BR102020024609A2 - Compostos de rna de interferência para inibição transcricional de foxp3 métodos de obtenção, composições farmaceuticas contendo-os e uso - Google Patents
Compostos de rna de interferência para inibição transcricional de foxp3 métodos de obtenção, composições farmaceuticas contendo-os e uso Download PDFInfo
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Abstract
A presente invenção descreve novos compostos do tipo short hairpin RNA, ou shRNA, úteis para inibir a transcrição do gene FOXP3, que codifica o fator de transcrição FOXP3 (Forkhead box P3) e, assim, inibir seletivamente as células T regulatórias (Treg), que têm fenótipo imunossupressor e são inibidoras da atividade antitumoral, sem, no entanto, comprometer a funcionalidade de células T efetoras, permitindo que o sistema imunológico do paciente possa atuar no combate ao câncer. Métodos de obtenção dos compostos também são objeto da presente invenção, assim como composições farmacêuticas que os contenham e seu uso no tratamento de tumores e câncer.
Description
[0001] Este pedido contém uma listagem de sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorporada aqui por referência.
[0002] A presente invenção se refere ao campo da biotecnologia, mais precisamente a moléculas de ácidos nucleicos capazes de promover o silenciamento de genes envolvidos em processos de imunossupressão no ambiente tumoral, processos de obtenção e seu uso na fabricação de composições farmacêuticas e no tratamento de tumores e / ou câncer.
[0003] O câncer é uma nomenclatura genérica relacionada a um conjunto de mais de 100 doenças, as quais têm em comum o crescimento desordenado de células que se dividem rapidamente, e tendem a ser muito agressivas, incontroláveis e que podem espalhar-se para outras regiões do corpo, processo conhecido como metástase.
[0004] Devido ao fato de o câncer ser uma doença com altos índices de mortalidade e haver dificuldade na identificação de um tratamento eficaz, vários estudos têm sido realizados para compreender melhor as bases moleculares de suas causas, buscando identificar características comuns a todos os tipos de cânceres. Hanahan e Weinberg identificaram algumas dessas características comuns: autossuficiência em sinais de crescimento; insensibilidade para sinais de inibição de crescimento; evasão da morte celular programada (apoptose); potencial ilimitado de replicação; angiogênese sustentada, capacidade de invadir tecidos e criar metástases, habilidade de modificar ou reprogramar o metabolismo celular, a promoção da inflamação, a instabilidade genômica e, finalmente, a evasão da destruição pelo sistema imune (Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70 e Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 2011;144(5):646-74).
[0005] Com base em estudos, concluiu-se que as células cancerígenas causam anergia ou tolerância através de vários mecanismos, por exemplo, diminuição de moléculas de MHC, inibição da expressão de moléculas co-estimuladoras, indução de substâncias imunossupressoras, como TGF- [beta] e IL-10 e infiltração de células T reguladoras (Treg) CD4+ CD25+ nos tecidos do câncer, dentre outras, com a finalidade de escapar da ação do sistema imunológico (Smyth MJ et al., Nat. Immunol. 2, pp293-299, 2001; Dunn GP et al., Immunity 21, ppl37-148, 2004).
[0006] Os linfócitos T citotóxicos (CTL) e células natural killers(NK) são os protagonistas no processo de eliminação de células tumorais, mediando a imunovigilância. Outros tipos de células, como macrófagos ou células dendríticas, podem fagocitar células tumorais e desempenham um papel importante na apresentação antigênica para ativação de células T (Garg AD, Romano E, Rufo N, Agostinis P. Immunogenic versus tolerogenic phagocytosis during anticancer therapy: mechanisms and clinical translation. Cell Death Differ. 2016;23(6):938-51.). Ao ativar várias vias de morte celular, as células citotóxicas proporcionam uma proteção contra uma variedade de agentes patogênicos e tumores. Porém, as células tumorais utilizam como mecanismo de defesa a imunossupressão para fugir das vias citotóxicas.
[0007] A partir da compreensão de alguns dos mecanismos que estão envolvidos na resposta imune, foi desenvolvida a capacidade de inferir mecanismos nos quais seria possível intervir para reativar a resposta (Miller JFAP, Sadelain M. The Journey from Discoveries in Fundamental Immunology to Cancer Immunotherapy. Cancer Cell. 2015;27(4):439-49).
[0008] Em 1980, os estudos de Coley, conhecido como pai da imunoterapia, resultaram na regressão de sarcomas inoperáveis em pacientes submetidos a procedimentos de estimulação do sistema imunológico. Esses resultados abriram as portas a uma nova possibilidade de terapia, com foco no estímulo do sistema imune como opção para tratar o câncer e deram início a uma série de novos estudos nesse campo (Coley WB. The treatment of malignat tumors by repeated inoculations of erysipelas. Am J Med Sci. 1893;105(5):487-510. Coley WB. The Treatment of Inoperable Sarcoma by Bacterial Toxins (the Mixed Toxins of the Streptococcus erysipelas and the Bacillus prodigiosus). Proc R Soc Med. 1910;3(Surg. Sect.):1-48).
[0009] Diferentemente dos tratamentos mais recorrentes de câncer, os quais atacam as células tumorais, o trabalho com imunoterapia consiste em estimular o sistema imunológico para aumentar a resposta antitumoral, o que pode ser feito por meio de diversos tipos de abordagens.
[0010] Uma das abordagens é usar moléculas que promovem: (i) a apresentação de antígenos tumorais e maturação de APC como GM-CSF, CD40 e agonistas de TLR; e (ii) a proliferação de células T efetoras, chamadas de moléculas coestimuladoras, estas incluem moléculas como 4-1BBL, OX40L, CD40, GITR, veiculadas usando diferentes procedimentos (Khalil DN, Smith EL, Brentjens RJ, Wolchok JD. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 2016;13(5):273-90 e Ophir E, Bobisse S, Coukos G, Harari A, Kandalaft LE. Personalized approaches to active immunotherapy in cancer. Biochim Biophys Acta - Rev Cancer. 2016;1865(1):72-82).
[0011] Outra estratégia possível é o uso de moléculas que inibem o ambiente imunossupressor, ou “pontos de verificação imunológicos” (em inglês Immune-checkpoints), estes referem-se a uma infinidade de vias inibitórias ligadas ao sistema imunológico que são cruciais para manter a auto tolerância e a modulação da duração e amplitude das respostas imunes nos tecidos periféricos, a fim de minimizar os danos colaterais (Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2012 Apr;12(4):252-64).
[0012] Adicionalmente, há estratégias antitumorais personalizadas, como a engenharia de células T com a função de fortalecer a resposta imune antitumoral (Chang ZL, et al. Trends Mol Med. 2017;23(5):430-50) e o isolamento de células T de sítios tumorais a partir de biopsias, enriquecimento dessa população in vitro e reintrodução destas no paciente (Rosenberg SA, et al. Cancer Ther Clin. 2011;17(13):4550—8).
[0013] Essas estratégias terapêuticas anteriormente mencionadas podem ser combinadas obtendo uma resposta em sinergia.
[0014] Por mais que as estratégias de imunoterapia para câncer tenham chegado a converter-se hoje em uma revolução promissora, especialmente os bloqueadores de checkpointsimunológicos, as terapias disponíveis só beneficiam de 15 a 25% dos pacientes (Ventola CL. Cancer Immunotherapy, Part 2 : Efficacy , Safety , and Other Clinical Considerations. Pharmacol Ther. 2017;42(7):452-63). Isso é causado principalmente pela expressão tumoral dos ligantes associados aos inibidores e pelos mecanismos de imunossupressão.
[0015] O estudo destes mecanismos pode levar ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para potencializar a resposta imune antitumoral (Beatty GL, Gladney WL. Immune escape mechanisms as a guide for cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2015;21(4):687-92.; Stewart TJ, Abrams SI. How tumours escape mass destruction. Oncogene. 2008;27(45):5894-903).
[0016] Nesse sentido, a infiltração de linfócitos no tumor é um indício de ação da resposta imune, pois células T podem ser atraídas para o sítio tumoral mediando sua eliminação. Por outro lado, as células T regulatórias (Treg) também podem ser atraídas para o sítio tumoral, sendo que o aumento desta população imunossupressora em sítios tumorais tem sido associado a um prognóstico pouco favorável em casos clínicos de câncer, como carcinoma hepatocelular, (Huang Y, et al. Prognostic Value of Tumor-Infiltrating FOXP3 + T Cells in Gastrointestinal Cancers : A Meta Analysis. PLoS One. 2014;9(5)), adenocarcinoma ductal pancreático (Hiraoka N, et al. Clin Cancer Res. 2006;12:5423-34), câncer gástrico (Sasada T, et al. Cancer 2003;98(5):1089-99.), câncer de mama (Lopes LF, et al. FOXP3 Transcription Factor : A Candidate Marker for Susceptibility and Prognosis in Triple Negative Breast Cancer. 2014;2014.), de tiroide (Cunha LL, et al. Clinics (Sao Paulo). 2012;67(5):483-8), de ovário (Sato E, et al. Proc Natl Acad Sci. 2005;102(51):18538-43.), entre outros (Shang B, Liu Y, Jiang S, Liu Y Sci Rep. 2015;5(October):1-9).
[0017] Com base nos dados de correlação do prognóstico desfavorável com a infiltração de células Treg, a inibição dessas células em pacientes com câncer pode ser uma alternativa interessante para melhorar a resposta imune antitumoral.
[0018] As células Treg são células do sistema imunológico que atuam na supressão da resposta imune. No microambiente tumoral, isso ocorre pela antagonização com linfócitos efetores, o que prejudica o combate às células tumorais pelo sistema imunológico.
[0019] A partir de estudos que associaram uma doença autoimune pronunciada e letal em camundongos à mutação do gene FOXP3 (Ramsdell F, Ziegler SF. FOXP3 and scurfy: how it all began. Nat Rev Immunol. 2014 Apr 11;(April):1-7.; Zheng Y, Josefowicz SZ, Kas A, Chu T-T, Gavin M a, Rudensky AY. Genome-wide analysis of FOXP3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 2007 Feb 22;445(7130):936-40) e estudos de geração in vitro de células com fenótipo imunossupressor por meio da transdução retroviral de cassete de expressão com gene FOXP3 em células CD4 (Loser K, Hansen W, Apelt J, Balkow S, Buer J, Beissert S. In vitro-generated regulatory T cells induced by FOXP3-retrovirus infection control murine contact allergy and systemic autoimmunity. Gene Ther. 2005;12(17):1294-304.), os grupos envolvidos no estudo das células supressoras verificaram que havia expressão do gene FOXP3 em células CD4+CD25+. Concluíram que somente as células CD4+CD25+FOXP3+ cumpriam funções supressoras, e que o FOXP3 é indispensável para esse fenótipo, caracterizando as células T regulatórias (Williams LM, Rudensky AY. Maintenance of the FOXP3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of FOXP3. Nat Immunol. 2007 Mar;8(3):277-84; Khattri R, Cox T, Yasayko S-A, Ramsdell F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 2003;4(4):337-42; Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor FOXP3. Science. 2003 Feb 14;299(5609):1057-61; Fontenot JD, Rasmussen JP, Williams LM, Dooley JL, Farr AG, Rudensky AY Regulatory T Cell Lineage Specification by the Forkhead Transcription Factor FOXP3. Immunity. 2005;22:329-41).
[0020] Existem duas populações de células T regulatórias: as naturais ou derivadas do timo (tTreg) e as induzidas na periferia (pTreg). A população que é gerada in vitrono laboratório difere dessas duas e suas células são conhecidas como Treg induzidas (iTreg) (Kanamori M, Nakatsukasa H, Okada M, Lu Q, Yoshimura A. Induced Regulatory T Cells: Their Development, Stability, and Applications. Vol. 37, Trends in Immunology. Elsevier Ltd; 2016. p. 803-11). Todas caracterizam-se pela expressão do FOXP3 e possuem características imunossupressoras, mas é a estabilidade da expressão do FOXP3, a ativação pelo TCR e o lugar no qual são encontradas o que caracteriza as populações.
[0021] O FOXP3 (nome dado por ser parte da família de fatores transcricionais forkhead/ winged-helix(Bennett CL, Christie J, Ramsdell F, Brunkow ME, Ferguson PJ, Whitesell L, et al. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet. 2001;27(January):20-1) é um fator de transcrição que atua como ativador e repressor de genes. Com aproximadamente 2800 sítios de união, é capaz de unir-se a mais de 700 genes em células Treg (Zheng Y, Josefowicz SZ, Kas A, Chu T-T, Gavin M a, Rudensky AY. Genome-wide analysis of FOXP3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 2007 Feb 22;445(7130):936-40; Marson A, Kretschmer K, Frampton GM, Jacobsen ES, Polansky JK, MacIsaac KD, et al. FOXP3 occupancy and regulation of key target genes during T-cell stimulation. Nature. 2007;445(7130):931-5) e, aproveitando os enhancers que ficam disponíveis depois da ativação pelo TCR, estabelece uma série de modificações epigenéticas que levam ao fenótipo imunossupressor das Treg (Samstein RM, Arvey A, Josefowicz SZ, Peng X, Reynolds A, Sandstrom R, et al. FOXP3 exploits a pre-existent enhancer landscape for regulatory T cell lineage specification. Cell. 2012;151(1):153-66).
[0022] As Treg podem suprimir CD4+, CD8+, células natural killer (NK), linfócitos B, células dendríticas e mastócitos. Os mecanismos moleculares de supressão incluem: secreção de citocinas supressoras, como a interleucina IL10, IL35 e TGF-β, citólise mediada pela granzima-B, expressão de moléculas de superfície celular como galectina-1, LAG-3, CD39, e Nrp1 (Josefowicz SZ, Lu L-F, Rudensky AY. Regulatory T cells: mechanisms of differentiation and function. Annu Rev Immunol. 2012 Jan;30:531-64; Pedroza-Pacheco I, Madrigal A, Saudemont A. Interaction between natural killer cells and regulatory T cells: perspectives for immunotherapy. Cell Mol Immunol. 2013;10(3):222-9; Shevach EM. Mechanisms of FOXP3+ T Regulatory Cell-Mediated Suppression. Immunity. 2009;30(5):636-45).
[0023] As Treg também estão envolvidas em vários processos imunes relacionados à homeostasia, inflamação e infecção, onde inibem a resposta efetora uma vez que o perigo foi controlado. Um fato que demonstra a plasticidade e especificidade das Treg é o mecanismo pelo qual conseguem identificar as células alvo e migrar para o lugar onde é necessário a ação. No entanto, às vezes, as células Treg podem inibir, indesejadamente, a resposta efetora como ocorre no caso do câncer, onde essa resposta supressora precoce pode favorecer a progressão tumoral.
[0024] Além de impulsionar a diferenciação e a ativação das células Treg, a expressão de FOXP3 diminui a proliferação e atividade de células T efetoras. Além disso, as células T FOXP3+ podem controlar uma resposta Thl, resposta Thl7, suprimir a produção de anticorpos, controlar a atividade de células T citotóxicas CD8+ e a apresentação de antígenos.
[0025] A transferência gênica lentiviral de FOXP3 (também conhecida como proteína P3 de FOX, FOX3P, AAID, DIETER, IPEX, JM2, PIDX, XPID ou escurfina) foi descrita anteriormente por Chen e Passerini (Chen, C. et al. (2011). Transplante. Proc. 43 (5): 2031-2048; Passerini, L. et al. (2013). Sci. Transl. Med. 5 (2l5): 2l5ral74 e Passerini, L. et al. (2017). Frente. Immunol. 5: 1282). Passerini et al. (2017) relataram anteriormente o desenvolvimento de métodos para restaurar a função em células Treg de pacientes portadores de mutações no FOXP3, e a transferência gênica mediada por lentivírus foi usada em células T CD4+ e células T efetoras, que foram convertidas em células T reguladoras com características de células do tipo Treg e tais células apresentaram potente atividade supressora in vitroe in vivo. Passerini et al. (2013) também demonstraram a conversão de células T CD4+ em células Treg após a transferência de genes FOXP3 mediada por lentivírus, na qual as células mostraram ser estáveis em condições inflamatórias. Chen et al. (2011) também descreve a transferência adotiva de células T manipuladas, nas quais as células T foram infectadas com um vetor lentiviral que codifica um fragmento FOXP3-IRES-GFP. Essas células foram mostradas para proteger os receptores de GVHD em um modelo murino. É manifesta a necessidade de novas abordagens para expressar e regular FOXP3 em linfócitos humanos primários.
[0026] Aspectos do estado da técnica referem-se a métodos e composições que são úteis para a regulação positiva de FOXP3 em células, particularmente células do sistema imunológico, como células T ou outros linfócitos (WO2018031871 e WO2019210078). Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para aumentar a expressão de FOXP3 em linfócitos ex vivo para administração a um indivíduo. Como FOXP3 é um fator de transcrição que impulsiona a diferenciação de células T e a atividade de células T reguladoras (Tregs), essas modalidades são úteis para serem administradas em um sujeito com a finalidade promover a atividade imunossupressora e / ou uma resposta toleragênica. Adicionalmente, os métodos propostos podem ser úteis para o tratamento de condições auto-imunes, rejeição de transplantes ou doença do enxerto versus hospedeiro ou outras condições relacionadas para as quais é desejada a supressão de uma resposta imune.
[0027] Por outro lado, no caso de tratamento do câncer, a imunossupressão não é um fator desejado, e sim, um problema para o tratamento.
[0028] Frente a este cenário e buscando alternativas de novos tratamentos de tumores utilizando a imunoterapia, os pesquisadores partiram do fato de que o fator de transcrição FOXP3 é considerado uma chave mestra na regulação do fenótipo imunossupressor das células Treg, e desenvolveram compostos capazes de produzir o silenciamento específico de FOXP3, com o objetivo de inibir seletivamente células Treg, inibidoras da atividade antitumoral, sem comprometer a funcionalidade de células T efetoras e, como isso, permitir que o sistema imunológico do paciente possa atuar no combate ao câncer.
[0029] Dentro dos melhores conhecimentos dos presentes inventores, não existe, no atual estado da técnica, qualquer publicação que descreva os compostos descritos e seu uso como imunoterapia no tratamento de doenças onde a supressão da resposta imune não é desejada.
[0030] A presente invenção tem como objetivo fornecer novos compostos capazes de inibir a transcrição do gene que codifica o fator FOXP3 (Forkhead box P3). Os compostos são RNAs de interferência que promovem o silenciamento gênico transcricional (TGS) do gene FOXP3.
[0031] Mais precisamente, tais compostos são: moléculas de shRNA (short hairpin RNA); moléculas de siRNA (small interferingRNA) que são duplas fitas de RNA de cerca de 21 pares de bases; ou moléculas de sasRNA (small antisenseRNA), que são fitas simples de RNA de interferência de cerca de 20 bases nucleotídicas.
[0032] As moléculas de RNA de interferência TGS da invenção exercem efeito inibitório com base na complementaridade entre RNA e DNA, induzindo alterações epigenéticas que resultam em silenciamento gênico.
[0033] Um outro aspecto da invenção inclui os referidos compostos associados a sistemas de entrega para veiculação do RNA de interferência para o interior da célula alvo. Tais sistemas incluem diversas estratégias, como vetores virais, anticorpos, peptídeos, nanopartículas, lipossomos e aptâmeros de RNA ou DNA.
[0034] Em um aspecto particular da presente invenção, as moléculas de shRNA são veiculadas por meio de vetores de expressão que compreendem sequências genéticas que codificam o RNA de interferência sob a regulação de sequências que promovem sua expressão no interior da célula alvo. As moléculas de siRNA ou sasRNA são sintetizadas quimicamente, podendo ser acopladas com outros elementos para veiculação da molécula de RNA de interferência para o interior de células alvo. As moléculas sintéticas de siRNA e sasRNA podem incluir bases nitrogenadas modificadas, por exemplo, bases fluorinadas, que conferem maior estabilidade à molécula de RNA de interferência.
[0035] Também é objeto da presente invenção fornecer processos para a obtenção dos novos compostos.
[0036] Outro aspecto da presente invenção é o uso dos compostos na preparação de composições farmacêuticas úteis no tratamento do tumor, mais especificamente no tratamento de câncer, bem como para promover o silenciamento do gene FOXP3 e para potencializar a imunidade antitumoral.
[0037] Além disso, a presente invenção também tem como objetivo fornecer composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade efetiva de pelo menos um dos compostos da invenção ou a combinação entre eles, e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0038] Em outro aspecto, os compostos nas composições farmacêuticas da invenção podem apresentar bases nitrogenadas modificadas, como por exemplo bases fluorinadas.
[0039] Adicionalmente, são descritas composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção que promovem o silenciamento transcricional do gene FOXP3 associados a veículos para sua entrega às células, como vetores virais, preferencialmente vetores lentivirais, ou aptâmeros de RNA ou DNA.
[0040] Em particular, são descritas composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um dos compostos de RNA de interferência capazes de inibir a transcrição do gene que codifica o fator FOXP3 (Forkhead box P3) e, assim, promover o silenciamento gênico transcricional (TGS) do gene FOXP3. As referidas composições são úteis no tratamento e/ou prevenção de tumor, mais especificamente no tratamento e/ou prevenção de câncer.
[0041] Também é objeto da invenção o uso dos compostos no tratamento e/ou prevenção de tumor, mais especificamente no tratamento e/ou prevenção de câncer, bem como para potencializar a imunidade antitumoral e para promover o silenciamento do gene FOXP3.
[0042] A presente invenção também visa um método para potencializar a imunidade antitumoral compreendendo a administração de pelo menos um dos compostos ou mistura deles, sendo que o método pode compreender a associação com outras terapias antitumorais disponíveis.
[0043] Figura 1 - Esquema do aptâmero quimérico 41BB-sasRNA, em que sasRNA é selecionado do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78.
[0044] Figura 2 - O aptâmero 41BB-TS6 inibe FoxP3 em células T regulatórias. O gráfico mostra a expressão de FoxP3 determinada por citometria de fluxo. No eixo X, ITR é o controle não tratado, 41BB-ctr o controle negativo e 41BB-TS6 é a molécula terapêutica.
[0045] Figura 3 - O gráfico mostra proliferação de células T CD8 incubadas com Treg. No eixo X, temos diferentes tratamentos de Treg, sendo: ITR, Treg não tratada; 41BB-ctr, o aptâmero contendo sequência irrelevante de sas-RNA; 41BB-Ts6, aptâmero quimérico contendo sasRNA para inibir FoxP3; e CD8, células T CD8 na ausência de Treg.
[0046] Figura 4 - Curva de crescimento tumoral. O volume do tumor é medido em função do tempo nos animais submetidos aos tratamentos indicados.
[0047] A presente invenção descreve novos compostos úteis para inibir a transcrição do gene FOXP3, que codifica o fator de transcrição FOXP3 (Forkhead box P3) e, assim, inibir seletivamente as células T regulatórias (Treg), que têm fenótipo imunossupressor e são inibidoras da atividade antitumoral, sem, no entanto, comprometer a funcionalidade de células T efetoras, permitindo que o sistema imunológico do paciente possa atuar no combate ao câncer.
[0048] Os compostos da invenção são ácidos nucleicos, mais particularmente do tipo RNA de interferência, uma ferramenta para manipular a expressão gênica amplamente utilizada para entender a função de diferentes genes e até mesmo usada como opção terapêutica para várias doenças.
[0049] Em um aspecto preferencial, a invenção, que se baseia no silenciamento gênico transcricional (TGS), compreende moléculas do tipo short hairpinRNA (shRNA), small interferingRNA (siRNA) e small antisenseRNA (sasRNA). Essas moléculas apresentam atividade inibitória com base na complementaridade entre RNA e DNA, induzindo alterações epigenéticas que resultam em silenciamento gênico. Estas modificações epigenéticas são baseadas na metilação de DNA e modificação de histonas para um estado menos acessível.
[0050] De um modo particular, os compostos da presente invenção são moléculas de ácidos nucleicos que podem ser codificadas por vetores de expressão ou sintetizadas quimicamente.
[0051] As moléculas do tipo shRNA da invenção são veiculadas por vetores de expressão. Nesse caso, o RNA de interferência é codificado por um fragmento que contém fita senso de DNA, cuja sequência é definida por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39. Para geração de uma molécula de RNA de interferência, o vetor de expressão deve codificar um cassete de expressão que apresenta um promotor de RNA polimerase II a montante de um DNA dupla fita, o dito DNA compreende uma sequência senso selecionada entre as sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39, uma sequência hairpin e a sequência antisenso seguida do sinal de terminação. A transcrição dessa construção de DNA irá gerar, no interior das células alvo, moléculas de RNA de interferência do tipo shRNA para inibição transcricional de FOXP3. Assim, a presente invenção inclui um vetor de expressão que compreende uma sequência senso selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39. Em um aspecto particular da invenção, o vetor é lentiviral. Em outro aspecto da invenção, são incluídas partículas virais recombinantes, úteis para a veiculação dos vetores da invenção ao interior da célula alvo.
[0052] Já as moléculas da invenção do tipo sasRNA ou siRNA são RNAs de interferência que podem ser sintetizados quimicamente. As moléculas de sasRNA ou siRNA compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78. Tabela 1. Sequências candidatas para geração de moléculas de RNA de interferência TGS.
[0053] Os compostos RNA de interferência da invenção têm ação intracelular e têm como alvo o genoma celular, bastando uma única molécula para bloquear a expressão gênica de FOXP3. Os referidos compostos do tipo RNA de interferência da invenção, que compreendem as sequências SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO 78 em sua estrutura, são complementares a sítios ricos em citosinas seguidas por guaninas (CpG) no promotor. Tais regiões são susceptíveis de metilação por metiltransferases e, consequentemente, podem induzir o silenciamento gênico transcricional (TGS).
[0054] Um outro aspecto da invenção provê os compostos RNA de interferência da invenção do tipo siRNA e sasRNA compreendendo as sequências definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 nos quais as bases nitrogenadas estão modificadas. Mais precisamente, as bases modificadas são fluorinadas. As bases nitrogenadas fluorinadas em SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 são, preferencialmente, 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP. As bases dCTP e dUTP são fluorinadas para aumentar estabilidade do RNA, possibilitando sua aplicação in vivo.
[0055] Também são objetos da presente invenção os compostos SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 associados a veículos que promovam sua entrega intracelular. Mais precisamente, os compostos SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 podem ser acoplados a anticorpos, aptâmeros, nanopartículas, lipossomos, peptídeos, vetores virais, entre outros vetores, para que sejam carreados para o interior das células. Em um aspecto da presente invenção, os compostos SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 estão associados a um aptâmero. Uma vez que células Treg podem apresentar expressão constitutiva de 4-1BB (Goldstein MJ, Kohrt HE, Houot R, Varghese B, Lin JT, Swanson E, et al. Adoptive cell therapy for lymphoma with CD4 T cells depleted of CD137-expressing regulatory T cells. Cancer Res. 2012;72(5):1239-47.), os inventores postularam que este seria um excelente receptor para internalização dos compostos SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78. Preferencialmente, o aptâmero é dirigido ao receptor 4-1BB de células T Alternativamente, outros aptâmeros dirigidos a receptores de células T humanas como CD4, CD28, OX40, entre outros também podem ser utilizados. Em um aspecto da presente invenção, os candidatos sasRNA-TGS se apresentam como uma fita simples e são desenhados para serem unidos à extremidade 3' do aptâmero, gerando as construções quiméricas. Os inventores da presente invenção demonstraram que a associação dos compostos sasRNA da invenção a aptâmeros de RNA promoveram seu efeito intracelular. Deste modo, uma concretização da invenção inclui aptâmeros quiméricos que compreendem uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 ligada a um aptâmero.
[0056] Em outra concretização, a presente invenção refere-se ao processo de produção dos compostos RNA de interferência SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78. Mais precisamente, a invenção descreve um processo de síntese química dos compostos, que inclui 4 etapas:
[0057] a. Síntese de uma sequência molde (template) de DNA fita simples;
[0058] b. Amplificação de material;
[0059] c. Transcrição de RNA a partir de material molde obtido na etapa “b”;
[0060] d.Purificação do material transcrito obtido na etapa “c”.
[0061] A síntese química do material molde na etapa “a” pode ser realizada na forma de oligonucleotídeos por metodologias conhecidas no estado da técnica.
[0062] A amplificação de material na etapa “b” é realizada por tecnologia de PCR, utilizando iniciadores senso e antisenso. O material obtido na etapa b consiste em DNA dupla-fita, que é purificado com colunas de cromatografia.
[0063] Para a transcrição descrita na etapa “c”, podem ser utilizadas as metodologias convencionais descritas no estado da técnica. Por exemplo, emprega-se kits comerciais contendo enzima T7 polimerase e, como substrato para a polimerização, são usados os monômeros ATP, GTP, 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP.
[0064] A purificação descrita na etapa "d" é realizada a partir de gel SDS-PAGE com eluição em solução salina. A seguir, o material eluido é filtrado em 0,22 um.
[0065] Em uma modalidade, a presente invenção descreve o uso dos compostos da invenção na preparação de composições farmacêuticas. Esta modalidade compreende o uso de vetores que codificam compostos shRNA da invenção e dos compostos siRNA e sasRNa da invenção na preparação de composições farmacêuticas. Em outra modalidade, as sequências siRNA e sasRNa da invenção apresentam bases nitrogenadas modificadas, por exemplo, fluorinadas. Em outra modalidade da invenção, os compostos de RNA de interferência da invenção estão acoplados a veículos que promovam sua entrega no interior da célula.
[0066] A presente invenção também contempla composições farmacêuticas, ou seja, uma forma apropriada de dosagem, onde a composição citada compreende como ingrediente ativo uma quantidade efetiva de um ou mais dos compostos da invenção. Os ditos compostos da invenção presentes nas composições farmacêuticas são os vetores de expressão que codificam as moléculas de shRNA, ou seja, compreendem uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39, ou ainda os compostos são os siRNA ou sasRNA que compreendem em sua estrutura uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78, e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em um aspecto da invenção, as sequências de siRNA ou sasRNA apresentam bases nitrogenadas modificadas, por exemplo, fluorinadas. Em outra modalidade da invenção, os compostos da invenção estão acoplados a veículos que promovam sua entrega no interior da célula. As referidas composições farmacêuticas são úteis para promover o silenciamento do gene FOXP3, potencializar a imunidade antitumoral, tratamento e/ou prevenir tumores e tratamento e/ou prevenir câncer.
[0067] Em uma modalidade preferencial da invenção, as composições compreendem como ingrediente ativo um ou mais compostos que são sequências de sasRNA cuja estrutura compreende uma sequência selecionada entre aquelas definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 e cujas bases nitrogenadas são fluorinadas para promover o aumento da estabilidade da sequência in vivo, tais bases fluorinadas são 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP e, ainda, são associados a veículos para sua entrega nas células. O veículo preferencial é um aptâmero dirigido ao receptor 4-1BB de células T Alternativamente, outros aptâmeros dirigidos a receptores de células T humanas como CD4, CD28, OX40, entre outros também podem ser utilizados.
[0068] As composições farmacêuticas podem ser preparadas por métodos bem conhecidos pelo estado da técnica.
[0069] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas, preferencialmente, por via injetável.
[0070] A presente invenção também descreve um método para potencializar a imunidade antitumoral compreendendo a administração de pelo menos um dos compostos do tipo RNA de interferência da invenção, ou seja, vetores que codificam a sequência de shRNA que compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39, ou sasRNA compreendendo sequências selecionadas de SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78, ou siRNA compreendendo sequências selecionadas de SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78, ou mistura deles. Adicionalmente, um método de tratamento de câncer administrando uma dose efetiva de pelo menos um dos compostos descritos. Mais especificamente, o método pode compreender a associação do composto, objeto da presente invenção, com outras terapias antitumorais disponíveis, como quimioterapia, radioterapia, imunoterapia e similares.
[0071] O termo "câncer" divulgado neste documento compreende câncer de pulmão, câncer de pulmão celular de arsênico, câncer de cólon, câncer de osso, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer cefálico ou cervical, melanoma cutâneo ou endoftálmico, histerocarcinoma, neuroblastoma, câncer de ovário, câncer retal, câncer de estômago, câncer perianal, câncer de cólon, câncer de mama, dometrioma, carcinoma cervical, carcinoma vaginal, carcinoma vulval, doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer entérico, câncer de glândula endócrina, câncer de tireóide, câncer de paratireóide, câncer adrenal, sarcoma de tecido liso , câncer uretral, câncer peniano, câncer prostático, leucemias, leucemia crônica ou aguda, linfocitoma, câncer cístico, câncer nefrítico ou hidrourético, carcinoma de células renais, carcinoma pélvico renal, tumor do SNC, linfoma primário do SNC, tumor da medula espinhal, neuroglioma do tronco cerebral, adenomatose hipofisária e similar.
[0072] Entende-se o termo “uma quantidade efetiva” por qualquer dosagem/concentração dos compostos capaz de inibir a transcrição do fator FOXP3 (Forkhead boxP3) e, com isso, inibir seletivamente as células Treg.
[0073] O termo “composto” divulgado neste documento pode compreender as sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 78. O termo “composto” inclui, ainda, as sequências de RNA definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 com modificações em suas bases nitrogenadas. As referidas modificações incluem, por exemplo, bases fluorinadas, como 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP. O termo “composto” inclui, ainda, as sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 78, com ou sem bases nitrogenadas modificadas, acopladas a veículos para sua entrega intracelular. Os veículos incluem anticorpos, aptâmeros de RNA, aptâmeros de DNA, nanopartículas, lipossomos, vetores virais, peptídeos, entre outros vetores, sendo preferencialmente um aptâmero de RNA. O termo “composto” inclui as sequências de RNA definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 associadas a um aptâmero dirigido ao receptor 4-1BB de células T O termo “composto” inclui ainda sequências de DNA, mais precisamente vetores de expressão, que codifiquem uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39 em uma construção cuja expressão origine moléculas de shRNA no interior das células alvo. Tais vetores são preferencialmente vetores plasmidiais virais, mais preferencialmente vetores lentivirais. O termo “composto” inclui ainda partículas virais recombinantes compreendendo os vetores da invenção, as quais podem ser usadas para sua veiculação à célula alvo.
[0074] Os exemplos a seguir, descritos detalhadamente, ilustram a presente invenção sem, todavia, limitar seu escopo de proteção, e que várias modificações, à luz das mesmas, serão sugestivas aos especialistas na técnica. Tais realizações equivalentes devem estar incluídas dentro do escopo e alcance das reivindicações que acompanham.
[0075] Primeiramente, por meio de análises de bioinformática utilizando-se a plataforma VISTA (https://rvista.dcode.org/) do NIH (Loots GG, Ovcharenko I, Pachter L, Dubchak I, Rubin EM. rVista forComparative Sequence-Based Discovery of Functional Transcription Factor Binding Sites rVista for Comparative Sequence-Based Discovery of Functional Transcription Factor Binding Sites. Genome Res. 2002;832-9.), os inventores determinaram sequências alvo para o silenciamento gênico transcricional no gene FOXP3. As análises foram realizadas a partir da sequência do gene humano (FOXP3, número de acesso NCBI NG_007392.1) e murino (FoxP3, número de acesso NCBI AF277994.1).
[0076] Para isso, usaram como critérios a busca por regiões de alta homologia entre camundongos e humanos (regiões maiores de 500 pb e com mais de 76% de homologia) e regiões compreendendo alta quantidade de citosinas seguidas por guaninas (CpG), susceptíveis de metilação por metiltransferases.
[0077] Depois de selecionar as regiões do hotspot de FoxP3, considerando-se especificamente a região do promotor, os candidatos de RNA de interferência TGS foram gerados com auxílio de um algoritmo disponibilizado pelo Dr. Kevin Morris, City of Hope (EUA), conforme descrito no trabalho publicado: Ackley A, Lenox A, Stapleton K, Knowling S, Lu T, Sabir KS, et al. An Algorithm for Generating Small RNAs Capable of Epigenetically Modulating Transcriptional Gene Silencing and Activation in Human Cells. Mol Ther Nucleic Acids. 2013 Jan;2(May):e104.
[0078] Esse processo levou ao desenho das sequências candidatas para geração de moléculas de RNA de interferência TGS (Tabela 1).
[0079] Inicialmente, os inventores optaram por gerar sequências de DNA codificantes de shRNA, que poderiam ser veiculadas por vetores lentivirais. Essas sequências de DNA codificantes de shRNA são compostas por uma sequência senso proveniente do algoritmo, um hairpin, uma sequência antisenso e um sinal de terminação. O shRNA completo é uma dupla fita de DNA, que contém, portanto, a sequência senso, um hairpin, a sequência antisenso. O shRNA é clonado num vetor de expressão plasmidial lentiviral à jusante de um promotor de RNA polimerase II. Esse vetor plasmidial é utilizado para produção de partículas virais recombinantes que codificam o shRNA. Essas partículas têm a capacidade de veicular o cassete de expressão de shRNA para o interior de uma célula, que terá produção do RNA de interferência para inativar FOXP3. A sequência do RNA de interferência, é a sequência de RNA, correspondente a sequência da fita senso de DNA, conforme Tabela 1 para cada candidato. Essa molécula de RNA de interferência é que inibirá a expressão de FOXP3 na célula alvo.
[0080] Os candidatos de shRNA-TGS complementares à região do promotor de FOXP3 da Tabela 1 tiveram suas sequências de DNA sintetizadas como oligonucleotídeos, flanqueados por extremidades coesivas e clonados no vetor PLKO THY1.1 usando BamHI e EcoRI. Após realizar a ligação, bactérias DH5α foram transformadas e cultivadas por 16 horas a 37°C. Aquelas colônias que crescessem foram utilizadas para PCR de colônia. Os clones positivos foram selecionados para miniprep e confirmação de sequenciamento, aqueles que tivessem os candidatos de RNA confirmados por sequenciamento foram depois isolados com kit de midiprep (Quiagen) e usados para as preparações virais.
[0081] Os veículos virais apresentam uma boa eficiência na entrega celular dos candidatos, entretanto, sistemas não virais podem aumentar a biossegurança de uma estratégia para inibição de Treg, pensando-se no desenvolvimento de futuras aplicações voltadas à terapia humana. Assim, foram produzidos aptâmeros quiméricos de RNA contendo sequências de sasRNA tal como definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78. Estes aptâmeros foram baseados no aptâmero 4-1BB, originalmente desenvolvido e otimizado pelo grupo do Dr. Eli Gilboa Universidade de Miami. Os candidatos de RNA de interferência sasRNA se apresentam como uma fita simples e foram desenhados para serem unidos à extremidade 3' do aptâmero de RNA 4-1BB gerando as construções quiméricas (Figura 1).
[0082] Inicialmente, os aptâmeros foram sintetizados a partir de moldes de DNA. Estes moldes de DNA foram amplificados numa PCR convencional usando os oligos específicos. Os produtos de PCR foram purificados usando as colunas QIAprep Spin (Qiagen, Valencia, CA). O aptâmero de ARN foi transcrito usando a polimerase T7 (Y639F). Os produtos foram purificados por electroforese em gel de poliacrilamida e concentrados numa coluna 30 Kda Amicon Ultra-4 (Millipore, Billerica, MA). Após disso foi medida a concentração no nanodrop (Thermo).
[0083] Para avaliar o efeito inibitório dos aptâmeros quiméricos em Treg, utilizamos nosso modelo de silenciamento de Foxp3 em células iTReg. Assim, células CD4 pré ativadas e induzidas para Treg foram incubadas com os aptâmeros por 24 horas e depois deixadas em cultura por mais 72 horas. Após a incubação, as células foram coletadas, coradas para FOXP3 e analisadas por citometria de fluxo (Figura 2).
[0084] Os resultados obtidos demonstram claramente que o aptâmero quimérico 41BB-Ts6 é eficaz na inibição de Foxp3.
[0085] As células Treg apresentam a propriedade de inibir a proliferação de células T No caso do câncer, a infiltração de células Treg no sítio tumoral pode antagonizar a resposta antitumoral. Sendo assim, os inventores efetuaram um ensaio de proliferação em que células T incubadas com células Treg apresentam redução na proliferação. Essas células Treg, portanto apresentam atividade imunossupressora. Os inventores verificaram claramente que células Treg incubadas com aptâmero 41BB-TS6 tiveram o potencial de imunossupressão reduzido, observando-se aumento de proliferação de células T efetoras, acima da condição na ausência de aptâmero (ITR). (Figura 3)
[0086] Para esse estudo, foram utilizados animais c56bl desafiados com tumores singenicos derivados de melanoma, B16-F10. Os animais receberam tratamento com a vacina antitumoral GVAX e também com aptâmero controle (41BB-CTR) e aptâmero terapêutico (41BB-TS6). Podemos verificar claramente que animais que receberam o aptâmero terapêutico apresentam significativa redução no crescimento tumoral (Figura 4).
Claims (27)
1. Sequências de ácidos nucleicos caracterizadas por consistir de uma sequência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 78.
2. Vetor de expressão que codifica um RNA de interferência, o dito vetor caracterizado por compreender uma sequência senso selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 sob a regulação de sequências que promovem a expressão do RNA de interferência no interior da célula alvo.
3. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender um promotor de RNA polimerase II a montante da sequência senso.
4. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por codificar RNA de interferência do tipo short hairpinRNA.
5. Vetor de expressão, de acordo com as reivindicações 2 a 4, caracterizado por compreender, adicionalmente à sequência senso selecionada do grupo de sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39, uma sequência hairpine a sequência antisenso seguida do sinal de terminação.
6. Vetor de expressão, de acordo com as reivindicações 2 a 5, caracterizado por ser um vetor lentiviral.
7. Partícula viral recombinante caracterizada por compreender um vetor tal como definido nas reivindicações 2 a 6.
8. Sequências de short hairpinRNA caracterizadas por compreender uma sequência senso selecionada do grupo das sequências definidas por SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 e, adicionalmente, uma sequência hairpine a sequência antisenso.
9. Sequências de RNA de interferência caracterizadas por compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 78.
10. Sequência de RNA de interferência de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por ser do tipo small interference RNA ou small antisense RNA.
11. Sequência de RNA de interferência de acordo com as reivindicações 9 e 10, caracterizada por compreender bases nitrogenadas fluorinadas.
12. Sequência de RNA de interferência de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as bases fluorinadas são 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP.
13. Sequência de RNA de interferência de acordo com as reivindicações 9 a 12, caracterizada por ser acoplada a anticorpos, aptâmeros, nanopartículas, lipossomos, peptídeos ou vetores virais para que sejam carreados para o interior das células.
14. Sequência de RNA de interferência de acordo com as reivindicações 9 e 13, caracterizada por ser acoplada um aptâmero.
15. Sequência de RNA de interferência de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por ser acoplada à extremidade 3’ do aptâmero.
16. Sequência de RNA de interferência de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por ser acoplada a um aptâmero, em que o aptâmero é dirigido ao receptor 4-1BB de células T, ou a outros aptâmeros dirigidos a receptores de células T humanas que consistem de CD4, CD28 e OX40.
17. Aptâmeros quiméricos, caracterizados por compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 ligada a um aptâmero.
18. Processo de obtenção de siRNA e sasRNA caracterizado por compreender as etapas: Síntese de uma sequência molde (template) de DNA fita simples; Amplificação de material por tecnologia de PCR, utilizando iniciadores senso e antisenso; Transcrição de RNA a partir de material molde de DNA dupla-fita obtido na etapa de amplificação com enzima T7 polimerase; Purificação do material transcrito obtido na etapa de transcrição, em que o RNA de interferência do tipo siRNA ou sasRNA compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78.
19. Uso dos compostos definidos nas reivindicações 1 a 17 caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para promover o silenciamento do gene FOXP3.
20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para potencializar a imunidade antitumoral.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de tumores e para tratamento de câncer.
22. Composições farmacêuticas caracterizadas por compreender como ingrediente ativo uma ou mais sequências de ácidos nucléicos tais como definidas nas reivindicações 1 a 17 mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
23. Composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadas por serem para o tratamento e / ou prevenção de câncer.
24. Composições farmacêuticas caracterizadas por compreender como ingrediente ativo um ou mais compostos que são sequências de sasRNA cuja estrutura compreende uma sequência selecionada entre aquelas definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 e cujas bases nitrogenadas são fluorinadas, tais bases fluorinadas são 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP e, ainda, são associados a veículos para sua entrega nas células, em que tais veículos são aptâmeros.
25. Método para potencializar a imunidade antitumoral caracterizado por ser por meio da administração de pelo menos um dos compostos conforme definidos nas reivindicações 1 a 17.
26. Uso dos compostos tais como definidos nas reivindicações 1 a 17, caracterizado por ser no tratamento e/ou prevenção de tumor, mais especificamente no tratamento e/ou prevenção de câncer.
27. Uso dos compostos de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por ser em associação com outras terapias antitumorais disponíveis.
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