG-RS-86의 합성에서 기술된 바와 유사한 절차를 따른다. ESI (m/z) = (M+H) 331.
CG-RS-107의 합성
Figure pct00066
4-포르밀벤즈아미드 (745 ㎎, 5 mmol) 및 5-브로모피리딘-2-일 메틸 케톤 (800 ㎎, 4 mmol) 의 반응은 320 ㎎의 알돌 생성물을 제공하는 CG-RS-86의 합성에서 기술된 바와 유사한 절차를 따른다. ESI (m/z) = (M+H) 331.
CG-RS-112의 합성
Figure pct00067
4-포르밀벤즈아미드 (450 ㎎, 3 mmol) 및 4-아세틸피리딘 (290 ㎎, 2.4 mmol) 의 반응은 300 ㎎의 알돌 생성물을 제공하는 CG-RS-86의 합성에서 기술된 바와 유사한 절차를 따른다. ESI (m/z) = (M+H) 253.
CG-RS-122의 합성
Figure pct00068
4-포르밀벤즈아미드 (1 g, 6.7 mmol) 및 3-아세틸피리딘 (650 ㎎, 5.4 mmol) 의 반응은 450 ㎎의 알돌 생성물을 제공하는 CG-RS-86의 합성에서 기술된 바와 유사한 절차를 따른다. ESI (m/z) = (M+H) 253.
CG-RS-124의 합성
Figure pct00069
4-포르밀벤즈아미드 (1 g, 6.7 mmol) 및 2-아세틸피리딘 (650 ㎎, 5.4 mmol) 의 반응은 600 ㎎의 알돌 생성물을 제공하는 CG-RS-86의 합성에서 기술된 바와 유사한 절차를 따른다. ESI (m/z) = (M+H) 253.
CG-RS-145의 합성
Figure pct00070
다음의 화합물들 메틸 4-포르밀벤조에이트 (1.64 g, 10 mmol) 및 2-아세틸푸란 (0.84 ㎖, 8.3 mmol) 은 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. THF (50 ㎖) 가 첨가되고 이어서 분말 LiOH (200 ㎎, 8.3 mmol) 이 첨가된다. 발생되는 탁한 혼합물은 상온에서 5 시간 교반된다. 이때. LC는 주로 시작 재료들을 나타내고, 따라서 수 ㎖의 MeOH가 첨가되고 추가 3 시간 동안 교반이 계속된다. 수용성 아세트산이 반응을 퀀칭하도록 첨가된다. 물과 에틸 아세테이트가 첨가되고, 층들이 분리된다. 수용성 층이 에틸 아세테이트를 사용하여 추출된다. 조합된 유기 부분은 물을 사용하여 2 번 세척되고, 건조되고 (MgSO4), 여과되고 2.8 g의 원료 (crude) 생성물을 얻도록 농축된다. 220 g 실리카 카트리지를 사용하여 정제된다. ESI (m/z) = (M+H) 257.
타깃 화합물들의 합성을 위해 일반화된 절차:
CG-RS-44의 합성
고체들 CG-RS-40 및 CG-RS-32가 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF가 첨가되고 고체들은 불그스름한 흐린 용액이 되고, 이어서 아세트산이 첨가되어, 밝은 노란색이 된다. 마지막으로, NH4OAc가 첨가되고, 용액은 약간 붉어지고 다소 투명한 용액이 된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 2 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여주고 시작 재료는 남아 있지 않다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들이 분리되고 여과되고 물로 여러 번 세척된다. 고체들은 최소량의 DCM에 용해되고 220 g 실리카 카트리지에 로딩되고, 100 ％ DCM을 사용하여 최대 5 분 용출되고, 이어서 5 내지 25 분까지 0 내지 5 ％ MeOH/DCM으로 상승되고, 25 내지 45 분간 5 ％ MeOH/DCM을 유지한다. 150 내지 173 개의 분획물들이 조합되고 농축되고, 수 ㎖의 MeOH가 첨가되고, 빻아지고, 고체들은 여과되고, 건조된다, 갈색 고체들 1.5g. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.72 (dd, J=3.51, 1.76 ㎐, 1 H) 7.39 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.48 (s, 1 H) 7.92 (s, 1 H) 8.02 내지 8.07 (m, 2 H) 8.08 내지 8.16 (m, 4 H) 8.29 내지 8.40 (m, 3 H) 8.57 (d, J=9.08 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 386.
타깃 화합물들의 합성을 위한 대표적인 스킴:
Figure pct00071
CG-RS-50의 합성
Figure pct00072
고체들 CG-RS-48 (2.0 g, 8.6 mmol) 및 CG-RS-32 (3.1 g, 9.5 mmol) 는 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (40 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (20 ㎖) 이 첨가되고 NH4OAc (16.6 g, 215 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 1.5 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여주고 시작 재료는 남아 있지 않다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들이 분리되고 여과되고 물로 여러 번 세척된다. 고압 하에서 건조되고 이어서 고체들이 DMF (최대 5 ㎖) 에 용해되고 220 g 실리카 카트리지로 로딩되고, 100 ％ DCM으로 최대 10 분 용출되고, 이어서 10 내지 30 분까지 0 내지 4 ％ MeOH/DCM로 상승되고, 30 내지 45 분까지 4 ％ MeOH/DCM을 유지한다. 185 내지 230 개의 분획물들이 조합되고 농축되고, 잔여물에 이소프로판올 (최대 50 ㎖) 이 첨가되고 빻아지고 고체들이 여과되고, 건조된다, 노란색 고체들 1.04 g. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.73 (dd, J=3.51, 1.76 ㎐, 1 H) 7.25 (d, J=3.51 ㎐, 1 H) 7.35 (d, J=2.63 ㎐, 1 H) 7.64 (d, J=3.51 ㎐, 1 H) 7.67 (br. s., 1 H) 7.92 (s, 1 H) 8.18 내지 8.28 (m, 2 H) 8.38 (d, J=8.78 ㎐, 2 H) 8.46 (s, 1 H) 8.54 (d, J=9.08 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 376.
CG-RS-47의 합성
Figure pct00073
고체들 CG-RS-40 (241 ㎎, 1 mmol) 및 CG-RS-46 (333 ㎎, 1.1 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (5 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (2.5 ㎖) 및 이어서 NH4OAc (2.3 g, 25 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 1 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들이 분리되고 여과되고 물로 여러 번 세척된다. 에테르 (30 ㎖ x 3) 로 세척되고, 고압 하에서 건조된다. 고체들은 최소량의 DCM에 용해되고 40 g 실리카 카트리지로 로딩되고, 0 내지 20 분까지 0 내지 5 ％ MeOH/DCM로 용출된다. 15 내지 55 개의 분획물들이 조합되고, 농축된다, 갈색 고체들 120 ㎎. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.72 (dd, J=3.22, 1.76 ㎐, 1 H) 7.38 (d, J=3.51 ㎐, 1 H) 7.47 (br. s., 1 H) 7.86 내지 7.94 (m, 1 H) 7.96 내지 8.16 (m, 8 H) 8.32 (d, J=1.17 ㎐, 1 H) 8.51 (d, J=8.49 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 366.
CG-RS-54의 합성
Figure pct00074
고체들 CG-RS-40 (150 ㎎, 0.62 mmol) 및 CG-RS-52 (237 ㎎, 0.68 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (4 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (2 ㎖) 및 이어서 NH4OAc (1.2 g, 15.5 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 2 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들이 분리되고 여과되고 물로 여러 번 세척되고 건조된다. 고체들이 DCM에 넣어지고 이어서 IPA (10 ㎖) 가 첨가되고, 회전 기화기에서 농축된다. 짙은 잔여물이 최소량의 DCM에 용해되고 40 g 실리카 카트리지 상으로 로딩되고, 10 분까지 100 ％ DCM, 10 내지 25 분까지 0 내지 4 ％ MeOH/DCM, 25 내지 30 분까지 4 ％ MeOH/DCM으로 용출된다. 49 내지 55 개의 분획물들이 조합되고, 농축된다, 밝은 갈색 고체들 120 ㎎. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.72 (d, J=1.76 ㎐, 1 H) 7.37 (d, J=2.93 ㎐, 1 H) 7.47 (br. s., 1 H) 7.82 내지 7.97 (m, 3 H) 8.00 내지 8.19 (m, 6 H) 8.29 (s, 1 H) 8.51 (d, J=7.90 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 409.
CG-RS-55의 합성
Figure pct00075
고체들 CG-RS-40 (150 ㎎, 0.62 mmol) 및 CG-RS-53 (246 ㎎, 0.68 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (4 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (2 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (1.2 g, 15.5 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 4 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 여기 및 정제 절차들은 CG-RS-54와 유사하다, 밝은 노란색 고체들 95 ㎎. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.71 (dd, J=3.37, 1.61 ㎐, 1 H) 7.35 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.51 (d, J=8.20 ㎐, 3 H) 7.90 (s, 1 H) 7.99 내지 8.17 (m, 6 H) 8.22 (s, 1 H) 8.41 (d, J=8.78 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 425.
CG-RS-58의 합성
Figure pct00076
고체들 CG-RS-40 (150 ㎎, 0.62 mmol) 및 CG-RS-57 (243 ㎎, 0.68 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (4 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (2 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (1.2 g, 15.5 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 1 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 여기 및 정제 절차들은 CG-RS-54와 유사하다, 밝은 노란색 고체들 125 ㎎. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 3.28 (d, J=10.54 ㎐, 3 H) 6.72 (br. s., 1 H) 7.39 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.43 내지 7.57 (m, 1 H) 7.92 (s, 1 H) 7.99 내지 8.22 (m, 8 H) 8.31 (s, 1 H) 8.55 (d, J=8.20 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 419.
CG-RS-61의 합성
Figure pct00077
고체들 CG-RS-40 (150 ㎎, 0.62 mmol) 및 CG-RS-60 (258 ㎎, 0.68 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (4 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (2 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (1.2 g, 15.5 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 2 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 여기 및 정제 절차들은 CG-RS-54와 유사하다, 갈색 고체들 120 ㎎. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.62 내지 6.77 (m, 1 H) 7.37 (d, J=2.93 ㎐, 1 H) 7.47 (br. s., 1 H) 7.81 내지 7.97 (m, 3 H) 8.00 내지 8.19 (m, 6 H) 8.27 (s, 1 H) 8.43 (d, J=8.20 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 441.
CG-RS-64의 합성
Figure pct00078
고체들 CG-RS-40 (150 ㎎, 0.62 mmol) 및 CG-RS-63 (229 ㎎, 0.68 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (4 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (2 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (1.2 g, 15.5 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 1 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 여기 및 정제 절차들은 CG-RS-54와 유사하다, 갈색 고체들 100 ㎎. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 3.89 (s, 3 H) 6.63 내지 6.81 (m, 1 H) 7.37 (d, J=3.51 ㎐, 1 H) 7.42 내지 7.53 (m, 1 H) 7.91 (s, 1 H) 7.99 내지 8.19 (m, 8 H) 8.28 (s, 1 H) 8.45 (d, J=8.49 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 399.
CG-RS-66의 합성
Figure pct00079
고체들 CG-RS-40 (150 ㎎, 0.62 mmol) 및 CG-RS-65 (243 ㎎, 0.68 mmol) 가질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (4 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (2 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (1.2 g, 15.5 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 2 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들은 분리되고, 여과되고 물로 여러 번 세척되고, 에테르로 3 번 세척되고, 건조된다. 잔여물은 DMF (최대 1 ㎖) 에 용해되고 40 g 실리카 카트리지 상으로 로딩되고, 5 분까지 100 ％ DCM, 5 내지 30 분까지 0 내지 15 ％ MeOH/DCM으로 용출된다. 49 내지 54 개의 분획물이 조합되고, 농축된다, 밝은 갈색 고체들 70 ㎎. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.72 (d, J=1.46 ㎐, 1 H) 7.38 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.44 (s, 3 H) 7.88 내지 7.99 (m, 3 H) 8.00 내지 8.1 (m, 6 H) 8.27 (s, 1 H) 8.48 (d, J=8.49 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 420.
CG-RS-67A 및 CG-RS-67B의 합성
Figure pct00080
CG-RS-64 (50 ㎎, 0.12 mmol) 가 압력 용기에 넣어지고, MeOH (2 ㎖) 및 농축 NH4OH (2 ㎖) 가 첨가된다. 발생되는 용액은 100 ℃까지 가열되고 하룻밤 동안 유지된다. 이때, LC는 산 및 아미드 양자를 보여주고, 에스테르는 남아 있지 않다. 콘텐트들은 농축되고, 잔여물은 DCM에 넣어지고 아세트산 몇 방울이 첨가되고, 다시 농축된다. 잔여물은 12 g 실리카 카트리지에서 정제되고, 5 분까지 100 ％ DCM, 그리고 5 내지 30 분까지 0 내지 20 ％ MeOH/DCM, 30 내지 35 분까지 20 ％ MeOH/DCM으로 용출된다.
상단 분획물들은 아미드이다 (중량 10 ㎎). 데이터: CG-RS-67A: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) μ ppm 6.71 (br. s., 1 H) 7.37 (s, 1 H) 7.41 내지 7.50 (m, 2 H) 7.90 (s, 1 H) 7.98 내지 8.15 (m, 8 H) 8.25 (s, 1 H) 8.37 (d, J=7.61 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 384. 극성 분획물은 산이다 (중량 19 ㎎). CG-RS-67B: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.68 내지 6.75 (m, 1 H) 7.37 (d, J=2.64 ㎐, 1 H) 7.46 (br. s., 1 H) 7.91 (s, 1 H) 8.00 내지 8.15 (m, 8 H) 8.26 (s, 1 H) 8.41 (d, J=8.20 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 385.
CG-RS-70의 합성
Figure pct00081
고체들 CG-RS-40 (262 ㎎, 1.1 mmol) 및 CG-RS-69 (400 ㎎, 1.1 mmol) 가 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (6 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (2 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (2.1 g, 27.5 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들은 분리되고, 여과되고 물로 여러 번 세척되고, 건조된다. 고체들은 DCM에 넣어지고 이어서 IPA (10 ㎖) 가 첨가되고, 회전 기화기에서 농축된다. 짙은 잔여물은 최소량의 DCM에 용해되고 40 g 실리카 카트리지 상으로 로딩되고, 10 분까지 100 ％ DCM, 10 내지 25 분까지 0 내지 5 ％ MeOH/DCM 그리고 25 내지 30 분까지 5 ％ MeOH/DCM으로 용출된다. 생성물을 함유하는 분획물들이 조합되고 농축되어, 밝은 갈색 고체들 20 ㎎, 및 약간의 불순물 100 ㎎이 얻어진다. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 3.90 (s, 3 H) 6.67 내지 6.77 (m, 1 H) 7.34 (d, J=2.64 ㎐, 1 H) 7.46 (br. s., 1 H) 7.69 (t, J=7.76 ㎐, 1 H) 7.91 (s, 1 H) 8.00 내지 8.15 (m, 7 H) 8.23 (s, 1 H) 8.55 (d, J=7.61 ㎐, 1 H) 8.81 (s, 1 H). ESI (m/z) = (M+H) 399.
CG-RS-72의 합성
Figure pct00082
고체들 CG-RS-40 (150 ㎎, 0.62 mmol) 및 CG-RS-71 (218 ㎎, 0.68 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (4 ㎖) 이 첨가되고, 이어서 아세트산 (2 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (1.2 g, 15.5 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 여기 및 정제 절차들은 CG-RS-54와 유사하다, 밝은 갈색 고체들 120 ㎎. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) μ ppm 6.09 (s, 2 H) 6.69 (dd, J=3.22, 1.76 ㎐, 1 H) 7.05 (d, J=8.20 ㎐, 1 H) 7.32 (d, J=2.93 ㎐, 1 H) 7.45 (br. s., 1 H) 7.84 내지 7.90 (m, 3 H) 7.92 (d, J=1.17 ㎐, 1 H) 7.99 내지 8.08 (m, 4 H) 8.10 (s, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 385. 3
CG-RS-73의 합성
Figure pct00083
CG-RS-70 (100 ㎎, 0.24 mmol) 이 압력 용기에 넣어지고, MeOH (5 ㎖) 및 농축 NH4OH (5 ㎖) 가 첨가된다. 발생되는 용액은 100 ℃까지 가열되고 하룻밤 동안 유지된다. 이때 LC는 산 및 아미드 양자를 보여주고, 에스테르는 남아 있지 않다. 콘텐트들은 농축되고, 잔여물은 IPA에 넣어지고 아세트산 몇방울이 첨가되고, 다시 농축된다. 잔여물은 40 g 실리카 카트리지에서 정제되고, 5 분까지 100 ％ DCM, 5 내지 25 분까지 0 내지 20 ％ MeOH/DCM으로 용출되고, 25 내지 32 분까지 30 ％ MeOH/DCM으로 증가된다.
분획물들 48 내지 60은 아미드 및 산 양자를 함유하여, 조합되고 농축되고, 다음 단계로 이어진다. 산만을 함유하는 몇몇 분획물들은 조합되고 8 ㎎의 산을 얻도록 농축된다. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.71 (br. s., 1 H) 6.75 내지 7.11 (m, 1 H) 7.34 (d, J=3.81 ㎐, 1 H) 7.46 (br. s., 1 H) 7.61 내지 7.72 (m, 1 H) 7.91 (s, 1 H) 8.00 내지 8.14 (m, 7 H) 8.22 (s, 1 H) 8.51 (s, 1 H) 8.79 (s, 1 H). ESI (m/z) = (M+H) 385.
CG-RS-75의 합성
Figure pct00084
산과 CG-RS-73 (60 ㎎) 으로부터의 아미드의 혼합물이 질소 분위기 하 상온에서 THF (4 ㎖) 및 MeOH (1 ㎖) 의 혼합물에 넣어진다. 트리메틸실릴디아조메탄 (에테르 내 2 M, 150 ㎕) 이 첨가되고 1 시간 동안 교반된다. 이때, TLC는 주로 아미드 및 에스테르를 보여주어, 아세트산 몇 방울이 첨가되고, 10 분 동안 계속해서 교반된다. 용액은 농축되고 12 실리카 카트리지에서 정제된다. 아미드는 밝은 갈색 고체 (5 ㎎) 로서 얻어진다. 데이터: 1H NMR (600 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.68 내지 6.75 (m, 1 H) 7.38 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.49 (br. s., 2 H) 7.61 (t, J=7.76 ㎐, 1 H) 7.90 (s, 1 H) 7.96 (d, J=7.91 ㎐, 1 H) 8.00 내지 8.18 (m, 7 H) 8.24 (s, 1 H) 8.43 (d, J=8.49 ㎐, 1 H) 8.68 (s, 1 H). ESI (m/z) = (M+H) 384.
CG-RS-90의 합성
Figure pct00085
고체들 CG-RS-86 (1.54 g, 4.7 mmol) 및 CG-RS-87 (1.67 g, 5.17 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (30 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (15 ㎖) 이 첨가되고, 이어서 NH4OAc (최대 9 g, 118 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들은 분리되고 여과되고 물로 여러번 세척되고, 건조된다, 붉은 갈색 고체들 1.76 g. 원재료 125 ㎎이 DCM (1 ㎖) 에 넣어지고 12 g 실리카 겔 카트리지 상에 로딩된다. 컬럼이 10 분까지 100 ％ DCM, 10 내지 25 분까지 0 내지 5 ％ MeOH/DCM 그리고 25 내지 30 분까지 5 ％ MeOH/DCM으로 용출된다. 생성물은 밝은 갈색 고체들 (45 ㎎) 로서 얻어졌다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 7.47 (s, 1 H) 7.71 내지 7.75 (m, 2 H) 7.91 (s, 1 H) 8.04 (d, J=8.49 ㎐, 2 H) 8.11 (br. s., 1 H) 8.17 (d, J=8.49 ㎐, 2 H) 8.32 (d, J=8.49 ㎐, 2 H) 8.34 내지 8.40 (m, 3 H) 8.44 (s, 1 H) 8.61 (d, J=9.08 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 474.
CG-RS-91의 합성
Figure pct00086
고체들 CG-RS-89 (1.54 g, 4.7 mmol) 및 CG-RS-87 (1.67 g, 5.17 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (30 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (15 ㎖) 이 첨가되고, 이어서 NH4OAc (최대 9 g, 118 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 여기 및 정제는 CG-RS-90에 기술된 바와 같다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 7.41 (td, J=7.69, 1.61 ㎐, 1 H) 7.46 (s, 1 H) 7.54 (t, J=7.47 ㎐, 1 H) 7.73 (dd, J=7.61, 1.46 ㎐, 1 H) 7.79 (d, J=8.20 ㎐, 1 H) 8.03 (d, J=7.61 ㎐, 3 H) 8.06 내지 8.14 (m, 3 H) 8.34 (d, J=9.08 ㎐, 2 H) 8.48 (d, J=1.17 ㎐, 1 H) 8.55 (d, J=8.78 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 474.
CG-RS-106의 합성
Figure pct00087
고체들 CG-RS-105 (650 ㎎, 1.96 mmol) 및 CG-RS-87 (698 ㎎, 2.2 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (12 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (6 ㎖) 이 첨가되고, 이어서 NH4OAc (3.8 g, 49 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들은 분리되고, 여과되고 물로 여러번 세척되고, 디에틸 에테르로 복수회 세척되고, 건조된다. 고체들은 이전에 기술된 바와 같이 40 g 실리카 카트리지에서 정제된다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) μ ppm 7.25 내지 7.35 (m, 1 H) 7.47 (br. s., 1 H) 7.77 (d, J=7.61 ㎐, 1 H) 7.97 (t, J=7.76 ㎐, 1 H) 8.03 내지 8.14 (m, 5 H) 8.36 (d, J=8.78 ㎐, 2 H) 8.54 (s, 2 H) 8.59 내지 8.68 (m, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 475.
CG-RS-109의 합성
Figure pct00088
다음 화합물들, CG-RS-90 (120 ㎎, 0.25 mmol), N-메틸피페라진 (70 ㎕, 0.625 mmol), BINAP (31 ㎎, 0.05 mmol), 및 디옥산 (3 ㎖) 이 불활성 분위기 하 상온에서 마이크로웨이브 반응 용기에 넣어진다. NaOtbu (60 ㎎, 0.625 mmol) 가 첨가되고 이어서 촉매 Pd2dba3 (23 ㎎, 0.025 mmol) 이 첨가되고, 발생되는 짙은 붉은 색 용액은 질소를 사용하여 진공 및 압력 사이클들에 3 번 노출된다. 마이크로웨이브 반응기에 넣어지고 4 시간 동안 105 ℃까지 가열되고, 2 ㎖의 DMF가 짙은 용액에 첨가되고 여과되고, 20 ％ MeOH/DCM (10 ㎖ x 3) 으로 린싱되고, 여과액은 농축되고 40g 실리카 카트리지에서 정제된다. 생성물은 불량한 수율로 5 ㎎이 얻어졌다. 데이터: HPLC RT=3.66, ESI (m/z) = (M+H) 494.
CG-RS-115의 합성
Figure pct00089
다음 화합물들, CG-RS-106 (120 ㎎, 0.25 mmol), 모르폴린 (55 ㎕, 0.625 mmol), BINAP (31 ㎎, 0.05 mmol), 및 디옥산 (4.5 ㎖) 이 불활성 분위기 하 상온에서 마이크로웨이브 반응 용기에 넣어진다. NaOtbu (60 ㎎, 0.625 mmol) 가 첨가되고 이어서 촉매 Pd2dba3 (23 ㎎, 0.025 mmol) 이 첨가되고, 발생되는 짙은 붉은 색 용액은 질소를 사용하여 진공 및 압력 사이클들에 3 번 노출된다. 마이크로웨이브 반응기에 넣어지고 4 시간 동안 105 ℃까지 가열되고, 2 ㎖의 DMF가 짙은 용액에 첨가되고 여과되고, 20 ％ MeOH/DCM (10 ㎖ x 3) 으로 린싱되고, 여과액은 농축되고 40g 실리카 카트리지에서 정제된다. 생성물은 불량한 수율로, 밝은 노란색 고체들 4 ㎎가 얻어졌다. 데이터: HPLC RT=4.22, ESI (m/z) = (M+H) 482.
CG-RS-116의 합성
Figure pct00090
다음 화합물들, CG-RS-90 (120 ㎎, 0.25 mmol), 모르폴린 (55 ㎕, 0.625 mmol), BINAP (31 ㎎, 0.05 mmol), 및 디옥산 (5 ㎖) 이 불활성 분위기 하 상온에서 건식 2-목 RB 플라스크에 넣어진다. NaOtbu (60 ㎎, 0.625 mmol) 가 첨가되고 이어서 촉매 Pd2dba3 (23 ㎎, 0.025 mmol) 이 첨가되고, 발생되는 짙은 붉은 색 용액은 질소를 사용하여 진공 및 압력 사이클들에 3 번 노출된다. 36 시간 동안 100 ℃까지 가열되고, 상온으로 냉각되도록 가열이 오프된다. 반응 콘텐트들은 셀라이트 패드를 통해 여과되고, DCM (30 ㎖), 에틸 아세테이트 (30 ㎖) 및 1:1 DCM/EA (30 ㎖) 로 린싱된다. 여과액은 농축되고 12 g 실리카 카트리지에서 정제된다. 생성물 16 ㎎은 밝은 노란색 고체들로서 얻어졌다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 3.19 내지 3.24 (m, 4 H) 3.71 내지 3.79 (m, 4 H) 7.07 (d, J=8.78 ㎐, 2 H) 7.45 (s, 1 H) 8.03 (d, J=8.49 ㎐, 3 H) 8.13 (d, J=8.20 ㎐, 4 H) 8.21 내지 8.27 (m, 4 H) 8.29 (s, 1 H) 8.36 (d, J=9.08 ㎐, 3 H) 8.60 (d, J=9.08 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 481.
CG-RS-123의 합성
Figure pct00091
고체들 CG-RS-121 (1.3 g, 3.9 mmol) 및 CG-RS-87 (1.4 g, 4.3 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (20 ㎖) 가 첨가되고 이어서 아세트산 (10 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (7.5 g, 97.5 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들은 분리되고, 여과되고 물로 여러번 세척되고, 건조되고, 황갈색 고체가 얻어진다. 원재료 250 ㎎이 DCM/MeOH/DMF 혼합물 (최대 1 ㎖) 에 넣어지고 40 g 실리카 겔 카트리지 상으로 로딩된다. 컬럼은 5 분까지 100 ％ DCM, 5 내지 25 분까지 0 내지 5 ％ MeOH/DCM 그리고 25 내지 32 분까지 5 ％ MeOH/DCM으로 용출된다. 생성물은 밝은 갈색 고체들 (38 ㎎) 로서 얻어졌다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) □ppm 7.47 (br. s., 1 H) 8.01 내지 8.14 (m, 5 H) 8.26 (dd, J=8.49, 2.05 ㎐, 1 H) 8.36 (d, J=8.49 ㎐, 2 H) 8.50 내지 8.58 (m, 2 H) 8.60 내지 8.68 (m, 3 H) 8.86 (d, J=2.05 ㎐, 1 H). ESI (m/z) = (M+H) 475.
CG-RS-125의 합성
Figure pct00092
고체들 CG-RS-122 (100 ㎎, 0.39 mmol) 및 CG-RS-87 (140 ㎎, 0.43 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (3 ㎖) 가 첨가되고 이어서 아세트산 (1.5 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (800 ㎎, 10.4 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들은 분리되고, 여과되고 물로 여러번 세척되고, 짙은 잔여물까지 건조된다. 잔여물은 DCM/MeOH 혼합물로 처리되고, 여과되고, 동일한 용매 시스템으로 몇 번 린싱된다. 농축되고 12 g 실리카 카트리지에서 정제되고, 24 ㎎의 목표된 생성물이 갈색 고체들로서 얻어진다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.79 (br. s., 1 H) 7.04 (br. s., 1 H) 7.48 (br. s., 1 H) 7.58 (dd, J=7.76, 4.83 ㎐, 1 H) 8.06 (d, J=8.20 ㎐, 2 H) 8.12 (br. s., 1 H) 8.20 (d, J=8.20 ㎐, 2 H) 8.37 (d, J=8.49 ㎐, 2 H) 8.48 (d, J=13.47 ㎐, 2 H) 8.61 내지 8.74 (m, 3 H) 9.53 (s, 1 H). ESI (m/z) = (M+H) 397.
CG-RS-128의 합성
Figure pct00093
고체들 CG-RS-124 (252 ㎎, 1 mmol) 및 CG-RS-87 (355 ㎎, 1.1 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (8 ㎖) 가 첨가되고 이어서 아세트산 (4 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (1.93 g, 25 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. CG-RS-125에 기술된 바와 같은 유사한 여기 및 정제 절차는 타깃 화합물로 유도한다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 7.47 (br. s., 1 H) 7.52 (d, J=12.30 ㎐, 1 H) 7.99 내지 8.15 (m, 6 H) 8.38 (d, J=8.78 ㎐, 2 H) 8.53 (s, 1 H) 8.63 (d, J=7.91 ㎐, 1 H) 8.66 (d, J=8.78 ㎐, 2 H) 8.71 내지 8.77 (m, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 397.
CG-RS-129의 합성
Figure pct00094
고체들 CG-RS-127 (252 ㎎, 1 mmol) 및 CG-RS-87 (355 ㎎, 1.1 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (8 ㎖) 가 첨가되고 이어서 아세트산 (4 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (1.93 g, 25 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. CG-RS-125에 기술된 바와 같은 유사한 여기 및 정제 절차는 타깃 화합물로 유도한다. 데이터: HPLC RT=3.46, ESI (m/z) = (M+H) 397.
CG-RS-130의 합성
Figure pct00095
고체들 CG-RS-44 (100 ㎎, 0.26 mmol) 가 질소 분위기 하 0 ℃에서 DMF (3 ㎖) 에 넣어진다. 몇 분의 교반 후에, NaH (16 ㎎, 60 ％ 확산, 0.39 mmol) 가 첨가되고, 5 분 동안 교반이 계속되고, 이때, MeI (16 ㎕, 0.26 mmol) 가 첨가된다. 상온까지 데워지는 동안 계속해서 교반된다. 2 시간 후에, TLC는 시작 재료를 포함하는 3 개의 스폿들을 보여준다. 물로 퀀칭되고, 통상적으로 여기 및 정제는 목표된 생성물 (7 ㎎) 을 유도한다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 2.80 (d, J=4.10 ㎐, 3 H) 6.72 (br. s., 1 H) 7.39 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.89 내지 7.94 (m, 1 H) 8.00 (d, J=8.20 ㎐, 2 H) 8.08 내지 8.16 (m, 3 H) 8.32 내지 8.41 (m, 3 H) 8.58 (d, J=8.20 ㎐, 3 H). ESI (m/z) = (M+H) 400.
CG-RS-131의 합성
Figure pct00096
고체들 CG-RS-44 (193 ㎎, 0.5 mmol) 가 질소 분위기 하 0 ℃에서 DMF (6 ㎖) 에 넣어진다. 몇 분의 교반 후에, NaH (96 ㎎, 60 ％ 확산, 2 mmol) 가 첨가되고, 5 분 동안 계속해서 교반되고, 이 때 MeI (125 ㎕, 2 mmol) 가 첨가된다. 상온까지 데워지는 동안 계속해서 교반된다. 하룻밤 동안 교반된 후, TLC는 주로 단일 스폿을 보여준다. 물로 퀀칭되고, 통상적인 여기는 170 ㎎의 원재료를 제공하고, 이로부터 50 ㎎이 정제되고 나머지는 다음 단계가 이어진다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 2.84 내지 3.09 (m, 6 H) 6.72 (br. s., 1 H) 7.39 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.57 (d, J=7.91 ㎐, 2 H) 7.91 (s, 1 H) 7.99 내지 8.16 (m, 3 H) 8.26 내지 8.44 (m, 3 H) 8.57 (d, J=8.49 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 414.
CG-RS-134의 합성
Figure pct00097
CG-RS-44 (77 ㎎, 0.2 mmol) 가 질소 분위기 하 상온에서 DCM (2 ㎖) 에 넣어진다. 몇 분의 교반 후에, TFAA (44 ㎕) 가 첨가되고 이어서 TEA (60 ㎕) 가 첨가된다. 상온에서 2 시간의 교반 후에, TLC 및 LC 양자는 목표된 생성물을 보여준다. DCM이 첨가되고, 이어서 물이 첨가되고, 층들이 분리된다. 수용성 층이 DCM을 사용하여 추출되고, 조합된 유기 부분이 물을 사용하여 2 번 세척되고, 건조된다 (Na2SO4). 원료 생성물이 43 ㎎의 목표된 화합물을 노란색 고체들로서 얻도록 12 g 실리카 카트리지에서 정제된다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.72 (br. s., 1 H) 7.40 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.92 (s, 1 H) 8.03 (d, J=8.20 ㎐, 2 H) 8.11 (s, 1 H) 8.22 (d, J=8.20 ㎐, 2 H) 8.31 내지 8.41 (m, 3 H) 8.57 (d, J=8.49 ㎐, 2 H).
ESI (m/z) = (M+H) 368.
CG-RS-136의 합성
Figure pct00098
이하의 화합물들, CG-RS-123 (240 ㎎, 0.5 mmol), 모르폴린 (109 ㎕, 1.25 mmol), BINAP (62 ㎎, 0.1 mmol), 및 디옥산 (7 ㎖) 이 불활성 분위기 하 상온에서 건식 2-목 RB 플라스크에 넣어진다. NaOtbu (120 ㎎, 1.25 mmol) 가 첨가되고 이어서 촉매 Pd2dba3 (46 ㎎, 0.05 mmol) 가 첨가되고, 발생되는 검붉은색 용액이 질소를 사용하여 진공 및 압력 사이클들에 3 번 노출된다. 24 시간 동안 100 ℃까지 가열되고, 상온으로 냉각되도록 가열이 오프된다. 반응 콘텐트들은 솜마개 (cotton plug) 를 통해 여과되고, DCM/MeOH 혼합물을 사용하여 몇 번 린싱된다. 여과액은 농축되고, DMF (2 ㎖) 에 용해되고 40 g 실리카 카트리지에서 정제된다. 생성물 32 ㎎은 노란색 고체들로서 얻어졌다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 3.28 내지 3.51 (m, 4 H) 3.76 (br. s., 4 H) 6.64 내지 7.16 (m, 1 H) 7.36 내지 7.60 (m, 2 H) 8.05 (s, 5 H) 8.30 내지 8.52 (m, 4 H) 8.52 내지 8.69 (m, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 482.
CG-RS-137의 합성
Figure pct00099
이하의 화합물들, CG-RS-123 (240 ㎎, 0.5 mmol), N-메틸피페라진 (139 ㎕, 1.25 mmol), BINAP (62 ㎎, 0.1 mmol), 및 디옥산 (7 ㎖) 이 불활성 분위기 하 상온에서 건식 2-목 RB 플라스크에 넣어진다. NaOtbu (120 ㎎, 1.25 mmol) 가 첨가되고 이어서 촉매 Pd2dba3 (46 ㎎, 0.05 mmol) 가 첨가되고, 발생되는 검붉은색 용액이 질소를 사용하여 진공 및 압력 사이클들에 3 번 노출된다. 24 시간 동안 100 ℃까지 가열되고, 상온으로 냉각되도록 가열이 오프된다. 반응 콘텐트들은 솜마개를 통해 여과되고, DCM/MeOH 혼합물을 사용하여 몇 번 린싱된다. 여과액은 농축되고, DMF (2 ㎖) 에 용해되고 40 g 실리카 카트리지에서 정제된다. 생성물 28 ㎎은 노란색 고체들로서 얻어졌다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 2.33 (br. s., 3 H) 2.61 (br. s., 4 H) 3.32 내지 3.41 (m, 4 H) 7.45 (br. s., 1 H) 7.51 (d, J=2.34 ㎐, 1 H) 8.05 (s, 4 H) 8.10 (br. s., 1 H) 8.33 내지 8.40 (m, 3 H) 8.41 내지 8.47 (m, 2 H) 8.55 내지 8.65 (m, 3 H). ESI (m/z) = (M+H) 495.
CG-RS-143의 합성
Figure pct00100
이하의 화합물들, 에탄올 (3 ㎖) 의 NH4OH.HCl (70 ㎎, 1 mmol) 및 K2CO3 (276 ㎎, 2 mmol) 가 건식 RB 플라스크에 넣어진다. 5 분간 교반되고 이어서 CG-RS-140 (100 ㎎, 0.27 mmol) 이 첨가되고 이어서 환류 (reflux) 하도록 가열된다. 6 시간의 환류 후에, 반응 혼합물은 회전 기화기에서 농축된다. MeOH가 첨가되고, 여과되고, 이어서 보다 많은 MeOH로 린싱되고, 농축된다. 잔여물에 트리에틸 오소포르메이트 (최대 5 ㎖) 가 첨가되고 하룻밤 동안 140 내지 150 ℃로 가열된다. 냉각되도록 가열이 오프되고, 농축된다. 잔여물은 12 g 실리카 카트리지에서 정제되고; 최대 3 ㎎의 목표된 생성물이 얻어진다. 데이터: HPLC RT=4.32, ESI (m/z) = (M+H) 411.
CG-RS-147의 합성
Figure pct00101
고체들 CG-RS-145 (512 ㎎, 2 mmol) 및 CG-RS-87 (711 ㎎, 2.2 mmol) 이 질소 분위기 하에서 RB 플라스크에 넣어진다. DMF (10 ㎖) 가 첨가되고, 이어서 아세트산 (5 ㎖) 이 첨가되고 이어서 NH4OAc (4.6 g, 60 mmol) 가 첨가된다. 50 ℃로 예열된 오일 욕에 놓이고 이어서 90 ℃까지 가열되고, 이 온도로 3 시간 동안 유지된다. 이때, LC는 주로 목표된 생성물을 보여준다. 가열을 오프시켜, 상온으로 냉각되게 한다. 과도한 물을 추가함으로써 퀀칭되고, 한동안 교반된다. 고체들이 분리되고 여과되고 물로 몇번 세척되고, 건조된다. 고체들은 DCM (10 ㎖) 에 용해되고 실리카 겔 (8 g) 이 첨가되고, 농축된다. 고체들은 실리카 겔 플러그 상으로 로딩되고 정제된다. 생성물은 노란색 고체들 (330 ㎎) 로서 얻어졌다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 3.88 (s, 3 H) 6.71 (dd, J=3.22, 1.76 ㎐, 1 H) 7.38 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.91 (s, 1 H) 8.03 내지 8.21 (m, 5 H) 8.35 (d, J=9.66 ㎐, 3 H) 8.56 (d, J=8.78 ㎐, 2 H). ESI (m/z) = (M+H) 401.
CG-RS-148의 합성
Figure pct00102
고체들 CG-RS-147 (60 ㎎, 0.15 mmol) 가 THF (3 ㎖) 에 넣어지고 1 M 수용성 LiOH (0.3 ㎖, 0.3 mmol) 가 첨가된다. 발생되는 용액은 상온에서 하룻밤 동안 교반된다. 이때, LC는 시작 재료만을 보여주고 따라서 또 다른 부분의 1 M 수용성 LiOH (0.3 ㎖, 0.3 mmol) 이 첨가된다. 3 시간 동안 50 ℃까지 가열된다. 이때 TLC는 시작 재료가 남아 있지 않다는 것을 보이고, 따라서 가열이 오프된다. 상온으로 냉각되게 된다. 에틸 아세테이트 및 물이 첨가되고, 층들이 분리된다. 수용성 층이 에틸 아세테이트로 세척되고, 이어서 최대 pH 5까지 산성화된다. 유기 층들이 화합물들을 갖고, 조합되고, 건조되고 농축되기 때문에, DCM을 사용하여 2 번 추출된다. 32 ㎎의 목표된 화합물을 백색 고체들로서 얻도록 12 g 실리카 카트리지에서 정제된다. 데이터: 1H NMR (599 ㎒, DMSO-d 6) δ ppm 6.71 (dd, J=3.22, 1.46 ㎐, 1 H) 7.39 (d, J=3.22 ㎐, 1 H) 7.91 (s, 1 H) 8.02 내지 8.20 (m, 5 H) 8.28 내지 8.42 (m, 3 H) 8.57 (d, J=8.78 ㎐, 2 H) 13.15 (br. s., 1 H). ESI (m/z) = (M+H) 387.
* * *
본 명세서에 기술된 예들 및 실시예들은 단지 예시를 목적으로 하고 다양한 수정들 또는 변경들이 본 발명의 관점에서 당업자에게 제안될 것이고, 본 출원의 정신 및 권한 및 첨부된 청구항들의 범위 내에 포함된다는 것이 이해된다. 본 명세서에 기술된 방법들 및 재료들과 유사한 임의의 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 검사를 위해 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들 및 재료들이 기술되었다.
본 명세서에 언급된 모든 공개 문서들, GenBank 시퀀스들, ATCC 기탁물들, 특허들 및 특허 출원들은 각각이 개별적으로 표기되더라도 모든 목적들을 위해 이들 전체가 참조로서 본 명세서에 명시적으로 인용된다.

Claims (6)

  1. 화학식 1의 구조를 갖는 화합물에 있어서,
    Figure pct00103

    여기서 R1, R2, 및 R3은 푸란-2-일, 푸란-3-일, 푸란-4-일, 4-할로벤질, 3-할로벤질, 5-할로벤질, 디할로벤질, 트리할로벤질, 테트라할로벤질, 펜타할로벤질,

    Figure pct00105

    Figure pct00106

    Figure pct00107

    Figure pct00108

    Figure pct00109

    Figure pct00110

    Figure pct00111
    및
    Figure pct00112
    로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    할로는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오드이고, 단,
    R3가 푸라닐일 때, R1은
    Figure pct00113
    일 수 없는, 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R1은
    Figure pct00114
    이고, R3은
    Figure pct00115
    또는 푸라닐이고, 그리고 R2는
    Figure pct00116
    , 푸라닐,
    Figure pct00117
    및
    Figure pct00118
    로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 화합물.
  3. 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물로서,
    Figure pct00119

    여기서 R1, R2, 및 R3은 푸란-2-일, 푸란-3-일, 푸란-4-일, 4-할로벤질, 3-할로벤질, 5-할로벤질, 디할로벤질, 트리할로벤질, 테트라할로벤질, 펜타할로벤질,
    Figure pct00120

    Figure pct00121

    Figure pct00122

    Figure pct00123

    Figure pct00124

    Figure pct00125

    Figure pct00126

    Figure pct00127
    및
    Figure pct00128
    로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    할로는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오드인, 암 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    R1은
    Figure pct00129
    이고, R3은
    Figure pct00130
    또는 푸라닐이고, 그리고 R2는
    Figure pct00131
    , 푸라닐,
    Figure pct00132
    및
    Figure pct00133
    로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 암 치료용 약학적 조성물.
  5. 암들을 치료하기 위한 방법에 있어서,
    유효한 양의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 투여하는 단계를 포함하고,
    Figure pct00134

    여기서 R1, R2, 및 R3은 푸란-2-일, 푸란-3-일, 푸란-4-일, 4-할로벤질, 3-할로벤질, 5-할로벤질, 디할로벤질, 트리할로벤질, 테트라할로벤질, 펜타할로벤질,
    Figure pct00135

    Figure pct00136

    Figure pct00137

    Figure pct00138

    Figure pct00139

    Figure pct00140

    Figure pct00141

    Figure pct00142
    및
    Figure pct00143
    로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    할로는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오드인, 암 치료 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    R1은
    Figure pct00144
    이고, R3은
    Figure pct00145
    또는 푸라닐이고, 그리고 R2는
    Figure pct00146
    , 푸라닐,
    Figure pct00147
    및
    Figure pct00148
    로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 암 치료 방법.
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