CN105695501A

CN105695501A - 创制光温敏不育系的方法及其在植物育种中的应用

Info

Publication number: CN105695501A
Application number: CN201410714426.3A
Authority: CN
Inventors: 杨仲南; 朱骏; 张森; 周文涛; 周鹊
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2034-11-28
Also published as: JP2017535294A; CN105695501B; WO2016082803A1; JP6524252B2; PH12017500983A1

Abstract

本发明公开了一种培育植物不育系的方法，包括降低所述植物植株中花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性的步骤。以及一种将植物从不育转为可育的方法，包括降低花粉细胞膜合成速度、和/或延缓花粉发育速度的步骤。另外本发明提供了花粉发育相关的GDSL酯酶或其编码基因在培育植物不育系、或制备培育植物不育系的试剂或试剂盒中的用途。

Description

创制光温敏不育系的方法及其在植物育种中的应用

技术领域

本发明涉及农业和生物技术领域，尤其涉及一种创制光温敏不育系的方法及其在植物育种中的应用。

背景技术

在农业生产中，由于传统去雄手段耗时费力，雄性不育系在杂交制种，提高农业产量中有巨大的优势。雄性不育往往被分为细胞质雄性不育(CMS)以及细胞核雄性不育(GMS)。三系杂交体系的建立依赖于细胞质雄性不育。然而，有几个缺点阻碍了三系配套杂交在实践中的广泛应用。首先，细胞质雄性不育植株普遍存在着品质较差的的问题；其次，三系杂交水稻的组合增产潜力越来越小。再次，由于野败类型的雄性不育细胞质单一，一旦胞质不育丧失或某种毁灭性病虫害发生，会造成巨大损失。随着细胞核雄性不育中光温敏条件性雄性不育的发现，两系法杂交水稻应运而生。相对于三系杂交法，光温敏不育系兼有不育系和保持系两种状态。与三系法相比，两系法具有不受恢保关系的限制，既核不育可以与大量常规品种杂交，配组自由，因而更容易获得优良性状的杂交优势，从根本上解决三系中雄性不育细胞质单一化的问题。近年来，两系杂交水稻在中国农业生产中的应用越来越广泛。

早在1973年,石明松在中国湖北省从晚粳品种(Oryzasativassp.japonica)农垦58中选育出光敏感不育系并提出了一系两用的水稻杂种优势利用新途径。随后，以农垦58S(NK58S)为父本，与籼稻杂交获得的培矮64S(PA64S)也在两系杂交中得到广泛应用。但培矮64S的育性对于温度的变化更加敏感。在水稻中，光温敏不育系受到单基因隐性位点控制。最近的研究表明，农垦58S与培矮64S的不育性状受到同一个遗传位点的控制，而温度和光照都会对该位点产生影响，这些发现使人们对光温敏育性转换的分子机制更加难以理解。

目前为止，水稻中共有十三个光温敏不育系被发现：pms1,pms2,pms3,rpms1,rpms2,tms1,tms2,tms3,tms4,tms5,tms6,rtms1以及Ms-h，分别定位在第7,3,12,8,9,8,7,6,2,2,5,10和9条染色体上。光温敏不育在番茄，玉米以及小麦中也有报道。最近的研究发现，一个突变的小RNA(smallRNA),osa-smR5864m,导致pms2以及p/tms2-1(农垦58S和培矮64S)突变体的不育表型。然而，光温敏不育的分子机理仍然不清楚，使得人们缺乏有效的理论支持和技术手段来解决两系育种中实际问题。

鉴于拟南芥较小的基因组，快速的生长周期以及大量的突变体库等无可比拟的优势，使其在植物生物学研究领域成为模式植物。此外，拟南芥能够在严格控制温度，光照等条件的狭小空间中进行培养。前人的研究发现了一些拟南芥条件不育突变体，如PEAMT基因突变体t365以及GA/IAA生物合成受阻的ms33突变体都表现为温敏不育表型。

然而，目前本领域中尚缺少调控方式简便的植物不育系用于植物育种过程中，因此迫切需要调控方式简单方便的植物不育系培育技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育植物光温敏不育系的方法，包括降低花粉发育相关的GDSL酯酶表达或活性来创制光温敏植物材料,从而解决目前核不育光温敏遗传位点少，制种纯度不高的问题。

在本发明的第一方面，提供了一种培育植物不育系的方法，包括步骤：降低所述植物植株中花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性。

在另一优选例中，所述的GDSL酯酶参与所述植物的花粉发育过程的脂类代谢。

在另一优选例中，所述的GDSL酯酶将甘油三酯水解为甘油和脂肪酸。

在另一优选例中，所述的“降低”是指将所述植株中在花粉发育过程中GDSL酯酶的表达活性降低满足以下条件：

A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；

其中，A1为所述植株中花粉发育相关的GDSL酯酶的酶活性；A0为野生型同种类型植物植株中相同GDSL酯酶的酶活性。

在另一优选例中，所述GDSL酯酶为TMF1或其同源蛋白。

在另一优选例中，所述TMF1的野生型氨基酸序列选自下组：SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6。

在另一优选例中，所述GDSL酯酶是选自下组的细胞、组织或器官中特异性表达的：植物花序以及花药中。

在另一优选例中，所述细胞或组织包括：绒毡层、小孢子母细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述GDSL酯酶在花药发育期特异性表达。

在另一优选例中，所述的花药发育期包括前花药形成阶段(-3天～0天)、花药形成阶段、后花药形成阶段(花药形成后1-5天)。

在另一优选例中，所述GDSL酯酶在花药发育第6期特异表达。

在另一优选例中，所述GDSL酯酶在花粉减数分裂期达到表达最高峰。

在另一优选例中，所述降低植物植株中花粉发育相关的GDSL酯酶活性的方法包括：使GDSL酯酶编码基因的表达水平下降、和/或使GDSL酯酶活性下降。

在另一优选例中，所述的下降指与野生型GDSL酯酶的表达水平E0相比，所述植株中花粉发育相关的GDSL酯酶的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％；和/或与野生型的花粉发育相关的GDSL酯酶的酶活性A0相比，所述植株中花粉发育相关的GDSL酯酶的酶活性A1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％。

在另一优选例中，所述的降低植株中GDSL酯酶活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、或其组合。

在另一优选例中，所述GDSL酯酶编码基因为TMF1基因。

在另一优选例中，所述TMF1基因能够编码SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:6所示氨基酸序列。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：降低所述植株中TMF1基因的表达水平、缺失TMF1基因和/或致TMF1基因突变来实现降低植株中GDSL酯酶的表达或活性。

在另一优选例中，所述的植物包括农作物、林业植物、花卉；优选地包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更优选地包括水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥。

在另一优选例中，所述的植物选自：十字花科(Brassicaceae)植物、鼠耳芥属(Arabidopsis)植物、拟南芥(A.thaliana)。

本发明的第二方面，提供了一种花粉发育相关的GDSL酯酶或其编码基因的用途，用于培育植物不育系、或用于制备培育植物不育系的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的编码基因为TMF1基因。

在另一优选例中，所述TMF1基因能够编码SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:6所示氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供了一种将植物从不育转为可育的方法，包括步骤：降低花粉细胞膜合成速度、和/或延缓花粉发育速度。

在另一优选例中，所述的植物是花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性水平下降的植物。

在另一优选例中，所述植物为根据权利要求1-6中任一项所述的方法培育的植物不育系。

在另一优选例中，所述方法包括：降低花粉细胞膜合成速度，从而延缓花粉发育。

在另一优选例中，所述方法包括：降低植株代谢水平，从而降低花粉细胞膜合成速度。

在另一优选例中，所述降低或延缓是通过以下方式实现：降低植株生长的环境温度、减少植株的光照时间、或组合。

在另一优选例中，降低植株生长的环境温度包括将环境温度(平均温度)控制在17-22℃，更优选地为17-20℃，如17℃、18℃、19℃或20℃。

在另一优选例中，降低植株生长的环境温度的时间包括花药形成阶段，花粉成熟阶段以及开花授粉阶段，或其前后2周。

在另一优选例中，在植株抽薹或抽穗时开始降低植株的生长温度，低温培育3-10天后，恢复正常温度培育。

本发明的第四方面，提供了一种植物育种方法，包括维持植株不育的步骤；将植株由不育转为可育的步骤；和，维持植株可育并育种的步骤；

在所述维持植株不育的步骤中，包括，对根据本发明第一方面的方法培育的植物不育系进行维持；

在将植株由不育转为可育的步骤中，包括，利用根据本发明第三方面的方法将植株由不育转为可育。

本发明的第五方面，提供了一种植物细胞，所述植物细胞发育成的植株中花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性降低。

在另一优选例中，所述GDSL酯酶为TMF1。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示低温能够恢复雄性不育tmf1突变体的育性

a.Ler植株的正常可育表型。

b.在正常条件下，tmf1突变体的短小果荚不含种子。

c.低温条件下tmf1突变体植株完全恢复育性。

d-f.比较野生型，tmf1(24℃)和tmf1(17℃)果荚的种子；野生型(d)和tmf1(17℃)(f)是有许多可育果荚，但是tmf1(24℃)(e)的短小果荚中没有种子。

g-i.野生型和tmf1突变体花药的亚历山大染色。野生型(g)和tmf1(17℃)(i)花药中充满了紫色有活力的花粉，然而，在tmf1(24℃)花药(f)中只有绿色的残余表明花粉败育。Bar＝100um。

j.17℃不同持续时间处理下tmf1突变植株恢复可育果荚的数量。

k.在不同温度处理下tmf1突变植株可育表型的变化，24℃时果荚短小不育，在17℃处理时果荚恢复育性，将突变体重新置于24℃时突变体又呈现不育表型。

l.在不同植物生长阶段的低温处理，表明只有当生殖器官出现时突变体育性才能被低温所恢复。

图2显示tmf1突变体育性恢复的临界温度以及恢复时间

a.tmf1育性恢复的临界温度以及在不同温度下的tmf1可育恢复率；b.低温处理后tmf1育性恢复的时间。

图3显示恢复突变体花粉发育阶段的半薄切片分析

野生型(a)和tmf1(24℃)(b)以及tmf1(17℃)(c)花药的半薄切片。在第7期花药中，野生型和tmf1(24℃或17℃)突变体花药没有可观察到的区别。在第8期，野生型和tmf1(24℃或17℃)突变体药室中，小孢子成功的从四分体中释放。在第9期，在tmf1(24℃)中有些小孢子开始降解，然而在tmf1(17℃)中的小孢子与野生型的一致。在第10期，大多数tmf1(24℃)的小孢子细胞质皱缩且降解。然而，tmf1(17℃)中大部分恢复的小孢子较为正常。在第11期，大多数tmf1(24℃)的小孢子在药室中降解，而除了个别败育的小孢子tmf1(17℃)中的花粉粒出现。在第12期，tmf1(17℃)中出现成熟花粉粒，但是在tmf1(24℃)仅有降解的细胞残余紧贴于药室内壁。E,表皮层；En,药室内壁；ML,中间层；Msp,小孢子；PG,花粉粒；RM,残余；T,绒毡层；Tds,四分体。Bar＝20um。

图4显示恢复突变体花粉发育阶段的扫描电镜分析

野生型和tmf1(24℃或17℃)突变体花粉发育的扫描电镜观察。野生型与恢复植株tmf1(17℃)的成熟花药中含有许多正常的花粉,外壁结构正常。而tmf1(24℃)突变体中则没有花粉。

图5显示恢复突变体花粉发育阶段的透射电镜分析

野生型(a)和tmf1(24℃)(b)以及tmf1(17℃)(c)花粉发育的超显微结构。在第7期野生型和tmf1(24℃或17℃)突变体的四分体发育正常。突变体中的初生外壁沉积与野生型一致。在第8期，野生型和tmf1(17℃)中释放的小孢子形成外壁外层，而tmf1(24℃)中小孢子则开始出现微弱降解。在第9期(即空泡期)，tmf1(24℃)小孢子破碎并伴随细胞质泄漏但仍拥有正常外壁形式。相反，tmf1(17℃)的小孢子则克服了这一缺陷。在第12期，tmf1(17℃)的成熟花粉粒拥有内壁和外壁。Ba,柱状结构；I,内壁；Msp,小孢子；Ne,外壁内层；PC,花粉包被；PG,花粉粒；RM,残余；Tc,顶盖结构。Bars＝5um。

图6显示TMF1编码一个膜定位的具有GDSL结构域的酯酶

a.tmf1突变体的精细定位区间。

b.tmf1基因结构信息以及突变体的突变位点。

c.tmf1蛋白的突变位点以及保守结构域(SEQIDNO.:1)。

图7显示TMF1在绒毡层和小孢子母细胞中高效表达

a.tmf1在花药绒毡层和小孢子母细胞中高效表达，Rt,根；St,茎；Lf,叶；Inf,花序；Sl,幼苗；SP,造孢细胞；MMC,小孢子母细胞；T,绒毡层；MC,减数分裂细胞；Tds,四分体；PG,花粉粒。

b.亚细胞定位表明该蛋白定位在细胞膜上。

图8显示TMF1蛋白具有酯酶活性

a.原核表达的野生型TMF1以及突变体TMF1(T90I)的蛋白。

b.以p-NPB为底物，对以上两个纯化蛋白的酶活测定。

c.利用GC/MS技术，以甘油三酯为底物，鉴定TMF1的酯酶/水解酶活性。第28min的峰值产物为十六烷脂肪酸。

图9显示TMF1表达并不受到温度的诱导

a.野生型(24℃/17℃)和tmf1突变体(24℃/17℃)花序RNA中的TMF1定量RT-PCR。

b.野生型(24℃/17℃)和tmf1突变体(24℃/17℃)中TMF1的Westernblot实验。

c.以p-NPB为底物，对TMF1以及TMF1(T90I)纯化蛋白在不同温度下的的酶活测定。

图10显示TMF1和共表达基因不涉及育性恢复的过程

a.野生型(24℃/17℃)和tmf1突变体(24℃/17℃)中8个TMF1共表达的同源基因的定量RT-PCR。

b.tmf1at1g52570和tmf1at3g55190的双突变分析。

c.以p-NPB为底物，野生型(24℃/17℃)和tmf1突变体(24℃/17℃)中花絮分离总植物蛋白的酶活实验。

图11显示低温延缓了花粉膨胀期的生长速度

a.花粉发育可分为四个时期(小孢子释放期，单核细胞期，双核细胞期和三核细胞期)。左图展示了不同时期花苞的大小。在不同时期小孢子发育的大小则位于右图上方。这些小孢子的DAPI染色揭示了它们的发育阶段并在右图下方加以展示。

b.在不同发育时期野生型小孢子大小的统计分析。

c.在不同外界温度下野生型小孢子的平均生长速率。

图12显示缩短光周期同样延缓了花粉膨胀期的生长速度

a.tmf1突变体植株可通过光周期调节恢复育性(左图)。在光培养16小时/暗培养8小时的条件下，亚历山大染色表明tmf1突变体中仅有绿色败育花粉(右下)。而在光培养8小时/暗培养16小时的条件下则出现紫色活力花粉(右上)。

b.在不同光周期条件下tmf1突变体植株的育性恢复率。

c.将光照周期与温度结合进行的育性转换统计数据。

图13显示不同物种中tmf1基因的蛋白序列相似性以及进化分析

a.蛋白序列比对表明TMF1直系同源基因的氨基酸序列非常保守，大多在60％以上。

b.进化分析表明，不同物种中的直系同源基因在双子叶植物和单子叶植物有清晰的分岔，有共同的起源。

图14显示了野生型水稻TMF1-MBP重组蛋白的表达及活性，

a.水稻TMF1-MBP重组蛋白的电泳检测结果；

b.重组蛋白的活性检测结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，对于某些特定的植物不育系，通过调控花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性，可以调控所述植株的育性，实现不育性与育性之间进行可控的转换。本发明人还开发了相应的培育植物不育系等多种在农业育种等方面有广泛应用价值的技术。在此基础上完成了本发明。

在实验中，申请人发现拟南芥TMF1基因(THERMOSENSITIVEMALEFERTILITY1)编码了一个GDSL的酯酶并参与到花粉发育中的脂类代谢过程中，该基因的缺失使得突变体在正常生长条件下(24℃，16小时光照/8小时黑暗)显示完全不育的表型。而低温和短日照减缓了花粉的生长速度和脂类代谢过程，使突变体克服了该基因的缺失造成的脂类代谢缺陷，使花粉安全度过快速膨胀期。

GDSL酯酶及其编码序列

GDSL酯酶是一类在不同物种中都存在的超家族蛋白，在水解和合成酯类化合物中起重要作用(Akohetal.,2004；Bricketal.,1995)。在植物中，目前有一些酯酶的功能被报道与抗逆，形态发育有关(Cameraetal.2005；Ohetal.2005)。如在番茄种子萌发以及康乃馨花瓣衰亡中都有酯酶基因的表达(Matsuietal.2004；Hongetal.2000)。目前，还没有与花粉发育相关的GDSL酯酶被报道。

适用于本发明的花粉发育相关的GDSL酯酶没有特别限制，可以是来自任何植物品种，代表性的植物包括，但并不限于：

水稻(基因号：OS02G0290900与拟南芥直系同源TMF1蛋白同源性为59％)、玉米(基因号：GRMZM2G166330与拟南芥直系同源TMF1蛋白同源性为59％)、高粱(基因号：Sb04g011320与拟南芥直系同源TMF1蛋白同源性为58％)、小麦(基因号：Traes_1BL_8D2A7532F与拟南芥直系同源TMF1蛋白同源性为58％)、大豆(基因号：GLYMA01G43590与拟南芥直系同源TMF1蛋白同源性为71％)。

在图13中，Os为水稻、At为拟南芥、Sb为高粱、Ta为小麦、Zm为玉米、Gm为大豆；从图13不同物种中TMF1基因的蛋白序列相似性以及进化分析中可以看出该基因在不同物种中的的保守性较强，拟南芥中该基因的突变会造成不育性状，因此，对该基因进行分子遗传操作将可以用于培育其它物种的不育系。

拟南芥TMF1蛋白序列：

1MSIKLLVLVFSLLIIFTRPKLIADHHLTTRISPIYPSISTFQPSIPPFLP

51PSPSRRAQSPTVKPSLPFVPALFVFGDSSVDSGTNNFLGTLARADRLPYG

101RDFDTHQPTGRFCNGRIPVDYLGLPFVPSYLGQTGTVEDMFQGVNYASAG

151AGIILSSGSELGQRVSFAMQVEQFVDTFQQMILSIGEKASERLVSNSVFY

201ISIGVNDYIHFYIRNISNVQNLYTPWNFNQFLASNMRQELKTLYNVKVRR

251MVVMGLPPIGCAPYYMWKYRSQNGECAEEVNSMIMESNFVMRYTVDKLNR

301ELPGASIIYCDVFQSAMDILRNHQHYGFNETTDACCGLGRYKGWLPCISP

351EMACSDASGHLWWDQFHPTDAVNAILADNVWNGRHVDMCYPTNLETMLHS

(SEQIDNO.:1)

编码拟南芥TMF1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:7所示。

水稻TMF1蛋白序列：

1MALPFLLLLAFALLFPLSAPPRCCSAAPASSPPPSPPPSPAAAAAAPRRT

51PLVPALFVIGDSTADVGTNNYLGTLARADREPYGRDFDTRRPTGRFSNGR

101IPVDYIAEKLGLPFVPPYLEQNMRMGVGSVDLSNIDGMIQGVNYASAAAG

151ILSSSGSELGMHVSLSQQVQQVEDTYEQLSLALGEAATTDLFRKSVFFFS

201IGSNDFIHYYLRNVSGVQMRYLPWEFNQLLVNAMRQEIKNLYNINVRKVV

251MMGLPPVGCAPHFLWEYGSQDGECIDYINNVVIQFNYALRYMSSEFIRQH

301PGSMISYCDTFEGSVDILKNRDRYGFLTTTDACCGLGKYGGLFMCVLPQM

351ACSDASSHVWWDEFHPTDAVNRILADNVWSGEHTKMCYPVDLQQMVKLK

(SEQIDNO.:2)

编码水稻TMF1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:8所示。

高粱TMF1蛋白序列：

1MAVAPLLTLLLLLFLSGSGPRRCSAAATANSTSSPSPPPRPAPLVPALFV

51IGDSTADVGTNNYLGTLARADREPYGRDFDTHRPTGRFSNGRIPVDYIAE

101RLGLPFVPPYLEQNMRTGAADVGLTSIDGMIQGVNYASAAAGIISSSGSE

151LGMHVSLTQQVQQVEDTYEQLSLALGEAAVANLFRRSVFFVSIGSNDFIH

201YYLRNVSGVQMRYLPWEFNQLLVSTMRQEIKNLYDINVRKVILMGLPPVG

251CAPHFLEEYGSQTGECIDYINNVVIEFNYALRHMSSEFISQHPDSMISYC

301DTFEGSVDILNNREHYGFVTTTDACCGLGKYGGLIMCVLPQMACSDASSH

351VWWDEFHPTEAVNRILADNVWSSQHTKMCYPLDLQQMVKLKL

(SEQIDNO.:3)

编码高粱TMF1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:9所示。

小麦TMF1蛋白序列

1MAPSLAHLVCLLLLLLLLLSALPLSAAASTPRSAPPSAPPTPLVPALFVI

51GDSTSDVGTNNYLGTLARADREPYGRDFDTHRPTGRFSNGRIPVDYLAEK

101LGLPFVPPYLEQSMRMGGGGVGLSNIGGMIQGVNYASAAAGILSSSGSEL

151GMHVSLTQQVQQVEDTYEQLALALGEAATVDLFRRSVFFVSIGSNDFIHY

201YLRNVSGVQMHYLPWEFNQLLVNAVRQEIKNLYNINVRKVVLMGLPPVGC

251APHFLSDYGSQNGECIDYINNVVIEFNYGLRHMSSEFIRQYPDSMISYCD

300TFEGSVDILENRDRYGFLTTTDACCGLGKYGGLFICVLPQMACSDASSHV

351WWDEFHPTDAVNRILAENVWSGEHTRMCYPVNLQEMVKLKQ

(SEQIDNO.:4)

编码小麦TMF1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:10所示。

大豆TMF1蛋白序列：

1MMSVRVIVYLLSTVLVVSSTFVESRALLQFQDPSPPSTAPSSSPVPLAPA

51LFVIGDSSVDCGTNNFLGTFARADHLPYGKDFDTHQPTGRFSNGRIPVDY

101LALRLGLPFVPSYLGQTGAVEDMIQGVNYASAGAGIILSSGSELGQHISL

151TQQIQQFTDTLQQFILNMGEDAATNHISNSVFYISIGINDYIHYYLLNVS

201NVDNLYLPWHFNHFLASSLKQEIKNLYNLNVRKVVITGLAPIGCAPHYLW

251QYGSGNGECVEQINDMAVEFNFLTRYMVENLAEELPGANIIFCDVLEGSM

301DILKNHERYGFNVTSDACCGLGKYKGWIMCLSPEMACSNASNHIWWDQFH

351PTDAVNAILADNIWNGRHTKMCYPMNLEDMVNRMAR

(SEQIDNO.:5)

编码大豆TMF1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:11所示。

玉米TMF1蛋白序列：

1MAVAPLFALLVLFLSGPRRCAAAAAAAAAAASPSSPSPSPRPAPLVPALF

51VIGDSTADVGTNNYLGTLARADREPYGRDFDTHHPTGRFSNGRIPVDYIA

101ERLGLPFVPPYLEQSMRTGAGGVGLTNIDGMIQGVNYASAAAGIISSSGS

151ELGMHVSLTQQVQQVEDTYEQLSLALGEAAAGNLFRRSVFFVSIGSNDFI

201HYYLRNVSGVQMRYLPWEFNQLLVSTMRQEIKNLYDINVRKVILMGLPPV

251GCAPHFLEEYGSQTGECIDYINNVVIEFNYALRHMSREFISQHPDSMISY

301CDTFEGSVDILNNREHYGFVTTTDACCGLGKYGGLIMCVLPQMACSDASS

351HVWWDEFHPTDAVNRILADNVWSSQHTKMCYPLDLQQMVKLKL

(SEQIDNO.:6)

编码玉米TMF1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:12所示。

在一方面，本发明提供一种培育植物不育系的方法，包括步骤：降低所述植物植株中花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性。

术语“GDSL酯酶”、“GDSL多肽”、“GDSL蛋白”等可互换使用，指具有GDSL蛋白氨基酸序列(如SEQIDNO:1-6)的蛋白或多肽。在未特别指出时，术语“GDSL蛋白”包括野生型和突变型GDSL蛋白。

本发明的GDSL酯酶可包含SEQIDNO:1-6所示氨基酸的序列。然而，不限于此，因为根据植物种类或品种，该蛋白的氨基酸序列可能有所不同。换言之，其可以是突变型蛋白或人工变体，所述突变型蛋白或人工变体的氨基酸序列在SEQIDNO:1-6所示氨基酸序列的一个或多个位置包含一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加，只要有助于通过弱化该蛋白的活性而培育植物不育系。本文的“几个”可根据蛋白中氨基酸残基的三维结构的位置或类型而有所不同，但尤其表示2-20，特别是2-10，更特别是2-5。此外，根据植物的个体或种类，氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置包括人工变体或天然突变所致的那些。

可通过以下方式降低(弱化)本发明GDSL酯酶的活性：1)编码该蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失，2)修饰表达调控序列以降低该多核苷酸的表达，3)修饰染色体上的序列或4)它们的组合。

在上文中，可利用染色体基因插入的载体，通过将编码内源性靶蛋白的多核苷酸替换为标记基因或部分核苷酸序列缺失的多核苷酸来实施编码蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失。“部分”缺失的长度可根据多核苷酸的种类而有所不同，但尤其是2bp-300bp，更特别是2bp-100bp，更特别是1bp-5bp。

还可通过以下方式修饰表达调控序列来降低多核苷酸表达：通过核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它们的组合在表达调控序列中诱导突变以进一步弱化表达调控序列的活性，或将表达调控序列替换成活性更低的序列。表达调控序列包括编码启动子的序列、操纵子序列、核糖体结合位点和控制转录和翻译终止的序列。

此外，可通过以下方式修饰染色体上的多核苷酸序列以弱化蛋白的活性：通过核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它们的组合在序列中诱导突变以进一步弱化该序列的活性，或将多核苷酸序列替换成经修饰的序列以便获得更弱的蛋白活性。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的GDSL蛋白或多肽”是指GDSL蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化水稻等植物中GDSL蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括GDSL蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GDSL蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：

(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；

(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；

(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；

(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。

根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明的优选地实施方式中，“GDSL蛋白”或“GDSL多肽”序列如SEQIDNO:1-6所示。该术语还包括具有与GDSL蛋白相同功能的、SEQIDNO:1-6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GDSL蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度的条件下能与GDSL蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GDSL蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GDSL蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有GDSL蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“GDSL保守性变异多肽”指与SEQIDNO:1-6所示的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala

[0194]

His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:7-12所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:1-6的蛋白质，但与SEQIDNO:7-12所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQIDNO:1-6的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

在一个优选地实施方式中，所述的GDSL多肽的编码序列选自下组：(1)编码如SEQIDNO:1-6所述多肽的多核苷酸序列；(2)如SEQIDNO:7-12所示的多核苷酸序列；(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码该多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:1-6所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GDSL蛋白的多聚核苷酸。

本发明的GDSL蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GDSL蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的水稻GDSL蛋白。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码GDSL蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，GDSL蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GDSL蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐受性改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用GDSL蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GDSL蛋白的转录产物。

花粉发育

植物中不同器官特异表达的脂酶基因也提示了其在植物发育中脂酶对调控脂质代谢起到重要的作用(Bricketal.1995Huetal.,2003)。作为水解酶的脂酶可催化切去单个，双个和三个甘油以释放脂肪酸和醇类(AngkawidjajaandKanaya2006)。酶活反应提示了TMF1拥有功能性的脂酶活性，从而通过脱脂作用来水解单个脂分子，在花粉发育中，细胞膜的快速生长需要许多额外的原料补给包括游离脂肪酸以供膜合成使用我们推测其可能参与到了小孢子细胞膜的脂类代谢当中，为细胞膜的合成提供脂分子原料。

本发明的主要优点包括：

(a)提供了一种通过降低植物中花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性来创制植物不育系的方法。

(b)提供了一种通过降低花粉细胞膜合成速度、和/或延缓花粉发育速度来使不育植株的性状转化为可育的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)或植物分子生物学-实验手册(PlantMolecularBiology-ALaboratoryMannual,MelodyS.Clark编,Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料与方法

植物材料与种植

本发明中拟南芥材料为Lersbergerecta背景。EMS突变株的诱变和筛选参照Zhangetal.2007。4℃条件下，种子预萌发于0.1％琼脂糖培养基上72小时。植物材料培养于蛭石中，培养条件则为：室温24℃，光培养16小时/暗培养8小时(正常条件),直至抽苔。之后，抽苔株转移至光照培养箱中低温培养(17℃-22℃)。对于不同光周期，抽苔株在室温24℃下，分别于光培养12小时/暗培养12小时；光培养10小时/暗培养14小时或者是光培养8小时/暗培养16小时进行处理。

原生质体分离与转染

拟南芥原生质体分离和转染步骤可参考(YOOetal.2007)。以野生型植株为模板，克隆TMF1的全长cDNA片段(不包括终止密码子)，用于GFP标签的融合。PCR产物克隆至带有eGFP标签的PMON530载体上，然后转染至新鲜分离的拟南芥原生质体中。转染后的原生质体培养在23℃黑暗条件下20个小时。最终，利用ZEISS共焦激光扫描显微镜进行观察(LSM5PASCAL；ZEISS,http://www.zeiss.com)。

细胞学分析

用尼康数码相机(D-7000)拍摄植物材料。亚历山大染色与DAPI染色可参考Alex和er,1969；Rossetal.,1996。对于半薄切片，选取花苞不同发育阶段进行固定并包埋于Spurr环氧树脂中(具体方法可参考Zhangetal.,2007)。使用PowertomeXL(RMCProducts,Tucson,Arizona,USA)切片机进行每1μm切片并用甲苯胺蓝进行染色。使用OlympusDX51数码相机(Olympus,Japan)进行花药切片的拍摄。将8nm金颗粒包裹新鲜雄蕊和花粉粒材料进行扫描电镜实验，并利用JSM-840显微镜(JEOL,Japan)观察。对于透射电镜实验，将拟南芥花絮冰上固定于固定液中(配方是：含有2.5％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液，pH7.2)。花苞材料则进一步依次包埋至树脂(‘HardPlus’EmbeddingResin,UniteKingdom)中(具体方法可参考Zhangetal.,2007)。超薄切片(50-70nm)则利用JEM-1230透射电子显微镜(JEOL,Japan)进行观察。

RNA抽提和定量RT-PCR

总RNA可利用Trizol试剂(Invitrogen,USA)由成熟土培拟南芥植物花组织进行提取。利用poly-dT(12–18)引物；MMLV反转录酶和相应试剂将5μg的RNA反转第一条cDNA链(60分钟，42℃)。合成好的cDNA链作为PCR的模板。定量RT-PCR则是利用SYBRGreenImastermix(Toyobo,Japan)通过ABIPRISM7300系统(AppliedBiosystems,USA)进行检测。定量RT-PCR的程序参数是：95℃5分钟，94℃10秒变性40个循环,60℃退货延伸1分钟。定量RT-PCR中所使用的引物列表于电子版的附件中。β-Tubulin则作为对照。

原位杂交

根据digoxigenin(DIG)RNA标记试剂盒和PCRDIG引物合成试剂盒(Roche)说明书进行非放射性RNA原位杂交实验。利用TMF1特异引物扩增cDNA片段。PCR产物克隆至pSK载体并测序(Stratagene)。质粒DNA完全由HindIII和BamHI进行彻底消化，并以此作为模板利用T3或是T7RNA聚合酶分别进行转录。利用OlympusDP70数码相机进行图片拍摄。

植物内源性酶活实验

利用植物蛋白提取试剂(ThermoScientificProd#89803,USA)将不同光周期和温度下花苞组织的蛋白进行提取。无色底物p-nitrophenolbutyrate(p-NPB)溶解于20mM的异丙醇中。按1:10轻摇稀释phosphate-TritonX-100缓冲液，直至溶液澄清并达到稳定乳状液。混合液(50ul)分配至比色皿中，且分别在24℃和17℃预孵育15分钟。含有植物总蛋白(0.08ug/ul,50ul)的每份酶液准备于50mM磷酸缓冲液中(pH724℃/17℃)，然后加入底物混合液使反应体系至100ul，并在24℃/17℃条件下再孵育15分钟。利用分光光度计(BIO-RADModelSmartSpectmPlus)在吸光度405处检测p-NP的黄色反应产物。最后，将总吸光度扣除空白吸光度(不含植物酶的反应混合物)以此计算得到相应酶活。

GC-MS分析游离脂肪酸

对于每份花苞样本(野生型24℃/17℃,tmf1突变体24℃/17℃)取50mg的新鲜组织，放置于聚四氟乙烯的螺帽玻璃管中。加入1ml含有2.5％硫酸的甲醇。样本于80℃加热1小时并在室温冷却。之后依次加入500μL戊烷，1.5mL0.9％NaCl来提取脂肪酸甲酯(FAME)。剧烈摇晃然后离心以辅助分层。转移部分上层相(含戊烷的脂肪酸甲酯)至一个注射小瓶中。反应混合物通过TraceGC–PolarisQ(Finnigan-spectronex)质谱仪配进行分析。典型的质谱条件可是分流式注入或不分流式注入；火焰电子检测器温度为240℃；烘箱的温度程序是60℃2分钟，10℃/min至240℃,保持此温度30分钟。

实施例1拟南芥tmf1突变体的不育表型在低温条件下得以恢复

发明人利用EMS化学诱变的方式从拟南芥Ler生态型中分离到了tmf1-1突变体。同时，在拟南芥Col生态型的T-DNA插入突变体库中筛选到一个外显子插入的突变体tmf1-2。在正常的环境温度下(24℃)，纯合的tmf1突变体的营养生长正常，但育性丧失，只有短小无种子的果荚(图1b和e)。遗传分析表明tmf1突变体属于孢子体雄性不育，受到单基因隐性位点控制(Yietal.,2006)。申请人将tmf1突变体在24℃培养至抽薹，将其移入17℃连续培养，其后续的果荚皆恢复育性(图1c和f)。在同样低温条件下，野生型植株的并没有受到影响(结果未显示)。亚历山大染色显示低温条件下突变体的花粉被染成紫红色，与野生型相同(图1i)，而正常条件下的突变体花药内并无可育花粉(图1h)。这个结果说明低温能够弥补tmf1突变体中的雄配子体发育缺陷。

为了验证低温是否影响突变体育性，申请人将抽薹的tmf1植株在17℃分别处理1-5天，随后移回24℃。如图所示，恢复的可育果荚的数量随着处理时间的延长而增加(图1j,k)，表明育性的恢复与低温的持续处理呈正相关。为了测定临界温度，申请人将tmf1突变体分别置入17,18,19,20,21,22,23℃进行培养并观察育性恢复情况，结果表明在17-20℃的条件下，突变体全部恢复育性，而在21℃和22℃的条件下育性分别降低至85％和48％，更高的温度则会导致完全不育(图2a)。然而，申请人的观察发现在环境温度22℃以下时，相对高的温度能够较早地恢复植物的育性(图2b)。同时，为了研究其低温恢复的发育节点，申请人将不同发育阶段的tmf1突变体(分别为6,12,18,24和30天的植株)转移至低温条件下各培养5天。结果表明在抽薹的植株中，低温处理能够恢复育性(24以及30天的植株)，而较早发育阶段的植株仍然不育。因此，申请人推断只有在花序形成后，低温才能对育性恢复产生影响(图1l)。

实施例2低温能够弥补tmf1突变体中从四分体释放后的小孢子发育缺陷

为了确定tmf1突变体在花粉发育中的缺陷，申请人进行了花药半薄切片。在野生型中，在第6和7期，小孢子母细胞经历减数分裂形成四分体(S和ersetal.,1999)。随后，小孢子从四分体释放，并逐渐形成了有正常花粉壁的三核花粉粒(图3a)。在常温条件下(24℃)的tmf1突变体中，直到花药发育第7期突变体和野生型没有观察到可见差异，这表明突变体雄配子体减数分裂不受影响(图3b)。至花药发育第8期，tmf1小孢子从四分体释放，与野生型相比，呈现不规则的肿胀表型。第9期，大部分tmf1小孢子开始降解，随后，小孢子的细胞质收缩和瓦解。最终，药室内只有一些败育花粉的碎片，并没有正常的花粉形成(图3b)。另一方面，在低温状态下(17℃)，tmf1小孢子在第8期的肿胀表型仍然存在。但在后续的发育阶段，大部分小孢子并没有破裂降解，而逐渐恢复正常，最后除去一小部分的败育花粉外，低温下的药室中产生了正常的成熟花粉粒(图3c)。

扫描电镜显示，tmf1突变体在常温条件下(24℃)的药室中没有花粉粒，但其在低温条件下的花粉粒数量与结构与野生型基本一致(图4)。TEM观察表明在tmf1小孢子的细胞完整性在低温条件下得以恢复(图5c)。在四分体时期，在不同条件下，tmf1小孢子质膜波浪型起伏与野生型相比都较为正常，表明花粉外壁沉积的模式并没有受到影响(图5b)。在小孢子释放时期，野生型和tmf1的小孢子都形成了较为正常的柱状和顶盖结构构成花粉外壁(图5a和5c)。在小孢子环形空泡化(ring-vacuolated)时期，在正常温度(24℃)下，tmf1小孢子的外壁结构仍然较为规则，但其细胞质已明显泄漏，这导致了小孢子后期的破裂降解。这个结果表明，尽管小孢子的外壁正常形成，但该基因的缺失导致了细胞膜完整性受损。在低温条件(17℃)下，tmf1小孢子花粉细胞质保持稳定(图5c)，表明低温能够克服tmf1突变所带来的细胞膜完整性缺陷。

实施例3TMF1基因编码了一个在绒毡层及小孢子母细胞特异表达的膜定位的GDSL酯酶

在先前的研究中，申请人已经将TMF1基因精细定位到拟南芥第四条染色体的49.5Kb的区域上。在本工作中，申请人利用超过3000不育后代突变体，将TMF1基因定位于13kb的包括8个基因的区域(图6a)。其中At4g10950基因编码一个GDSL酯酶/水解酶家族蛋白。在tmf1突变体中，在该基因的第一个外显子检测到一个ACC到ATC突变(苏氨酸突变为异亮氨酸)的单核苷酸突变。根据Phosphat数据库(http://phosphat.mpimp-golm.mpg.de/)的预测，这个突变的苏氨酸是一个假定的磷酸化位点。对于T-DNA插入突变体tmf1-2，申请人使用了TAIL-PCR的方法,对扩增出的边界序列进行了测序，发现tmf1-2突变体的最后一个外显子存在T-DNA插入(图6b)。申请人利用了遗传互补实验进一步进行验证。克隆了At4g10950基因组片段，包括上游启动子区和下游区域，利用农杆菌介导转化入tmf1/+杂合的植株。鉴定显示9个转基因株系中的7株为tmf1/tmf1背景，这些植株在正常温度(24℃)下恢复了育性形成了正常的果荚。这表明At4g10950就是TMF1，用于互补的基因组片段包含了足够的遗传信息来执行TMF1的生物学功能。

TMF1基因编码了一个含有404个氨基酸大约45kDa的蛋白。结构域分析表明TMF1蛋白属于含有GDSL结构域的一个酯酶/水解酶家族，具有4个保守的区域(I,II,III,V)(图6c)，这些结构域对于该酶的催化活性有重要作用。申请人构建了35s启动子驱动的TMF1蛋白C端融合GFP的载体，转化入拟南芥的原生质体，利用激光共聚焦显微镜来观察TMF1的亚细胞定位。结果显示GFP的荧光在原生质体的细胞膜上表达(图7b)。而在阳性对照35S::GFP中，荧光充斥在整个细胞中。然而，序列分析表明TMF1蛋白并不具有跨膜结构域，因此，申请人猜测这个蛋白被分泌到细胞膜上。利用半定量的RT-PCR技术，申请人检测了根，茎，叶，花和幼苗中TMF1的相对表达，结果显示TMF1在花序中高效表达(图7a)。为了检测其在花药发育中的时空表达，申请人采用了原位杂交技术，结果表明TMF1在花药发育第4期开始表达，减数分裂期在绒毡层和小孢子母细胞中达到最高峰，随后开始逐渐减少(图7a)。上述的突变体细胞学分析显示，突变体小孢子的缺陷也是从四分体释放时期开始，这与TMF1表达结果一致。

实施例4TMF1蛋白具有酯酶活性，但其并不受到温度诱导

为了检测TMF1蛋白是否具有酯酶活性，申请人利用原核表达系统对其进行表达纯化。由于tmf1-1突变体为点突变，申请人同时克隆了野生型TMF1和突变体的TMF1(T90I)基因进行原核表达(图8a)。以p-nitrophenylbutyrate(p-NPB)为底物，对这两个纯化的蛋白进行了酶活测定，结果发现突变体TMF1(T90I)蛋白的活性相比野生型蛋白降低了约50％的活性(图8b),表明该突变位点对酶活的影响较大。此外，申请人利用GC/MS技术进一步验证其酯酶的功能，将甘油三酯(Triglyceride)作为底物与野生型的TMF1进行孵育后，检测结果发现TMF1能够剪切甘油三酯中的脂肪酸链产生十六烷酸(hexadecanoicacid)(图8c),表明其参与到花粉发育中的脂类代谢过程。

为了阐明tmf1突变体温敏的机制，申请人对不同温度条件下的野生型和突变体花苞中的TMF1转录与蛋白水平进行了检测。定量PCR检测表明，常温(24℃)与低温(17℃)条件下突变体和野生型的TMF1在转录水平上没有显著差异(图9a)。进一步的Westernblot检测发现，其蛋白水平上也没有明显的变化(图9b)，这些结果表明TMF1并不受到不同温度的诱导表达。此外，在不同温度条件下，申请人分别测定了野生型TMF1以及突变TMF1(T90I)蛋白的酶活，结果发现随着环境温度的降低，两者的酶活也逐渐降低，在17℃时酶活基本持平(图9c)。同时，为了鉴定是否存在GDSL家族基因的补偿机制，申请人选取了9个在花药共表达的TMF1同源蛋白进行了不同条件下的转录水平检测。结果显示其中5个并没有明显的变化(图10a)。在剩下的4个差异表达基因中，申请人从SIGnAL突变体库(Alonsoetal.,2003)中获得了其中两个基因的T-DNA突变体。这两个突变体分别与tmf1-1构建双突变后发现，双突变体的不育性状在低温时仍然可以恢复(图10b)。为了检测其他同源补偿机制，申请人提取了野生型和突变体的花序总蛋白进行p-NPB酶活实验，结果显示野生型总蛋白的活性在常温(24℃)时较高，低温(17℃)时显著降低。而突变体总蛋白活性在常温时已经降低，在低温时也并没有恢复(图10c)。这些结果表明，在低温条件下，拟南芥花粉发育过程中对于酯酶并不非常依赖，并且在同源补偿机制与育性的恢复没有直接的联系。

实施例5较低的环境温度会导致拟南芥的花粉发育速度减缓

上述的细胞学观察表明在常温(24℃)下大多数tmf1突变体小孢子在环形空泡期降解。早期的文献表明拟南芥花粉在成熟过程中体积不断增大。申请人推测在tmf1突变体中，小孢子由于不能渡过快速膨胀过程而导致花粉破裂和败育。因此，申请人测定了野生型的小孢子在雄配子体发生过程中的表面积，根据花苞的大小初步将花粉发育过程分为4个时期：小孢子释放期(releasedstage)，单核花粉期(uninucleatestage)，双核花粉期(bicellularstage)以及三核花粉期(tricellularstage)(图11a)。数据统计结果表明小孢子从四分体释放后的表面积大约为500um²。而经过第一次有丝分裂后，双核期的小孢子表面积大约扩大了2倍。当形成三核花粉后，花粉表面积增大到了2300um²(图11b)。同时，申请人统计了不同温度下各个时期的生长速度，结果显示在常温条件(24℃)下从小孢子释放期到单核花粉期的小孢子生长速度约为8.6um²/hr；从单核花粉期到双核花粉期的小孢子生长速度约为38.9um²/hr，细胞学分析显示，大多数tmf1小孢子的破裂存在于这个阶段；而双核花粉期到三核花粉期的速度为33.7um²/hr。然而，在低温条件(17℃)下，第二阶段的生长速度下降了大约3倍(图11c)。经测定生长速度在野生型和tmf1突变体中是相近的。因此，这个结果暗示低温所延缓的生长发育时间是弥补tmf1小孢子缺陷的重要原因。

实施例6光敏感性育性转换现象同样存在于tmf1中

早期的研究发现在长日照培养条件下植物生殖器官的发育要快于短日照(Ebling,1994；Zhuetal.,1997)。因此，申请人猜测在短日照条件下tmf1小孢子的发育缺陷是否能够恢复。申请人在常温条件下(24℃)，长日照(16小时光照8小时黑暗/16L8D)培养tmf1突变体至抽薹阶段随后将其置入短日照(8小时光照16小时黑暗/8L16D)培养5天。结果显示突变体的育性同样得到了恢复。亚历山大染色实验表明在长日照的条件下突变体花药内没有花粉但在短日照条件下有一定量的花粉形成(图12a)。申请人进一步检测了常温条件下在10小时光照14小时黑暗(10L14D)以及12小时光照12小时黑暗条件下的育性恢复情况，发现仍有80％以上的植株恢复育性(图12b)。这些结果揭示了tmf1在短日照条件下的育性恢复机制类似于低温处理的机制。随后，申请人综合了温度和光照条件进行了实验，首先申请人降低了环境温度但延长了光照时间，发现在21℃，20L4D条件下有68％的植株恢复育性，而在同样温度22L2D条件下恢复率下降到30％以下。而在高温(27℃)下，8L16D的光照周期培养的突变体只有30％恢复育性，而在10L14D的光照周期培养的突变体育性恢复率仅有9％(图12c)，这些结果表明对于TMF1突变体来说，环境温度相对于光照周期对育性的恢复起到更重要的作用。

实施例7水稻中TMF1蛋白同样具有酯酶活性

根据GenBank数据库的序列比对信息，TMF1几乎在所有陆生植物中植物中皆有直系同源蛋白，而在绿藻中没有直系同源的存在。申请人选取了拟南芥，水稻，高粱，玉米和大豆的蛋白序列进行了同源性比对，结果显示GDSL结构域在陆生植物中高度保守(图13a)。基于neighbor-joining方法分析得出的无根进化树显示，不同物种中的直系同源基因在双子叶植物和单子叶植物有清晰的分岔，并有共同的起源(图13b)。

由于不同植物中TMF1蛋白的同源性较高，申请人克隆了野生型水稻中的OsTMF1(OS02G0290900)基因，并将其构建在p-C5x原核表达载体上。利用原核表达系统对TMF1-MBP重组蛋白进行表达并纯化。结果显示加入IPTG后，在70KD处有明显的条带(图14a)。为了检测OsTMF1蛋白是否具有酯酶活性，申请人以p-nitrophenylbutyrate(p-NPB)为底物，对纯化的重组蛋白(0.5ug)进行了酶活测定，A405nm的吸光度测定发现OsTMF1蛋白能够水解p-NPB并随着与孵育时间成正相关(图14b)。

根据上述的实验结果可以确定，水稻的TMF1蛋白同样具有酯酶活性，降低水稻中TMF1蛋白的表达或活性可以培育水稻不育系。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims

1.一种培育植物不育系的方法，其特征在于，包括步骤：降低所述植物植株中花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GDSL酯酶为TMF1或其同源蛋白；优选地，所述TMF1的野生型氨基酸序列选自下组：SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:6。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GDSL酯酶是在选自下组的细胞、组织或器官中特异性表达的：植物花序以及花药中。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降低植物植株中花粉发育相关的GDSL酯酶活性的方法包括：使GDSL酯酶编码基因的表达水平下降、和/或使GDSL酯酶活性下降。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括农作物、林业植物、花卉；优选地包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更优选地包括水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥。

6.一种花粉发育相关的GDSL酯酶或其编码基因的用途，其特征在于，用于培育植物不育系、或用于制备培育植物不育系的试剂或试剂盒。

7.一种将植物从不育转为可育的方法，其特征在于，包括步骤：降低花粉细胞膜合成速度、和/或延缓花粉发育速度；优选地，所述的植物是花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性水平下降的植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述降低或延缓是通过以下方式实现：降低植株生长的环境温度、减少植株的光照时间、或组合。

9.一种植物育种方法，包括维持植株不育的步骤；将植株由不育转为可育的步骤；和，维持植株可育并育种的步骤；其特征在于，

在所述维持植株不育的步骤中，包括，对根据权利要求1-5中任一项所述的方法培育的植物不育系进行维持；

在将植株由不育转为可育的步骤中，包括，利用权利要求7-8中任一项所述的方法将植株由不育转为可育。

10.一种植物细胞，其特征在于，所述植物细胞发育成的植株中花粉发育相关的GDSL酯酶的表达或活性降低。