CN105777752A - 独一味颗粒的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了独一味颗粒的质量控制方法，是一种通过控制独一味颗粒中活性成分进而控制成药质量的分析方法。本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有促进骨折愈合作用，可能是独一味颗粒发挥治疗作用的物质基础之一。该化合物可以从独一味的干燥全草中分离得到，且分离制备方法得率高，可以进行大规模制备。本发明提供的液相分析方法可以将独一味颗粒中的化合物(Ⅰ)与其他化合物分开，达到基线分离(分离度＞2.0)，化合物(Ⅰ)峰纯度检测合格。本发明提供的化合物(Ⅰ)在独一味颗粒的质量控制过程中可以作为化学对照品用于化合物(Ⅰ)的定性或定量分析。

Description

独一味颗粒的质量控制方法

技术领域

本发明属于药物技术领域，涉及药物制剂的质量分析，具体涉及独一味颗粒的质量控制方法。

背景技术

独一味颗粒是河南洛正制药厂科研人员与北京等科研机构联合开发的无糖型高浓缩颗粒剂。具有病人服量少，药效足等特点，广泛运用于骨伤科：骨折、筋骨扭伤、风湿痹痛；外科：术后镇痛、止血；妇科；口腔科等临床科室。深受临床医师及患者好评。

独一味是藏、蒙、纳西等民族民间草药，具有止血、镇痛、活血化瘀、抗菌消炎、增强免疫力等作用。在我国一千多年前的藏医学名著《四部医典》和《晶珠本草》中就已有记载。独一味生长于海拔2700～4500m的高山草甸、河滩等处。主产于西藏、青海、云南、四川、甘肃等省区。藏医将其用于骨髓炎、关节黄水病、骨折、跌伤、枪伤等。

临床应用主要为：1、治疗骨外伤：用独一味治疗外伤后软组织损伤79例，外伤骨折12例，有效率96.1％。治疗骨外科20余病种356例，结果：显效率20.5％，有效率63.5％。对14例患者用独一味前后测定前臂内侧皮肤痛觉阈，结果服药后1，2，3，4h从药前的4.34cm增加到5.71，6.41，6.71，6.75cm，服药后痛阈升高，表明独一味用于骨外科有较好的止血、镇痛效果。2、术后镇痛：用独一味对耳鼻咽喉及头颈外科手术病人150例进行镇痛疗效观察，其中男108例，女42例，年龄16～84岁，总有效率88.0％，鼻部及头颈部有效率达90.4％和92.3％，较对照组疗效为优，同时对鼻部手术出血也具有较好的止血作用。对40例18～66岁(男32例，女8例)肛瘘手术服用独一味观察治疗，对照组30例，手术后服去痛片，维生素K1肌肉注射，庆大霉素32万U加入生理盐水500ml，静脉滴注，其结果为：手术后疼痛、尿潴留、手术创面渗血的疗效均优于对照组，且手术创面愈合时间较对照组快。3、治疗妇科疾病：用独一味治疗妇科疾病190例，其中因宫血、炎症、放环等所致阴道出血139例，显效51.1％，有效41.0％，因痛经、附件炎及其它原因所致疼痛51例，显效31.4％，有效45.1％，较之维生素K、6－氨基乙酸、安络血、去痛片、肤宁滴丸的疗效为优。4、治疗视网膜静脉阻塞(PVO)：独一味可以疏血管、消除视网膜水肿，有利于视功能的恢复，并减少并发症的发生。

独一味颗粒安全性高。小鼠灌胃独一味叶浸膏的LD50为13.5g/kg。浸膏1.5g/kg给麻醉家兔肠内注入无中毒表现，浸膏以0.1g/kg、0.5g/kg给犬服，连续21天，对动物活动，一般状态；血象，肝肾功能无明显影响。病理组织切片各脏器大部分未见异常。偶见血管扩张充血和肝组织坏死。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种从独一味颗粒中分离得到的新化合物；

本发明的第二目的在于提供上述新化合物的制备方法；

本发明的第三目的在于提供一种基于上述新化合物的液相分析方法，用于控制独一味颗粒的质量，提高独一味颗粒的质量控制水平；

本发明的第四目的在于提供上述新化合物在独一味颗粒质量控制中用作对照品的用途。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

所述的化合物(Ⅰ)的制备方法包括如下操作步骤：

步骤S1，将独一味的干燥全草粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；

步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用8～12％乙醇洗脱7～11个柱体积，再用70～80％乙醇洗脱11～15个柱体积，收集70～80％乙醇洗脱液，减压浓缩得70～80％乙醇洗脱浓缩物；

步骤S3，将步骤S2中70～80％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为60:1、30:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；

步骤S4，将步骤S3中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；

步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70～80％的甲醇水溶液等度洗脱，收集7～11个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。

进一步地，步骤S1中用80％乙醇热回流提取。

进一步地，步骤S2中所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。

进一步地，步骤S2中，先用10％乙醇洗脱9个柱体积。

更进一步地，步骤S2中，再用75％乙醇洗脱13个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱浓缩物。

进一步地，步骤S5中用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱。

上述化合物(Ⅰ)在独一味颗粒质量控制方法中用作化学对照品的用途。

所述独一味颗粒质量控制方法为高效液相色谱法，参数如下：

色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.5％磷酸溶液；

梯度洗脱程序：0.01～5min，A10％→15％；5～10min，A15％→48％；10～25min，A48％→78％；25～30min，A78％→10％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：284nm；

柱温：35℃；

进样量：10μL。

进一步地，所述的C18柱为AgilentExtendC18柱(4.6mm×250mm，5μm)。

本发明的优点：

1、本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有促进骨折愈合作用，可能是独一味颗粒发挥治疗作用的物质基础之一；

2、化合物(Ⅰ)可以从独一味的干燥全草中分离得到，本发明提供的制备方法得率高，可以进行大规模制备；

3、本发明提供的液相分析方法可以将独一味颗粒中的化合物(Ⅰ)与其他化合物分开，达到基线分离(分离度＞2.0)，化合物(Ⅰ)峰纯度检测合格；

4、本发明制备的化合物(Ⅰ)纯度高，在独一味颗粒的质量控制过程中可以用于化合物(Ⅰ)的定性或定量。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

实施例1：化合物(Ⅰ)的制备和结构确证

分离制备方法：

步骤S1，将2kg独一味的干燥全草粉碎，用80％乙醇热回流提取(10L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；

步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用D101型大孔树脂富集，先用10％乙醇洗脱9个柱体积，再用75％乙醇洗脱13个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱浓缩物；

步骤S3，将步骤S2中75％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为60:1(7个柱体积)、30:1(6个柱体积)、15:1(6个柱体积)和8:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；

步骤S4，将步骤S3中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(4个柱体积)、15:1(6个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；

步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集7～11个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(752mg，HPLC归一化纯度大于98％)。

结构确证：黄色无定形固体；HR-ESIMS给出的准分子离子峰m/z413.1672[M+H]⁺，表明化合物分子式为C₂₂H₂₄N₂O₆，不饱和度为12。¹H-NMR谱(pyridine-d₅，500MHz)中，H-1(11.79，s)，H-3(3.62，d，J＝10.9Hz)，H-5(6.88，s)，H-9(7.59，d，J＝2.7Hz)，H-11(7.25，dd，J＝8.7，2.7Hz)，H-12(7.45，d，J＝8.7Hz)，H-14a(2.78，d，J＝12.3Hz)，H-14b(2.03，ddd，J＝12.3，12.1，10.9Hz)，H-15(2.13，m)，H-16(3.14，m)，H-17(9.82，d，J＝5.7Hz)，H-18(0.97，t，J＝7.8Hz)，H-19a(1.61，m)，H-19b(1.27，m)，H-20(2.10，m)，H-21a(3.85，dd，J＝10.3，2.6Hz)，H-21b(2.29，d，J＝10.3Hz)，22-OMe(3.68，s)；¹³C-NMR谱(pyridine-d₅，125MHz)中，C-2(136.0，C)，C-3(56.8，CH)，C-5(155.8，CH)，C-6(99.9，C)，C-7(115.8，C)，C-8(129.3，C)，C-9(103.8，CH)，C-10(152.9，C)，C-11(112.8，CH)，C-12(112.3，CH)，C-13(131.8，C)，C-14(33.2，CH₂)，C-15(38.8，CH)，C-16(60.9，CH)，C-17(202.5，CH)，C-18(11.8，CH₃)，C-19(23.2，CH₂)，C-20(39.4，CH)，C-21(55.7，CH₂)，C-22(172.7，C)，C-23(174.5，C)，22-OMe(52.1，CH₃)。红外波谱表明该化合物含有羰基(1728cm^-1与1622cm^-1)基团；紫外波谱表明该化合物含有吲哚(最大吸收206nm，274nm与310nm)基团。¹H-NMR谱显示存在1,2,4-三取代苯基质子信号δH7.59(1H，d，J＝2.7Hz，H-9)，7.25(1H，dd，J＝8.7，2.7Hz，H-11)与7.45(1H，d，J＝8.7Hz，H-12)；一个烯烃质子信号δH6.88(1H，s，H-5)；三组亚甲基质子信号δH2.78(1H，d，J＝12.3Hz，H-14a)与2.03(1H，ddd，J＝12.3，12.1，10.9Hz，H-14b)、1.61(1H，m，H-19a)与1.27(1H，m，H-19b)、3.85(1H，dd，J＝10.3，2.6Hz，H-21a)与2.29(1H，d，J＝10.3Hz，H-21b)；四组次甲基质子信号δH3.62(1H，d，J＝10.9Hz，H-3)、2.13(1H，m，H-15)、3.14(1H，m，H-16)与2.10(1H，m，H-20)；一个醛基质子信号δH9.82(3H，d，J＝5.7Hz，H-17)；一个甲氧基质子信号δH3.68(3H，s，22-OMe)；一个甲基质子信号δH0.97(3H，t，J＝7.8Hz，H-18)；一个连氮质子信号δH11.79(1H，s，H-1)。¹³C-NMR谱与DEPT谱显示有两组双键，两个羰基，一个醛基，两个甲基，三个亚甲基，四个次甲基。此外，¹H-¹HCOSY谱中，证明存在明显的H-3/H₂-14/H-15/H-16/H-17，H₃-18/H₂-19/H-20/H₂-21，H-15/H-20以及H-11/H-12信号相关。据HMBC谱分析可知，甲氧基质子与C-22存在信号相关说明OMe与C-22位相连；进一步通过2D-INADEQUAR分析δC120-180范围内的碳碳直接相关信号可知，C-6与C-23存在相关信号，证明羧基与C-6位相连。在这类生物碱骨架中，H-15总是处在构型的α位；另外，H-3、H-14b与H-15三者之间的偶合常数J_3，14b与J_14b，15为10.6与12.7，表明H-3、H-14b与H-15为同轴顺式构型。ROESY谱中，H-3与H-15，H-3与H-20以及H-15与H-20的相关性表明H-3与H-20为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下式所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。化学结构式和碳原子编号如下：

实施例2：化合物(Ⅰ)的药理作用(促进骨折愈合)

1、材料与方法

1.1动物：青紫兰健康家兔30只，体质量2.0～2.5kg，雌雄兼用。兔标准颗粒饲料喂养。均由兰州生物制品研究所提供。

1.2试剂与样品：化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。仙灵骨葆胶囊：由淫羊藿、续断、补骨脂等药物组成。贵州仙灵药业有限责任公司生产。硫喷妥钠，麻醉用药，上海新亚药业有限公司生产。使用时用生理盐水配制成2％的溶液供腹腔注射。青霉素钠，哈尔滨制药总厂生产。阿卡波糖、化合物(Ⅰ)及其组合物先用少量DMSO超声溶解，再用纯化水溶解稀释灌胃。

1.3家兔分组及模型制备

将上述30只家兔适应性饲养3d后，腹腔注射2％硫喷妥钠40mg/kg麻醉。取桡骨中段纵行切口，显露桡骨中段，用牙科钻的圆砂轮将桡骨锯成3mm宽的骨缺损标准横断骨折。不做固定，术后每天肌注青霉素钠4×10⁴U/kg，连用3d，动物造模后随机分为3组，分别为空白对照组、阳性对照组(仙灵骨葆胶囊，280mg·kg^-1)和化合物(Ⅰ)组(20mg·kg^-1)。药物混悬液灌胃法给药，术后第1天开始灌胃。阳性对照组灌服仙灵骨葆0.28g/kg，均以10ml/kg蒸馏水稀释，空白对照组灌服10ml/kg生理盐水。各兔灌胃1次/d，连续至处死日期为止。

1.4标本采集与处理

灌胃后第3周于耳中央动脉采血检测血清碱性磷酸酶(ALPase)。于灌胃第14天用空气栓塞法处死第一批兔子，每组内也用随机法分为2个亚组，每个亚组5只。于肘关节离断前臂，置同一胶片盒摄X线片，然后完整分离桡骨，剔除附着的软组织及骨膜，用生理盐水纱布块包裹桡骨标本，置-20℃冰箱冷藏备用。将另一侧桡骨标本于骨折部上下方各1cm处锯断，4％甲醛固定备用。第31天同前法处死第二批兔子，采集标本。

1.5血清ALPase测定

采用比色法测定血清碱性磷酸酶[S-ALP(IU/L)]。

1.6骨痂生物力学测试

将桡骨标本于测试前2h取出，自然解冻，置万能材料实验机，作三点弯曲实验，测试桡骨骨痂力学强度。跨距50mm，加载速度10mm/min，以最大载荷作为桡骨愈合程度的标志。视骨折断面为椭圆，用游标卡尺测量骨折部最大直径(d1)和最小直径(d2)，得出最大半径(a)和最小半径(b)，求出椭圆的横截面积，计算出最大应力。计算公式如下：

横截面积：F＝πab(单位：mm²)；最大应力＝最大载荷/横截面积(单位：N·mm^-2)

1.7统计学方法

X线片评分结果按分数编秩，SPSS19.0软件进行组间秩和检验。其余各数据均以x±s表示，用SPSS19.0软件进行方差分析，LSD法进行显著性检验。

2、实验结果

2.1对骨折家兔模型血清ALPase检测结果。

和空白对照组相比，阳性对照组血清ALPase含量升高(P<0.05)；与空白对照组相比，化合物(Ⅰ)组血清ALPase含量显著升高(P<0.01)。结果见表1。

2.2对骨折家兔模型骨生物力学测试结果

14天时，和空白对照组相比，阳性对照组最大应力升高(P<0.05)，最大载荷显著升高(P<0.01)；和空白对照组相比，化合物(Ⅰ)组最大应力和最大载荷明显升高(P<0.01)；31天时，和空白对照组相比，化合物(Ⅰ)组与阳性对照组最大应力和最大载荷明显升高(P<0.01)。结果见表2和表3。

表1对骨折家兔模型血ALPase的影响

组别	ALPase(IU/L)
		空白对照组	118.170±7.960
阳性对照组	141.000±15.279
		化合物(Ⅰ)组	163.670±25.224

表2对骨折家兔模型骨生物力学的影响(14天)

表3对骨折家兔模型骨生物力学的影响(31天)

上述结果表明，化合物(Ⅰ)具有促进骨折愈合的作用，可能是独一味颗粒发挥治疗作用的物质基础之一。

实施例3：独一味颗粒的质量控制方法

1、仪器：Agilent1260高效液相色谱仪

2、试剂：化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％，制备方法见实施例1；独一味颗粒为河南省洛正制药厂产品。

3、色谱条件：

色谱柱：AgilentExtendC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.5％磷酸溶液；

梯度洗脱程序：0.01～5min，A10％→15％；5～10min，A15％→48％；10～25min，A48％→78％；25～30min，A78％→10％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：284nm；

柱温：35℃；

进样量：10μL。

4、供试品溶液的制备

取独一味颗粒样品适量研成细粉，精确称取细粉0.5g置于50ml离心管中，精密加入2.5mol·L^-1盐酸甲醇溶液40mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，用2.5mol·L^-1盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液15mL，置50mL圆底烧瓶中，于90℃水浴中加热水解1h，放冷，转移至50mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5、对照品溶液的制备

精密称取化合物(Ⅰ)20mg至20ml容量瓶中，甲醇超声溶解，冷却至室温后定容。精密移取2ml至20容量瓶中，甲醇稀释定容，配制成浓度约为0.1mg/ml的对照品溶液。

6、分析方法验证

使用DAD检测器，分别进样分析供试品溶液和对照品溶液，结果：供试品溶液液相色谱图中在对照品溶液液相色谱图出峰位置出峰；对照品溶液中化合物(Ⅰ)色谱峰的光谱图与供试品溶液中对应色谱峰的光谱图一致；供试品溶液中化合物(Ⅰ)色谱峰与相邻色谱峰的分离度大于2.0，且峰纯度高于阈值。

7、样品含量测定

分别取3个批号的独一味颗粒样品，按上述方法处理制备供试液，测定样品中化合物(Ⅰ)含量，3批样品中的含量分别为0.0455％、0.0461％、0.0457％。

本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有促进骨折愈合作用，可能是独一味颗粒发挥治疗作用的物质基础之一，可以从独一味的干燥全草中分离得到，在独一味颗粒的质量控制过程中可以作为化学对照品用于化合物(Ⅰ)的定性或定量分析。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：

步骤S1，将独一味的干燥全草粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；

步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用8～12％乙醇洗脱7～11个柱体积，再用70～80％乙醇洗脱11～15个柱体积，收集70～80％乙醇洗脱液，减压浓缩得70～80％乙醇洗脱浓缩物；

步骤S3，将步骤S2中70～80％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为60:1、30:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；

步骤S4，将步骤S3中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；

步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70～80％的甲醇水溶液等度洗脱，收集7～11个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中用80％乙醇热回流提取。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，先用10％乙醇洗脱9个柱体积。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，再用75％乙醇洗脱13个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱浓缩物。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S5中用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱。

8.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在独一味颗粒质量控制方法中用作化学对照品的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，所述独一味颗粒质量控制方法为高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法的参数如下：

色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.5％磷酸溶液；

梯度洗脱程序：0.01～5min，A10％→15％；5～10min，A15％→48％；10～25min，A48％→78％；25～30min，A78％→10％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：284nm；

柱温：35℃；

进样量：10μL。

10.权利要求9所述的C18柱为AgilentExtendC18柱(4.6mm×250mm，5μm)。