CN106442832B - 牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法 - Google Patents

牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：步骤一、牛大力供试品溶液的制备；步骤二、牛大力指纹图谱的测定：将牛大力供试品溶液注入高效液相色谱分析仪，记录110min内的色谱图，色谱分析条件为：柱温为30℃，检测波长为200‑320nm，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，流动相为乙腈‑体积浓度为0.05％的磷酸水溶液，梯度洗脱流速为0.6ml/min。本发明提供一种牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，建立牛大力的标准指纹图谱，为牛大力药材的真伪和品质的甄别和质量控制提供科学依据。

Description

牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明涉及药材指纹图谱的建立方法技术领域。更具体地说，本发明涉及一种牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法。
背景技术
牛大力，为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(Millettia speciosa Champ.)的干燥根。俗称金钟根、山莲藕、血藤、九龙串珠、牛古大力、大力薯等，野生于山谷、溪边、灌丛和山坡疏林边，两广和海南也均有栽培，其全年均可采收，其中以秋季、冬季和早春采收质量最佳。牛大力主要分布于广西、广东、福建、海南、贵州、湖南等地，其中以两广地区和海南省的产量最大。牛大力性味甘、平，归肺、经，具有补虚润肺，强筋活络的功能。牛大力药用历史悠久，早在《生草药性备要》记载其：“壮筋活络，补虚润肺。治腰腿痛，风湿痹痛，慢性肝炎，肺结核”。同时，《陆川本草》也记载其：“清肺止咳，清凉解毒。治咳血，痢疾，温病身热，口渴，头晕”。
中药指纹图谱技术是中药质量控制和鉴别技术的发展和进化，并随着当代分析技术的发展而不断壮大，对中药的质量控制研究和推向世界起推动作用。中药是建立在多种复杂化学成分复杂体系作用基础之上的，单一或少数几个成分很难囊括中药的整体性和复杂性，也不能反映中药的有效性和专属性。中药指纹图谱的出现为解决中药质量控制方法的科学性提供了新的技术手段。目前，尚未发现牛大力的标准指纹图谱研究，因此，建立牛大力的高效液相指纹图谱具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，建立牛大力的标准指纹图谱，为牛大力药材的真伪和品质的甄别和质量控制提供科学依据。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
步骤一、牛大力供试品溶液的制备；
步骤二、牛大力指纹图谱的测定：将牛大力供试品溶液注入高效液相色谱分析仪，进样体积为5-20μl，记录110min内的色谱图，得到牛大力的指纹图谱，色谱分析条件为：柱温为30℃，检测波长为200-320nm，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，流动相为乙腈-体积浓度为0.05％的磷酸水溶液，梯度洗脱流速为0.6ml/min，梯度洗脱程序为：
0～5min，乙腈体积浓度由5％匀速增加至8％；
5～15min，乙腈体积浓度由8％匀速增加至20％；
15～45min，乙腈体积浓度由20％匀速增加至25％；
45～55min，乙腈体积浓度由25％匀速增加至55％；
55～65min，乙腈体积浓度由55％匀速增加至70％；
65～100min，乙腈体积浓度由70％匀速增加至90％；
100～110min，乙腈体积浓度由90％匀速增加至95％。
优选的是，所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，牛大力供试品溶液的制备方法如下：取牛大力药材100g，用粉碎机将其粉碎，置于圆底烧瓶中，加入体积分数为50％的甲醇1000ml，浸泡2.0h，90℃水浴回流提取120min，放冷至室温，过滤，所得滤液减压干燥后得牛大力干膏；精密称取牛大力干膏2g，用25ml蒸馏水溶解，过滤，所得滤液上柱，经D101大孔树脂填充的色谱柱吸附30min，用蒸馏水水洗脱至无色，弃去水液，再用10倍色谱柱柱体积的体积分数为30％的甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥后加体积分数为30％的甲醇制备成为0.1g/ml的溶液，过滤，即得牛大力供试品溶液。
优选的是，所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，检测波长为250nm。
优选的是，所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，进样体积为15μl。
优选的是，所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，还包括：所得到的牛大力的指纹图谱共有15个峰，其中11号为高丽槐素峰，是内参照峰，其他14个共有峰的相对保留时间依次为1号峰0.231±0.0003min、2号峰0.278±0.0003min、3号峰0.657±0.0001min、4号峰0.689±0.0001min、5号峰0.714±0.0003min、6号峰0.772±0.0134min、7号峰0.792±0.0114min、8号峰0.932±0.0072min、9号峰0.946±0.0067min、10号峰0.957±0.0087min、12号峰1.021±0.0016min、13号峰1.154±0.0001min、14号峰1.241±0.0001min、15号峰1.325±0.0004min。
本发明至少包括以下有益效果：本发明的牛大力标准指纹图谱共有15个共有特征峰，这些峰共同构成了牛大力的指纹图谱特征，可作为牛大力的标准指纹图谱，本发明所建立的指纹图谱见过多批牛大力样品验证之后可用于牛大力的质量控制中，用于从整体上评价牛大力的药材质量，既避免了测定单一或单独几个化学成分判定药材质量的片面性，又增加了科学性，本发明的牛大力高效液相指纹图谱具有重复性强、精密度高和稳定可靠的，易于实施的特点，适用于牛大力药材的真伪和品质的甄别和质量控制。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的牛大力标准指纹图谱，其中1-15号峰为牛大力的共有特征峰。
图2为本发明采用的13批牛大力药材指纹图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，因此不能理解为对本发明的限制。
试剂：高丽槐素(纯度99.99％，批号：MUST-15071610)(纯度99.03％，批号：MUST-15061408)购自于成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；无水乙醇、冰醋酸(分析纯，成都科龙化工试剂厂)；超纯水。
仪器：岛津高效液相色谱仪(包括LC-20A二元泵，SIL-20A自动进样器，SPM-M20A二极管阵列检测器检测器，CTO-20A柱温箱，CBM-20A控制器)，AL204/01-电子天平(METTLERTOLEDO)，AL204/01-电子天平(METTLER TOLEDO)；色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×250mm)。
实施方式一：
一种牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
步骤一、牛大力供试品溶液的制备；
步骤二、牛大力指纹图谱的测定：将牛大力供试品溶液注入高效液相色谱分析仪，进样体积为5-20μl，记录110min内的色谱图，得到牛大力的指纹图谱，色谱分析条件为：柱温为30℃，检测波长为200-320nm，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，流动相为乙腈-体积浓度为0.05％的磷酸水溶液，梯度洗脱流速为0.6ml/min，梯度洗脱程序为：
0～5min，乙腈体积浓度由5％匀速增加至8％；
5～15min，乙腈体积浓度由8％匀速增加至20％；
15～45min，乙腈体积浓度由20％匀速增加至25％；
45～55min，乙腈体积浓度由25％匀速增加至55％；
55～65min，乙腈体积浓度由55％匀速增加至70％；
65～100min，乙腈体积浓度由70％匀速增加至90％；
100～110min，乙腈体积浓度由90％匀速增加至95％。
其中，所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，牛大力供试品溶液的制备方法如下：取牛大力药材100g，用粉碎机将其粉碎，置于圆底烧瓶中，加入体积分数为50％的甲醇1000ml，浸泡2.0h，90℃水浴回流提取120min，放冷至室温，过滤，所得滤液减压干燥后得牛大力干膏；精密称取牛大力干膏2g，用25ml蒸馏水溶解，过滤，所得滤液上柱，经D101大孔树脂填充的色谱柱吸附30min，用蒸馏水水洗脱至无色，弃去水液，再用10倍色谱柱柱体积的体积分数为30％的甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥后加体积分数为30％的甲醇制备成为0.1g/ml的溶液，过滤，即得牛大力供试品溶液。过滤方式为0.45μm微孔滤膜过滤。
其中，所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，检测波长为250nm。
其中，所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，进样体积为15μl。
对照品溶液的制备：精密称取对照芒柄花素和高丽槐素适量，用体积分数为50％的甲醇溶解，分别配成浓度为120μg/ml和100μg/ml的对照品溶液。
本实施方式采用的牛大力为广西钦州的牛大力，得到的牛大力高效液相指纹图谱见附图1，其中，所得到的牛大力的指纹图谱共有15个峰，其中11号为高丽槐素峰，是内参照峰，其他14个为牛大力的色谱峰。
方法重现性考验：
以13个产地的牛大力分别采用实施方式一的方法制备牛大力供试品溶液，制备分别建立指纹图谱，具体来源见下表1，得到的13个产地的牛大力的指纹图谱见图2。
表1牛大力药材来源标号
本发明还根据13批不同产地的牛大力药材分别根据本实施例的方法得到的指纹图谱见图2，分别标记为S1-S13，得到对照指纹图谱R，并以高丽槐素为内参照峰，计算其他14个共有峰的相对保留时间，得到牛大力的其他14个共有峰的相对保留时间依次为1号峰0.231±0.0003min、2号峰0.278±0.0003min、3号峰0.657±0.0001min、4号峰0.689±0.0001min、5号峰0.714±0.0003min、6号峰0.772±0.0134min、7号峰0.792±0.0114min、8号峰0.932±0.0072min、9号峰0.946±0.0067min、10号峰0.957±0.0087min、12号峰1.021±0.0016min、13号峰1.154±0.0001min、14号峰1.241±0.0001min、15号峰1.325±0.0004min。从13个样本的14个共有峰的相对保留时间的偏差范围可以得出，本发明的方法，针对不同牛大力样品中得到的色谱峰的相对保留时间偏差极小，表明本发明的方法重现性良好。
为了说明本发明的牛大力的指纹图谱的建立方法的效果，本申请的发明人进行了下述试验方法考察，避免了只测定1到2个成分造成的片面性和不科学性，表明本发明建立的牛大力指纹图谱可用于整体上评价和控制牛大力的质量。
方法学考察
精密度实验
取实施方式一的牛大力供试品液，HPLC测定，连续进样6次，以高丽槐素的色谱峰为内参照峰(S)，结果见表1，各色谱峰和相对保留时间RSD值小于0.50％，相对峰面积RSD值小于2.00％，精密度良好。
重复性实验
取实施方式一的批牛大力药材，同法制备供试品液，HPLC测定，连续进样6次，结果见表2，各色谱峰和相对保留时间RSD值小于0.50％，相对峰面积RSD值小于2.50％，说明本实验重复性良好。
稳定性实验
取实施方式一的牛大力供试品液，分别于0，2，4，8，12，24h进行HPLC测定，结果见表3，各色谱峰和相对保留时间RSD值小于0.50％，相对峰面积RSD值小于2.50％，说明样品在24h内稳定。
表1精密度实验结果(n＝6)
表2重复性实验结果(n＝6)
表3稳定性实验结果(n＝6)
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (4)

1.一种牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、牛大力供试品溶液的制备：取牛大力药材100g，用粉碎机将其粉碎，置于圆底烧瓶中，加入体积分数为50％的甲醇1000ml，浸泡2.0h，90℃水浴回流提取120min，放冷至室温，过滤，所得滤液减压干燥后得牛大力干膏；精密称取牛大力干膏2g，用25ml蒸馏水溶解，过滤，所得滤液上柱，经D101大孔树脂填充的色谱柱吸附30min，用蒸馏水水洗脱至无色，弃去水液，再用10倍色谱柱柱体积的体积分数为30％的甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥后加体积分数为30％的甲醇制备成为0.1g/ml的溶液，过滤；
步骤二、牛大力指纹图谱的测定：将牛大力供试品溶液注入高效液相色谱分析仪，进样体积为5-20μl，记录110min内的色谱图，得到牛大力的指纹图谱，色谱分析条件为：柱温为30℃，检测波长为200-320nm，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，流动相为乙腈-体积浓度为0.05％的磷酸水溶液，梯度洗脱流速为0.6ml/min，梯度洗脱程序为：
0～5min，乙腈体积浓度由5％匀速增加至8％；
5～15min，乙腈体积浓度由8％匀速增加至20％；
15～45min，乙腈体积浓度由20％匀速增加至25％；
45～55min，乙腈体积浓度由25％匀速增加至55％；
55～65min，乙腈体积浓度由55％匀速增加至70％；
65～100min，乙腈体积浓度由70％匀速增加至90％；
100～110min，乙腈体积浓度由90％匀速增加至95％。
2.如权利要求1所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于，检测波长为250nm。
3.如权利要求2所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于，进样体积为15μl。
4.如权利要求3所述的牛大力的高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于，还包括：所得到的牛大力的指纹图谱共有15个峰，其中11号为高丽槐素峰，是内参照峰，其他14个共有峰的相对保留时间依次为1号峰0.231±0.0003min、2号峰0.278±0.0003min、3号峰0.657±0.0001min、4号峰0.689±0.0001min、5号峰0.714±0.0003min、6号峰0.772±0.0134min、7号峰0.792±0.0114min、8号峰0.932±0.0072min、9号峰0.946±0.0067min、10号峰0.957±0.0087min、12号峰1.021±0.0016min、13号峰1.154±0.0001min、14号峰1.241±0.0001min、15号峰1.325±0.0004min。
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