CN105518128B - 遗传稳定的溶瘤性rna病毒、其制备方法及用途 - Google Patents

遗传稳定的溶瘤性rna病毒、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

在用于通过修饰天然ECHO 7病毒来制备经修饰的ECHO 7型肠道病毒的方法中，其中所述天然ECHO 7病毒通过已知方法从人粪便中分离并通过基因组序列鉴定，所述修饰如下进行：首先在通过抗癌剂达卡巴嗪弱化的癌细胞中进行病毒适应，进一步在人胚胎成纤维细胞培养物中传代经修饰的病毒，随后在人黑色素瘤细胞中繁殖并进一步在通过利巴韦林处理的人胚胎成纤维细胞培养物中传代，通过已知方法分离和纯化。经修饰的病毒适合用于治疗各种肿瘤。

Description

遗传稳定的溶瘤性RNA病毒、其制备方法及用途
说明书
技术领域
本发明涉及开发新的生物技术产生的抗癌制剂，即遗传稳定的溶瘤性RNA病毒，用于制备所述溶瘤性病毒的方法，及其用途。
背景技术
病毒杀死癌细胞的能力已知了一个多世纪[Kelly,E.；Russell,S.J.History ofoncolytic viruses:genesis to genetic engineering.Mol.Ther.2007,15,pp.651-659]，并且在使用各种病毒的实验性癌症疗法中取得了许多有前景的成功，尽管它们在临床实践中的使用受到难以预见肿瘤与其宿主以及病毒与人免疫系统对病毒抗体的应答之间的相互作用的阻碍。
虽然关于病毒在癌症疗法中的使用的临床研究开始于超过50年前，但目前只有两种病毒被批准用于在癌症疗法中的临床应用。它们是删除了E1B 55K基因的腺病毒(Garber,K.China approves world's first oncolytic virus therapy for cancertreatment.J.Natl.Cancer Inst.2006，98，pp.298-300)和Echo类型的未经修饰的钝化小RNA病毒科肠道病毒(欧亚专利007839；欧洲专利申请03733607)，其用作抗肿瘤免疫刺激物。
因此，新型高效溶瘤性病毒的开发仍然是时事问题(Han Hsi Wong,NicholasR.Lemoine,Yaohe Wang,Viruses 2010,2,pp.78-106)。
为了增加病毒选择性感染癌细胞的潜力并提高溶瘤活性，已公开了许多经修饰的病毒。它们的特征在于缺失了特定基因，从而防止其在正常细胞中繁殖，或者整合了用于改善溶瘤性质的附加基因。
然而，关于提供针对肿瘤细胞的选择性和功效的遗传学修饰的有限知识导致经修饰的病毒相较于原始病毒，具有较低的溶细胞活性，或较高的人免疫系统抗病毒应答(S.Meerani,Yang Yao,Oncolytic viruses in cancer therapy.European Journal ofScientific Research,vol.40 no.1(2010),pp.156-171；Han Hsi Wong,NicholasR.Lemoine,Yaohe Wang,Viruses 2010,2,78-106)。
尽管病毒是良好建立的用于将载体转运至细胞内的工具，但它们的用途受到病毒的高免疫原性的限制(Peng,Z.Current status of gendicine in China:recombinanthuman Ad-p53 agent for treatment of cancers.Hum.Gene.Ther.2005,16,1016-1027)。
未修饰的ECHO型病毒(包括ECHO 7)的最严重不利性质之一是其引起可具有致命结果的感染的能力(Wreghitt T.G.,Gandy G.M.,King A.,Sutehall G.,Fatal neonatalECHO 7virus infection,The Lancet,vol.324,p.465,1984)。已知这些病毒导致在马来西亚的手足口病(http://www.vadscorner.com/echovirus7.html)，白血病儿童的心肌炎(Midula M.,Marzetti G.,Borra G.,Sabatino G.,Myocarditis associated with ECHO7 type infection in leukemic child,Acta Paediatrica Volume 65,Issue 4,pp.649-651,July 1976)，无菌性脑膜炎，麻痹性疾病及发热(http://virology-online.com/ viruses/Enteroviruses6.htm)。因此，致病性是将ECHO 7型病毒用于治疗癌症患者必须克服的主要限制之一。
本发明的公开内容
技术问题
因此，要解决的问题是开发一种高效的选择性溶瘤性病毒，其没有在正常细胞中的致病性以及低免疫应答，并具有高遗传稳定性。众所周知且认可的是，RNA病毒在细胞培养物中传代后很容易突变，这可改变表型，从而导致致病性增加。因此，对于通过使用野生非致病性ECHO 7病毒株作为起始材料来制备基于溶瘤性病毒的药物，非常重要的是找到会允许产生此病毒的溶瘤性修饰的程序，其中该病毒会保留原始病毒的非致病性特征并且是遗传稳定的。
技术问题的解决方案
此问题如下令人惊讶地解决：通过开发利用单链RNA病毒的高突变潜力并结合突变体的特异性靶向选择(从而提供从具有高且选择性的溶瘤活性的突变种库的快速分离)的方法来靶向修饰单链RNA病毒。许多癌细胞对病毒具有抗性(病毒不能进入细胞和在其中存活)。通过仔细地选择其中病毒被修饰的细胞系和通过适当预处理癌细胞，有可能产生用于癌症治疗的遗传稳定且非致病性的病毒。由本发明提供的病毒实际上是首次公开基于ECHO-7型病毒的遗传稳定的溶瘤性病毒，所述遗传稳定的病毒可用于作为药物的长期制备(多次复制)。
发明简述
我们已开发出用于修饰天然ECHO 7病毒(通过基因组序列SeqNo2鉴定)的方法，该方法包括首先在通过抗癌剂例如达卡巴嗪弱化的癌细胞中进行病毒适应，在人胚胎成纤维细胞培养物中传代经修饰的病毒，在人黑色素瘤细胞中繁殖和在任选用利巴韦林处理的人胚胎成纤维细胞培养物中传代，分离病毒以及纯化病毒。病毒可以通过已知方法分离和纯化。使用亚毒性浓度的抗癌剂如达卡巴嗪用于修饰癌细胞并使用这些经处理的癌细胞作为用于病毒复制的宿主细胞已导致产生具有稳定基因组的突变病毒，其适合用作用于治疗癌症的高效药物。
在进行病毒适应过程中可以使用多于一种类型的细胞系。
附图简述
图1是经修饰的病毒(Seq ID No 1)和未修饰(天然)的病毒(Seq ID No 2)的基因组的比较，以及
图2是经修饰的病毒(Seq ID No 4)和未修饰(天然)的病毒(Seq ID No 5)的氨基酸序列的比较。
序列表自由文本
Seq ID No 1：经修饰的病毒；
Seq ID No 2：未修饰(天然)的病毒；
Seq ID No 3：繁殖12个月之后的经修饰的病毒；
Seq ID No 4：经修饰的病毒的氨基酸序列；
Seq ID No 5：未修饰的病毒的氨基酸序列；
Seq ID No 6：引物Eo7-1F；Seq ID No 7：引物Eo7-1R；
Seq ID No 8：引物Eo7-2F；Seq ID No 9：引物Eo7-2R；
Seq ID No 10：引物Eo7-3F；Seq ID No 11：引物Eo7-3R；
Seq ID No 12：引物Eo7-4F；Seq ID No 13：引物Eo7-4R；
Seq ID No 14：引物Eo7-5F；Seq ID No 15：引物Eo7-5R；
Seq ID No 16：引物Eo7-6F；Seq ID No 17：引物Eo7-6R；
Seq ID No 18：引物Eo7-7F；Seq ID No 19：引物Eo7-7R；
Seq ID No 20：引物Eo7-8F；Seq ID No 21：引物Eo7-8R；
Seq ID No 22：引物Eo7-9F；Seq ID No 23：引物Eo7-10F；
Seq ID No 24：引物Eo7-9R；Seq ID No 25：引物Eo7-11F；
Seq ID No 26：引物Eo7-11R；Seq ID No 27：引物Eo7-12F；
Seq ID No 28：引物Eo7-12R；Seq ID No 29：引物Eo7-13F；
Seq ID No 30：引物Eo7-13R；Seq ID No 31：引物Eo7-14F；
Seq ID No 32：引物Eo7-14R；Seq ID No 33：引物Eo7-15F；
Seq ID No 34：引物Eo7-15R；Seq ID No 35：引物Eo7-16F；
Seq ID No 36：引物Eo7-17F；Seq ID No 37：引物Eo7-16R；
Seq ID No 38：引物Eo7-18F；Seq ID No 39：引物Eo7-18R；
Seq ID No 40：引物Eo7-19F；Seq ID No 41：引物Eo7-19R；
Seq ID No 42：引物Eo7-20F；Seq ID No 43：引物Eo7-20R；
Seq ID No 44：引物Eo7-21F；Seq ID No 45：引物Eo7-21R；
Seq ID No 46：引物Eo7-22F；Seq ID No 47：引物Eo7-22R；
Seq ID No 48：引物Eo7-23F；Seq ID No 49：引物Eo7-23R；
Seq ID No 50：引物Eo7-24F；Seq ID No 51：引物Eo7-24R；
Seq ID No 52：引物Eo7-25F；Seq ID No 53：引物Eo7-25R；
Seq ID No 54：引物Eo7-26F；Seq ID No 55：引物Eo7-26R；
发明详述
我们已出人意料地发现分离自人肠的已知的Echo 7型小RNA病毒科肠道病毒(Picornaviridae Enterovirus)适合用于此目的。通过标准方法测定的原始核苷酸序列被发现相当类似于Wallace型小RNA病毒科肠道病毒的核苷酸序列。
对分离的天然肠道病毒在血管肉瘤组织中的溶瘤活性的核查证实，3x105TCID50/0.03ml剂量的个体病毒及其组合均不具有显著的溶瘤活性，例外是ECHO 7型病毒显示更有前景的活性(表1)。
表1.病毒对血管肉瘤组织培养物的影响
RNA单链病毒基因组的不稳定性是众所周知的事实；因此，这样的病毒通常不被选择用于构建溶瘤性病毒试剂。
所分离的天然病毒的修饰在几个连续步骤中实现。
第一步骤通过在小牛血清的存在下在胰蛋白酶消化的单层人胚胎成纤维细胞培养物中复制病毒来利用RNA病毒的高突变潜力(平均每次复制一次突变)以开发致细胞病变突变体。
将细胞孵育10天，每次当培养的细胞已退化50％时进行传代。
在RD细胞培养物中测试所选择的病毒，在感染后24小时已观察到显著的致细胞病变效应。通过最后稀释法测定的所开发的病毒的滴度为TCID50＝1×10-8。
将该毒株繁殖、分离并储存在-70℃下以供进一步用于生产选择性和遗传稳定的溶瘤株。
通过使用特别开发的包括三个步骤的方法，修饰这样获得的病毒。
在第一肿瘤细胞系中的第一修饰步骤
在第一修饰步骤中，将病毒在通过抗癌剂弱化的肿瘤细胞系中繁殖。在此步骤中使用人乳腺腺癌细胞系(MCF-7)。
用亚毒性剂量(20μΜ)的达卡巴嗪DTIC处理这些细胞的单层。在用达卡巴嗪处理后，将细胞转移到新鲜培养基并与病毒接触，在不添加血清的情况下继续繁殖。在与病毒接触24小时后，去除细胞并从培养基中分离病毒。
将病毒在人胚胎成纤维细胞培养物中反复繁殖(传代)并再次用于感染MCF-7细胞系。重复此过程10次。因此，这个修饰步骤包括在人乳腺腺癌细胞和人胚胎成纤维细胞中交替地繁殖病毒。
在第二肿瘤细胞系中的第二修饰步骤
在下一修饰步骤中，将如上所述的病毒与胃腺癌细胞培养物接触。用亚毒性剂量(20μΜ)的达卡巴嗪DTIC处理这些细胞的单层。
由在第一步骤中的修饰后分离的病毒感染这些细胞的单层，并在不含血清的培养基中继续繁殖。
在与病毒接触24小时后，去除细胞并从培养基中分离病毒。将病毒在人胚胎成纤维细胞培养物中反复繁殖(传代)，并在此之后再次用于感染胃腺癌细胞系。重复此过程10次。因此，此第二修饰步骤包括在胃腺癌细胞和人胚胎成纤维细胞中交替地繁殖病毒。
在第一修饰步骤和在第二修饰步骤中，繁殖程序总是通过最后在人胚胎成纤维细胞培养物中繁殖病毒来完成。
在人黑色素瘤细胞中的第三修饰步骤
将在第二步骤中产生的病毒用于感染在手术中获得的人肿瘤。
黑色素瘤癌组织在先前通过化疗治疗的23名患者的手术中获得。
通过经修饰的病毒感染组织并在不存在二氧化碳的情况下在37℃孵育。在用于感染新的组织材料(来自另一名患者的新鲜黑色素瘤组织)之前，将经修饰的病毒在人胚胎成纤维细胞培养物中反复繁殖至7Ig TCID50/1ml的滴度。
在于感染前7小时通过5mM利巴韦林处理并培养24个小时的人胚胎成纤维细胞培养物中繁殖经修饰的病毒。从培养物中分离病毒，并将在成纤维细胞培养物中繁殖病毒的程序重复10次。
最后，将病毒分离、纯化并在未加入利巴韦林的人胚胎成纤维细胞培养物中进行繁殖。
将繁殖的病毒用于序列测定。经修饰的病毒的基因组与冷冻的未修饰天然病毒(来自NCBI数据库的Echo 7型Wallace株)的基因组约10％不同，外壳部分约12％不同。
发现通过所述方法修饰的病毒是令人惊讶地稳定的。其基因组在连续传代12个月(在人胚胎肺培养物MRC 5中繁殖12个月)之后仅改变了0.7％。尤其重要的事实是，经修饰的病毒(下文简写为MV)的特征在于：对恶性细胞特别高的致细胞病变效应和对正常细胞系的低细胞毒性，以及在小鼠中无体内毒性。
在使用细胞系的实验中，MV被发现对于下述是细胞毒性的：黑色素瘤细胞系FM9、FM55、FM94和SK-Mel26，胃癌细胞，人口腔鳞状细胞癌SCC25细胞，来源于肺癌(A549)的人上皮细胞系，急性单核球性白血病THP-1细胞，横纹肌肉瘤RD细胞，人胰腺腺癌HPAF-II细胞，人乳腺腺癌细胞(MCF-7)，以及胃腺癌GC1和甲状腺癌系HA007的原代细胞培养物。
在动物实验中，MV引起鼠肉瘤M-1、小鼠纤维肉瘤MX-17以及可移植肿瘤莫洛尼肉瘤(SM)和KRS-321肉瘤的消退。
在临床试点研究中，在一组46名黑色素瘤I期患者中，使用MV进行治疗，在43名患者中50个月没有观察到黑色素瘤的进展。在对照组中，在接受标准治疗的31名患者中的10名中黑色素瘤进展。
在44名II期黑色素瘤患者的50个月研究中，黑色素瘤的进展在38名患者中停止，相比之下，在接受标准治疗的36名患者的对照组中，黑色素瘤在15名患者中没有进展，但在21名患者中进展。对于使用MV治疗的患者，没有观察到严重的不良反应。
工业实用性
我们已开发了可有利地用于癌症病毒治疗的新型病毒株(MV)，其具有针对遗传漂变稳定的原始基因组序列，具有针对各种类型肿瘤的致细胞病变活性，特征在于不良反应的低发生率和低毒性。因此，我们出人意料地解决了将RNA病毒更广泛地用于医学的主要障碍-获得可用于标准化连续制备溶瘤性病毒制剂的遗传稳定的毒株。病毒制剂可用于针对各种肿瘤细胞的抗癌疗法。
实施例
本发明在实施例中更详细地描述。然而，不将本发明解释为限于这些实施例。
病毒
根据本发明修饰的病毒是ECHO-7病毒(小RNA病毒科，肠道病毒属，ECHO(肠道致细胞病变人孤儿(Enteric Cytopathic Human Orphan))7型，IV群，正义单链RNA病毒)。天然病毒可通过基因组序列Seq Id No 2来鉴定。
实施例1.原始病毒株的分离和表征
使用已知的方法用于分离(A.C.Rentz,J.E.Libbey,R.S.Fujinami,F.G.Whitby,and C.L.Byington.Investigation of Treatment Failure in Neonatal Echovirus 7Infection.The Pediatric Infectious Disease Journal,Volume 25,Number 3,March2006,259)和在BS-C-1细胞系(CCL 26；ATCC)中繁殖(Libbey JE,McCright IJ,Tsunoda I等人.Peripheral nerve protein,P0,as a potential receptor for Theiler's murineencephalomyelitis virus.J Neurovirol.2001；7:97-104.Pevear DC,Tull TM,SeipelME等人.Activity of pleconaril against enteroviruses.Antimicrob AgentsChemother.1999；43:2109-2115)。病毒繁殖和滴度测定按照公开的方法进行(ZurbriggenA,Fujinami RS.A neutralization-resistant Theiler's virus variant produces analtered disease pattern in the mouse central nervous system.J Virol.1989；63:1505-1513)。
实施例2.病毒修饰
在第一修饰步骤中，在通过抗癌剂弱化的肿瘤细胞系中繁殖病毒。首先，使用人乳腺腺癌细胞培养物(MCF-7)用于繁殖，将所述细胞培养物在具有10％血清(Gibco)和抗生素(100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素)的DME培养基(Sigma-Aldrich)中在含有5％CO2的大气下于37℃培养直到产生单层细胞。
用亚毒性剂量(20μΜ)的达卡巴嗪DTIC处理所获得的这些细胞的单层。在用达卡巴嗪处理后，将细胞转移到未加入血清的新鲜培养基，将细胞与病毒接触并继续进行繁殖。
在与病毒接触24小时后，去除细胞并从培养基中分离病毒。将病毒在人胚胎成纤维细胞培养物中反复繁殖并再次用于感染MCF-7细胞系。重复此过程10次。
在接下来的第二步骤中，将如上所述的病毒与胃腺癌细胞培养物接触。将用于繁殖的细胞培养物在具有10％血清(Gibco)和抗生素(100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素)的DME培养基(Sigma-Aldrich)中在含有5％CO2的大气下于37℃培养直到产生单层细胞。
用亚毒性剂量(20μΜ)的达卡巴嗪DTIC处理所获得的这些细胞的单层。在用达卡巴嗪处理后，将细胞转移到未加入血清的新鲜培养基，将细胞与病毒接触并继续进行繁殖。
在与病毒接触24小时后，去除细胞并从培养基中分离病毒。将病毒在人胚胎成纤维细胞培养物中反复繁殖并再次用于感染胃腺癌细胞系。重复此过程10次。
在第三步骤中，将在第二步骤中产生的病毒用于感染在手术中获得的人肿瘤。黑色素瘤癌组织在先前通过化疗治疗的23名患者的手术中获得。
肿瘤细胞分离自脂肪细胞、坏死组织和血液，保持在0℃下24小时，打碎并作为约0.1cm3的大组织片浸渍于Eagle培养基(4ml培养基用于10mg组织)中，用制备的病毒感染并在无二氧化碳的情况下在37℃下孵育。
将培养基每天替换为新鲜部分直到肿瘤破坏，这通过培养基的氧化水平在形态和视觉上确定。
每天在无肿瘤组织的培养基样品中测定病毒滴度。从实验结束时的病毒滴度相较于第0天的滴度测定病毒复制速率。在从23名患者获得的组织中进行病毒的这种修饰。
在用于感染新的组织材料之前，经修饰的病毒每次在人胚胎成纤维细胞培养物中反复繁殖至7Ig TCID50/1ml的滴度。
在于感染前7小时通过5mM利巴韦林处理并培养24个小时的人胚胎成纤维细胞培养物中繁殖经修饰的病毒。从培养基中分离病毒，并重复过程10次。
最后，将病毒分离、纯化并在未加入利巴韦林的人胚胎成纤维细胞培养物中进行繁殖。
将所繁殖的病毒样品通过在人胚胎成纤维细胞培养物中传代12个月伴随反复测定基因组序列(Seq ID No 1)来用于基因组序列、抗癌活性和复制稳定性的测定。
实施例3.病毒基因组序列的测定
分离的、经修饰和培养的病毒基因组的分离、扩增和测序根据已知的方法进行[Chua BH,McMinn PC,Lam SK,Chua KB.Comparison of the complete nucleotidesequences of echovirus 7 strains UMMC and the prototype(Wallace)straindemonstrates significant genetic drift over time.J Gen Virol.2001 Nov；82(Pt11):2629-39]。
为了这个目的，从NCBI基因库中选择具有完整基因组序列的96种肠道病毒。这些病毒的完整基因组序列通过Vector NTI程序进行下载和比较。基于比较结果，确定了病毒基因组的最保守的区域，并在这些区域中选择13个简并的寡核苷酸对，覆盖了潜在肠道病毒基因组的长度。在合成前13个片段之后，产生另外13个核苷酸对。这些寡核苷酸对是病毒特异性的并被设计来产生重叠片段。在建立全基因组序列之后，用病毒特异性引物反复测序病毒基因组。
实施例3.1未修饰(天然)的病毒的基因组序列
天然病毒的序列从26个单独的重叠PCR片段产生，所述片段由表2中列出的引物合成。
表2.用于测序病毒的完整基因组的引物。
UTR-非翻译区
5'-末端和3'-末端序列相应地使用5'-RACE和3'-RACE方法获得。
作为结果，发现未修饰的病毒的全基因组序列由除去多聚A序列的7434个核苷酸组成(Seq ID No 2)。
不可翻译的5'-末端(5'NTR)含有742个核苷酸，随后是以在743位上的起始密码子(AUG)起始的编码部分，其含有2196个氨基酸的密码子并以7331位上的终止密码子(UAA)结束(Seq ID No 2)。该毒株的不可翻译的3'-末端(3'NTR)含有100个核苷酸，随后是多聚A序列。
实施例3.2经修饰的病毒(MV)的序列
起始病毒的序列从26个单独的重叠PCR片段产生，所述片段由表2中列出的引物合成。
5'-末端和3'-末端序列相应地使用5'-RACE和3'-RACE方法获得。
作为结果，发现经修饰的病毒的全基因组序列由除去多聚A序列的7427个核苷酸组成(Seq ID No 1)。
该毒株的不可翻译的5'-末端(5'NTR)含有742个核苷酸，随后是编码序列。含有关于病毒多聚蛋白的信息的编码部分以在743位上的起始密码子(AUG)起始，含有2194个氨基酸的密码子并以7325位上的终止密码子(UAA)结束(Seq ID No 1)。该毒株的不可翻译的3'-末端(3'NTR)含有100个核苷酸，随后是多聚A序列。
实施例3.3经修饰的病毒在繁殖12个月后的基因组序列
经修饰的病毒的序列从26个单独的重叠PCR片段产生，所述片段由表2中列出的引物合成。
该毒株的5'-末端和3'-末端序列相应地使用5'-RACE和3'-RACE方法获得。
作为结果，发现经修饰的病毒的全基因组序列由除去多聚A序列的7427个核苷酸组成(Seq ID No 3)。不可翻译的5'-末端(5'NTR)含有742个核苷酸，随后是以在743位上的起始密码子(AUG)起始的编码部分，其含有2194个氨基酸的密码子并以7325位上的终止密码子(UAA)结束(Seq ID No 3)。该毒株的不可翻译的3'-末端(3'NTR)含有100个核苷酸，随后是多聚A序列。
实施例3.4经修饰的病毒(MV)和天然株的基因组的比较
经修饰的病毒(MV)和起始株的基因组的比较提供于图1中。
通过Vector NTI程序计算的核苷酸序列差异是显著的，对于完整基因组为10％，并且对于编码病毒外壳蛋白的部分为12％。经修饰的毒株和起始株的氨基酸序列示于图2中。
实施例3.5经修饰的病毒在繁殖12个月后的基因组序列
在连续传代12个月后，经修饰的病毒(MV)的基因组的序列中的变化不超过初始序列的0.7％。
所有发现的变化是一个核苷酸替换，部分是沉默突变(不改变氨基酸)。如果氨基酸被改变，则它的位置是在基因组多态性部分中，显然对病毒活性没有相关影响。
实施例4病毒传代
病毒MV通过已知的方法传代并在无细菌、病毒、真菌或支原体的人胚胎肺培养物MRC 5(Instituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia,Brescia-Laboratorio Centro Substrati Cellulari,Catalogue No.BS CL 68(来源：美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md，USA)中繁殖12个月，并在之后冷冻储存在-70℃下。
实施例5经修饰的病毒(MV)的抗癌活性的测定
在使用细胞系的实验中，MV被发现对于下述是细胞毒性的：黑色素瘤细胞系FM9、FM55、FM94和SK-Mel26，胃癌细胞，人口腔鳞状细胞癌SCC25细胞，来源于肺癌(A549)的人上皮细胞系，急性单核球性白血病THP-1细胞，横纹肌肉瘤RD细胞，人胰腺腺癌HPAF-II细胞，人乳腺腺癌细胞(MCF-7)，以及胃腺癌GC1和甲状腺癌系HA007的原代细胞培养物。
因此，例如，3天的MV注射在55％(22个中的11个)的动物中导致肉瘤M-1质量减少，相比之下，对照组中为6％(18个中的1个)的自发消退。
在Wistar大鼠上在以15x106TCID50的剂量注射MV后第5天移植肉瘤KRS-321，在44％的动物(11/25)中观察到肿瘤消退，而在对照组中没有消退的病例。
在相同的癌细胞系和移植的肿瘤上传代12个月后检测病毒样品的抗癌活性，没有观察到与原始MV的统计学显著差异。
MV和传代12个月的病毒均不在完好小鼠中引起任何毒性反应。
实施例6经修饰的病毒在治疗患者中的抗癌活性
经修饰的病毒(MV)对黑色素瘤患者的治疗根据下列方案进行：疗法开始于在切除肿瘤2-3周后通过肌内施用2ml的含有2x106TCID50/ml-2x108TCID50/ml滴度的溶液进行3天，并连续地以每月间隔根据相同的3天方案进行支持注射。在第四个月后，每月施用病毒制剂一次进行接下来的8个月。在接下来的2年中，以相同的剂量继续支持疗法，逐渐增加施用之间的间隔至6、8和12周。
在临床试点研究中，在一组46名黑色素瘤I期患者中，使用MV进行治疗，在43名患者中50个月没有观察到黑色素瘤的进展。在对照组中，在接受标准治疗的31名患者中的10名中黑色素瘤进展。
在44名II期黑色素瘤患者的50个月研究中，黑色素瘤的进展在38名患者中停止，相比之下，在接受标准治疗的36名患者的对照组中，黑色素瘤在15名患者中没有进展，但在21名患者中进展。
治疗的功效由以下实例表征：
病例1：女性，年龄76，Melanoma cutis dorsi
Op.11.09.2009.Excisio tu cutis dorsi
pT4b N0 M0
SN活组织检查未进行
Ex consilio:随访
Op.07.04.2010.LAE axillaris sin.
Mts l/n axillaris sin
Ex consilio:Roferon
从2010年6月24日到2010年8月30日，Roferon 6mil 3x/周。
治疗由于副作用而中断。
从2010年10月，开始使用以具有2x106TCID50/ml-2x108TCID50/ml滴度的2ml剂量的病毒制剂的疗法。治疗良好耐受，并且没有记录到疾病的进展直到2012年2月1日。
病例2：女性，年龄42，Melanoma cutis dorsi
Op.25.05.2008.Excisio tu cutis dorsi
pT4a N0M0,Clark V,Breslow 9mm
SN活组织检查未进行
从2008年6月27日到2011年6月27日施用病毒制剂(具有2x106TCID50/ml-2x108TCID50/ml滴度的2ml)。
21.01.2011.US检查：疤痕中复发
Op.02.02.2011.Excisio.组织学检查：肉芽肿
持续病毒制剂(具有2x106TCID50/ml-2x108TCID50/ml滴度的2ml)直到2011年6月27日。
在观察期间(直到2011年12月)，没有记录到疾病进展的证据。
病例3：女性，年龄57，Melanoma cutis dorsi
Op.19.08.2007.Excisio tu cutis dorsi
P T3b N0M0
SN活组织检查未进行
推荐：随访
Op.10.12.2009.LAE colli dx.组织学检查：mts l/n colli dx
疾病进展-在2010年2月22日的US检查：mts l/n colli
22.02.2010.Ex consilio:由于巨大肿块而不推荐手术
从2010年2月22日施用病毒制剂(具有2x106TCID50/ml-2x108TCID50/ml滴度的2ml)并仍然在进行中。
最后一次临床就诊在2011年11月22日-疾病已稳定。
病例4：女性，年龄58，Melanoma cutis dorsi
Op.2004年4月.Excisio tu cutis dorsi,LAE axillaris sin.
pT4b,N2c,M0(Breslow 15mm)
Reexcisio 2006年1月，2006年9月(局部复发)
从2006年10月到2007年5月用IFN治疗。
Reexcisio cum dermoplasticum 2007年2月，2007年5月，2007年9月。
从2008年2月到2011年4月施用病毒制剂(具有2x106TCID50/ml-2x108TCID50/ml滴度的2ml)。
内脏转移2011年2月。
Exitus letalis 2011年10月。
剂型和施用
用于治疗性治疗的病毒制剂可以是可注射水溶液的形式，所述溶液含有如上文所述的具有稳定基因组序列的经修饰的病毒，所述病毒的滴度为例如2x106TCID50/ml-2x108TCID50/ml。携带病毒的溶液可以是任何生理可接受的无菌溶液，特别是氯化钠溶液。制剂在冷冻条件下保存和运输，并在使用前在室温下解冻。制剂可以以对应于一次注射给患者的单次剂量的体积存在于小瓶或其它容器单元中。
制剂可以在切除所讨论的肿瘤后，当伤口已愈合时，通过将其肌内(i.m.)注射给患者来施用。剂量可以是一次2ml的上述溶液。通过注射的肌内施用根据计划的治疗时间表进行重复。

Claims (6)

1.ECHO 7型经修饰的肠道病毒，其特征在于所述经修饰的肠道病毒的基因组序列为Seq ID No 1。
2.权利要求1的经修饰的肠道病毒，其中经修饰的肠道病毒在细胞培养物中连续繁殖12个月后，所述经修饰的肠道病毒的基因组序列中的改变不大于1.0％。
3.权利要求1或2的经修饰的肠道病毒，其中经修饰的肠道病毒在细胞培养物中连续繁殖12个月后，所述经修饰的肠道病毒的基因组序列中的改变不大于0.7％。
4.权利要求1或2的病毒在制备用于治疗肿瘤学疾病的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述肿瘤学疾病选自：黑色素瘤，胃癌，肠癌，人乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌，肾癌，膀胱癌，淋巴肉瘤，子宫癌，血管肉瘤，横纹肌肉瘤。
6.权利要求5的用途，其中所述肿瘤学疾病是黑色素瘤。
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