BR102020024609A2 - Compostos de rna de interferência para inibição transcricional de foxp3 métodos de obtenção, composições farmaceuticas contendo-os e uso - Google Patents
Compostos de rna de interferência para inibição transcricional de foxp3 métodos de obtenção, composições farmaceuticas contendo-os e uso Download PDFInfo
- Publication number
- BR102020024609A2 BR102020024609A2 BR102020024609-7A BR102020024609A BR102020024609A2 BR 102020024609 A2 BR102020024609 A2 BR 102020024609A2 BR 102020024609 A BR102020024609 A BR 102020024609A BR 102020024609 A2 BR102020024609 A2 BR 102020024609A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- seq
- cells
- sequences
- cancer
- rna
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 title abstract description 50
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 title abstract description 44
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 title description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 66
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 101150027879 FOXP3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 38
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims description 11
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 11
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 claims description 3
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 claims description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 abstract description 36
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 abstract description 16
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 15
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract description 12
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 4
- 238000012033 transcriptional gene silencing Methods 0.000 description 18
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 230000019113 chromatin silencing Effects 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 4
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 3
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 201000004029 Immune dysregulation-polyendocrinopathy-enteropathy-X-linked syndrome Diseases 0.000 description 3
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000002602 induced regulatory T cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000000297 Erysipelas Diseases 0.000 description 2
- 108090000852 Forkhead Transcription Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004315 Forkhead Transcription Factors Human genes 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 2
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 206010007953 Central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229940032072 GVAX vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000000795 Galectin 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 1
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- -1 IL35 Proteins 0.000 description 1
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 1
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 101150051337 NRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100039467 P3 protein Human genes 0.000 description 1
- 101710117080 P3 protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038111 Recurrent cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005074 Retroviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 1
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 description 1
- 201000003761 Vaginal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006721 cell death pathway Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 208000025997 central nervous system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011220 combination immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001957 hydrouretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000008129 pancreatic ductal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 208000016800 primary central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010062261 spinal cord neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000005737 synergistic response Effects 0.000 description 1
- 230000009392 systemic autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000032620 x-linked multiple congenital anomalies-neurodevelopmental syndrome Diseases 0.000 description 1
Abstract
A presente invenção descreve novos compostos do tipo short hairpin RNA, ou shRNA, úteis para inibir a transcrição do gene FOXP3, que codifica o fator de transcrição FOXP3 (Forkhead box P3) e, assim, inibir seletivamente as células T regulatórias (Treg), que têm fenótipo imunossupressor e são inibidoras da atividade antitumoral, sem, no entanto, comprometer a funcionalidade de células T efetoras, permitindo que o sistema imunológico do paciente possa atuar no combate ao câncer. Métodos de obtenção dos compostos também são objeto da presente invenção, assim como composições farmacêuticas que os contenham e seu uso no tratamento de tumores e câncer.
Description
[0001] Este pedido contém uma listagem de sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorporada aqui por referência.
[0002] A presente invenção se refere ao campo da biotecnologia, mais precisamente a moléculas de ácidos nucleicos capazes de promover o silenciamento de genes envolvidos em processos de imunossupressão no ambiente tumoral, processos de obtenção e seu uso na fabricação de composições farmacêuticas e no tratamento de tumores e / ou câncer.
[0003] O câncer é uma nomenclatura genérica relacionada a um conjunto de mais de 100 doenças, as quais têm em comum o crescimento desordenado de células que se dividem rapidamente, e tendem a ser muito agressivas, incontroláveis e que podem espalhar-se para outras regiões do corpo, processo conhecido como metástase.
[0004] Devido ao fato de o câncer ser uma doença com altos índices de mortalidade e haver dificuldade na identificação de um tratamento eficaz, vários estudos têm sido realizados para compreender melhor as bases moleculares de suas causas, buscando identificar características comuns a todos os tipos de cânceres. Hanahan e Weinberg identificaram algumas dessas características comuns: autossuficiência em sinais de crescimento; insensibilidade para sinais de inibição de crescimento; evasão da morte celular programada (apoptose); potencial ilimitado de replicação; angiogênese sustentada, capacidade de invadir tecidos e criar metástases, habilidade de modificar ou reprogramar o metabolismo celular, a promoção da inflamação, a instabilidade genômica e, finalmente, a evasão da destruição pelo sistema imune (Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70 e Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 2011;144(5):646-74).
[0005] Com base em estudos, concluiu-se que as células cancerígenas causam anergia ou tolerância através de vários mecanismos, por exemplo, diminuição de moléculas de MHC, inibição da expressão de moléculas co-estimuladoras, indução de substâncias imunossupressoras, como TGF- [beta] e IL-10 e infiltração de células T reguladoras (Treg) CD4+ CD25+ nos tecidos do câncer, dentre outras, com a finalidade de escapar da ação do sistema imunológico (Smyth MJ et al., Nat. Immunol. 2, pp293-299, 2001; Dunn GP et al., Immunity 21, ppl37-148, 2004).
[0006] Os linfócitos T citotóxicos (CTL) e células natural killers(NK) são os protagonistas no processo de eliminação de células tumorais, mediando a imunovigilância. Outros tipos de células, como macrófagos ou células dendríticas, podem fagocitar células tumorais e desempenham um papel importante na apresentação antigênica para ativação de células T (Garg AD, Romano E, Rufo N, Agostinis P. Immunogenic versus tolerogenic phagocytosis during anticancer therapy: mechanisms and clinical translation. Cell Death Differ. 2016;23(6):938-51.). Ao ativar várias vias de morte celular, as células citotóxicas proporcionam uma proteção contra uma variedade de agentes patogênicos e tumores. Porém, as células tumorais utilizam como mecanismo de defesa a imunossupressão para fugir das vias citotóxicas.
[0007] A partir da compreensão de alguns dos mecanismos que estão envolvidos na resposta imune, foi desenvolvida a capacidade de inferir mecanismos nos quais seria possível intervir para reativar a resposta (Miller JFAP, Sadelain M. The Journey from Discoveries in Fundamental Immunology to Cancer Immunotherapy. Cancer Cell. 2015;27(4):439-49).
[0008] Em 1980, os estudos de Coley, conhecido como pai da imunoterapia, resultaram na regressão de sarcomas inoperáveis em pacientes submetidos a procedimentos de estimulação do sistema imunológico. Esses resultados abriram as portas a uma nova possibilidade de terapia, com foco no estímulo do sistema imune como opção para tratar o câncer e deram início a uma série de novos estudos nesse campo (Coley WB. The treatment of malignat tumors by repeated inoculations of erysipelas. Am J Med Sci. 1893;105(5):487-510. Coley WB. The Treatment of Inoperable Sarcoma by Bacterial Toxins (the Mixed Toxins of the Streptococcus erysipelas and the Bacillus prodigiosus). Proc R Soc Med. 1910;3(Surg. Sect.):1-48).
[0009] Diferentemente dos tratamentos mais recorrentes de câncer, os quais atacam as células tumorais, o trabalho com imunoterapia consiste em estimular o sistema imunológico para aumentar a resposta antitumoral, o que pode ser feito por meio de diversos tipos de abordagens.
[0010] Uma das abordagens é usar moléculas que promovem: (i) a apresentação de antígenos tumorais e maturação de APC como GM-CSF, CD40 e agonistas de TLR; e (ii) a proliferação de células T efetoras, chamadas de moléculas coestimuladoras, estas incluem moléculas como 4-1BBL, OX40L, CD40, GITR, veiculadas usando diferentes procedimentos (Khalil DN, Smith EL, Brentjens RJ, Wolchok JD. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 2016;13(5):273-90 e Ophir E, Bobisse S, Coukos G, Harari A, Kandalaft LE. Personalized approaches to active immunotherapy in cancer. Biochim Biophys Acta - Rev Cancer. 2016;1865(1):72-82).
[0011] Outra estratégia possível é o uso de moléculas que inibem o ambiente imunossupressor, ou “pontos de verificação imunológicos” (em inglês Immune-checkpoints), estes referem-se a uma infinidade de vias inibitórias ligadas ao sistema imunológico que são cruciais para manter a auto tolerância e a modulação da duração e amplitude das respostas imunes nos tecidos periféricos, a fim de minimizar os danos colaterais (Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2012 Apr;12(4):252-64).
[0012] Adicionalmente, há estratégias antitumorais personalizadas, como a engenharia de células T com a função de fortalecer a resposta imune antitumoral (Chang ZL, et al. Trends Mol Med. 2017;23(5):430-50) e o isolamento de células T de sítios tumorais a partir de biopsias, enriquecimento dessa população in vitro e reintrodução destas no paciente (Rosenberg SA, et al. Cancer Ther Clin. 2011;17(13):4550—8).
[0013] Essas estratégias terapêuticas anteriormente mencionadas podem ser combinadas obtendo uma resposta em sinergia.
[0014] Por mais que as estratégias de imunoterapia para câncer tenham chegado a converter-se hoje em uma revolução promissora, especialmente os bloqueadores de checkpointsimunológicos, as terapias disponíveis só beneficiam de 15 a 25% dos pacientes (Ventola CL. Cancer Immunotherapy, Part 2 : Efficacy , Safety , and Other Clinical Considerations. Pharmacol Ther. 2017;42(7):452-63). Isso é causado principalmente pela expressão tumoral dos ligantes associados aos inibidores e pelos mecanismos de imunossupressão.
[0015] O estudo destes mecanismos pode levar ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para potencializar a resposta imune antitumoral (Beatty GL, Gladney WL. Immune escape mechanisms as a guide for cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2015;21(4):687-92.; Stewart TJ, Abrams SI. How tumours escape mass destruction. Oncogene. 2008;27(45):5894-903).
[0016] Nesse sentido, a infiltração de linfócitos no tumor é um indício de ação da resposta imune, pois células T podem ser atraídas para o sítio tumoral mediando sua eliminação. Por outro lado, as células T regulatórias (Treg) também podem ser atraídas para o sítio tumoral, sendo que o aumento desta população imunossupressora em sítios tumorais tem sido associado a um prognóstico pouco favorável em casos clínicos de câncer, como carcinoma hepatocelular, (Huang Y, et al. Prognostic Value of Tumor-Infiltrating FOXP3 + T Cells in Gastrointestinal Cancers : A Meta Analysis. PLoS One. 2014;9(5)), adenocarcinoma ductal pancreático (Hiraoka N, et al. Clin Cancer Res. 2006;12:5423-34), câncer gástrico (Sasada T, et al. Cancer 2003;98(5):1089-99.), câncer de mama (Lopes LF, et al. FOXP3 Transcription Factor : A Candidate Marker for Susceptibility and Prognosis in Triple Negative Breast Cancer. 2014;2014.), de tiroide (Cunha LL, et al. Clinics (Sao Paulo). 2012;67(5):483-8), de ovário (Sato E, et al. Proc Natl Acad Sci. 2005;102(51):18538-43.), entre outros (Shang B, Liu Y, Jiang S, Liu Y Sci Rep. 2015;5(October):1-9).
[0017] Com base nos dados de correlação do prognóstico desfavorável com a infiltração de células Treg, a inibição dessas células em pacientes com câncer pode ser uma alternativa interessante para melhorar a resposta imune antitumoral.
[0018] As células Treg são células do sistema imunológico que atuam na supressão da resposta imune. No microambiente tumoral, isso ocorre pela antagonização com linfócitos efetores, o que prejudica o combate às células tumorais pelo sistema imunológico.
[0019] A partir de estudos que associaram uma doença autoimune pronunciada e letal em camundongos à mutação do gene FOXP3 (Ramsdell F, Ziegler SF. FOXP3 and scurfy: how it all began. Nat Rev Immunol. 2014 Apr 11;(April):1-7.; Zheng Y, Josefowicz SZ, Kas A, Chu T-T, Gavin M a, Rudensky AY. Genome-wide analysis of FOXP3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 2007 Feb 22;445(7130):936-40) e estudos de geração in vitro de células com fenótipo imunossupressor por meio da transdução retroviral de cassete de expressão com gene FOXP3 em células CD4 (Loser K, Hansen W, Apelt J, Balkow S, Buer J, Beissert S. In vitro-generated regulatory T cells induced by FOXP3-retrovirus infection control murine contact allergy and systemic autoimmunity. Gene Ther. 2005;12(17):1294-304.), os grupos envolvidos no estudo das células supressoras verificaram que havia expressão do gene FOXP3 em células CD4+CD25+. Concluíram que somente as células CD4+CD25+FOXP3+ cumpriam funções supressoras, e que o FOXP3 é indispensável para esse fenótipo, caracterizando as células T regulatórias (Williams LM, Rudensky AY. Maintenance of the FOXP3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of FOXP3. Nat Immunol. 2007 Mar;8(3):277-84; Khattri R, Cox T, Yasayko S-A, Ramsdell F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 2003;4(4):337-42; Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor FOXP3. Science. 2003 Feb 14;299(5609):1057-61; Fontenot JD, Rasmussen JP, Williams LM, Dooley JL, Farr AG, Rudensky AY Regulatory T Cell Lineage Specification by the Forkhead Transcription Factor FOXP3. Immunity. 2005;22:329-41).
[0020] Existem duas populações de células T regulatórias: as naturais ou derivadas do timo (tTreg) e as induzidas na periferia (pTreg). A população que é gerada in vitrono laboratório difere dessas duas e suas células são conhecidas como Treg induzidas (iTreg) (Kanamori M, Nakatsukasa H, Okada M, Lu Q, Yoshimura A. Induced Regulatory T Cells: Their Development, Stability, and Applications. Vol. 37, Trends in Immunology. Elsevier Ltd; 2016. p. 803-11). Todas caracterizam-se pela expressão do FOXP3 e possuem características imunossupressoras, mas é a estabilidade da expressão do FOXP3, a ativação pelo TCR e o lugar no qual são encontradas o que caracteriza as populações.
[0021] O FOXP3 (nome dado por ser parte da família de fatores transcricionais forkhead/ winged-helix(Bennett CL, Christie J, Ramsdell F, Brunkow ME, Ferguson PJ, Whitesell L, et al. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet. 2001;27(January):20-1) é um fator de transcrição que atua como ativador e repressor de genes. Com aproximadamente 2800 sítios de união, é capaz de unir-se a mais de 700 genes em células Treg (Zheng Y, Josefowicz SZ, Kas A, Chu T-T, Gavin M a, Rudensky AY. Genome-wide analysis of FOXP3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 2007 Feb 22;445(7130):936-40; Marson A, Kretschmer K, Frampton GM, Jacobsen ES, Polansky JK, MacIsaac KD, et al. FOXP3 occupancy and regulation of key target genes during T-cell stimulation. Nature. 2007;445(7130):931-5) e, aproveitando os enhancers que ficam disponíveis depois da ativação pelo TCR, estabelece uma série de modificações epigenéticas que levam ao fenótipo imunossupressor das Treg (Samstein RM, Arvey A, Josefowicz SZ, Peng X, Reynolds A, Sandstrom R, et al. FOXP3 exploits a pre-existent enhancer landscape for regulatory T cell lineage specification. Cell. 2012;151(1):153-66).
[0022] As Treg podem suprimir CD4+, CD8+, células natural killer (NK), linfócitos B, células dendríticas e mastócitos. Os mecanismos moleculares de supressão incluem: secreção de citocinas supressoras, como a interleucina IL10, IL35 e TGF-β, citólise mediada pela granzima-B, expressão de moléculas de superfície celular como galectina-1, LAG-3, CD39, e Nrp1 (Josefowicz SZ, Lu L-F, Rudensky AY. Regulatory T cells: mechanisms of differentiation and function. Annu Rev Immunol. 2012 Jan;30:531-64; Pedroza-Pacheco I, Madrigal A, Saudemont A. Interaction between natural killer cells and regulatory T cells: perspectives for immunotherapy. Cell Mol Immunol. 2013;10(3):222-9; Shevach EM. Mechanisms of FOXP3+ T Regulatory Cell-Mediated Suppression. Immunity. 2009;30(5):636-45).
[0023] As Treg também estão envolvidas em vários processos imunes relacionados à homeostasia, inflamação e infecção, onde inibem a resposta efetora uma vez que o perigo foi controlado. Um fato que demonstra a plasticidade e especificidade das Treg é o mecanismo pelo qual conseguem identificar as células alvo e migrar para o lugar onde é necessário a ação. No entanto, às vezes, as células Treg podem inibir, indesejadamente, a resposta efetora como ocorre no caso do câncer, onde essa resposta supressora precoce pode favorecer a progressão tumoral.
[0024] Além de impulsionar a diferenciação e a ativação das células Treg, a expressão de FOXP3 diminui a proliferação e atividade de células T efetoras. Além disso, as células T FOXP3+ podem controlar uma resposta Thl, resposta Thl7, suprimir a produção de anticorpos, controlar a atividade de células T citotóxicas CD8+ e a apresentação de antígenos.
[0025] A transferência gênica lentiviral de FOXP3 (também conhecida como proteína P3 de FOX, FOX3P, AAID, DIETER, IPEX, JM2, PIDX, XPID ou escurfina) foi descrita anteriormente por Chen e Passerini (Chen, C. et al. (2011). Transplante. Proc. 43 (5): 2031-2048; Passerini, L. et al. (2013). Sci. Transl. Med. 5 (2l5): 2l5ral74 e Passerini, L. et al. (2017). Frente. Immunol. 5: 1282). Passerini et al. (2017) relataram anteriormente o desenvolvimento de métodos para restaurar a função em células Treg de pacientes portadores de mutações no FOXP3, e a transferência gênica mediada por lentivírus foi usada em células T CD4+ e células T efetoras, que foram convertidas em células T reguladoras com características de células do tipo Treg e tais células apresentaram potente atividade supressora in vitroe in vivo. Passerini et al. (2013) também demonstraram a conversão de células T CD4+ em células Treg após a transferência de genes FOXP3 mediada por lentivírus, na qual as células mostraram ser estáveis em condições inflamatórias. Chen et al. (2011) também descreve a transferência adotiva de células T manipuladas, nas quais as células T foram infectadas com um vetor lentiviral que codifica um fragmento FOXP3-IRES-GFP. Essas células foram mostradas para proteger os receptores de GVHD em um modelo murino. É manifesta a necessidade de novas abordagens para expressar e regular FOXP3 em linfócitos humanos primários.
[0026] Aspectos do estado da técnica referem-se a métodos e composições que são úteis para a regulação positiva de FOXP3 em células, particularmente células do sistema imunológico, como células T ou outros linfócitos (WO2018031871 e WO2019210078). Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para aumentar a expressão de FOXP3 em linfócitos ex vivo para administração a um indivíduo. Como FOXP3 é um fator de transcrição que impulsiona a diferenciação de células T e a atividade de células T reguladoras (Tregs), essas modalidades são úteis para serem administradas em um sujeito com a finalidade promover a atividade imunossupressora e / ou uma resposta toleragênica. Adicionalmente, os métodos propostos podem ser úteis para o tratamento de condições auto-imunes, rejeição de transplantes ou doença do enxerto versus hospedeiro ou outras condições relacionadas para as quais é desejada a supressão de uma resposta imune.
[0027] Por outro lado, no caso de tratamento do câncer, a imunossupressão não é um fator desejado, e sim, um problema para o tratamento.
[0028] Frente a este cenário e buscando alternativas de novos tratamentos de tumores utilizando a imunoterapia, os pesquisadores partiram do fato de que o fator de transcrição FOXP3 é considerado uma chave mestra na regulação do fenótipo imunossupressor das células Treg, e desenvolveram compostos capazes de produzir o silenciamento específico de FOXP3, com o objetivo de inibir seletivamente células Treg, inibidoras da atividade antitumoral, sem comprometer a funcionalidade de células T efetoras e, como isso, permitir que o sistema imunológico do paciente possa atuar no combate ao câncer.
[0029] Dentro dos melhores conhecimentos dos presentes inventores, não existe, no atual estado da técnica, qualquer publicação que descreva os compostos descritos e seu uso como imunoterapia no tratamento de doenças onde a supressão da resposta imune não é desejada.
[0030] A presente invenção tem como objetivo fornecer novos compostos capazes de inibir a transcrição do gene que codifica o fator FOXP3 (Forkhead box P3). Os compostos são RNAs de interferência que promovem o silenciamento gênico transcricional (TGS) do gene FOXP3.
[0031] Mais precisamente, tais compostos são: moléculas de shRNA (short hairpin RNA); moléculas de siRNA (small interferingRNA) que são duplas fitas de RNA de cerca de 21 pares de bases; ou moléculas de sasRNA (small antisenseRNA), que são fitas simples de RNA de interferência de cerca de 20 bases nucleotídicas.
[0032] As moléculas de RNA de interferência TGS da invenção exercem efeito inibitório com base na complementaridade entre RNA e DNA, induzindo alterações epigenéticas que resultam em silenciamento gênico.
[0033] Um outro aspecto da invenção inclui os referidos compostos associados a sistemas de entrega para veiculação do RNA de interferência para o interior da célula alvo. Tais sistemas incluem diversas estratégias, como vetores virais, anticorpos, peptídeos, nanopartículas, lipossomos e aptâmeros de RNA ou DNA.
[0034] Em um aspecto particular da presente invenção, as moléculas de shRNA são veiculadas por meio de vetores de expressão que compreendem sequências genéticas que codificam o RNA de interferência sob a regulação de sequências que promovem sua expressão no interior da célula alvo. As moléculas de siRNA ou sasRNA são sintetizadas quimicamente, podendo ser acopladas com outros elementos para veiculação da molécula de RNA de interferência para o interior de células alvo. As moléculas sintéticas de siRNA e sasRNA podem incluir bases nitrogenadas modificadas, por exemplo, bases fluorinadas, que conferem maior estabilidade à molécula de RNA de interferência.
[0035] Também é objeto da presente invenção fornecer processos para a obtenção dos novos compostos.
[0036] Outro aspecto da presente invenção é o uso dos compostos na preparação de composições farmacêuticas úteis no tratamento do tumor, mais especificamente no tratamento de câncer, bem como para promover o silenciamento do gene FOXP3 e para potencializar a imunidade antitumoral.
[0037] Além disso, a presente invenção também tem como objetivo fornecer composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade efetiva de pelo menos um dos compostos da invenção ou a combinação entre eles, e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0038] Em outro aspecto, os compostos nas composições farmacêuticas da invenção podem apresentar bases nitrogenadas modificadas, como por exemplo bases fluorinadas.
[0039] Adicionalmente, são descritas composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção que promovem o silenciamento transcricional do gene FOXP3 associados a veículos para sua entrega às células, como vetores virais, preferencialmente vetores lentivirais, ou aptâmeros de RNA ou DNA.
[0040] Em particular, são descritas composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um dos compostos de RNA de interferência capazes de inibir a transcrição do gene que codifica o fator FOXP3 (Forkhead box P3) e, assim, promover o silenciamento gênico transcricional (TGS) do gene FOXP3. As referidas composições são úteis no tratamento e/ou prevenção de tumor, mais especificamente no tratamento e/ou prevenção de câncer.
[0041] Também é objeto da invenção o uso dos compostos no tratamento e/ou prevenção de tumor, mais especificamente no tratamento e/ou prevenção de câncer, bem como para potencializar a imunidade antitumoral e para promover o silenciamento do gene FOXP3.
[0042] A presente invenção também visa um método para potencializar a imunidade antitumoral compreendendo a administração de pelo menos um dos compostos ou mistura deles, sendo que o método pode compreender a associação com outras terapias antitumorais disponíveis.
[0043] Figura 1 - Esquema do aptâmero quimérico 41BB-sasRNA, em que sasRNA é selecionado do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78.
[0044] Figura 2 - O aptâmero 41BB-TS6 inibe FoxP3 em células T regulatórias. O gráfico mostra a expressão de FoxP3 determinada por citometria de fluxo. No eixo X, ITR é o controle não tratado, 41BB-ctr o controle negativo e 41BB-TS6 é a molécula terapêutica.
[0045] Figura 3 - O gráfico mostra proliferação de células T CD8 incubadas com Treg. No eixo X, temos diferentes tratamentos de Treg, sendo: ITR, Treg não tratada; 41BB-ctr, o aptâmero contendo sequência irrelevante de sas-RNA; 41BB-Ts6, aptâmero quimérico contendo sasRNA para inibir FoxP3; e CD8, células T CD8 na ausência de Treg.
[0046] Figura 4 - Curva de crescimento tumoral. O volume do tumor é medido em função do tempo nos animais submetidos aos tratamentos indicados.
[0047] A presente invenção descreve novos compostos úteis para inibir a transcrição do gene FOXP3, que codifica o fator de transcrição FOXP3 (Forkhead box P3) e, assim, inibir seletivamente as células T regulatórias (Treg), que têm fenótipo imunossupressor e são inibidoras da atividade antitumoral, sem, no entanto, comprometer a funcionalidade de células T efetoras, permitindo que o sistema imunológico do paciente possa atuar no combate ao câncer.
[0048] Os compostos da invenção são ácidos nucleicos, mais particularmente do tipo RNA de interferência, uma ferramenta para manipular a expressão gênica amplamente utilizada para entender a função de diferentes genes e até mesmo usada como opção terapêutica para várias doenças.
[0049] Em um aspecto preferencial, a invenção, que se baseia no silenciamento gênico transcricional (TGS), compreende moléculas do tipo short hairpinRNA (shRNA), small interferingRNA (siRNA) e small antisenseRNA (sasRNA). Essas moléculas apresentam atividade inibitória com base na complementaridade entre RNA e DNA, induzindo alterações epigenéticas que resultam em silenciamento gênico. Estas modificações epigenéticas são baseadas na metilação de DNA e modificação de histonas para um estado menos acessível.
[0050] De um modo particular, os compostos da presente invenção são moléculas de ácidos nucleicos que podem ser codificadas por vetores de expressão ou sintetizadas quimicamente.
[0051] As moléculas do tipo shRNA da invenção são veiculadas por vetores de expressão. Nesse caso, o RNA de interferência é codificado por um fragmento que contém fita senso de DNA, cuja sequência é definida por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39. Para geração de uma molécula de RNA de interferência, o vetor de expressão deve codificar um cassete de expressão que apresenta um promotor de RNA polimerase II a montante de um DNA dupla fita, o dito DNA compreende uma sequência senso selecionada entre as sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39, uma sequência hairpin e a sequência antisenso seguida do sinal de terminação. A transcrição dessa construção de DNA irá gerar, no interior das células alvo, moléculas de RNA de interferência do tipo shRNA para inibição transcricional de FOXP3. Assim, a presente invenção inclui um vetor de expressão que compreende uma sequência senso selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39. Em um aspecto particular da invenção, o vetor é lentiviral. Em outro aspecto da invenção, são incluídas partículas virais recombinantes, úteis para a veiculação dos vetores da invenção ao interior da célula alvo.
[0052] Já as moléculas da invenção do tipo sasRNA ou siRNA são RNAs de interferência que podem ser sintetizados quimicamente. As moléculas de sasRNA ou siRNA compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78. Tabela 1. Sequências candidatas para geração de moléculas de RNA de interferência TGS.
[0053] Os compostos RNA de interferência da invenção têm ação intracelular e têm como alvo o genoma celular, bastando uma única molécula para bloquear a expressão gênica de FOXP3. Os referidos compostos do tipo RNA de interferência da invenção, que compreendem as sequências SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO 78 em sua estrutura, são complementares a sítios ricos em citosinas seguidas por guaninas (CpG) no promotor. Tais regiões são susceptíveis de metilação por metiltransferases e, consequentemente, podem induzir o silenciamento gênico transcricional (TGS).
[0054] Um outro aspecto da invenção provê os compostos RNA de interferência da invenção do tipo siRNA e sasRNA compreendendo as sequências definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 nos quais as bases nitrogenadas estão modificadas. Mais precisamente, as bases modificadas são fluorinadas. As bases nitrogenadas fluorinadas em SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 são, preferencialmente, 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP. As bases dCTP e dUTP são fluorinadas para aumentar estabilidade do RNA, possibilitando sua aplicação in vivo.
[0055] Também são objetos da presente invenção os compostos SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 associados a veículos que promovam sua entrega intracelular. Mais precisamente, os compostos SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 podem ser acoplados a anticorpos, aptâmeros, nanopartículas, lipossomos, peptídeos, vetores virais, entre outros vetores, para que sejam carreados para o interior das células. Em um aspecto da presente invenção, os compostos SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 estão associados a um aptâmero. Uma vez que células Treg podem apresentar expressão constitutiva de 4-1BB (Goldstein MJ, Kohrt HE, Houot R, Varghese B, Lin JT, Swanson E, et al. Adoptive cell therapy for lymphoma with CD4 T cells depleted of CD137-expressing regulatory T cells. Cancer Res. 2012;72(5):1239-47.), os inventores postularam que este seria um excelente receptor para internalização dos compostos SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78. Preferencialmente, o aptâmero é dirigido ao receptor 4-1BB de células T Alternativamente, outros aptâmeros dirigidos a receptores de células T humanas como CD4, CD28, OX40, entre outros também podem ser utilizados. Em um aspecto da presente invenção, os candidatos sasRNA-TGS se apresentam como uma fita simples e são desenhados para serem unidos à extremidade 3' do aptâmero, gerando as construções quiméricas. Os inventores da presente invenção demonstraram que a associação dos compostos sasRNA da invenção a aptâmeros de RNA promoveram seu efeito intracelular. Deste modo, uma concretização da invenção inclui aptâmeros quiméricos que compreendem uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 ligada a um aptâmero.
[0056] Em outra concretização, a presente invenção refere-se ao processo de produção dos compostos RNA de interferência SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78. Mais precisamente, a invenção descreve um processo de síntese química dos compostos, que inclui 4 etapas:
[0057] a. Síntese de uma sequência molde (template) de DNA fita simples;
[0058] b. Amplificação de material;
[0059] c. Transcrição de RNA a partir de material molde obtido na etapa “b”;
[0060] d.Purificação do material transcrito obtido na etapa “c”.
[0061] A síntese química do material molde na etapa “a” pode ser realizada na forma de oligonucleotídeos por metodologias conhecidas no estado da técnica.
[0062] A amplificação de material na etapa “b” é realizada por tecnologia de PCR, utilizando iniciadores senso e antisenso. O material obtido na etapa b consiste em DNA dupla-fita, que é purificado com colunas de cromatografia.
[0063] Para a transcrição descrita na etapa “c”, podem ser utilizadas as metodologias convencionais descritas no estado da técnica. Por exemplo, emprega-se kits comerciais contendo enzima T7 polimerase e, como substrato para a polimerização, são usados os monômeros ATP, GTP, 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP.
[0064] A purificação descrita na etapa "d" é realizada a partir de gel SDS-PAGE com eluição em solução salina. A seguir, o material eluido é filtrado em 0,22 um.
[0065] Em uma modalidade, a presente invenção descreve o uso dos compostos da invenção na preparação de composições farmacêuticas. Esta modalidade compreende o uso de vetores que codificam compostos shRNA da invenção e dos compostos siRNA e sasRNa da invenção na preparação de composições farmacêuticas. Em outra modalidade, as sequências siRNA e sasRNa da invenção apresentam bases nitrogenadas modificadas, por exemplo, fluorinadas. Em outra modalidade da invenção, os compostos de RNA de interferência da invenção estão acoplados a veículos que promovam sua entrega no interior da célula.
[0066] A presente invenção também contempla composições farmacêuticas, ou seja, uma forma apropriada de dosagem, onde a composição citada compreende como ingrediente ativo uma quantidade efetiva de um ou mais dos compostos da invenção. Os ditos compostos da invenção presentes nas composições farmacêuticas são os vetores de expressão que codificam as moléculas de shRNA, ou seja, compreendem uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39, ou ainda os compostos são os siRNA ou sasRNA que compreendem em sua estrutura uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78, e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em um aspecto da invenção, as sequências de siRNA ou sasRNA apresentam bases nitrogenadas modificadas, por exemplo, fluorinadas. Em outra modalidade da invenção, os compostos da invenção estão acoplados a veículos que promovam sua entrega no interior da célula. As referidas composições farmacêuticas são úteis para promover o silenciamento do gene FOXP3, potencializar a imunidade antitumoral, tratamento e/ou prevenir tumores e tratamento e/ou prevenir câncer.
[0067] Em uma modalidade preferencial da invenção, as composições compreendem como ingrediente ativo um ou mais compostos que são sequências de sasRNA cuja estrutura compreende uma sequência selecionada entre aquelas definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 e cujas bases nitrogenadas são fluorinadas para promover o aumento da estabilidade da sequência in vivo, tais bases fluorinadas são 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP e, ainda, são associados a veículos para sua entrega nas células. O veículo preferencial é um aptâmero dirigido ao receptor 4-1BB de células T Alternativamente, outros aptâmeros dirigidos a receptores de células T humanas como CD4, CD28, OX40, entre outros também podem ser utilizados.
[0068] As composições farmacêuticas podem ser preparadas por métodos bem conhecidos pelo estado da técnica.
[0069] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas, preferencialmente, por via injetável.
[0070] A presente invenção também descreve um método para potencializar a imunidade antitumoral compreendendo a administração de pelo menos um dos compostos do tipo RNA de interferência da invenção, ou seja, vetores que codificam a sequência de shRNA que compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39, ou sasRNA compreendendo sequências selecionadas de SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78, ou siRNA compreendendo sequências selecionadas de SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78, ou mistura deles. Adicionalmente, um método de tratamento de câncer administrando uma dose efetiva de pelo menos um dos compostos descritos. Mais especificamente, o método pode compreender a associação do composto, objeto da presente invenção, com outras terapias antitumorais disponíveis, como quimioterapia, radioterapia, imunoterapia e similares.
[0071] O termo "câncer" divulgado neste documento compreende câncer de pulmão, câncer de pulmão celular de arsênico, câncer de cólon, câncer de osso, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer cefálico ou cervical, melanoma cutâneo ou endoftálmico, histerocarcinoma, neuroblastoma, câncer de ovário, câncer retal, câncer de estômago, câncer perianal, câncer de cólon, câncer de mama, dometrioma, carcinoma cervical, carcinoma vaginal, carcinoma vulval, doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer entérico, câncer de glândula endócrina, câncer de tireóide, câncer de paratireóide, câncer adrenal, sarcoma de tecido liso , câncer uretral, câncer peniano, câncer prostático, leucemias, leucemia crônica ou aguda, linfocitoma, câncer cístico, câncer nefrítico ou hidrourético, carcinoma de células renais, carcinoma pélvico renal, tumor do SNC, linfoma primário do SNC, tumor da medula espinhal, neuroglioma do tronco cerebral, adenomatose hipofisária e similar.
[0072] Entende-se o termo “uma quantidade efetiva” por qualquer dosagem/concentração dos compostos capaz de inibir a transcrição do fator FOXP3 (Forkhead boxP3) e, com isso, inibir seletivamente as células Treg.
[0073] O termo “composto” divulgado neste documento pode compreender as sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 78. O termo “composto” inclui, ainda, as sequências de RNA definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 com modificações em suas bases nitrogenadas. As referidas modificações incluem, por exemplo, bases fluorinadas, como 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP. O termo “composto” inclui, ainda, as sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 78, com ou sem bases nitrogenadas modificadas, acopladas a veículos para sua entrega intracelular. Os veículos incluem anticorpos, aptâmeros de RNA, aptâmeros de DNA, nanopartículas, lipossomos, vetores virais, peptídeos, entre outros vetores, sendo preferencialmente um aptâmero de RNA. O termo “composto” inclui as sequências de RNA definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 associadas a um aptâmero dirigido ao receptor 4-1BB de células T O termo “composto” inclui ainda sequências de DNA, mais precisamente vetores de expressão, que codifiquem uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39 em uma construção cuja expressão origine moléculas de shRNA no interior das células alvo. Tais vetores são preferencialmente vetores plasmidiais virais, mais preferencialmente vetores lentivirais. O termo “composto” inclui ainda partículas virais recombinantes compreendendo os vetores da invenção, as quais podem ser usadas para sua veiculação à célula alvo.
[0074] Os exemplos a seguir, descritos detalhadamente, ilustram a presente invenção sem, todavia, limitar seu escopo de proteção, e que várias modificações, à luz das mesmas, serão sugestivas aos especialistas na técnica. Tais realizações equivalentes devem estar incluídas dentro do escopo e alcance das reivindicações que acompanham.
[0075] Primeiramente, por meio de análises de bioinformática utilizando-se a plataforma VISTA (https://rvista.dcode.org/) do NIH (Loots GG, Ovcharenko I, Pachter L, Dubchak I, Rubin EM. rVista forComparative Sequence-Based Discovery of Functional Transcription Factor Binding Sites rVista for Comparative Sequence-Based Discovery of Functional Transcription Factor Binding Sites. Genome Res. 2002;832-9.), os inventores determinaram sequências alvo para o silenciamento gênico transcricional no gene FOXP3. As análises foram realizadas a partir da sequência do gene humano (FOXP3, número de acesso NCBI NG_007392.1) e murino (FoxP3, número de acesso NCBI AF277994.1).
[0076] Para isso, usaram como critérios a busca por regiões de alta homologia entre camundongos e humanos (regiões maiores de 500 pb e com mais de 76% de homologia) e regiões compreendendo alta quantidade de citosinas seguidas por guaninas (CpG), susceptíveis de metilação por metiltransferases.
[0077] Depois de selecionar as regiões do hotspot de FoxP3, considerando-se especificamente a região do promotor, os candidatos de RNA de interferência TGS foram gerados com auxílio de um algoritmo disponibilizado pelo Dr. Kevin Morris, City of Hope (EUA), conforme descrito no trabalho publicado: Ackley A, Lenox A, Stapleton K, Knowling S, Lu T, Sabir KS, et al. An Algorithm for Generating Small RNAs Capable of Epigenetically Modulating Transcriptional Gene Silencing and Activation in Human Cells. Mol Ther Nucleic Acids. 2013 Jan;2(May):e104.
[0078] Esse processo levou ao desenho das sequências candidatas para geração de moléculas de RNA de interferência TGS (Tabela 1).
[0079] Inicialmente, os inventores optaram por gerar sequências de DNA codificantes de shRNA, que poderiam ser veiculadas por vetores lentivirais. Essas sequências de DNA codificantes de shRNA são compostas por uma sequência senso proveniente do algoritmo, um hairpin, uma sequência antisenso e um sinal de terminação. O shRNA completo é uma dupla fita de DNA, que contém, portanto, a sequência senso, um hairpin, a sequência antisenso. O shRNA é clonado num vetor de expressão plasmidial lentiviral à jusante de um promotor de RNA polimerase II. Esse vetor plasmidial é utilizado para produção de partículas virais recombinantes que codificam o shRNA. Essas partículas têm a capacidade de veicular o cassete de expressão de shRNA para o interior de uma célula, que terá produção do RNA de interferência para inativar FOXP3. A sequência do RNA de interferência, é a sequência de RNA, correspondente a sequência da fita senso de DNA, conforme Tabela 1 para cada candidato. Essa molécula de RNA de interferência é que inibirá a expressão de FOXP3 na célula alvo.
[0080] Os candidatos de shRNA-TGS complementares à região do promotor de FOXP3 da Tabela 1 tiveram suas sequências de DNA sintetizadas como oligonucleotídeos, flanqueados por extremidades coesivas e clonados no vetor PLKO THY1.1 usando BamHI e EcoRI. Após realizar a ligação, bactérias DH5α foram transformadas e cultivadas por 16 horas a 37°C. Aquelas colônias que crescessem foram utilizadas para PCR de colônia. Os clones positivos foram selecionados para miniprep e confirmação de sequenciamento, aqueles que tivessem os candidatos de RNA confirmados por sequenciamento foram depois isolados com kit de midiprep (Quiagen) e usados para as preparações virais.
[0081] Os veículos virais apresentam uma boa eficiência na entrega celular dos candidatos, entretanto, sistemas não virais podem aumentar a biossegurança de uma estratégia para inibição de Treg, pensando-se no desenvolvimento de futuras aplicações voltadas à terapia humana. Assim, foram produzidos aptâmeros quiméricos de RNA contendo sequências de sasRNA tal como definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78. Estes aptâmeros foram baseados no aptâmero 4-1BB, originalmente desenvolvido e otimizado pelo grupo do Dr. Eli Gilboa Universidade de Miami. Os candidatos de RNA de interferência sasRNA se apresentam como uma fita simples e foram desenhados para serem unidos à extremidade 3' do aptâmero de RNA 4-1BB gerando as construções quiméricas (Figura 1).
[0082] Inicialmente, os aptâmeros foram sintetizados a partir de moldes de DNA. Estes moldes de DNA foram amplificados numa PCR convencional usando os oligos específicos. Os produtos de PCR foram purificados usando as colunas QIAprep Spin (Qiagen, Valencia, CA). O aptâmero de ARN foi transcrito usando a polimerase T7 (Y639F). Os produtos foram purificados por electroforese em gel de poliacrilamida e concentrados numa coluna 30 Kda Amicon Ultra-4 (Millipore, Billerica, MA). Após disso foi medida a concentração no nanodrop (Thermo).
[0083] Para avaliar o efeito inibitório dos aptâmeros quiméricos em Treg, utilizamos nosso modelo de silenciamento de Foxp3 em células iTReg. Assim, células CD4 pré ativadas e induzidas para Treg foram incubadas com os aptâmeros por 24 horas e depois deixadas em cultura por mais 72 horas. Após a incubação, as células foram coletadas, coradas para FOXP3 e analisadas por citometria de fluxo (Figura 2).
[0084] Os resultados obtidos demonstram claramente que o aptâmero quimérico 41BB-Ts6 é eficaz na inibição de Foxp3.
[0085] As células Treg apresentam a propriedade de inibir a proliferação de células T No caso do câncer, a infiltração de células Treg no sítio tumoral pode antagonizar a resposta antitumoral. Sendo assim, os inventores efetuaram um ensaio de proliferação em que células T incubadas com células Treg apresentam redução na proliferação. Essas células Treg, portanto apresentam atividade imunossupressora. Os inventores verificaram claramente que células Treg incubadas com aptâmero 41BB-TS6 tiveram o potencial de imunossupressão reduzido, observando-se aumento de proliferação de células T efetoras, acima da condição na ausência de aptâmero (ITR). (Figura 3)
[0086] Para esse estudo, foram utilizados animais c56bl desafiados com tumores singenicos derivados de melanoma, B16-F10. Os animais receberam tratamento com a vacina antitumoral GVAX e também com aptâmero controle (41BB-CTR) e aptâmero terapêutico (41BB-TS6). Podemos verificar claramente que animais que receberam o aptâmero terapêutico apresentam significativa redução no crescimento tumoral (Figura 4).
Claims (27)
1. Sequências de ácidos nucleicos caracterizadas por consistir de uma sequência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 78.
2. Vetor de expressão que codifica um RNA de interferência, o dito vetor caracterizado por compreender uma sequência senso selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 sob a regulação de sequências que promovem a expressão do RNA de interferência no interior da célula alvo.
3. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender um promotor de RNA polimerase II a montante da sequência senso.
4. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por codificar RNA de interferência do tipo short hairpinRNA.
5. Vetor de expressão, de acordo com as reivindicações 2 a 4, caracterizado por compreender, adicionalmente à sequência senso selecionada do grupo de sequências definidas por SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 39, uma sequência hairpine a sequência antisenso seguida do sinal de terminação.
6. Vetor de expressão, de acordo com as reivindicações 2 a 5, caracterizado por ser um vetor lentiviral.
7. Partícula viral recombinante caracterizada por compreender um vetor tal como definido nas reivindicações 2 a 6.
8. Sequências de short hairpinRNA caracterizadas por compreender uma sequência senso selecionada do grupo das sequências definidas por SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 e, adicionalmente, uma sequência hairpine a sequência antisenso.
9. Sequências de RNA de interferência caracterizadas por compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 78.
10. Sequência de RNA de interferência de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por ser do tipo small interference RNA ou small antisense RNA.
11. Sequência de RNA de interferência de acordo com as reivindicações 9 e 10, caracterizada por compreender bases nitrogenadas fluorinadas.
12. Sequência de RNA de interferência de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as bases fluorinadas são 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP.
13. Sequência de RNA de interferência de acordo com as reivindicações 9 a 12, caracterizada por ser acoplada a anticorpos, aptâmeros, nanopartículas, lipossomos, peptídeos ou vetores virais para que sejam carreados para o interior das células.
14. Sequência de RNA de interferência de acordo com as reivindicações 9 e 13, caracterizada por ser acoplada um aptâmero.
15. Sequência de RNA de interferência de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por ser acoplada à extremidade 3’ do aptâmero.
16. Sequência de RNA de interferência de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por ser acoplada a um aptâmero, em que o aptâmero é dirigido ao receptor 4-1BB de células T, ou a outros aptâmeros dirigidos a receptores de células T humanas que consistem de CD4, CD28 e OX40.
17. Aptâmeros quiméricos, caracterizados por compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 ligada a um aptâmero.
18. Processo de obtenção de siRNA e sasRNA caracterizado por compreender as etapas: Síntese de uma sequência molde (template) de DNA fita simples; Amplificação de material por tecnologia de PCR, utilizando iniciadores senso e antisenso; Transcrição de RNA a partir de material molde de DNA dupla-fita obtido na etapa de amplificação com enzima T7 polimerase; Purificação do material transcrito obtido na etapa de transcrição, em que o RNA de interferência do tipo siRNA ou sasRNA compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste das sequências definidas por SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78.
19. Uso dos compostos definidos nas reivindicações 1 a 17 caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para promover o silenciamento do gene FOXP3.
20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para potencializar a imunidade antitumoral.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de tumores e para tratamento de câncer.
22. Composições farmacêuticas caracterizadas por compreender como ingrediente ativo uma ou mais sequências de ácidos nucléicos tais como definidas nas reivindicações 1 a 17 mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
23. Composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadas por serem para o tratamento e / ou prevenção de câncer.
24. Composições farmacêuticas caracterizadas por compreender como ingrediente ativo um ou mais compostos que são sequências de sasRNA cuja estrutura compreende uma sequência selecionada entre aquelas definidas por SEQ ID NO: 40 a SEQ ID NO: 78 e cujas bases nitrogenadas são fluorinadas, tais bases fluorinadas são 2’-F-dCTP e 2’-F-dUTP e, ainda, são associados a veículos para sua entrega nas células, em que tais veículos são aptâmeros.
25. Método para potencializar a imunidade antitumoral caracterizado por ser por meio da administração de pelo menos um dos compostos conforme definidos nas reivindicações 1 a 17.
26. Uso dos compostos tais como definidos nas reivindicações 1 a 17, caracterizado por ser no tratamento e/ou prevenção de tumor, mais especificamente no tratamento e/ou prevenção de câncer.
27. Uso dos compostos de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por ser em associação com outras terapias antitumorais disponíveis.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR102020024609A2 true BR102020024609A2 (pt) | 2024-04-09 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11590171B2 (en) | Targeted replacement of endogenous T cell receptors | |
| Helmy et al. | Cancer immunotherapy: accomplishments to date and future promise | |
| CN105849269B (zh) | Rna转录载体及其用途 | |
| BR112019020001A2 (pt) | linhagens celulares estimuladoras para expansão ex vivo e ativação de células exterminadoras naturais | |
| KR102495308B1 (ko) | 면역 기능 제어 인자를 발현하는 면역 담당 세포 및 발현 벡터 | |
| JP2019006792A (ja) | 治療剤の送達方法 | |
| US20200347386A1 (en) | Combination gene targets for improved immunotherapy | |
| JP2019532640A (ja) | 免疫原性が低下したｈｌａクラスｉ欠損ｎｋ−９２細胞 | |
| WO2019154391A1 (zh) | 嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的nkg2d car-nk细胞及其制备方法和应用 | |
| JP2021536435A (ja) | 核酸とｃａｒ修飾免疫細胞とを含む治療薬およびその使用 | |
| JPWO2019178422A5 (pt) | ||
| JP2021522188A (ja) | 内因性遺伝子活性化を用いる多重腫瘍ワクチン接種のための組成物および方法 | |
| Zilio et al. | 4PD functionalized dendrimers: a flexible tool for in vivo gene silencing of tumor-educated myeloid cells | |
| CN106574241A (zh) | 癌症免疫疗法组合物和方法 | |
| CN114729325A (zh) | 在培养物中具有改善的持久性的基因工程化t细胞 | |
| BR112021014442A2 (pt) | Composições de regulação gênica e métodos para imunoterapia aprimorada | |
| Lee et al. | Precision medicine-enabled cancer immunotherapy | |
| Puig-Saus et al. | Gene editing: Towards the third generation of adoptive T-cell transfer therapies | |
| BR102020024609A2 (pt) | Compostos de rna de interferência para inibição transcricional de foxp3 métodos de obtenção, composições farmaceuticas contendo-os e uso | |
| JP2022552197A (ja) | 自己細胞療法で免疫療法の非応答者を治療する方法 | |
| US20210069245A1 (en) | Mirna modulation of t cell signaling and uses thereof | |
| US20220362308A1 (en) | Oral administration of genetically engineered bacteria | |
| Wang et al. | Gene-modified bone marrow cell therapy for prostate cancer | |
| WO2024059821A2 (en) | Car t cell compositions for treatment of cancer | |
| WO2024161014A1 (en) | Splice-switching antisense oligonucleotide (sso) modulating the expression of a tumor specific protein derived from te-exon junction (jet) transcript |