JP2016540015A - 低分子C−Myc阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、米国仮出願第61/914,590号(2013年12月11日出願)の優先権の利益を主張する。優先権出願の全開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、National Institutes of Healthの助成金番号CA078230による米国政府支援を受けて部分的になされた。したがって、米国政府は、本発明について一定の権利を有し得る。
本発明は、c−Myc阻害化合物、ならびにc−Mycシグナル伝達経路の阻害および癌の治療におけるそれらの使用に関する。Mycは、基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパー(bHLH−LZ)タンパク質のファミリーに属する転写調節因子であり、bHLH−LZタンパク質MAXと二量体化して機能的になる。MYC−MAXヘテロ二量体は、E−Boxモチーフ(パリンドロームDNA配列)に優先的に結合する。MYCは、2つの分子レベルでの転写に影響を与える。転写因子として、それは、標的遺伝子のプロモーターに結合して、転写活性を刺激または抑制し得る。MYC機能獲得を示す癌細胞における転写の増幅因子として、それは、既存の転写プログラムの活性を増強する。両方の状況において、MYCは、MAXと二量体化して有効になるはずである。ヒトゲノムは、3つのMYC遺伝子と、対応するタンパク質(c−MYC、N−MYCおよびL−MYC)とを含有する。特に断りのない限り、MYCは、本明細書では、c−MYCタンパク質を示すために使用される。c−Mycはまた、転写抑制因子として作用し得る。それは、Miz−1転写因子に結合し、p300共活性化因子を置換することによって、Miz−1標的遺伝子の発現を阻害する。加えて、Mycは、DNA複製の制御において直接的な役割を有する。
以下の実施例に詳述されるように、本発明は、いくつかの公知の化合物のc−Myc阻害活性に関する本発明者らの発見に部分的に基づくものである。これらの化合物は、当初は溶液相生物学的スクリーニングのために調製されたKrohnkeピリジン化合物のコンビナトリアルライブラリに由来するものであった(Fujimori et al.,J.Combinatorial Chem.5:627−631,2003)。MYC−MAX相互作用の蛍光偏光スクリーニングによって、前記化合物のいくつかの新規のc−Myc阻害活性を同定した。同定した化合物は、細胞培養においてMyc誘発性発癌性形質転換を阻害し、Myc過剰発現ヒトおよび鳥類細胞の増殖を妨げ、Myc媒介性転写調節を減少させることができる。加えて、前記化合物は、Myc過剰発現ヒト癌細胞の異種移植物の成長を有効に遮断し得る。本明細書に例示される特定のMyc阻害化合物は、4−(2−(フラン−2−イル)−6−(4−ニトロフェニル)ピリジン−4−イル)ベンズアミド(KJ−Pyr−9)、5−(2−(フラン−2−イル)−6−(4−ニトロフェニル)ピリジン−4−イル)フラン−2−カルボキサミド(KJ−Pyr−10)、5−(2−(フラン−2−イル)−6−(4−メトキシフェニル)ピリジン−4−イル)フラン−2−カルボキサミド(KJ−Pyr−6)、4’−(2−(フラン−2−イル)−6−フェニルピリジン−4−イル)−[1,1’−ビフェニル]−4−カルボキサミド(KJ−Pyr−4)である。それらの構造は、図1に示されている。
固体支持体SJ2−86上への化合物の固定化
4−カルボキシベンズアルデヒド(0.72g、4.8mmol、3.0当量)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(0.74g、4.8mmol、3.0当量)およびN,N′−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(0.76mL、0.61g、4.8mL、3.0当量)を脱保護Rinkアミド樹脂(2.2g、0.73mmol/g、1.6mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(8.0mL)懸濁液に追加した。12時間激しく振盪した後、吸引下でろ過によって溶媒を除去し、DMF、MeOHおよびCH2Cl2(3×3×10mL)で樹脂を逐次洗浄した。ネガティブフリーアミンTNBS試験により、樹脂上のアミンの定量的アシル化を確認した。
ベンズアルデヒド官能化樹脂SJ2−86(1.0g、0.66mmol/g、0.66mmol)を2−アセチルフラン(0.17g、1.5mmol、2.0当量)および粉末LiOH(36mg、1.5mmol、2.0当量)のジメトキシエタン(DME)(9.8mL)およびH2O(0.20mL)混合物に懸濁した。36時間激しく振盪した後、吸引下でろ過によって溶媒を除去し、酢酸、DMF、MeOHおよびCH2Cl2(4×3×10mL)で樹脂を逐次洗浄した。1時間にわたってトリフルオロ酢酸(TFA)を使用して切断した樹脂の小サンプルのLC−MS分析によって、反応の完了を確認した。不完全な反応を繰り返した。化合物SJ2−90は、その強力な固有の蛍光により、UV−Visクロマトグラムにおいて、214nmの特徴的な負の吸光度シグナルを示す。
ピリジン(80uL、1.0mmol、2.0当量)を、激しく撹拌しながら2−ブロモ−4’−フルオロアセトフェノン(0.11g、0.50mmol)の無水テトラヒドロフラン(2.0mL)溶液に追加した。約20分後に、無色の沈殿物の形成が見られ、撹拌を20時間継続した。ろ過によって沈殿物を単離し、最小量の冷ジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥して、無色の結晶性固体としてSJ2−97を得た(0.147g、定量)。
フェナシルピリジニウムSJ2−97(89mg、0.30mmol)を樹脂SJ2−90樹脂(0.17g、0.10mmol)のDMF(2.0mL)、酢酸(1.3mL)およびNH4OAc(0.23g、3.0mmol、30当量)懸濁液に追加した。懸濁液を90℃で60時間撹拌した。DMF、MeOHおよびCH2Cl2(3×3×5mL)で樹脂を逐次洗浄した。TFA(4.0mL)によって樹脂から生成物を2時間かけて切断し、真空下で蒸発乾固し、分取シリカTLC(Rf=(CH2Cl2/MeOH、93:7)0.55)によって精製して、淡黄色の固体としてSJ2−116(4.59mg、12.8%)を得、その純度および同一性をLC−MSによってさらに確認した。
スキーム2.KDJ−9および類似体の液相合成
化合物SJ2−123
MeOH(2.5mL)中で、2−アセチルフラン(55mg、0.50mmol)およびLiOH(12mg、0.50mmol)を1時間撹拌してから、メチル4−ホルミル安息香酸(82mg、0.50mmol)を追加した。約45分後、厚い無色の沈殿物が形成し、懸濁液をさらに1時間45分間激しく撹拌した。次いで、遠心分離によって沈殿物を分離し、酢酸(3%、3.0mL)を上清に追加し、さらに遠心分離によってさらなる沈殿物を単離した。合わせた固体を真空下で乾燥して、無色の固体(88.5mg、69.1%)としてSJ2−123を得た。
酢酸(24mL)およびDMF(36mL)の混合物中で、カルコンSJ2−123(0.60g、2.4mmol)、フェナシルピリジニウムブロミドSJ2−127(0.76g、2.4mmol)およびNH4OAc(5.4g、71mmol、30当量)を90℃で24時間撹拌した。飽和NaHCO3(20mL)を追加し、続いて、ガス放出が停止するまで粉末NaHCO3を少しずつ追加した。混合物を真空下で乾燥し、無色になるまでCH2Cl2/アセトン(1:1)で残留物を洗浄した。この溶液を真空下で蒸発させ、得られた固体を、溶離液として純粋なCH2Cl2(Rf=0.57)を使用してシリカゲルクロマトグラフィー(8.0×4.5cm)によって精製して、淡黄色の固体としてSJ2−136(0.463g、48.2%)を得た。
LiOH(96mg、4.0mmol)のH2O(5.0mL)溶液を、SJ2−136(0.40g、1.0mmol)のTHF(45mL)溶液に追加し、72時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を、溶離液としてCH2Cl2/MeOH(95:5)(Rf(CH2Cl2/MeOH、95:5)=0.26)を使用してシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(6.5×4.5cm)によって精製して、淡黄色の固体(0.38g、98.4%)としてSJ2−140を得た。
塩化オキサリル(0.39mL、0.57g、4.5mmol、5.0当量)を、SJ2−140(0.35g、0.90mmol)のCH2Cl2(27mL)およびDMF(0.13mL)溶液に追加し、20時間撹拌した。濃NH3(20mL)を追加し、混合物を30分間激しく撹拌した。ロータリーエバポレーションによって有機相を蒸発させ、得られた沈殿物をろ過によって水相から分離した。真空乾燥した残留物を、溶離液としてMeOH/CH2Cl2(3.0→5.0%)(Rf(CH2Cl2/MeOH、95:5)=0.34)を使用してシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(5×4.5cm)によって精製して、淡黄色の固体としてKDJ−9(0.34g、97.9%)を得た。
本明細書に記載されるc−Myc阻害化合物は、様々な治療または予防(例えば、抗腫瘍)用途において有用であり得る。それらは、c−Myc媒介性細胞活性を抑制もしくは阻害するために、および癌を治療するために、または腫瘍(特に、Myc依存性腫瘍)の発生を予防するために容易に用いられ得る。したがって、本発明は、細胞(例えば、腫瘍細胞)におけるc−Myc媒介性生化学的活性またはc−Mycシグナル伝達経路を阻害するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、被験体(例えば、癌に罹患している被験体)中に存在する。いくつかの実施形態では、本発明の治療用途は、被験体における腫瘍の発生の予防または癌の治療を対象とする。典型的には、本発明の治療方法は、有効量の本明細書に記載されるc−Myc阻害剤(例えば、KJ−Pyr−9またはその誘導体)を含む医薬組成物を被験体に投与することを伴う。本発明のスクリーニング方法にしたがって同定され得る新規c−Myc阻害剤も用いられ得る。
以下の実施例は、本発明を限定するためではなく、例示のために提供される。
スクリーニング:MYC−MAX二量体化の阻害について、蛍光偏光を用いて低分子化合物のKrohnkeピリジンライブラリ(Fujimori et al.,J.Combinatorial Chem.5:625−631,2003)をスクリーニングすることによって、有効なMyc阻害剤を同定した。ヒトMYCおよびMAX bHLH−LZドメインを大腸菌で発現させ、Alexa Fluor594で標識したE−box DNA二重鎖と結合させた。これら3つの要素を混合すると、MYCおよびMAXはヘテロ二量体化し、E−box DNAに結合する。この結合は、Alexa Fluor594シグナルの蛍光偏光の増加をもたらす。この複合体の形成を阻害する化合物は蛍光偏光を減少させ、この活性を、MYC−MAX二量体化の阻害剤のスクリーニングに使用した。混合物を用いて、1回目のライブラリスクリーニングを行った。最も強力な阻害を示した混合物を個々の化合物として再合成し、再スクリーニングして、図1に示されている4つの有効な分子を得た。MYC−MAXおよびMAX−MAXに対するこれらの各化合物の相対的結合親和性を上記のように再評価したところ、選択した4つの構造体は、MAX−MAX二量体よりもMYC−MAXに対して有意に高い親和性を示した。
細胞増殖に対する効果:Myc活性の上昇は、多くの癌細胞株の増殖に必須である。本発明者らは、Myc活性の増加に依存することが公知である3つの細胞株に対してKJ−PYR−9を試験した:NCI−H460、MDA−MB−231およびSUM−159PT。KJ−Pyr−9の濃度は様々であるが、3つの細胞株すべての増殖が阻害された(図3)。加えて、c−Mycの構成的高発現を示すバーキットリンパ腫細胞株は、KJ−Pyr−9に対して高度に感受性である(図6)。選択した増殖鳥類細胞およびヒト細胞に対しても、KJ−Pyr−9を評価した(図7)。正常ウズラ胚線維芽細胞(QEF)、およびv−jun癌遺伝子によって、または化学発癌物質メチルコラントレンによって腫瘍形成的に形質転換したQEFは、その成長がごくわずかに阻害されただけであったのに対して、v−mycによって形質転換した細胞は、有意により大きな影響を受けた(図7A)。ヒト線維芽細胞および異なるヒト癌細胞株でも、同様の結果が得られた。特に、高レベルのMyc癌原遺伝子を発現する白血病細胞株K−562、MOLT−4およびHL−60は、それらの増殖が強力に阻害されたのに対して、ヒト線維芽細胞または結腸癌細胞株SW−480は、影響を受けなかった(図7B)。
蛍光偏光アッセイ。MYCおよびMAXのHisタグ付bHLH−LZドメインを大腸菌で発現させ、Hisトラップによって精製した。5−カルボキシフルオレセインをAlexa Fluor−594に代えた以外はKiessling et al.,Chemistry&biology 13(7):745−751,2006に記載されているように、蛍光偏光アッセイを行った。
K562、Daudi、NCI−H460および/またはHFFはすべて、ATCCから入手し、製造業者が推奨するように成長させた。処理の前日に、K562、Daudi、NCI−H460および/またはHFFをそれぞれ細胞3,000個、10,000個、3,000個、4,000個/ウェルで組織培養処理96ウェルプレートに100μlで播種した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。ハイグレードDMSO(SIGMA,D8418)中で、Myc阻害剤を調製した。無血清培地中で系列希釈または単一希釈の化合物を調製し、細胞に3回反復で追加した(50μl/ウェル)。37℃で3日間インキュベートした後、以下のように細胞増殖を分析した:10μlの色素溶液(CellTiter 96(登録商標)Non−Radioactive Cell Proliferation Assay,Promega)を各ウェルに追加した。プレートを37℃で2〜4時間インキュベートした。次いで、100μlの可溶化/停止溶液を各ウェルに追加し、プレートを撹拌しながら室温で1時間インキュベートした。96ウェルプレートリーダー(Flexstation 3,Molecular Device)を使用して、吸光度を570nmで記録した。GraphPad prismでデータを分析し、非線形回帰フィット(Log(阻害剤)対反応−可変勾配方程式)を使用して適用した際に、IC50値を計算した。
ATG−MycのCEFフォーカスアッセイを使用して、本発明者らは、化合物CG−RS−44(KJ−PYR−9)がATG−Mycの阻害および特異性を提供することを最初に確認した。このデータは、0〜20μMの濃度範囲の化合物(0、1.25、2.5、5、10および20μMで試験)における用量依存性阻害を示している。次いで、本発明者らは、ATG−Mycフォーカス形成の阻害について、15個のCG−RS−44類似体の活性を調べた。結果を図11に示す。具体的には、(化合物CG−RS−44それ自体に加えて)化合物CG−RS−47、CG−RS−70およびCG−RS−129は、10μMの濃度でフォーカス形成をもたらさなかった。これらの化合物は、10μMでフォーカス形成を完全に阻害したことから、CG−RS−44と同程度か、またはおそらくそれ以上に機能する。加えて、化合物CG−RS−50、CG−RS−54、CG−RS−55およびCG−RS−56はまた、いくらかの阻害活性を示したが、化合物CG−RS−58、−61、−64、−90、−91、−106、−123または−128を使用した場合には、阻害が見られなかった。さらに、化合物CG−RS−70または−129では、細胞成長のわずかな減少が観察された。また、CEFアッセイにおいて、IC50値を測定して、いくつかの化合物のMyc阻害活性を調べた。この研究の結果により、化合物CG−RS−44は、試験したすべての類似体(化合物CG−RS−47、−70および−109Bを含む)よりもATG−Mycフォーカス形成をよく阻害したことが示された。
CG−RS−40の合成
以下の化合物4−ホルミルベンズアミド(7.0g、47mmol)および2−アセチルフラン(3.9mL、39mmol)を窒素雰囲気下のRBフラスコに入れた。THF(280mL)を追加し、次いで、粉末LiOH(934mg、39mmol)を追加した。得られた混濁混合物を室温で一晩撹拌した。この時点において、LCは、微量の2−アセチルフラン、主に所望の生成物および4−ホルミルベンズアミド(約20%)を示した。2.2mLの酢酸を含む20mLの水でクエンチした。水および酢酸エチルを追加し、層を分離した。20%IPAの酢酸エチル溶液で水層を2回抽出した。有機部分を合わせ、濃縮した。得られた固体をエーテル(70mL)で処理し、加熱し、デカントした。これをさらに2回繰り返した。固体を10%MeOH/DCM(30mL)でトリチュレートし、ろ過し、10%MeOH/DCM(10mL)で洗浄した。固体重量4.4g。ろ液を濃縮し、isco220gシリカカートリッジで精製した。これにより、白色の固体としてさらなる550mgが得られた。ESI(m/z)=(M+H)242。
5−ヒドロキシメチルフラン−2−カルボキサミド(470mg、3.3mmol)を室温でDCM(6mL)およびTHF(6mL)に溶解し、デス−マーチン試薬(1.6g、3.7mmol)を追加した。この時点において、TLCは、主に所望の生成物(出発物質と比較して非極性)を示した。通常の水性処理およびメタノール単離により、300mgの所望の生成物が得られた。
メチル(5−ヒドロキシメチル)フランカルボキシレート(12g)、MeOH(50mL)および濃NH4OH(70mL)を圧力反応器に入れた。100℃に加熱し、24時間後、TLCは、主に2つの極性のスポットが残存しており、出発物質が残存していないことを示した。ロータリーエバポレーターで濃縮し、得られた固体を約55mLのIPAに入れ、加熱して完全に溶解した。室温に冷却すると、固体が分離し始め、ろ過し、乾燥した(2.4g)。次いで、母液を濃縮して体積を半分にし、1.3gの第2のクロップを得た。
CG−RS−44の合成
固体CG−RS−40およびCG−RS−32を窒素下のRBフラスコに入れた。DMFを追加すると、固体が赤色調の混濁溶液になり、次いで、酢酸を追加すると、淡黄色になった。最後に、NH4OAcを追加すると、この溶液がやや赤色調でやや透明になる。50℃の予熱油浴中に入れ、次いで、90℃に加熱し、この温度で2時間維持した。この時点において、LCは、主に所望の生成物が残存しており、出発物質が残存していないことを示した。放熱して室温に冷却した。過剰の水を追加することによってクエンチし、少しの間撹拌した。固体が分離し、ろ過し、水で数回洗浄した。固体を最小量のDCMに溶解し、220gシリカカートリッジにロードし、溶出(100%DCMで最大5分間、次いで、5〜25分に0〜5%MeOH/DCMに上昇させ、25〜45分に5%MeOH/DCMを維持)した。画分150〜173を合わせ、濃縮し、数mLのMeOHを追加し、トリチュレートし、固体をろ過し、乾燥した(1.5gの褐色の固体)。データ:1H NMR(600MHz,DMSO−d6)δppm 6.72(dd,J=3.51,1.76Hz,1H)7.39(d,J=3.22Hz,1H)7.48(s,1H)7.92(s,1H)8.02−8.07(m,2H)8.08−8.16(m,4H)8.29−8.40(m,3H)8.57(d,J=9.08Hz,2H)。ESI(m/z)=(M+H)386。
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