BR112020007880A2 - receptor de células t - Google Patents

Abstract

  A presente invenção refere-se a um novo receptor de células T (TCR), em particular pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) do mesmo; uma célula T expressando o dito TCR; um clone expressando o dito TCR; um vetor codificando o dito TCR; uma versão solúvel do dito TCR; uma composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina compreendendo o dito TCR, a dita célula, o dito clone ou o dito vetor; uso do dito TCR ou da dita célula ou do dito clone ou do dito vetor ou da dita composição farmacêutica ou do agente imunogênico ou biespecífico ou vacina para tratar câncer; e um método de tratamento de câncer usando o dito TCR, a dita célula, o dito clone, o dito vetor, a dita composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina compreendendo o dito TCR.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEPTOR DE CÉLULAS T". Campo Técnico

[0001] A presente descrição refere-se a um novo receptor de células T (TCR), em particular pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) do mesmo; uma célula T expressando o dito TCR; um clone expressando o dito TCR; um vetor codificando o dito TCR; uma versão solúvel do dito TCR; uma composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina compreendendo o dito TCR, a dita célula, o dito clone ou o dito vetor; uso do dito TCR ou da dita célula ou do dito clone ou do dito vetor ou da dita composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina para tratar o câncer; e um método de tratamento de câncer usando o dito TCR, a dita célula, o dito clone, o dito vetor, a dita composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina compreendendo o dito TCR. Antecedentes

[0002] Descobriu-se uma nova classe de células T eficaz no tratamento de câncer, que reconhece as células cancerosas por meio da proteína relacionada à classe de complexo principal de histocompatibilidade invariável à população (MR)1. A identificação dessa nova célula T resultou de experimentos em busca de células T que reconhecem células cancerosas sem a necessidade de um antígeno específico de leucócitos humanos (HLA). O locus HLA é altamente variável, com mais de 17.000 alelos diferentes tendo sido descritos hoje. Como tal, qualquer abordagem terapêutica que funcione via HLA só pode ser eficaz em uma minoria de pacientes. Por outro lado, toda a população humana expressa MR1.

[0003] O principal tipo de células T restritas a MR1 que são conhecidas é chamado de células T invariantes associadas à mucosa

(MAITs). Sabe-se que os MAITs reconhecem intermediários da biossíntese de riboflavina microbacteriana. Estudos recentes deste próprio laboratório e de outros laboratórios mostraram que também existem outros tipos de células T restritas a MR1 que reconhecem diferentes ligantes ligados a MR1. O trabalho aqui descrito mostra que essa nova classe de células T tem especificidade alvo via MR1, mas o TCR não se liga ao MR1 propriamente dito ou ao MR1 carregado com ligantes infecciosos conhecidos, de preferência essa célula T reconhece um ligante específico do câncer dentro da ranhura de ligação a MR1; o MR1 apresenta um ligante câncer-específico, ou câncer-induzido para o TCR.

[0004] Este novo clone de células T, MC.7.G5, foi descoberto durante uma triagem de células T a partir de um doador saudável que não correspondia ao HLA para a linhagem de células epiteliais basais alveolares de adenocarcinoma, A549 (referência de ATCC® CCL-185 para informação). A abordagem experimental envolveu a incubação de células T com células A549 e então o isolamento e clonagem de células T que se proliferaram em resposta às células A549. Investigações posteriores mostraram que o clone de células T MC.7.G5 foi capaz de reconhecer e matar células cancerosas, além de células cancerosas de vários órgãos e tipos de tecidos, mostrando assim que o clone tinha potencial para tratar a maior parte dos tipos de câncer.

[0005] Como é conhecido, e como mostrado na Figura 12, o TCR é uma proteína heterodimérica ancorada em membrana ligada a dissulfeto, que consiste normalmente nas cadeias alfa (α) e beta (β) altamente variáveis que se associam às moléculas da cadeia CD3 invariante para formar um TCR de funcionamento completo. As células T que expressam este receptor são chamadas de células T α:β (ou αβ).

[0006] As cadeias α e beta β são compostas por domínios extracelulares compreendendo uma região constante (C) e uma região variável (V). A região constante é proximal à membrana celular, seguida por uma região transmembrana e uma cauda citoplasmática curta, enquanto a região variável se liga ao ligante. O ligante para a maior parte das células T αβ é um peptídeo ligado a uma molécula MHC.

[0007] O domínio variável tanto da cadeia α quanto da cadeia β de TCR tem três regiões variáveis chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Há também uma área adicional de variabilidade na cadeia β (HV4) que normalmente não entra em contato com o antígeno e, portanto, não é considerada uma CDR. Em geral, o sítio de ligação ao antígeno é formado pelas alças de CDR da cadeia α e da cadeia β de TCR. CDR1α e CDR2α são codificadas pelos genes Vα individuais, enquanto CDR1β e CDR2β são codificadas pelos genes Vβ individuais. A CDR3 da cadeia α de TCR é hipervariável devido ao potencial de adição e remoção de nucleotídeos em torno da junção da região V e da região de junção. A CDR3 de cadeia β de TCR tem ainda mais capacidade de variação, pois também pode incluir um gene de diversidade (D).

[0008] A CDR3 é a principal CDR responsável pelo reconhecimento do antígeno processado, embora também tenha sido demonstrado que a CDR1 da cadeia alfa também interage com a parte N-terminal do peptídeo antigênico, e a CDR1 da cadeia β interage com a parte C- terminal do peptídeo.

[0009] Em 2015, cerca de 90,5 milhões de pessoas tiveram câncer. Cerca de 14,1 milhões de novos casos ocorrem por ano (não incluindo câncer de pele que não melanoma). Ele causa cerca de 8,8 milhões de mortes (15,7%) humanas. Os tipos mais comuns de câncer em homens são câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer colorretal e câncer de estômago. Nas mulheres, os tipos mais comuns de câncer são câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão e câncer de colo do útero. Se o câncer de pele, que não melanoma, fosse incluído no total de novos cânceres a cada ano, isso representaria cerca de 40% dos casos. Em crianças, a leucemia linfoblástica aguda e os tumores cerebrais são mais comuns, exceto na África, onde o linfoma não- Hodgkin ocorre com mais frequência. Em 2012, cerca de 165.000 crianças menores de 15 anos foram diagnosticadas com câncer. O risco de câncer aumenta significativamente com a idade e muitos cânceres ocorrem mais comumente em países desenvolvidos. As taxas estão aumentando à medida que mais pessoas vivem até a velhice e à medida que mudanças no estilo de vida ocorrem no mundo em desenvolvimento. Os custos financeiros do câncer foram estimados em US $ 1,16 trilhões por ano a partir de 2010. Segue-se que é necessário fornecer maneiras melhores e mais seguras de tratar ou erradicar esta doença. Uma imunoterapia que usa os sistemas de defesa natural do corpo para matar tecido aberrante é reconhecida como mais segura do que a intervenção química, mas, para ser eficaz, a imunoterapia deve ser específica para o câncer. Além disso, a descoberta de uma imunoterapia eficaz contra qualquer tipo de câncer seria extremamente benéfica, pois não só poderia ser administrada a indivíduos que sofrem de muitos tipos diferentes de câncer (isto é, teria aplicação em população), mas também poderia ser administrada a um único indivíduo que sofre de mais de um tipo de câncer. Além disso, a identificação de uma imunoterapia que não fosse restrita ao MHC também seria extremamente vantajosa, pois significa que poderia ser administrada a qualquer indivíduo, independentemente do tipo de tecido de MHC.

[0010] As células T que foram identificadas aqui têm as características anteriormente vantajosas, pois são eficazes contra qualquer tipo de câncer e não são restritas ao MHC e, portanto, têm aplicação à população devido à expressão onipresente da molécula restritiva de MR1.

[0011] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um receptor de célula T específico para tumor (TCR) caracterizado por uma região determinante de complementaridade compreendendo ou consistindo de (CDR) CAYRSAVNARLMF (SEQ ID Nº: 1) e/ou CASSEARGLAEFTDTQYF (SEQ ID Nº: 2).

[0012] Em uma modalidade preferencial da invenção, a dita CDR compreende ou consiste em (CDR) CAYRSAVNARLMF (SEQ ID Nº: 1) e/ou CASSEARGLAEFTDTQYF (SEQ ID Nº: 2) ou uma CDR que compartilha pelo menos 88% de identidade com ela, tal como 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.

[0013] As CDRs descritas neste documento representam as CDR3s do dito TCR e, portanto, são as principais CDRs responsáveis pelo reconhecimento de antígeno ou ligante processado. As outras CDRs (CDR1alfa, CDR2alfa, CDR1beta e CDR2beta) são codificadas pela linhagem germinativa. Portanto, a invenção refere-se ainda a um TCR também incluindo uma ou mais dessas outras CDRs, isto é, CDR1alfa, CDR2alfa, CDR1beta ou CDR2beta.

[0014] Por conseguinte, em uma modalidade preferencial, o dito TCR compreende ou consiste emem uma ou mais, incluindo qualquer combinação, das seguintes regiões determinantes de complementaridade: TSESDYY (CDR1α) SEQ ID Nº: 3 ATEN (CDR2α) SEQ ID Nº: 4 MGHDK (CDR1β) SEQ ID Nº: 5 SYGVNS (CDR2β) SEQ ID Nº: 6

[0015] A referência aqui mencionada a um TCR específico para tumor é a um TCR que reconhece especificamente uma célula tumoral ou um ligante de célula tumoral, no contexto de MR1, e é ativado pelo mesmo, mas não é ativado por uma célula não tumoral ou um ligante de célula não tumoral, no contexto de MR1.

[0016] Em uma modalidade preferencial da invenção, o dito TCR é um TCR αβ com uma cadeia α e uma cadeia β e a dita CDR da dita cadeia α compreende ou consiste da CDR: CAYRSAVNARLMF (SEQ ID Nº: 1) ou uma CDR que compartilha pelo menos 88% de identidade com ela, tal como 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%; e a dita CDR da dita cadeia β compreende ou consiste da CDR: CASSEARGLAEFTDTQYF (SEQ ID Nº: 2) ou uma CDR que compartilha pelo menos 88% de identidade com ela, tal como 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Por conseguinte, o dito TCR pode compreender uma ou ambas as CDRs anteriores e, em uma modalidade preferencial, compreende ambas as ditas CDRs.

[0017] Ainda em uma outra modalidade preferencial, o dito TCR não é convencional, pois não é restrito ao MHC, mas se liga a um ligante específico para tumor no contexto de MR1, uma molécula alternativa do tipo MHC. Até então, pensava-se que as células T αβ restritas a MR1 eram exclusivamente células T invariantes associadas à mucosa (células MAIT), no entanto, foi demonstrado aqui que existe uma classe adicional de células T restritas a MR1 que não expressam a cadeia α de TCR MAIT, além disso, vantajosamente, essas células T e seus TCRs são específicos para tumor (isto é, respondem a células tumorais, mas não a células não tumorais), mas, surpreendentemente, são capazes de identificar qualquer tumor, independentemente da origem ou tipo de tecido e, portanto, têm potencial de terapia para todos os cânceres. Além disso, o fato de que essas células T e seus TCRs não são restritos ao MHC significa que eles têm potencial de terapia para toda a população e, portanto, representam uma nova terapia de câncer extremamente importante.

[0018] Em uma outra modalidade preferencial da invenção, a dita cadeia α do TCR compreende ou consiste em:

[0019] AQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYK

QPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLG DAAMYFCAYRSAVNARLMFGDGTQLVVKPNIQNPDPAVYQLRDSK

SSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS (SEQ ID Nº: 7) ou uma sequência que tenha pelo menos 88% de identidade com ela, tal como 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98% ou 99%.

[0020] Em uma outra modalidade preferencial da invenção, a dita cadeia β do TCR compreende ou consiste em:

[0021] EADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDP

GMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTS QYLCASSEARGLAEFTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPS EAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLK

EQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWT QDRAKPVTQIVSAEAWGRAD (SEQ ID Nº: 8) ou uma sequência que tenha pelo menos 88% de identidade com ela, tal como 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98% ou 99%.

[0022] (Nos parágrafos acima, o texto em negrito e sublinhado representa as CDRs)

[0023] Ainda em uma outra modalidade preferencial da invenção, o dito TCR compreende a dita cadeia α do TCR anterior e a dita cadeia β do TCR anterior.

[0024] Em ainda uma outra modalidade preferencial, o dito TCR é um TCR solúvel, ou sTCR, e, portanto, não tem os domínios transmembrana e, idealmente também, domínios intracelulares.

[0025] Ainda em outra modalidade preferencial da invenção, o dito TCR faz parte de um receptor quimérico tendo a funcionalidade aqui descrita.

[0026] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecida uma célula T expressando o dito TCR da invenção,

idealmente, em uma forma solúvel ou compatível com a membrana, isto é, tendo uma região transmembrana e região intracelular.

[0027] De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, é fornecido um clone de células T expressando o dito TCR da invenção, idealmente, em uma forma solúvel ou compatível com a membrana, isto é, tendo uma região transmembrana e uma região intracelular. De preferência, o dito clone é um clone MC.7.G5 como aqui descrito.

[0028] De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor codificando o dito TCR da invenção.

[0029] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina compreendendo o dito TCR ou célula ou clone ou vetor.

[0030] Em uma modalidade preferencial, a dita composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico é usada para tratar qualquer câncer, mas idealmente câncer colorretal, câncer de pulmão, de rim, de próstata, de bexiga, de colo de útero, melanoma (pele), de osso, de mama, de ovário ou sangue.

[0031] De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, é fornecido o uso do dito TCR ou célula ou clone ou vetor para tratar câncer.

[0032] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecido um método de tratamento de câncer compreendendo administrar o dito TCR ou célula ou clone ou vetor a um indivíduo a ser tratado.

[0033] Idealmente, o dito câncer é de qualquer tipo, mas em particular câncer colorretal, câncer de pulmão, de rim, de próstata, de bexiga, de colo do útero, melanoma (pele), de osso, de mama, de ovário ou de sangue.

[0034] Em um método preferencial da invenção, o dito TCR, célula,

clone ou vetor é administrado em combinação com um agente antitumoral tal como, mas não limitado a, um biespecífico.

[0035] A referência aqui feita a um biespecífico é uma referência a um anticorpo monoclonal biespecífico (BsMAb, BsAb) que é uma proteína artificial que pode se ligar simultaneamente a dois tipos diferentes de antígeno.

[0036] Alternativamente ainda, o dito TCR pode formar parte de um biespecífico em que o dito biespecífico inclui o dito TCR, com o objetivo de se ligar ao seu ligante em uma célula cancerosa, e também um componente ou ligante de ativação de célula imune que se liga e, assim, ativa uma célula imune, tal como uma célula T assassina.

[0037] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecida o uso do dito TCR ou célula ou clone ou vetor na fabricação de um medicamento para tratar câncer.

[0038] De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, é fornecida uma combinação terapêutica para o tratamento de câncer, que compreende: a) o dito TCR ou célula ou clone ou vetor em combinação com b) um outro agente terapêutico de câncer.

[0039] Nas reivindicações que seguem e na descrição anterior da invenção, exceto quando o contexto exige de outra forma, devido à linguagem expressa ou implicação necessária, a palavra "compreende", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo" são usadas de maneira inclusiva, ou seja, para especificar a presença dos recursos declarados, mas não impedir a presença ou adição de outros recursos em várias modalidades da invenção.

[0040] Todas as referências, incluindo qualquer patente ou pedido de patente, citadas nesta especificação são aqui incorporadas por referência. Não é admitido que qualquer referência constitua técnica anterior. Além disso, não é admitido que qualquer das técnicas anteriores constitua parte do conhecimento geral comum na técnica.

[0041] Os recursos preferenciais de cada aspecto da invenção podem ser como descrito em conjunto com qualquer um dos outros aspectos.

[0042] Outros recursos da presente invenção serão evidentes a partir dos seguintes exemplos. De um modo geral, a invenção se estende a qualquer novo recurso, ou qualquer nova combinação, dos recursos descritos nesta especificação (incluindo as reivindicações e desenhos em anexo). Assim, recursos, números inteiros, características, compostos ou porções químicas descritos em conjunto com um aspecto, modalidade ou exemplo particular da invenção devem ser entendidos como aplicáveis a qualquer outro aspecto, modalidade ou exemplo descrito aqui, a menos que seja incompatível com o mesmo.

[0043] Além disso, a menos que indicado de outra forma, qualquer recurso descrito neste documento pode ser substituído por um recurso alternativo que atenda ao mesmo propósito ou a um propósito similar.

[0044] Em toda a descrição e nas reivindicações desta especificação, o singular abrange o plural, a menos que o contexto exija de outra forma. Em particular, quando o artigo indefinido é usado, a especificação deve ser entendida como considerando a pluralidade bem como a singularidade, a menos que o contexto exija de outra forma.

[0045] Uma modalidade da presente invenção será agora descrita a título de exemplo apenas com referência ao seguinte, em que:

[0046] A Figura 1 mostra como o MC.7.G5 foi isolado e sua caracterização inicial. A. As células T foram marcadas com o corante CFSE, e incubadas por duas semanas com A549s. Uma redução na fluorescência de CFSE representou as células T que haviam proliferado, permitindo que as células T reativas A549 fossem isoladas. B. A reatividade de MC.7.G5 para células A549, com base na liberação de

TNFα, não foi prejudicada pelo bloqueio de anticorpos para MHC classe I ou II. Os sobrenadantes dos ensaios foram colhidos para análise por TNFα ELISA. C. O painel de fenotipagem de anticorpos do clone MC.7.G5 mostrou que era yδ-αβ + CD8+ (repetido na Figura 16A).

[0047] A Figura 2 mostra que MC.7.G5 não responde às células normais (sem câncer). O experimento compara a liberação de TNFα a partir do clone MC.7.G5 em resposta à linhagem celular MM909.24 de melanoma (alvo de câncer de MC.7.G5) e quatro linhagens celulares primárias (não tumorais, não imortais). SMC3 é uma linhagem celular de músculo liso; CIL-1 é uma célula epitelial ciliada, MCR5 é uma linhagem celular de fibroblastos transduzidos em hTERT; Hep2 é uma linhagem celular de hepatócitos. (linhagens celulares normais também testadas nas Figuras 15 e 17).

[0048] A Figura 3 mostra a sequência das cadeias TCRα e β de MC.7.G5.

[0049] A Figura 4 mostra que o Clone MC.7.G5 responde a uma ampla gama de alvos tumorais. Os sobrenadantes foram colhidos a partir do ensaio de ativação das células T mostrando a resposta de MC.7.G5 a um painel de tumores e examinados quanto à produção de TNFα e MIP1β. B. Ensaio de liberação de cromo mostrando a morte específica de células cancerosas nas relações de células T para células cancerosas mostradas. A&B executados em duplicado com barras de erro.

[0050] A Figura 5 mostra a captura de genes pela abordagem CRISPR de genoma integral usada para identificar MR1 como o ligante do clone MC.7.G5. Os dados para a tela da biblioteca CRISPR do clone MC.7.G5 são mostrados na Figura 13.

[0051] A Figura 6 mostra que o Clone MC.7.G5 mostra a especificidade alvo via MR1. A. O anticorpo MR1 bloqueou o reconhecimento de células A549. Produção de TNFα e MIP1β por

ELISA. B. Os nocautes MR1 A549c9 e MM909.24c4 de melanoma (tecnologia CRISPR/Cas 9) não foram reconhecidos por MC.7.G5. C. Não houve morte específica das células nocaute MR1 A549c9 ou da linhagem celular primária MRC5. A morte de MM909.24wt e A549wt também é mostrada. D. A superexpressão de MR1 nesta linhahem celular por transdução lentiviral aumenta levemente o reconhecimento. A linhagem LCL pt146 não é reconhecida pelo clone MC.7.G5, mesmo quando é transduzido para superexpressar MR1. Parte desse MR1 é apresentada na superfície da célula e pode ser detectada com um anticorpo MR1 (à direita).

[0052] A Figura 7 mostra que o Clone MC.7.G5 não cora com formas tetraméricas do ligante MAIT MR1- 5- (2-oxopropilidenamino) - 6-d-ribitilaminouracila (MR1-5-OP-RU) ou com MR1 acetil-6- formilpterina (Ac-6-FP). Em experimentos paralelos, um clone MAIT corou bem com tetrâmero MR1-5-OP-RU. Há também uma pequena população de células que coram com MR1-5-OP-RU na população PBMC. Espera-se que haja células MAIT detectáveis dentro das amostras de PBMC. Este resultado mostra que o MC.7.G5 TCR não se liga ao MR1 propriamente dito ou ao MR1 carregado com ligantes infecciosos conhecidos e sugere que esta célula T reconhece um ligante específico para câncer na ranhura de ligação ao MR1. Experimentos repetidos de coloração com tetrâmero são mostrados na Figura 14E, incluindo aqueles com MR1 'vazio').

[0053] A Figura 8 mostra que a infecção por Ac-6-FP e M.smeg reduz o reconhecimento pelo clone MC.7.G5, apesar do aumento da expressão de MR1 na superfície celular. A incubação de células A549 ou MM909.24 com 50 µg/mL de Ac-6-FP por 12 horas aumenta a expressão de MR1 na superfície, mas reduz o reconhecimento pelo clone MC.7.G5. Os efeitos da infecção por M. smeg são ainda mais drásticos e reduzem substancialmente a resposta do clone MC.7.G5 enquanto atuam como um potente ativador de um clone MAIT. Experimentos repetidos de M.smeg e Ac-6-FP são mostrados na Figura 14F & G.

[0054] A Figura 9 mostra a transdução de células T policlonais com o TCR MC.7.G5 (mostrado na Figura 2) e confere reconhecimento de tumor. Outros experimentos com o MC.7.G5 TCR e as células T do paciente são mostrados na Figura 15.

[0055] A Figura 10 é um esquema que mostra que o clone MC.7.G5 TCR reconhece apenas células cancerosas. O reconhecimento requer MR1 e é inibido por ligantes conhecidos de MR1 não cancerosos, sugerindo que MR1 apresenta um ligante câncer-específico, ou câncer- induzido, ao TCR MC.7.G5.

[0056] A Figura 11 é um esquema que mostra que ligantes MR1 conhecidos inibem o reconhecimento de células cancerosas por MC.7.G5 TCR.

[0057] A Figura 12 mostra a estrutura do mRNA e da proteína do receptor de células T. As estruturas de mRNA (superior) mostram que, para cada cadeia, CDR1 e CDR2 são codificadas na linhagem germinativa. CDR3 é o produto da diversidade juncional nas junções V- J da cadeia do receptor de células T (TCR)-α e as junções V-D-J na cadeia TCR-β. CDR3 é consequentemente hipervariável. O código de cores adotado para as alças de CDR é mantido em toda a figura. As áreas coloridas em cinza representam os domínios constante e variável dos TCRs (não incluindo as alças de CDR hipervariável). O painel inferior mostra a dobra de proteína esperada. Os TCRs adotam estruturas terciárias semelhantes que posicionam as alças das regiões determinantes da complementaridade (CDR) na extremidade distal da membrana das moléculas. Juntos, as seis alças de CDR formam o sítio de ligação ao antígeno.

[0058] A Figura 13 mostra que a triagem da biblioteca

CRISPR/Cas9 de genoma integral revela MR1 como o alvo candidato de MC.7.G5. (A) Visão geral da abordagem usada para revelar o ligante de MC.7.G5. As bibliotecas A e B CRISPR/Cas9 de genoma integral GeCKO v2 foram usadas como lentivírus para transduzir a linhagem de células-alvo HEK293T. O MC.7.G5 lisou HEK293T expressando sgRNAs para genes que são irrelevantes para o reconhecimento de HEK293T, enriquecendo assim sgRNAs para genes essenciais para a lise de células cancerosas por MC.7.G5. Foram realizadas duas rodadas de seleção com MC.7.G5 e as bibliotecas selecionadas comparadas com HEK293T não selecionado (sem MC.7.G5) para revelar sgRNAs enriquecidos. (B) O reconhecimento MC.7.G5 da biblioteca HEK293T selecionada pós-seleção é bastante reduzido em comparação com o HEK293T de ocorrência natural, sugerindo que os principais genes foram ablados por toda a abordagem do genoma CRISPR/Cas9. Ativação durante a noite e TNF ELISA. (C) MR1 foi identificado como um dos genes chave para o reconhecimento MC.7.G5 de HEK293T. Análise MAGeCK e genes destacados (coloridos) com ≥ 2 sgRNAs enriquecidos nas células HEK293T selecionadas. A validação de MR1 como o alvo de MC.7.G5 é mostrada na Figura 14.

[0059] A Figura 14 mostra a validação e a exploração do reconhecimento de MR1 por MC.7.G5. (A-D) MR1 é o alvo expresso por células cancerosas de MC.7.G5. (A) O reconhecimento do melanoma MM909.24 foi reduzido na presença do anticorpo bloqueador de MR1 (Ab). MHCI e II Abs foram utilizados como controle negativo. Ativação durante a noite e TNF ELISA. (B) A remoção da expressão de MR1 das linhagens celulares de câncer impediu o reconhecimento e a morte mediados por MC.7.G5. O melanoma MM909.24 e o adenocarcinoma de pulmão A549s foram transduzidos com um sgRNA para nocautear (- /-) o gene MR1 via CRIPSR/Cas9. Ativação durante a noite e TNF ELISA. Ensaio de citotoxicidade por liberação de cromo por 6 h

(MM909.24) ou 18 h (A549). (C) A superexpressão (+) do MR1 melhorou a morte de células cancerosas por MC.7.G5. As linhagens celulares de câncer C1R e HeLa que demonstraram induzir relativamente baixa ativação de MC.7.G5 foram transduzidas lentiviralmente para superexpressar estavelmente MR1. O melanoma MM909.24 foi incluído como controle positivo.

Ensaio de citotoxicidade de liberação de cromo realizado por 6 h. (D) A expressão de MR1 em células MR1 -/- restaura a ativação de MC.7.G5. As células MR1 -/- e MR1 -/-, A549 de ocorrência natural com um transgene MR1 (+) foram usadas em um ensaio de ativação noturna com MC.7.G5. TNF ELISA. (E & F) MC.7.G5 não reconhece MR1 por mecanismos conhecidos: (E) clone MC.7.G5, um clone MAIT canônico (reconhece MR1 com 5-OP-RU ligado), e um clone restrito a MHCI (MEL5/13, restrito a HLA A2, peptídeo Melan A ELAGIGILTV) foram utilizados para a coloração com os seguintes tetrâmeros: MR1 'Vazio' (mutante K43A para permitir o desdobramento na ausência de um ligante MR1), MR1 5-OP-RU e MHCI (HLA A2 ELAGIGILTV). O clone MHCI foi usado como um controle positivo para o tetrâmero MHCI irrelevante. (F) A549s carregados com a bactéria ativadora de MAIT Mycobacterium smegmatis reduziu o reconhecimento MC.7.G5 de A549. O clone MAIT canônico a partir de E foi usado como um controle positivo.

A549 MR1 -/- foi utilizado como um controle negativo para ambos os clones.

Coloração para CD107a de superfície e TNF intracelular.

Gate definido apenas no clone. (G) Ac-6- FP exógeno, uma molécula de ligação conhecida a MR1, reduziu o reconhecimento MC.7.G5 do melanoma MM909.24. Mock tratou os alvos WT e Ac-6-FP MR1 -/- usados como controles.

Painel esquerdo: Coloração para CD107a intracelular, TNF e IFNγ com tripla positividade analisada por FlowJo.

Barras de erro menores que símbolos de plotagem, representativas de dois experimentos.

Painel direito: expressão de MR1 nas células-alvo tratadas com Ac-6-FP.

[0060] A Figura 15 mostra que a transferência do receptor de células T MC.7.G5 redireciona as células T do paciente para matar o melanoma autólogo. (A) células T derivadas de pacientes com melanoma metastático (MM909.11 e MM909.24) transduzidas com o receptor de células T de MC.7.G5 reconheciam melanomas autólogos e não autólogos. As células T não traduzidas foram usadas como um controle negativo. Coloração para CD107a de superfície e TNF intracelular após 4 h de ativação. (B) células T do paciente MM909.11 transduzidas com MC.7.G5 TCR mataram melanomas autólogos e não autólogos, mas não células saudáveis. Ensaio de citotoxicidade de liberação de cromo com células T não transduzidas (-) e MC.7.G5 transduzidas (+) a partir do paciente MM909.11 versus melanoma autólogo, melanoma do paciente MM909.24 (de ocorrência natural e nocaute MR1 (-/-)) e linhagens celulares saudáveis: SMC3 (músculo liso); CIL-1 (epitelial ciliado); e Hep2 (hepatócito). Realizado na relação de célula T para células-alvo de 5:1, por 6 h e 18 h.

[0061] A Figura 16 mostra (A) Fenotipagem por citometria de fluxo de MC.7.G5. (B) Sequência genômica do locus MR1 do melanoma MM909.24 com deleção bialélica induzida por CRISPR/Cas9 de MR1 no éxon 2. (C) expressão de MR1 das células-alvo usadas na Figura 14A-D avaliada com um anticorpo anti-MR1 (Ab). (D) coloração com rCD2 de células T de pacientes com melanoma MM909.11 e MM909.24, com e sem MC.7.G5 TCR transduzido.

[0062] A Figura 17 mostra a morte de MC.7.G5 de uma gama de linhagens de células cancerosas (eixo x) de origem diferente (chave) após 48 horas de co-incubação ('ensaio de morte a longo prazo') (A). Isso mostra que MC.7.G5 foi capaz de matar 95-99,9% de cada linhagem celular, suplementando assim os dados dos ensaios de morte relativamente a curto prazo mostrados na Figura 4. Incubados em uma relação de células T para células-alvo de 5:1 e extensão da morte determinada usando microesferas de contagem ou células de referência marcadas com CFSE. (B) MC.7.G5 não matou células normais quando co-incubado por 7 dias. Relação de células T para células-alvo de 5:1 e microesferas de contagem usadas para estabelecer o número de células-alvo que permaneceram. SMC3 (músculo liso), Hep2 (hepatócito) e MRC5 (fibroblasto da pele). O melanoma MM909.11 foi usado como um controle positivo. Exibido como o número de células- alvo (saudáveis ou melanoma) por 1000 microesferas de contagem ± MC.7.G5. (C) MC.7.G5 matou sensivelmente o melanoma MM909.24. Incubadas por 7 dias e células de referência marcadas com CFSE usadas para estabelecer a extensão da morte. No mesmo ensaio, a linhagem celular normal Hep2 não foi morta.

[0063] A Figura 18 mostra que a superexpressão de MR1 K1A mutado ('vazio') em células CIRs não levou à ativação de M.7.G5 (A), apesar da alta coloração das CIRs-K43A com anticorpo MR1 (B). Em contraste, a superexpressão de MR1 de ocorrência natural em CIRs induziu a ativação de MC.7.G5. Isso demonstra ainda que o MC.7.G5 TCR reconhece o MR1 com uma carga acoplada e reforça os dados na Figura 14E, mostrando nenhuma coloração de MC.7.G5 com o tetrâmero K43A MR1 vazio. Métodos e Materiais

[0064] Aquisição e Caracterização do Clone de Células T MC.7.G5.

[0065] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram purificadas a partir do sangue de um doador saudável por separação padrão em gradiente de densidade, depois estimuladas com a linhagem de células epiteliais basais alveolares de adenocarcinoma humano A549 (ATCC® CCL-185 para condições de cultura e informações gerais). A fim de rastrear a proliferação de células T em resposta a A549s, as PBMCs foram marcadas com o corante celular carboxifluoresceína sucinimil éster (CFSE, Molecular Probes, Thermo

Fisher Scientific, Waltham, MA). As PBMCs foram lavadas extensivamente em PBS e depois incubadas a 37°C por 10 min no escuro com 1 μM de CFSE, seguido por arrefecimento com excesso de soro bovino fetal.

As PBMCs marcadas com CFSE foram cultivadas isoladamente, ou com A549s em placas de cultura de tecidos de 24 poços a uma densidade de 6-8 x106 de PBMC e 0,1-0,2 x106 de A549 em meio de iniciação de células T (Theaker e outros, 2016). O meio de cultura foi trocado (50% em volume) três vezes por semana e as células incubadas por um total de duas semanas.

Para avaliar o grau de proliferação em resposta a A549s, as células foram colhidas a partir da cultura lavada em PBS e marcadas com o corante de viabilidade celular Vivid (diluição 1:40 em PBS, em seguida 2 μL por mancha em 50 μL) (Life Technologies) e incubadas em RT por 5 min antes da adição do anticorpo anti-CD3 (Ab) (BW264/56, Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Alemanha) por mais 20 min em gelo.

As células foram ativadas em linfócitos (dispersão para frente versus lateral), células únicas (dispersão para frente versus lateral) e células Vivid-CD3+, e para análise de gráficos bivariados exibidos como CD3 Ab versus CFSE.

As células CFSElow (células T proliferadas) foram classificadas usando um BD FACS Aria (Central Biotechnology Services, Cardiff University, Reino Unido) para clonagem por limitação da diluição, conforme descrito anteriormente (Theaker e outros, 2016). Antes de realizar os ensaios de ativação, o MC.7.G5 foi colhido, lavado e incubado por 24 h em meio sérico reduzido, como descrito anteriormente (Wooldridge e outros, 2012). Subsequentemente, MC.7G.5 (30.000 por poço de uma placa de 96 poços) foi incubado com A549s (60.000 por poço) que haviam sido deixados sem marcação, ou marcados com 10 μg/mL de anticorpos (Abs) MHC classe I (W6/32, BioLegend, San Diego, CA) ou MHC Classe II (Tu39, BioLegend) por uma hora.

Sem lavagem, o MC.7G.5 foi adicionado aos poços até um volume final de 100 μL, com o clone também incubado isoladamente ou com 10 μg/mL de fito-hemaglutinina (PHA). Após a incubação durante a noite, os sobrenadantes foram colhidos e desenvolvidos por TNF ELISA (R&D Research, Minneapolis, MN). MC.7.G5 foi corado com Abs para expressão da superfície de CD3 (Miltenyi Biotec), CD8 (BW135/80, Miltenyi Biotec), CD4 (M-T466, Miltenyi Biotec),  TCR (11F2, Miltenyi Biotec) e αβ TCR (BW242/412, Miltenyi Biotec). Para coloração, o clone foi colhido a partir da cultura, lavado com PBS e marcado com a corante de viabilidade Vivid em temperatura ambiente (RT) seguida por cada um dos Abs separadamente por 20 minutos de gelo. A aquisição foi realizada em um Becton Dickinson FACS Canto II e os dados analisados usando o software FlowJo (Tree Star). Ativando o tamanho da célula (ativação de linfócitos), células vivid- e, em seguida, o marcador de superfície celular de interesse exibido como um histograma.

[0066] MC.7.G5 não responde às células normais.

[0067] As células saudáveis e seus meios de cultura proprietários foram obtidos a partir de Sciencell (Carlsbad, CA) e utilizados como células-alvo em ensaios de ativação e citotoxicidade descritos em outras partes da seção Materiais e Métodos. SMC3 (músculo liso do cólon humano), CIL-1 (epitélio ciliar não pigmentado humano) e Hep2 (hepatócito humano) foram utilizados a 60.000 células por poço de uma placa de 96 poços. Além disso, MRC-5 (fibroblasto pulmonar, referência ATCC® CCL-171) que expressa hTERT para retardar a senescência também foi utilizado nos mesmos ensaios.

[0068] A sequência das cadeias α e β de MC.7.G5 TCR.

[0069] O RNA foi extraído usando o kit RNEasy Micro (Qiagen). O cDNA foi sintetizado usando o kit 5'/ 3' SMARTer (Clontech, Paris, França) de acordo com as instruções do fabricante. A abordagem SMARTer usou uma transcriptase reversa do vírus da leucemia de molina de murino (MMLV), um iniciador 3' oligo-dT e um oligonucleotídeo 5' para gerar modelos de cDNA, que foram flanqueados por uma sequência de ancoragem universal conhecida. PCR foi então configurada usando um único par de iniciadores. Um iniciador reverso específico de região constante de TCR-β (Cβ-R1, 5'- GAGACCCTCAGGCGGCTGCTC-3', SEQ ID Nº: 9, Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemanha) e um iniciador direto específico para ancoragem (Clontech) foram utilizados na seguinte reação de PCR: 2,5 μL de cDNA modelo, 0,25 μL de Taq polimerase Phusion de alta fidelidade, 10 μL de tampão Phusion 5X, 0,5 μL de DMSO (todos a partir de Thermo Fisher Scientific), 1 μL de dNTP (50 mM cada, Life Technologies), 1 μL de cada iniciador (10 μM) e água livre de nuclease para um volume de reação final de 50 μL. Subsequentemente, 2,5 μL dos primeiros produtos de PCR foram retirados para configurar uma PCR aninhada como acima, usando um par de iniciadores aninhados (Cβ-R2, 5'- TGTGTGGCCAGGCACACCAGTGTG-3, SEQ ID Nº: 10, Eurofins Genomics e iniciador específico para ancoragem a partir de Clontech). Para ambas as reações de PCR, as condições de ciclagem foram as seguintes: 94° C por 5 min, 30 ciclos de 94°C por 30 s, 63°C por 30 s, 72°C por 90 s e finalmente 72°C por 10 min. Os produtos finais de PCR foram carregados em um gel de agarose a 1% e purificados com o kit de extração de gel QIAEX II (Qiagen). Os produtos purificados foram clonados em Zero-Blunt TOPO e transformados em células de E.coli One Shot quimicamente competentes para o sequenciamento padrão (ambos a partir de Life Technologies).

[0070] O clone MC.7.G5 responde a uma ampla gama de alvos tumorais.

[0071] Os ensaios de ativação foram realizados conforme descrito acima e também os ensaios de citotoxicidade usando ou células-alvo marcadas com cromato de sódio (Cromo51) (Ekeruche-Makinde e outros, 2012) ou um teste de morte a longo prazo baseado em citometria de fluxo (ver em outro lugar na seção Materiais e Métodos). Para ensaios de liberação de cromo, cada linhagem celular foi marcada com 30 μCi de Cr51 (Perkin Elmer, Waltham, MA) por 1 x106 células e 2000 células-alvo utilizadas por poço (placas de 96 poços) com MC.7.G5 para atingir a relação de células T - células-alvo desejada. Após a incubação durante a noite, os sobrenadantes foram colhidos, misturados com cintilante e lidos usando um contador Microbeta e lise específica calculada como descrito anteriormente (Ekeruche-Makinde e outros, 2012). Além dos A549s HEK293Ts acima, os detalhes das linhagens celulares de câncer usadas são os seguintes: nome da linhagem celular (referência ATCC® ou número ECACC para informações de cultura e adicionais)/tecido ou órgão de origem: HEK293T (rim fetal, LCR- 1573); LnCaP (CRL-1740)/próstata; SiHa (HTB-35) e HeLa (CCL-2)/colo de útero; MCF7 (HTB-22), MDA-MB-231 (CRM-HTB-26) e T47D (HTB- 133)/mama; TK143 (CRL-8303) e U20S (HTB-96)/osso; HCT-116 (CCL- 247)/cólon; Jurkat (TIB-152), T2 (0,174 x CEM.T2) (CRL-1992), K562 (CCL-243), CIR expressando HLA-A2 (CRL-1193), THP-1 (TIB-202), U266 (TIB-196) e Molts (CRL-1552)/todo o sangue; FM74 (ECACC 13012422), SK-Mel-28 (HTB-72) e FM45 (ECACC 13012410)/todos os melanomas de pele. RC177 (rim, carcinoma de células renais), MM909.11, MM909.15 e MM909.24 (todos os melanomas de pele) foram obtidos a partir de pacientes com câncer tratados no Centro de Imunoterapia de Câncer (CCIT, Herlev Hospital, Copenhague, Dinamarca). Clones de células T

[0072] O clone restrito HLA-A*0201 MEL5/13 que reconhece os peptídeos EAAGIGILTV e ELAGIGILTV (L heteroclítico na posição 2) de Melan A (Woodridge e outros (2010); Lissina e outros (2009)) e um clone MAIT canônico foram cultivados como descrito anteriormente (Tungatt e outros (2014)).

Captura de genes por CRISPR de genoma integral

[0073] Uma abordagem de biblioteca CRISPR/Cas9 de genoma integral foi usada (Figuras 5 e 14 para uma visão geral e também descrita recentemente (Patel e outros, 2017)). HEK293Ts direcionados ao genoma integral usando as sub-bibliotecas GeCKO v2 A e B (plasmídeo Adgene, # 1000000048, depositado pelo Dr. Feng Zhang) foram utilizados para seleção por MC.7G.5. Resumidamente, HEK293Ts transduzidos com sucesso (MOI de 0,4) selecionados com puromicina foram co-incubados com MC.7G.5 a uma relação predefinida de 1:1 por 2 a 3 semanas em placas de fundo plano de 96 poços. O DNA genômico de HEK293Ts que haviam sobrevivido a duas rodadas de seleção com MC.7G.5 foi usado para o sequenciamento da próxima geração para revelar RNAs guia inseridos e, portanto, os genes que foram alvos de ablação.

[0074] O clone MC.7.G5 mostra a especificidade alvo via MR1.

[0075] Utilizando a mesma abordagem acima para Abs de bloqueio de MHC, também foi realizado um ensaio de ativação usando um anticorpo anti-MR1, Figura 6 e Figura 14 (clone 26.5, BioLegend). MC.7.G5 foi usado no ensaio de ativação com células A549 e MM909.24 que foram direcionadas com a tecnologia CRISPR/Cas9 para ablar a expressão do gene MR1 como descrito anteriormente (Laugel e outros, 2016). As linhagens celulares foram usadas nos ensaios de ativação e liberação de cromo como acima. Um gene MR1 códon-otimizado de comprimento total foi gerado como partículas lentivirais e transduzido para células-alvo usando métodos semelhantes (um único gene e nenhum ratCD2 nesse caso) descrito abaixo para o MC.7G.5 TCR, para criar linhagens celulares superexpressando MR1 (alta). A expressão de MR1 foi avaliada usando 10 μg/mL do MR1 Ab (como acima) e 50.000 células por mancha em 50 μL de PBS com FBS a 2%. Nocaute de MR1 em MM909.24 alcançado como descrito acima para A549s (6). Os ensaios de ativação foram realizados como acima com as linhagens celulares: MM909.24wt, MM909.24 MR1-/-, MM909.24 MR1High, pt146 wt (linhagem de células linfoblastoides B), pt146 MR1-/- e pt146 MR1High.

[0076] O clone MC.7.G5 não mancha com formas tetraméricas do ligante MAIT MR1-5-OP-RU ou com MR1-Ac-6-FP.

[0077] MC.7.G5 foi colhido a partir da cultura, lavado em PBS + FBS a 2% e tratado com 50 nM do inibidor de proteína quinase (PKI), Dasatinib (Lissina e outros, 2009), depois marcado com tetrâmeros conjugados com PE montados com MR1 redobrado ou com Ac-6-FP ou com 5-OP-RU, Figuras 6 e 14. As células coradas com tetrâmero foram marcadas com anti-PE Ab não conjugado, conforme descrito anteriormente (Tungatt e outros, 2015), seguido por Vivid e anti-CD8 Ab. Um clone MAIT reativo a MR1-5-OP-RU foi corado da mesma maneira para atuar como um controle positivo. As células foram ativadas em tamanho então Vivid-CD8+ e exibidas como histogramas de fluorescência do tetrâmero com aquisição e análise de dados como acima.

[0078] A infecção por Ac-6-FP e M.smeg reduz o reconhecimento pelo clone MC.7.G5, apesar de melhorar a expressão de MR1 na superfície celular.

[0079] MC.7.G5 foi usado em um ensaio de ativação usando células-alvo (MM909.24 e A549) que foram pré-incubadas com 50 μg/mL (Figura 8) e 1, 10 ou 100 μg/mL (Figura 14), de Ac-6FP. Além disso, as células A549 que foram carregadas com M.smeg também foram usadas. As células-alvo que foram deixadas sem tratamento/sem carga foram usadas como controles negativos, Figuras 8 e 14. A549s foram incubadas com M.smeg em um MOI de 100:1 M.smeg para A549s, por duas horas em meio livre de antibióticos, seguido por enxague das células no frasco de cultura e depois cultivo por duas horas em R10. MC.7.G5 e um clone MAIT foram incubados por 4 a 5 h na presença do inibidor de processamento de TNF (TAPI)-0 (30 μM) e anti- CD107a Ab (H4A3, BD) e corados com anti-TNF Ab (cA2, Miltenyi Biotec), anti-CD3 Ab, anti-CD8 Ab e Vivid. As células vivid-CD3+ únicas ativadas por tamanho, e depois CD8+ versus CD107a ou TNFα com aquisição e análise de dados como acima. Cada uma das células-alvo também foi corada com MR1 Ab após incubação com Ac-6FP ou M.smeg a 10 µg/mL, utilizando 50.000 células por mancha em 50 µL de PBS com FBS a 2%.

[0080] A transdução de células T policlonais com o MC.7.G5 TCR (mostrado na Figura 2) confere reconhecimento de tumor.

[0081] As cadeias de TCR códon-otimizadas, de comprimento total, separadas por uma sequência 2A auto-clivável, foram sintetizadas (Genewiz) e clonadas no vetor de transferência lentiviral de 3ª geração pELNS (gentilmente fornecido pelo Dr. James Riley, universidade da Pensilvânia, PA). O vetor pELNS contém um gene marcador de CD2 de rato (rCD2) separado do TCR por outra sequência 2A auto-clivável. Partículas lentivirais foram geradas por transfecção com cloreto de cálcio das células HEK293T. Os vetores de transferência de TCR foram co-transfectados com plasmídeos de empacotamento e envelope pMD2.G, pRSV-Rev e pMDLg/pRRE. As partículas lentivirais foram concentradas por ultracentrifugação antes da transdução de células T CD8+ usando 5 μg/ml de polibreno, com as células T CD8+ purificadas por separação magnética (Miltenyi Biotec) a partir de doadores saudáveis (Figura 9) ou pacientes com melanoma (Figura 15) 24 horas de antecedência e ativadas durante a noite com microesferas CD3/CD28 (Dynabeads, Life Technologies) na relação de 3:1 microesferas : células T. As células T que absorveram o vírus foram selecionadas por enriquecimento com anti-rCD2 PE Ab (OX-34, BioLegend) seguido de microesferas magnéticas anti-PE (Miltenyi Biotec). As células T 14 dias pós-transdução foram expandidas com alimentadores alogênicos. Para todos os experimentos funcionais, as células T transduzidas por TC-MC.7.G5 foram > 95% de rCD2+ e utilizadas para análise funcional (Figura 16). As células transduzidas foram incubadas com células-alvo por 4 a 5 h na presença de 30 mM de TAPI-0 CD107a Ab e depois coradas com Abs para TNFα, CD3, CD8 e também Vivid. As células vivid-CD3+ únicas ativadas por tamanho, e depois CD8+ versus CD107a ou TNFα. Aquisição e análise de dados como acima. As células T transduzidas por TCR a partir dos pacientes também foram usadas para ensaios de citotoxicidade de liberação de cromo (Figura 15), como descrito acima. Citometria de Fluxo

[0082] As células foram coradas com corante Fixable Live/Dead Violet (Life Technologies) e os seguintes anticorpos de superfície: pan- αβ TCR PE (clone IP26, Biolegend), pan-γδ TCR-FITC (clone REA591, Miltenyi Biotec), CD3 PerCP (clone UCHT1, Biolegend), CD4 APC (clone VIT4, Miltenyi Biotec), CD8 PE (clone BW135/80, Miltenyi Biotec), CD2 PE de rato (clone OX-34, Biolegend) e MR1 PE (clone 26.5, Biolegend). Para a coloração com MR1 PE, o bloco Fc (Miltenyi Biotec) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Para a coloração do tetrâmero, os monômeros MR1 foram fornecidos por Jamie Rossjohn (Monash University) e os monômeros de pMHC produzidos internamente. Os tetrâmeros foram montados e utilizados para coloração otimizada, conforme descrito anteriormente (Tungatt e outros (2014)). Os dados foram adquiridos em um BD FACS Canto II (BD Biosciences) e analisados com o software FlowJo (TreeStar).

[0083] Nocaute de MR1 e Expressão de Transgene

[0084] O MR1 sgRNA e o lentivírus CRISPR/Cas9 foram produzidos e utilizados como descrito anteriormente (Laugel e outros (2016)). O transgene MR1 foi clonado na espinha dorsal do lentivetor pRRL.sin.cppt.pgk-gfp.wpre de segunda geração, desenvolvida pelo laboratório de Didier Trono (Addgene no. 12252), desprovida do promotor PGK humano e do GFP cDNA, e partículas lentivirais produzidas conforme descrito para MR1 sgRNA (Laugel e outros (2016)). As células-alvo foram infectadas na presença de 8 μg/mL de polibreno; 500 x g por duas horas a 37°C (Shalem e outros (2014)). As células positivas para anticorpo anti-MR1 PE (clone 26.2, Biolegend) foram enriquecidas magneticamente usando microsferas magnéticas anti-PE de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec). Sequenciamento e transdução de TCR

[0085] O MC.7.G5 TCR foi sequenciado internamente usando o kit SMARTer RACE (Clontech) e a reação em cadeia da polimerase em duas etapas usando iniciadores diretos universais e iniciadores reversos específicos para as regiões constantes de TCR-α e TCR-β. O TCR foi então sintetizado com códon-otimização (Genewiz), com cadeias de TCR de comprimento total separadas por uma sequência 2A auto- clivável (Ryan e outros, 1991). O TCR foi clonado no vetor lentiviral pELNS de terceira geração (gentilmente fornecido por James Riley, Universidade da Pensilvânia) que contém rCD2 separado do TCR por uma segunda sequência de auto-clivável 2A. As partículas lentivirais foram geradas por transfecção com cloreto de cálcio das células HEK293T e concentradas por ultracentrifugação. As PBMCs pós-terapia foram obtidas a partir de pacientes TIL MM909.11 e MM909.24 e células T CD8 e CD4 purificadas por enriquecimento magnético (Miltenyi Biotec). As células T foram subsequentemente ativadas por incubação durante a noite com esferas CD3/CD28 (Dynabeads; Life Technologies) na relação de 3:1 de microesferas para células T. As células T foram então transduzidas com MC.7.G5 TCR na presença de 5 μg/mL de polibreno (Santa Cruz Biotechnology). As células T que absorveram o vírus foram enriquecidas magneticamente com anticorpo anti-rCD2 e microesferas magnéticas anti-PE, de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec). 14 dias após a transdução, as células T foram expandidas como descrito anteriormente (Tungatt e outros (2014)). Para todos os experimentos funcionais, as células T transduzidas foram > 85% de rCD2+ (Figura 16D). Triagem de GeCKOv.2 de genoma integral

[0086] Partículas lentivirais para a biblioteca GeCKOv.2 (plasmídeo gentilmente fornecido por Feng Zhang (Sanjana e outros (2014)) (plasmídeo Addgene #1000000048)). A biblioteca GeCKOv.2 consiste em 123.411 (sg)RNAs de guia únicos direcionados a 19.050 genes codificadores de proteínas (6 sgRNAs por gene) e 1.864 microRNAs (4 sgRNAs por microRNA) e foram usados como lentivírus para transduzir a linhagem celular alvo HEK293T. 4 x 107 células HEK-293T foram transduzidas com um MOI de 0,4 para fornecer 100X de cobertura de cada sub-biblioteca. As células que absorveram o lentivírus foram selecionadas sob puromicina. Após 14 dias, metade da biblioteca foi congelada como um controle. MC.7.G5 foi adicionado às células HEK- 293T transduzidas restantes na relação de célula T para HEK293T de 0,25:1 em 20 UI de meio IL-2. Após 14 dias, MC.7.G5 foi adicionado novamente na relação de 0,5:1. Após 7 dias, as células HEK293T foram usadas para sequenciamento. O DNA genômico de 3 x 107 de células HEK-293T (controle não selecionado e selecionado com MC.7.G5) foi isolado (Kit Miniprep de DNA Genômico de manífero GenElute, Sigma Aldrich). A totalidade do DNA genômico isolado (2,5 µg por 50 µl de reação) foi usada para subsequente PCR, para garantir a captura da representação completa das bibliotecas. A PCR em duas etapas foi realizada como descrito anteriormente (Shalem e outros (2014)), usando iniciadores purificados por HPLC e o NEBNext High Fidelity PCR MasterMix (New England BioLabs). Os produtos de PCR < 300 pb foram subsequentemente isolados a partir do gel de agarose e sequenciados no instrumento HiSeq (Illumina), com 80 ciclos de leitura

1 (para determinar a sequência de sgRNAs) e 8 ciclos de leitura 2 (para identificar código de barras específico da amostra). A análise de guias enriquecidos foi realizada usando a análise MAGeCK (Li e outros (2014)). Ensaio de Morte a Longo Prazo

[0087] Para ensaios de morte com base no fluxo, 5000 a 10.000 de uma linhagem de células cancerosas ou normais foram colocadas em placas de 96 poços, e o clone MC.7.G5 foi adicionado para fornecer cinco células T por célula alvo (poços experimentais). As células foram co-cultivadas em 200 µL de meio de célula alvo suplementado com 20 UI de IL-2 e 25 ng/mL de IL-15. As células-alvo (poços de controle), MC.7.G5 e CSFE CIRs também foram cultivadas isoladamente para auxiliar na análise. As células foram incubadas por 48 horas. Para ensaios de sensibilidade, o número de MC.7.G5 foi titulado em relação às células-alvo e incubado por 7 dias. Além das linhagens celulares descritas em outras partes da seção Materiais e Métodos, também foi usada a linhagem celular A2780 de câncer de ovário (ECACC 93112519).

[0088] Antes da colheita, foram adicionadas a cada poço 0,1 x 10 6 células CIR marcadas com CFSE (0,1 µM) para permitir o número de células-alvo que permaneceram nos poços experimentais e de controle. As células foram lavadas três vezes com D-PBS refrigerado suplementado com 2 mM de EDTA e depois coradas nas placas de ensaio com Corante Fixable Live/Dead Violet (Life Technologies) e depois CD3 PerCP (clone UCHT1, BioLegend) e/ou anti-TRBV25.1 APC TCR (nomenclatura TRBV11 Arden: catálogo A66905, Beckman Coulter) Abs para permitir que células mortas e células T sejam bloqueadas deixando células-alvo viáveis para análises. A porcentagem de mortes foi calculada usando a seguinte equação:

% 𝑚𝑜𝑟𝑡𝑒 = 100 − ((𝑒𝑣𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑎𝑙𝑣𝑜 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑖𝑠 ÷ 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑒𝑠𝑓𝑒𝑟𝑎𝑠 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑖𝑠 𝑜𝑢 𝑒𝑣𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠 𝐶𝐹𝑆𝐸 𝐶𝐼𝑅) ÷ (𝑒𝑣𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑎𝑙𝑣𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 ÷ 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑒𝑠𝑓𝑒𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 𝑜𝑢 𝑒𝑣𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠 𝐶𝐹𝑆𝐸 𝐶𝐼𝑅) × 100)

[0089] Ensaios de ativação com expressão de MR1 vazio em células CIRs (K43A)

[0090] As células CIR foram transduzidas com MR1 portador da mutação K43A (R. Reantragoon e outros) como para o MR1 de ocorrência natural. Os ensaios de ativação e de citometria de fluxo foram realizados conforme descrito em outra parte da seção Materiais e Métodos. Resultados Caracterização do Clone

[0091] 1. O clone MC.7.G5 de células T reconhece células A549 (Figura 1A). A adição de 10 µg/ml de anticorpos bloqueadores MHC-I e MHC-II não bloqueou o reconhecimento (Figura 1B).

[0092] 2. A coloração do anticorpo e a citometria de fluxo confirmaram que o clone MC.7.G5 expressa um TCR αβ e é CD8+ (Figura 1C e repetido na Figura 16A).

[0093] 3. É importante ressaltar que o clone MC.7G.5 de células T não responde às linhagens celulares normais (sem câncer) (Figura 2 e Figuras 17B e C). Quando o MC.7.G5 TCR foi expresso em células T CD8 primárias, ele não mediou a morte de células normais (Figura 15B). O clone MC.7.G5 não respondeu a si próprio ou a células mononucleares do sangue periférico fresco (não mostrado). O clone de células T MC.7G.5 foi isolado a partir de um doador saudável normal, onde não estava causando danos óbvios. Concluiu-se que o clone MC.7G.5 de células T é específico para tumor.

[0094] 4. O clone de células T MC.7.G5 expressa um TCR feito a partir de TRAV38.2/DV8 TRAJ31 e TRBV25.1 TRBJ2.3 da sequência mostrada na Figura 3. O clone MC.7.G5 restrito a MR1 não é um MAIT e não expressa a cadeia TCRα de MAIT.

[0095] 5. O clone de células T MC.7.G5 produz MIP1β (Figura 4A) e TNFα (Figura 4A) em resposta a uma ampla gama de linhagens celulares de câncer. O MC.7.G5 também é altamente citotóxico em relação a muitas células cancerosas (Figuras 4B e 17A), mesmo com relações efetoras/alvos muito baixas (Figuras 4B e 17C). MC.7G.5 reconheceu todos os tipos de câncer testados: sangue, osso, melanoma (pele), cólon, rim, pulmão, colo do útero, mama, ovário e próstata. Além disso, essa citotoxicidade foi eficaz e sensível: os dados de um ensaio de morte a longo prazo (48 horas) mostraram > 95% de morte de linhagens de células cancerosas (Figura 17A) e baixas relações de células T para células-alvo (Figura 17C).

[0096] 6. As bibliotecas CRISPR/Cas9 de genoma integral de um alvo de câncer MC.7.G5 revelaram MR1 como o ligante de MC.7.G5 criando uma linhagem alvo que era resistente à lise pelo clone MC.7.G5. O sequenciamento dos RNAs guia nesta linhagem resistente mostrou que eles se dirigiam principalmente aos genes envolvidos no metabolismo e no sistema imunológico. Os RNAs guia para MR1 e microglobulina β2 foram altamente enriquecidos na população de células resistentes à lise por MC.7.G5. Esses genes imediatamente chamaram a atenção devido à sua ligação à ativação das células MAIT (o MR1 requer microglobulina β2 para se dobrar).

[0097] 7. O bloqueio com um anticorpo anti-MR1 ablou o reconhecimento da linhagem celular A549 (Figura 6A e repetida na Figura 14).

[0098] 6. As linhagens celulares de câncer A549 (clone c9) e MM909.24 (clone c4) não foram reconhecidas quando o MR1 é eliminado dessas linhagens (Figuras 6B e C e 14). A superexpressão do MR1 em MM909.24 via transdução lentiviral aumenta levemente o reconhecimento (Figura 6D e 14).

[0099] 8. A linhagem LCL pt146 não é reconhecida pelo clone de células T MC.7.G5. O MC.7.G5 também falha em reconhecer as células pt146, mesmo quando elas são transduzidas com um lentivírus que expressa MR1 e exibem alguma expressão de MR1 na superfície celular. A linhagem LCL pt146 não expressa o ligante de células T MC.7.G5. Isso sugere que o MC.7.G5 não está respondendo ao MR1 propriamente dito, mas pelo contrário, está reconhecendo um ligante câncer-específico único dentro da ranhura de ligação ao MR1 (Figura 6).

[0100] 9. O clone MC.7.G5 não cora com tetrâmeros MR1 carregados com Ac-6-FP ou 5-OP-RU (Figura 7 e repetido na Figura 14E). Os clones de células T MAIT coram com tetrâmeros MR1-5-OP- RU em um ensaio paralelo. Conclui-se que o MC.7.G5 não se liga aos ligantes MAIT. Esta descoberta é consistente com MC.7.G5 que não expressa a cadeia TRAV1-2 α invariante MAIT canônica. Isso foi corroborado usando os tetrâmeros MR1 'vazios' (K43A), que não coraram MC.7.G5. A mutação K43A de MR1 permite a redobramento de MR1 na ausência de uma carga vinculada, Figura 14. Da mesma forma, a expressão de MR1 vazio (K43A) não leva ao reconhecimento por MC.7.G5, apesar da boa expressão na superfície celular de MR1 nos C1Rs. (painel direito de coloração MR1 Ab), Figura 18. Isso demonstra ainda que um ligante expresso em câncer ligado a MR1 é importante para a ativação de MC.7.G5.

[0101] 10. A adição de 10, 50 ou 100 µg/mL do ligante de MR1 Ac- 6-FP (http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=4pj5) por 12 horas melhora substancialmente a expressão de MR1 na superfície das células MM909.24 (Figura 8 e 14G), mas diminui o reconhecimento dessas células pelo clone MC.7.G5 (Figura 8 e 14G). Esta descoberta sugere fortemente que o clone MC.7.G5 está reconhecendo um ligante ligado a MR1 que é diferente de Ac-6-FP na superfície de células MM909.24. Achados semelhantes foram observados com células A549. A incubação das células A549 com Ac-6-FP reduziu o reconhecimento enquanto aumentava a expressão de MR1 na superfície. A exposição de células A549 a Mycobacterium smegmatis (M.smeg) também aumentou a expressão de MR1. Isto é esperado, pois sabe-se que M.smeg produz ligantes MR1. Esses ligantes podem ser reconhecidos pelas células MAIT. As células A549 infectadas com M.smeg foram um bom ligante para um clone MAIT em um experimento paralelo (Figura 8 e 14F). A exposição de células A549 a M.smeg reduziu substancialmente o reconhecimento pelo clone MC.7.G5. Conclui-se que o clone MC.7.G5 reconhece células cancerosas por meio de um ligante na ranhura de ligação a MR1 que está presente apenas nas células cancerosas.

[0102] 11. A transdução do MC.7.G5 em células T policlonais permite que eles reconheçam os alvos tumorais (Figura 9). De fato, as células T CD8 do paciente com melanoma metastático MM909.11 transduzidas com o MC.7.G5 TCR mataram melanomas autólogos e não autólogos, mas não células normais (Figura 15). Conclui-se que o reconhecimento do tumor pelo clone MC.7.G5 ocorre através do receptor de células T MC.7.G5 mostrado na Figura 3 através de um ligante apresentado pela molécula de MR1.

[0103] Uma abordagem CRISPR/Cas9 de genoma integral, usando a biblioteca GeCKOv.2, que tem como alvo todos os genes de codificação de proteínas no genoma humano, com seis diferentes (sg)RNAs guias únicos, foi usada para identificar genes essenciais para o reconhecimento de células-alvo por MC.7.G5 (Figura 13A). Após duas rodadas de seleção com MC.7.G5, as células HEK293T transduzidas sobreviventes exibiram capacidade reduzida para estimular MC.7.G5, sugerindo que os principais genes envolvidos em seu reconhecimento foram ablados (Figura 13B). O sequenciamento dos CRISPR sgRNAs nas células HEK293T resistentes à lise mostrou que apenas 6 genes foram alvo de mais de um sgRNA enriquecido: β2M (cinco sgRNAs), MR1 (dois sgRNAs), fator regulador X (RFX, cinco sgRNAs), proteína contendo anquirina associada a RFX (RFXANK, cinco sgRNAs), proteína associada à RFX (RFXAP, três sgRNAs) e transdutor de sinal e ativador da transcrição 6 (STAT6, dois sgRNAs) (Figura 13C). RFX, RFXANK e RFXAP são componentes essenciais do complexo proteico responsável pela transativação dos promotores β2M, MHCI e MHCII.

Combinado com o fato de que β2M e MR1 se unem para formar uma molécula apresentadora de antígeno estável não polimórfica, conhecida por ativar MAITs e outras células T restritas a MR1, esses dados sugeriram fortemente que a célula T MC.7.G5 reconheceu alvos de câncer através da molécula de MR1 invariante.

Por conseguinte, o anticorpo MR1, mas não os anticorpos MHCI ou MHCII, bloqueou o reconhecimento de células-alvo por MC.7.G5 (Figura 14A). Nocaute mediado por CRISPR de MR1 de A549 e melanoma MM909.24 (mutação de deleção mostrada na Figura 16B) protegeu contra reconhecimento e lise mediados por MC.7.G5 (Figura 14B). O melanoma MM909.24 não corou com anticorpo anti-MR1, sugerindo que eram necessários níveis muito mínimos de MR1 para o reconhecimento alvo (Figura 16C). A superexpressão de MR1 resultou em forte reconhecimento dos alvos mal reconhecidos, HeLa e C1R, e um reconhecimento ligeiramente aprimorado do melanoma MM909.24 (Figura 14C). A reintrodução de MR1 em células A549 nocaute para CR1PR/Cas9 MR1 restaurou o reconhecimento por MC.7.G5 (Figura 14D), incutindo mais confiança de que o reconhecimento de que as células cancerosas era dependente de MR1.

[0104] Sabe-se que o MR1 apresenta intermediários na síntese de riboflavina na superfície celular para células MAIT e não se acredita que seja expresso na superfície celular sem carga vinculada. O MC.7.G5 não corou com tetrâmeros compostos por MR1 contendo a mutação K43A que permite o desdobramento de MR1 sem ligante ligado. O reconhecimento dependente de MR1 de células cancerosas sugeriu que MC.7.G5 poderia reconhecer um metabólito ligado a MR1 que foi especificamente expresso ou aumentado em células malignas. De acordo com esta hipótese, o MC.7.G5 não corou com tetrâmeros montados com MR1 apresentando o ativador de células T derivado de micróbios 5-OP-RU. Além disso, o reconhecimento das células-alvo foi reduzido quando carregado com a bactéria ativadora de MAIT, Mycobacterium smegmatis (M. smeg) (Figura 14F), ou com o ligante MR1, acetil-6-formilpterina (Ac-6-FP) (22, 23) (Figura 14G), apesar de um aumento na expressão na superfície de MR1 (Figura 14G). Esses resultados indicam que o MC.7G.5 não reconhece o MR1 propriamente dito, nem o MR1 por mecanismos conhecidos, mas sim o MR1 com carga vinculada que é específico ou associado a células cancerosas.

[0105] O sequenciamento por TCR de MC.7.G5 revelou um novo TCR constituído por uma cadeia  TRAV38.2/DV8 TRAJ31 pareada com uma cadeia  TRBV25.1 TRBJ2.3. Para explorar o potencial terapêutico de direcionar o MR1 em células cancerosas, purificou-se as células T a partir das PBMCs dos pacientes com melanoma em estágio IV e as transduziu-se lentiviralmente com o MC.7.G5 TCR, que resultou no reconhecimento e na morte de melanomas autólogos e não autólogos (Figura 15), mas não células saudáveis (Figura 15B). A morte foi específica para MR1, pois as células transduzidas por TCR MC.7.G5 não lisavam melanomas por nocaute para MR1 (Figura 15B). Conclui- se que o MC.7.G5 TCR pode redirecionar as células T do paciente para matar as células cancerosas do paciente sem a necessidade de um HLA específico. O MR1 é um alvo atraente para a imunoterapia do câncer devido à sua natureza não polimórfica e ubíqua. Avanços recentes nas descobertas de tetrâmeros e ligantes MR1 progrediram nessa área, mas ainda há muito a ser descoberto. Aqui, confirmou-se o reconhecimento de células cancerosas por um clone de células T que respondeu a várias linhagens de células cancerosas de diversos tipos de tecidos.

[0106] Os ensaios de morte a longo prazo (Figura 17) mostram a morte MC.7.G5 de uma gama de linhagens de células cancerosas de origem diferente. De fato, o MC.7.G5 foi capaz de matar 95-99,9% de cada linhagem celular. Além disso, o MC.7.G5 não matou células saudáveis.

[0107] A superexpressão do MR1 K43A mutado ('vazio') nas células CIRs não levou à ativação de M.7.G5 (Figura 18A), apesar da alta coloração do CIRs-K43A com anticorpo MR1 (Figura 18B). Em contraste, a superexpressão de MR1 de ocorrência natural em CIRs induziu a ativação de MC.7.G5. Isso demonstra que o MC.7.G5 TCR reconhece o MR1 com uma carga vinculada.

[0108] Os anticorpos MR1 atuais são incapazes de detectar baixa expressão superficial de MR1 em células cancerosas, apesar da expressão detectável de mRNA. De fato, o nível de expressão na superfície de MR1 necessário para o reconhecimento de células cancerosas por MC.7.G5 estava frequentemente abaixo do limite necessário para a coloração com anticorpo, sugerindo que o MC.7.G5 TCR pode ser capaz de responder a um número baixo de cópias do ligante MR1, semelhante a células T que reconhecem pMHC. Estes resultados também demonstram o imenso poder da triagem CRISPR/Cas9 de genoma integral como plataforma de descoberta de ligantes de células T não convencionais. De fato, também foi usada essa técnica para encontrar moléculas expressas obrigatórias na superfície celular necessárias para o reconhecimento de células cancerosas por

TCRs γδ e antecipou-se que as metodologias aplicadas aqui revolucionarão rapidamente o campo de células T não convencionais, revelando novos ligantes.

[0109] Em resumo, a triagem de CRISPR de genoma integral foi usada para revelar o ligante expresso em câncer de MC.7.G5. Os experimentos de validação de MR1 mostraram que a ativação de MC.7.G5 por células A549 poderia ser bloqueada pelo anticorpo MR1 e o clone não respondeu à célula A549 nocaute para MR1 criada por este laboratório (Laugel e outros, 2012) ou por um MR1 nocaute mediado por CRISPR/Cas9 do MM9909.24 alvo de melanoma. MC.7.G5 respondeu à maioria das linhagens celulares de câncer, mas não respondeu às células primárias (não tumorais). O reconhecimento das células cancerosas alvo por MC.7.G5 exigiu a expressão de MR1. O único polimorfismo no MR1 é silencioso (Parra-Cuadrado e outros, 2000), de modo que os TCRs restritos a MR1 podem responder às células de qualquer indivíduo na população. Isso faz do MR1 um candidato particularmente atraente para abordagens de terapia celular adotiva, pois um único produto pode ser usado em todos os pacientes (Guo e outros, 2015). Conclusão

[0110] O MC.7.G5 TCR permite que as células T reconheçam uma ampla gama de tumores. O reconhecimento ocorre através da molécula invariável da população MR1. O MR1 normalmente não é expresso na superfície celular na ausência de um ligante em sua nervura de ligação (Chua e outros, 2011). A expressão de um ligante que se liga ao MR1 permite que a molécula trafegue para a superfície celular para apresentar esse ligante (Figura 10). A adição de ligantes MR1 conhecidos reduz o reconhecimento de tumores pelo clone de células T MC.7.G5 e sugere que o MC.7.G5 reconheça um ligante específico de célula cancerosa no contexto de MR1 (Figura 11) (ou seja, outros ligantes competem com ligante do câncer para ligação ao MR1). Dado o que se sabe sobre MR1, parece provável que esse ligante seja um intermediário em uma via metabólica que é acionada por tumorigênese. Os experimentos em andamento visam determinar a natureza desse ligante.

[0111] Esta invenção está centrada no TCR identificado no clone de células T MC.7.G5. Este TCR reconhece uma ampla gama de células cancerosas através da proteína conservada relacionada ao MHC (MR)

1. Este TCR não reconhece células não tumorais. O nocaute CRISPR/Cas9 de MR1 das linhagens de tumor ou o bloqueio com anticorpo anti-MR1 remove o reconhecimento do TCR. A incubação com ligantes de ligação a MR1 conhecidos reduz o reconhecimento de TCR, sugerindo que o ligante do receptor de células T (TCR) é um metabólito específico para câncer que fica ou é apresentado ao TCR na ranhura de ligação ao MR1. O MC.7.G5 TCR pode ser usado em uma variedade de diferentes estratégias de imunoterapia para câncer. O amplo reconhecimento de tumores e a independência de reconhecimento do antígeno leucocitário humano (HLA) abrem possibilidades interessantes para imunoterapias abrangentes para câncer e para a população usando este TCR. Referências Chua WJ, Kim S, Myers N, Huang S, Yu L, Fremont DH, e outros (2011) Endogenous MHC-related protein 1 is transiently expressed on the plasma membrane in a conformation that activates mucosal-associated invariant T cells. Journal of Immunology, 186, 4744-50. Ekeruche-Makinde, J., M. Clement, D.K. Cole, E.S.J. Edwards, K. Ladell, J.J. Miles, K.K. Matthews, A. Fuller, K.A. Lloyd, F. Madura, G.M. Dolton, J. Pentier, A. Lissina, E. Gostick, T.K. Baxter, B.M. Baker, P.J. Rizkallah, D.A Price, L. Wooldridge and A.K. Sewell (2012). T cell receptor optimized skewing of the repertoire can enhance antigen targeting.

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Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Receptor de células T (TCR) específico para tumor caracterizado por uma região determinante de complementaridade que compreende ou consiste emem: (CDR) CAYRSAVNARLMF (SEQ ID Nº: 1) ou uma CDR que compartilha pelo menos 88% de identidade com a mesma; e/ou (CDR) CASSEARGLAEFTDTQYF (SEQ ID Nº: 2) ou uma CDR que compartilha pelo menos 88% de identidade com a mesma.

2. Receptor de células T específico para tumor (TCR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito TCR compreende ambas as ditas CDRs.

3. Receptor de células T específico para tumor (TCR), de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito TCR compreende ou consiste emem uma ou mais, incluindo qualquer combinação, das seguintes regiões determinantes de complementaridade: TSESDYY (CDR1α) SEQ ID Nº: 3 ATEN (CDR2α) SEQ ID Nº: 4 MGHDK (CDR1β) SEQ ID Nº: 5 SYGVNS (CDR2β) SEQ ID Nº: 6

4. Receptor de células T específico para tumor (TCR), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito TCR não é um TCR expresso por ou associado a uma célula T invariável associada à mucosa (célula MAIT).

5. Receptor de células T específico para tumor (TCR), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito TCR é uma cadeia α que compreende adicionalmente ou consistindo em:

AQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQ

PPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDA

AMYFCAYRSAVNARLMFGDGTQLVVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSD

KSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAW SNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS (SEQ ID Nº: 7) ou uma cadeia alfa que compartilha pelo menos 88% de identidade com a mesma.

6. Receptor de células T específico para tumor (TCR), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito TCR é uma cadeia β compreendendo adicionalmente ou consistindo de:

EADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDP

GMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTS

QYLCASSEARGLAEFTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPS

EAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLK

EQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWT QDRAKPVTQIVSAEAWGRAD (SEQ ID Nº: 8) ou uma cadeia beta que compartilha pelo menos 88% de identidade com a mesma.

7. Receptor de células T específico para tumor (TCR), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito TCR é solúvel.

8. Receptor de células T específico para tumor (TCR), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito TCR é restrito a MR1.

9. Célula T caracterizada pelo fato de que expressa o dito TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. Clone de células T caracterizado pelo fato de que expressa o dito TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

11. Clone de células T, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito clone é um clone MC.7.G5.

12. Vetor caracterizado pelo fato de que codifica o TCR de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

13. Composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina caracterizada pelo fato de que compreende o dito TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou a dita célula como definida na reivindicação 9 ou o dito clone como definido na reivindicação 10 ou 11 ou o dito vetor como definido na reivindicação 12.

14. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a dita célula como definida na reivindicação 9, ou o dito clone como definido na reivindicação 10 ou 11, ou o dito vetor como definido na reivindicação 12, ou a dita composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.

15. TCR, célula, clone, vetor, composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer, em que o dito câncer é selecionado a partir do grupo que compreende ou consiste em câncer colorretal, de pulmão, de rim, de próstata, de colo do útero, melanoma (pele), de osso, de ovário, de mama e de sangue.

16. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o dito TCR como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou a dita célula como definida na reivindicação 9, ou o dito clone como definido na reivindicação 10 ou 11, ou o dito vetor como definido na reivindicação 12, ou a dita composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina como definida na reivindicação 13, a um indivíduo a ser tratado.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é selecionado a partir do grupo que compreende ou consiste em câncer colorretal, de pulmão, de rim, de próstata, de colo do útero, melanoma (pele), de osso, de mama, de ovário e de sangue.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o dito TCR, célula, clone, vetor, composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina é administrado em combinação com um agente antitumoral.

19. Uso do dito TCR como definido nas reivindicações 1 a 8, ou da dita célula como definida na reivindicação 9, ou do dito clone como definido na reivindicação 10 ou 11, ou do dito vetor como definido na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratar câncer.

20. Combinação terapêutica para o tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: a) o dito TCR como definido nas reivindicações 1 a 8, ou a dita célula como definida na reivindicação 9, ou o dito clone como definido na reivindicação 10 ou 11, ou o dito vetor como definido na reivindicação 12, ou a dita composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina em combinação com b) um outro agente terapêutico de câncer.

21. TCR, célula, clone, vetor, composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina, caracterizado pelo fato de que é como substancialmente aqui descrito.