BR112020023182A2 - receptores de células t específicos para câncer - Google Patents

Abstract

''RECEPTORES DE CÉLULAS T ESPECÍFICOS PARA CÂNCER''. A presente invenção refere-se a um novo peptídeo anticâncer, um vetor que codifica o mesmo, uma composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina que compreendem o peptídeo anticâncer; uso do peptídeo anticâncer, vetor, composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina para tratar câncer; um método de tratamento de câncer usando o peptídeo anticâncer, vetor, composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina; e uma combinação terapêutica para o tratamento do câncer compreendendo o peptídeo anticâncer, vetor, composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEPTORES DE CÉLULAS T ESPECÍFICOS PARA CÂNCER". Campo técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um novo peptídeo anticâncer, um vetor que codifica o mesmo, uma composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina que compreende o referido peptídeo anticâncer; uso do referido peptídeo anticâncer, vetor, composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina para tratar câncer; um método de tratamento de câncer usando o referido peptídeo anticâncer, vetor, composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina; e uma combinação terapêutica para o tratamento do câncer compreendendo o referido peptídeo anticâncer, vetor, composição farmacêutica, agente imunogênico, biespecífico ou vacina. Antecedentes da invenção

[0002] Identificou-se uma nova classe de células T eficazes no tratamento do câncer.

[0003] Essa nova classe é estabelecida pensando que células T reconhecem peptídeos individuais do câncer por meio de seu receptor de células T cognato. Assim, pensa-se que um único TCR reconhece um único peptídeo antigênico do câncer, tipicamente quando apresentado na superfície da célula no contexto da molécula de antígeno leucocitário humano (HLA) classe | ou classe |l.

[0004] Este novo trabalho aqui apresentado mostra notável e significativamente que algumas células T reconhecem diferentes peptídeos antigênicos de câncer (de sequência distinta) usando o mesmo receptor de células T (TOR), indicando assim que um único TOR tem a capacidade de reconhecer múltiplos e distintos antígenos de câncer. Essa é uma identificação única que vai contra a sabedoria convencional e tem implicações significativamente benéficas no tratamento do câncer que é considerado uma doença multifacetada.

[0005] Este trabalho mostra que essas células T podem reconhecer vários peptídeos distintos que são derivados de diferentes antígenos de câncer quando apresentados na superfície da célula no contexto da mesma molécula de antígeno leucocitário humano (HLA) classe |. Na maioria dos casos, os peptídeos são apresentados na superfície da mesma célula cancerosa, o que não foi descrito antes.

[0006] Parece, portanto, que algumas células T raras são capazes de reconhecer uma variedade de peptídeos antigênicos de câncer individuais por meio de seu receptor de células T cognato. Esse novo tipo de célula T usa um receptor de célula T idêntico (TCR) para reconhecer células cancerosas por meio de vários peptídeos cancerígenos diferentes. Denominou-se essas células T de "células T multifacetadas" que, usando seu TCR cognato, podem reconhecer e atacar células cancerosas por meio de mais de um antígeno e, assim, reduzir amplamente as chances de escape imunológico por células Ccancerosas.

[0007] Em 2015, cerca de 90,5 milhões de pessoas tinham câncer. Cerca de 14,1 milhões de novos casos ocorrem por ano (não incluindo câncer de pele, exceto melanoma). Causa cerca de 8,8 milhões (15,7%) das mortes humanas. Os tipos mais comuns de câncer em homens são câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer colorretal e câncer de estômago. Nas mulheres, os tipos mais comuns de câncer são câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão e câncer cervical. Se o câncer de pele, exceto melanoma, fosse incluído no total de novos cânceres a cada ano, isso representaria cerca de 40% dos casos. Em crianças, leucemia linfoblástica aguda e tumores cerebrais são mais comuns, exceto na África, onde linfoma não Hodgkin ocorre com mais frequência. Em 2012, cerca de 165.000 crianças menores de 15 anos foram diagnosticadas com câncer. O risco de câncer aumenta significativamente com a idade e muitos cânceres ocorrem mais comumente em países desenvolvidos. As taxas estão aumentando à medida que mais pessoas vivem até a velhice e ocorrem mudanças no estilo de vida no mundo em desenvolvimento. Os custos financeiros do câncer foram estimados em US$ 1,16 trilhão por ano em 2010. Conclui- se que é necessário fornecer maneiras melhores e mais seguras de tratar ou erradicar essa doença. Uma imunoterapia que usa os sistemas de defesa naturais do corpo para matar o tecido aberrante é reconhecida como mais segura do que a intervenção química, mas, para ser eficaz, a imunoterapia deve ser capaz de eliminar a doença. Além disso, a identificação de uma imunoterapia que seja eficaz contra qualquer tipo de câncer ou uma série de cânceres seria extremamente benéfica, pois não só poderia ser administrada a indivíduos que sofrem de muitos tipos diferentes de câncer (ou seja, teria aplicação pan- populacional), como também poderia ser administrada a um único indivíduo que sofre de mais de um tipo de câncer.

[0008] As células T e seus receptores que foram identificados aqui têm as características vantajosas acima, pois são eficazes contra mais de um tipo de câncer, protegendo assim contra um câncer que foge da eficácia do sistema imunológico. Além disso, a produção dessas células T vantajosas e seus receptores pode ser realizada pelo uso dos novos peptídeos anticâncer aqui descritos. Declarações da invenção

[0009] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um receptor de células T anticâncer (TCR) isolado, ou um fragmento do mesmo, que reconhece uma pluralidade de antígenos peptídicos de câncer quando os referidos antígenos são apresentados em uma superfície celular por molécula de antígeno leucocitário humano (HLA) classe | e em que os referidos antígenos são distintos uns dos outros e são representativos de mais de um tipo de câncer.

[00010] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um TCR anticâncer ou um TCR específico para câncer, ou um fragmento do mesmo, que reconhece uma pluralidade de antígenos do câncer em que o referido TCR tem uma região determinante de complementaridade selecionada do grupo que compreende ou consiste em: CATSDRGQGANWDEQFF (SEQ ID NO: 1); CASTLGGGTEAFF (SEQ ID NO: 2); CSARDLLAETYEQYF (SEQ ID NO: 3); CASSSSDTDTOQYF (SEQ ID NO: 4); CSVEGSLGRALRANEQFF (SEQ ID NO: 5); CATHGGEKLFF (SEQ ID NO: 6); CASSYVGLGSPLHF (SEQ ID NO: 7); CSGQANTEAFF (SEQ ID NO: 8); CASSPTTGLKTRSGYTF (SEQ ID NO: 9); CSEGSPYNEQFF (SEQ ID NO: 10); CASSNGFHFNTLYF (SEQ ID NO: 11); CASSLGGGDTOQYF (SEQ ID NO: 12); CASSFAGTDTOQYF (SEQ ID NO: 13); CASSLGEGSPGELFF (SEQ ID NO: 14); CASSQEPNWNTEAFF (SEQ ID NO: 15); CASSFQGPGYGYTF (SEQ ID NO: 16); CSARDTTWGLEQYF (SEQ ID NO: 17); CATKPSGSTDTQYF (SEQ ID NO: 18); CSARDEGIGYEQYF (SEQ ID NO: 19); CASSSGPGELFF (SEQ ID NO: 20); CARRTLVIVRRFYSGNTIYF (SEQ ID NO: 21); CSARDLIGSQTYEQYF (SEQ ID NO: 22); CSARDPIGTESYEQYF (SEQ ID NO: 23); CSARDRAGRSPLHF (SEQ ID NO: 24);

CSVEESSGIYEQYF (SEQ ID NO: 25); CSAREDGGQTYEOQYF (SEQ ID NO: 26); CASSWAG PVEQYF (SEQ ID NO: 27); CASSSQGRAEOYF (SEQ ID NO: 28); CASSSRDSLYEQYF (SEQ ID NO: 29); CASSLGIISGQPQHF (SEQ ID NO: 30); CASSNTGGYTOYF (SEQ ID NO: 31); CASSQGLLLDNEQFF (SEQ ID NO: 32); CASSSPMDSGDTDTOQYF (SEQ ID NO: 33); CASSPRSGVPQHF (SEQ ID NO: 34); CASSFVREEGSTDTOQYF (SEQ ID NO: 35); CSARGTESYEQYF (SEQ ID NO: 36); CASWPGEGFGETOYF (SEQ ID NO: 37); CSGWGQGDEKLFF (SEQ ID NO: 38); CASSEYTSGNQPQHF (SEQ ID NO: 39); CSARDLWTGETYEQYF (SEQ ID NO: 40); CSATGLAGLGEQFF (SEQ ID NO: 41); CATSDLGTGVGEQFF (SEQ ID NO: 42); CSVGPGSTGELFF (SEQ ID NO: 43); CASSPTGEKLFF (SEQ ID NO: 44); CASSQEGGTWGDGYTEF (SEQ ID NO: 45); CATSDLLLAGGRSSYNEQFF (SEQ ID NO: 46); CASSEAASGRPOQTEF (SEQ ID NO: 47); CATSDATAGTSGSLYEQYF (SEQ ID NO: 48); CASSLTGLGQPQHF (SEQ ID NO: 49); CASSPAVLSYEQYF (SEQ ID NO: 50); CSARESLAETYEQYF (SEQ ID NO: 51); CASSPGLTANVLTF (SEQ ID NO: 52); CASSLGLAGNEOQYF (SEQ ID NO: 53); CASSNGFHFNTOYF (SEQ ID NO: 54);

CASSLGILTDTQYF (SEQ ID NO: 55); CASSFQPVDTOQYF (SEQ ID NO: 56); CSASEGIGQPQHF (SEQ ID NO: 57); e CASSVSGGEQFF (SEQ ID NO: 58), ou uma região determinante de complementaridade que tem pelo menos 85% de identidade com qualquer uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade anteriores.

[00011] Em outra modalidade de realização preferida da presente invenção, a referida região determinante de complementaridade tem pelo menos 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade anteriores.

[00012] Em uma modalidade de realização preferida da invenção, a pluralidade de antígenos é apresentada na superfície celular no contexto da molécula de antígeno leucocitário humano (HLA) classe | e, mais preferencialmente ainda, o referido reconhecimento ocorre ou mostra-se ocorrer por qualquer uma ou mais, incluindo qualquer combinação, das seguintes atividades: o TCR, ou uma célula T que expressa o referido TOR, desencadeia ou causa a morte de uma célula cancerosa que expressa qualquer um ou mais dos referidos antígenos; e/ou o TCR, ou uma célula T que expressa o referido TOR, desencadeia a produção de ou torna pró-inflamatórias citocinas tais como TNF e IFN gama (essa característica é útil para reverter o microambiente tumoral imunossupressor); e/ou o TCR, ou uma célula T que expressa o referido TOR, desencadeia desgranulação ou sofre desgranulação; e/ou o TCR, ou uma célula T que expressa o referido TCR, ativa qualquer um ou mais de CD107a, beta-quimiocinas (MIP 1 beta) e citocinas tais como Interferon gama (IFN gama) e fator de necrose tumoral (TNF).

[00013] Em uma modalidade de realização preferida da invenção, o referido TOR tem uma região determinante de complementaridade selecionada do grupo que compreende ou consiste em: CATSDRGQGANWDEQFF (SEQ ID NO: 59); CASTLGGGTEAFF (SEQ ID NO: 60); CSARDLLAETYEQYF (SEQ ID NO: 61); CASSSSDTDTOQYF (SEQ ID NO: 62); CSVEGSLGRALRANEQFF (SEQ ID NO: 63); CATHGGEKLFF (SEQ ID NO: 64); CASSYVGLGSPLHF (SEQ ID NO: 65); CSGQANTEAFF (SEQ ID NO: 66); CASSPTTGLKTRSGYTF (SEQ ID NO: 67); CSEGSPYNEQFF (SEQ ID NO: 68); CASSNGFHFNTLYF (SEQ ID NO: 69); e CASSLGGGDTOQYF (SEQ ID NO: 70); ou uma região determinante de complementaridade que tem pelo menos 85% de identidade com qualquer uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade anteriores.

[00014] Em outra modalidade de realização preferida da presente invenção, a região determinante de complementaridade tem pelo menos 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade anteriores.

[00015] Em uma modalidade de realização preferida da invenção, os referidos mais de um tipo de câncer são selecionados do grupo que compreende ou consiste em: câncer de nasofaringe, câncer sinovial, câncer hepatocelular, câncer renal, câncer de tecidos conjuntivos, melanoma, câncer de pulmão, câncer de intestino, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer cerebral, câncer de garganta, câncer oral, câncer de fígado, câncer ósseo, câncer pancreático,

coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de células T, amígdala, baço, neuroma, doença de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, câncer suprarrenal, câncer anal, câncer do ducto biliar, câncer de bexiga, câncer de ureter, glioma, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor da medula espinhal, câncer ósseo, osteocondroma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, câncer de local primário desconhecido, carcinoide, carcinoide do trato gastrointestinal, fibrossarcoma, câncer de mama, câncer muscular, doença de Paget, câncer cervical, ovário, sangue, câncer de cólon, câncer retal, câncer de esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer de colangioma, câncer de cabeça, câncer de olho, câncer de nasofaringe, câncer de pescoço, câncer de rim, tumor de Wilms, câncer de fígado, sarcoma de Kaposi, câncer de próstata, câncer testicular, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer de pele, mesotelioma, mieloma, mieloma múltiplo, ovário, endócrino, glucagonoma, câncer de paratireoide, câncer de pênis, câncer de hipófise, sarcoma de tecidos moles, retinoblastoma, câncer de intestino delgado, câncer de estômago, câncer de timo, câncer de tireoide, câncer trofoblástico, mola hidatiforme, câncer uterino, câncer endometrial, câncer de vagina, câncer de vulva, neuroma acústico, micose fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, câncer de gengiva, câncer de coração, câncer de lábio, câncer de meninges, câncer de boca, câncer de nervo, câncer de palato, câncer de glândula parótida, câncer de peritônio, câncer de faringe, câncer de pleura, câncer de glândula salivar, câncer de língua e câncer de amígdala.

[00016] Em ainda outra modalidade de realização preferida da invenção, os referidos mais de um tipo de câncer são selecionados do grupo que compreende ou consiste em: pancreático, sangue, ovário, pele, mama, cervical, próstata, osso, pulmão, fígado, cólon e rim.

[00017] Referência aqui a antígenos de câncer que são distintos uns dos outros é referência a antígenos de câncer que são representativos de diferentes tipos de câncer e, portanto, referência a antígenos que são distintamente diferentes em termos de sua estrutura de sequência ou da molécula, tipicamente proteína, de que eles são derivados.

[00018] No entanto, apesar dessa diferença na sequência do antígeno, o TCR da invenção é capaz de reconhecer uma pluralidade desses antígenos de câncer distintos ou diferentes. Os versados no estado da técnica entenderão que seria extremamente difícil para células cancerosas escaparem de células T que as têm como alvo por meio de mais de um antígeno de câncer diferente, pois o escape exigiria mutação simultânea de todos os alvos que diminuíram ou eliminaram a apresentação de todos os cognatos peptídeos.

[00019] Em uma modalidade de realização preferida da invenção, a molécula de antígeno leucocitário humano (HLA) classe | é MHC classe | (A, B ou C). Mais especificamente, o referido HLA é HLA A2 ou HLA A2Z4 ou HLA A1 ou HLA A3.

[00020] MHC classe | apresenta peptídeos a partir de dentro da célula. Por exemplo, no contexto de uma célula cancerosa, o sistema HLA traz fragmentos ou peptídeos da proteína expressa pelo câncer para a superfície da célula para que a célula possa ser reconhecida como cancerosa e destruída pelo sistema imunológico. Esses peptídeos são produzidos a partir de proteínas digeridas que são decompostas nos proteassomas. Em geral, esses peptídeos particulares são polímeros pequenos, com cerca de 7-20, tipicamente mas não exclusivamente com 9 ou 10, aminoácidos de comprimento. Antígenos oncogênicos apresentados pelo sistema MHC classe | atraem células T assassinas (também chamadas de células T CD8 positivas ou citotóxicas) que destroem as células cancerosas.

[00021] Em uma modalidade de realização preferida da invenção, o referido TOR é um TCR alfa beta (af).

[00022] Em ainda outra modalidade de realização preferida da presente invenção, o TCR é um TCR solúvel (sSTCR) e, portanto, não possui os domínios transmembrana e, idealmente também, intracelular.

[00023] Em ainda outra modalidade de realização preferida da invenção, o TCR é parte de um receptor quimérico com a funcionalidade aqui descrita. Idealmente, o TOR é fundido com um domínio constante de TCR ou a um domínio de sinalização de TCR.

[00024] Em alternativa, é fornecido um fragmento do TCR, tal como uma parte monomérica do mesmo, idealmente uma forma de cadeia simples do TCR.

[00025] Em outra alternativa, é fornecido um fragmento do TCR, tal como a região determinante de complementaridade do mesmo.

[00026] “De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula T que expressa o referido TOR da invenção, idealmente, em uma forma solúvel ou em uma forma compatível com a membrana, isto é, tendo uma região transmembrana e uma região intracelular.

[00027] “De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é fornecido um clone de células T que expressa o TCR da invenção, idealmente, em uma forma solúvel e, portanto, não possui um domínio transmembrana e, idealmente também, um domínio intracelular, ou uma forma compatível com a membrana, isto é, tendo uma região transmembrana e, idealmente também, um domínio intracelular.

[00028] De preferência, o clone é um clone de células T CR24, GD1, GD2, VB6G4.24, CR1 ou VB10 como aqui descrito.

[00029] Idealmente, o clone é CR24 que reconhece múltiplos peptídeos antigênicos de câncer, mais preferencialmente o clone CR24 reconhece uma pluralidade dos peptídeos selecionados do grupo que compreende ou consiste em: EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71) de Melan A (resíduos 26-35), LLLGIGILVL (SEQ ID NO: 72) de BST2 (resíduos

22-31) e NLSALGIFST (SEQ ID NO: 73) de IMP2 (resíduos 367-376). De preferência, esse reconhecimento está no contexto da apresentação de HLA A2.

[00030] Idealmente, o clone GD1 ou GD2 reconhece múltiplos peptídeos antigênicos de câncer, mais preferencialmente o clone GD1 ou GD2 reconhece os seguintes peptídeos: RLVDDFLLV (SEQ ID NO: 74) da transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT) (resíduos 855-873) e ALKDVEERV (SEQ ID NO: 75) do antígeno C2 associado a melanoma (MAGE C2) (resíduos 336-344). O clone GD1 foi capaz de matar linhagens de células de câncer de mama, sangue e melanoma.

[00031] Idealmente, os clones VB6G4.24, CR1 e VB10 reconhecem o peptídeo Melano A (EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71)), mas não os peptídeos BST2 (LLLGIGILVL (SEQ ID NO: 72) ou IMP2 (NLSALGIFST (SEQ ID NO: 73)) (nem como peptídeo exógeno nem de proteína transduzida expressa por MOLT3s). Uma vez que a sequência CDR3 da cadeia beta de TCR de VB6G4.24 apareceu em dados de clonotipagem para todas as dez linhagens de células de câncer na Figura 2, esse clone responde a várias linhagens de células de câncer, mas não por reconhecimento dos peptídeos IMP2 ou BST2.

[00032] “De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor que codifica o referido TOR da invenção.

[00033] “De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina que compreende o TCR ou célula T ou clone de célula T ou vetor da invenção.

[00034] Em uma modalidade de realização preferida da invenção, a composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina destina-se a uso no tratamento de câncer.

[00035] “De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é fornecido o TCR ou célula T ou clone ou vetor de célula T como descrito neste documento para uso no tratamento de câncer.

[00036] “De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento de câncer em um indivíduo com ou suspeito de ter câncer, compreendendo a administração do TCR ou célula T ou clone ou vetor de célula T ou composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina ao indivíduo a ser tratado.

[00037] Idealmente, o câncer é de qualquer tipo. Mais idealmente, o câncer é selecionado do grupo que compreende ou consiste em: câncer de nasofaringe, câncer sinovial, câncer hepatocelular, câncer renal, câncer de tecidos conjuntivos, melanoma, câncer de pulmão, câncer de intestino, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, cérebro câncer, câncer de garganta, câncer oral, câncer de fígado, câncer Ósseo, câncer pancreático, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de células T, amígdala, baço, neuroma, doença de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, câncer suprarrenal, câncer anal, câncer do ducto biliar, câncer de bexiga, câncer de ureter, glioma, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor da medula espinhal, câncer ósseo, osteocondroma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, câncer de local primário desconhecido, carcinoide, carcinoide do trato gastrointestinal, fibrossarcoma, câncer de mama, câncer muscular, doença de Paget, câncer cervical, ovário, sangue, câncer de cólon, câncer retal, câncer de esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer de colangioma, câncer de cabeça, câncer de olho, câncer de nasofaringe, câncer de pescoço, câncer de rim, tumor de Wilms, câncer de fígado, sarcoma de Kaposi, câncer de próstata, câncer testicular, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer de pele, mesotelioma, mieloma, mieloma múltiplo, ovário, endócrino, glucagonoma, câncer de paratireóide, câncer de pênis, câncer de hipófise, sarcoma de tecidos moles, retinoblastoma, câncer de intestino delgado, câncer de estômago, câncer de timo,

câncer de tireoide, câncer trofoblástico, mola hidatiforme, câncer uterino, câncer endometrial, câncer de vagina, câncer de vulva, neuroma acústico, micose fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, câncer de gengiva, câncer de coração, câncer de lábio, câncer de meninges, câncer de boca, câncer de nervo, câncer de palato, câncer de glândula parótida, câncer de peritônio, câncer de faringe, câncer de pleura, câncer de glândula salivar, câncer de língua e câncer de amígdala.

[00038] Mais preferencialmente, o câncer é câncer de pâncreas, sangue, ovário, pele, mama, osso, rim, cólon, cervical, fígado, próstata ou pulmão.

[00039] Em um método preferido da invenção, o TCR, célula, clone ou vetor é administrado em combinação com um agente anticâncer, tal como, mas não limitado ao mesmo, um anticorpo biespecífico.

[00040] Referência aqui a um biespecífico é referência a um anticorpo monoclonal biespecífico (BSMAb, BsAb) que é uma proteína artificial que pode se ligar simultaneamente a dois tipos diferentes de antígeno.

[00041] —Alternativamente, ainda, o TOR pode formar parte de um anticorpo biespecífico em que o biespecífico inclui o TOR, com a finalidade de se ligar ao seu ligante em uma célula cancerosa, e também um componente de ativação de célula imune ou ligante que se liga e assim ativa uma célula imune tal como uma célula T assassina.

[00042] “De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é fornecido o uso do TCR ou célula ou clone ou vetor na fabricação de um medicamento para tratar câncer.

[00043] “De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é fornecida uma combinação terapêutica para o tratamento de câncer, compreendendo: a) o TOR ou célula ou clone ou vetor ou agente imunogênico ou biespecífico ou vacina em combinação com b) outro agente terapêutico contra o câncer.

[00044] “De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é fornecido um peptídeo anticâncer ou antígeno peptídico capaz de desencadear células T anticâncer, o qual, idealmente, mas não exclusivamente, reconhece o TCR da invenção, ou uma parte dele, e que quando administrado a um indivíduo inicia a produção de: células T anticâncer que atuam como células T efetoras e/ou células T que reconhecem uma pluralidade de antígenos de câncer quando esses antígenos peptídicos são apresentados na superfície de uma célula por molécula de antígeno leucocitário humano (HLA) classe | e em que esses antígenos de câncer são distintos uns dos outros e são representativos de mais de um tipo de câncer.

[00045] “De acordo com outro aspecto ou em uma modalidade de realização preferida da presente invenção, um/esse peptídeo anticâncer é selecionado do grupo que compreende ou consiste em: ITSAIGVLPV (SEQ ID NO: 76); ITSAIGILPV (SEQ ID NO: 77); MTSAIGVLPV (SEQ ID NO: 78); QTSAIGVLPV (SEQ ID NO: 79); MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80); LTSAIGVLPV (SEQ ID NO: 81); ITSGIGVLPV (SEQ ID NO: 82); ITSAIGVLPI (SEQ ID NO: 83); QTSAIGILPV (SEQ ID NO: 84); ITSAIGVLFV (SEQ ID NO: 85).

[00046] Mais idealmente, o referido peptídeo anticâncer é MTSAIGILPV. Ainda mais idealmente, o referido peptídeo tem 80% ou 90% de identidade com um dos peptídeos anteriores e, portanto, inclui uma ou duas substituições, exclusões ou adições.

[00047] “De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma vacina que compreende o peptídeo anticâncer.

[00048] “De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico que compreende o peptídeo anticâncer.

[00049] “De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento de câncer o qual compreende a administração do peptídeo anticâncer, em sua forma nativa ou como uma vacina, composição farmacêutica, agente imunogênico ou biespecífico, a um indivíduo.

[00050] — De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado o uso de um peptídeo anticâncer para emprego no tratamento de câncer.

[00051] — De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado o uso do peptídeo anticâncer na produção de um medicamento para o tratamento do câncer.

[00052] Em uma modalidade de realização preferida da invenção, o câncer é selecionado daqueles aqui descritos, especialmente câncer de pele ou melanoma.

[00053] Nas reivindicações que se seguem e na descrição anterior da invenção, exceto onde o contexto exigir de outra forma devido à linguagem expressa ou implicação necessária, a palavra "compreende", ou variações como "que compreende" ou "compreendendo", é usada em um sentido inclusivo, isto é, para especificar a presença das características declaradas, mas não para impedir a presença ou adição de outras características em várias modalidades da invenção.

[00054] Todas as referências, incluindo qualquer patente ou pedido de patente, citadas neste relatório descritivo são aqui incorporadas como referência. Nenhuma admissão é feita de que qualquer referência constitui estado da técnica. Além disso, nenhuma admissão é feita de que qualquer um dos estados da técnica constitui parte do conhecimento geral comum no estado da técnica.

[00055] Características preferidas de cada aspecto da invenção podem ser conforme descrito em conexão com qualquer um dos outros aspectos.

[00056] Outras características da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir dos exemplos seguintes. De um modo geral, a invenção estende-se a qualquer nova característica, ou qualquer nova combinação das características apresentadas neste relatório descritivo (incluindo as reivindicações e desenhos anexos). Assim, recursos, números inteiros, características, compostos ou frações químicas descritos em conjunto com um aspecto, modalidade ou exemplo particular da invenção devem ser entendidos como sendo aplicáveis a qualquer outro aspecto, modalidade ou exemplo aqui descritos, a menos que seja incompatível com eles.

[00057] Além disso, a menos que indicado de outra forma, qualquer característica descrita neste documento pode ser substituída por uma característica alternativa que serve ao mesmo propósito ou a um propósito semelhante.

[00058] Ao longo da descrição e reivindicações deste relatório descritivo, o singular engloba o plural, a menos que o contexto exija de outra forma. Em particular, onde o artigo indefinido é usado, o relatório descritivo deve ser entendido como contemplando a pluralidade, bem como a singularidade, a menos que o contexto exija o contrário.

[00059] Uma modalidade de realização da presente invenção será agora descrita a título de exemplo apenas com referência ao seguinte, em que:

[00060] A Figura 1 mostra linfócitos de infiltração em tumor (TILs) usados para curar o paciente HLA A2+ MM909.24 de melanoma metastático que são capazes de reconhecer vários tipos de células cancerígenas HLA A2+. (A) Os TlLs foram testados contra melanoma autólogo e linhagens de células cancerosas de diferentes origens de tecido. (B) Ensaio de citotoxicidade de liberação de cromo com melanoma autólogo e as linhagens de células de câncer HLA A2+ apresentadas. As linhagens celulares são codificadas por cores de acordo com seu tecido de origem (A). Lise específica após 18 h de incubação é exibida. (C) Ensaio de TAPI-O em que TlLs foram incubados com as linhagens indicadas de células de câncer HLA A2+ por 5 h e a ativação avaliada por detecção de TNF e CD107a com anticorpos monoclonais. A porta ativada (TNF+ e/ou CD107a+) foi definida com base no controle de TIL sozinho. As células T respondentes foram classificadas por citometria de fluxo e usadas para o sequenciamento de nova geração das cadeias a e B do receptor de células T (TCR).

[00061] A Figura 2 mostra clonotipos de cadeias B do receptor de células T (TOR) de células T funcionais, do paciente TIL de HLA A2+ MMA909.24, capazes de responder a linhagens de células cancerosas, bem como melanoma autólogo (MM909.24). As células foram classificadas com base na função (ensaio TAPI-O com anticorpos CD107a e TNF) após 5 h de incubação com as linhagens de células cancerosas HLA A2+ mostradas (Figura 1) e usadas para sequenciamento de alto rendimento /llumina das cadeias de TCR. (A) As CDR3s da cadeia B do TOR são apresentados à esquerda, com cada segmento sombreado em azul do gráfico indicando que a CDR3 estava presente na população respondendo à linhagem de células cancerosas mostradas no alto do gráfico. Cinco TORs respondem a todos os tipos de câncer. (B) Mostra a proporção de CDR3s que reconheceram o número de linhagens de células cancerosas mostradas ao lado de cada segmento. Por exemplo, 2 linhagens celulares = melanoma autólogo + outra linhagem de células cancerosas; 10 linhagens celulares = melanoma autólogo + 9 outras linhagens de células cancerosas. Mais de 50% dos clonotipos que respondem ao melanoma autólogo HLA A2+ também respondem a quatro ou mais outros tipos de câncer.

[00062] A Figura 3 mostra um pipeline de identificação de epítopos de câncer. Essa figura descreve a estratégia usada para identificar o(s) peptídeo(s) reconhecido(s) pelas células T que respondem a vários tipos de células cancerosas. (A) Células T CD8 foram clonadas a partir de TIL MM909.24 por diluição limitante, em seguida, rastreadas em relação a citotoxicidade contra melanoma autólogo MM909.24. Em alguns casos, outros tipos de células cancerosas também foram usados durante a triagem. Os clones de interesse foram expandidos e usados para outros ensaios. (B) Rastreio da biblioteca de peptídeos combinatórios foi realizado relativamente a clones-chave de células T CD8 para revelar suas preferências de resíduos de aminoácidos em cada posição de um peptídeo. O esquema mostra o projeto de uma biblioteca CPL, composta de sub-bibliotecas de peptídeos; cada sub- biblioteca tem um resíduo de aminoácido fixo (círculo aberto) (1 dos 20 aminoácidos proteogênicos) em uma posição definida do peptídeo, com todas as outras posições da mesma sub-biblioteca sendo uma mistura aleatória de resíduos (quadrado cinza). (C) Os dados de CPL (exemplo mostrado na Figura 5) foram usados para rastrear um banco de dados de proteínas de câncer (manuscrito em preparação) para listar peptídeos candidatos que se prevê serem reconhecidos pelo clone. (D) Teste funcional de peptídeos de câncer candidatos para revelar aqueles reconhecidos por um clone de CD8.

[00063] A Figura 4 mostra que o cone de células T CR24 pode reconhecer várias linhagens de células de câncer FILA A2+ de diferentes origens de tecido. Ensaios TAPI-O foram usados para avaliar a reatividade de CR24 em relação às linhagens de células cancerosas mostradas. A porcentagem de reatividade (CD107a+ e/ou TNF+) é exibida. (A) CR24 reconheceu melanomas HLA A2+, mas não melanomas HLA A2-negativo. (B) A linhagem celular leucêmica CIR foi reconhecida quando FILA A2 foi expressa. (C) Reconhecimento de linhagens de células FILA A2+ não melanoma de diferentes origens em tecidos (chave).

[00064] A Figura 5 mostra o rastreio da biblioteca combinatória de peptídeos (CPL) do clone de células T CD8 CR24. Cada sub-biblioteca de uma tela de decâmero CPL foi incubada em duplicata com CR24, com a linhagem de células T2 deficiente em TAP (transportador associado ao processamento de antígeno) usada como uma célula que apresenta antígeno. A preferência de comprimento de peptídeo (10meros) de CR24 já havia sido determinada usando um ensaio de varredura de tamanho (dados não mostrados). Após incubação durante a noite, os sobrenadantes foram colhidos e a ativação do clone avaliada por ELISA de MIR1-B. Cada gráfico mostra uma posição de peptídeo da tela CPL, com os aminoácidos (código de uma única letra) mostrados no eixo x fixados nessa posição particular. As barras em verde mostram os resíduos de aminoácidos para um dos peptídeos reconhecidos por CR24, EAAGIGILTV de Melan A (resíduos 26-35). Os dados de CPL foram executados por meio de uma ferramenta de internet para antígeno de câncer sob medida para fornecer peptídeos candidatos que são mais prováveis de serem reconhecidos por CR24 (Figura 6).

[00065] A Figura 6 mostra o clone de células T CR24 que reconhece três peptídeos distintos derivados de diferentes proteínas do câncer. Dos peptídeos candidatos identificados pelo rastreio da biblioteca de peptídeos combinatória realizada na Figura 4, três dos peptídeos foram reconhecidos por CR24; EAAGIGILTV (Antígeno de Melanoma Reconhecido por células T1/Antígeno de Melanócito (MART-1/Melan A, resíduos — 26-35) http://www.iedb.org/epld/10987), — LLLGIGILVL (antígeno 2 do estroma da medula óssea (BST2, resíduos 22-31) e

NLSALGIFST da proteína de ligação do mMRNA 2 do fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IMP2, resíduos 367-376). Os dois resíduos de aminoácidos comuns a todos os três peptídeos são mostrados em vermelho na chave. O peptídeo Melan A está bem descrito como um alvo de células T que reconhecem melanomas. Uma versão de comprimento de 9 aminoácidos do peptídeo BST?2 foi descrita anteriormente (10: https://www.ncbi.nim.nih.gov/pubmed/16569595): O peptídeo IMP2 é um novo epítopo que não foi descrito anteriormente (manuscrito em preparação). (A) Ensaio de ativação com CR24 e uma titulação de cada peptídeo, incubado durante a noite, e sobrenadantes usados para ELISA de MIP-1EB. (B) CR24 corado com tetrâmeros de HLA A2 para cada um dos peptídeos, confirmando que o TCR cognato poderia envolver esses antígenos. Um protocolo de coloração otimizado foi usado. O tetrâmero de controle é HLA A2 ALWGPDPAAA (resíduos de pré-pró-insulina 15-24). (C) Ensaios de ativação com CR24 e células que apresentam antígeno que expressam as proteínas de que os três peptídeos de câncer são derivados. A linhagem celular, MOLT3 (naturalmente HLA-A2 negativo, Melan A negativo, BST2 negativo e IMP?2 negativo), foi transduzida com genes para expressão de HLA A2, Melan A, BST2, IMP2, a subunidade a2 do colágeno tipo IV e a proteína do capsídeo âncora do vírus Zika. As proteínas de colágeno e Zika atuaram como controles de transdução/proteína irrelevante. CR24 foi incubado durante a noite com cada uma das linhagens de células MOLT3 e sobrenadantes colhidos para ELISA de TNF.

[00066] A Figura 7 mostra clone de células T CR24 que reconhece melanoma autólogo por meio de pelo menos dois antígenos. (A) O gene Melan A no melanoma autólogo MM909.24 foi direcionado para ablação usando um RNA-guia (g) e CRISPR-Cas9. A sequência de aminoácidos de Melan A do tipo selvagem é mostrada com o peptídeo EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71) em azul. Sequenciamento dos /oci de Melan À confirmou a interrupção do gene devido a um códon STOP inicial (vermelho), em ambos os alelos, que estava a jusante da sequência de EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71). (B) Coloração intracelular para Melan À com um anticorpo anti-Melan A não conjugado e anticorpo secundário conjugado com PE confirmou a ausência de proteína Melan A. (C&D) Ensaios de ativação (TAPI-O com anticorpos TNF e CD107a) de TIL MM909.24 (C) e CR24 (D) com melanomas autólogos do tipo selvagem e Melan A knock-out (KO). O peptídeo Melan A EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71) foi usado como um controle positivo para CR24. CR24 ainda era capaz de reconhecer melanoma autólogo sem expressão de Melan A e, portanto, apresentação de HLA A2-EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71), sugerindo que pelo menos um outro peptídeo estava sendo reconhecido por CR24, e muito provavelmente aqueles derivados de BST2 e/ou IMP2.

[00067] A Figura 8 mostra células T com reatividade cruzada para peptídeos Melan A (EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71)), BST2 (LLLGIGILVL (SEQ ID NO: 72)) e IMP2 (NLSALGIFST (SEQ ID NO: 73)) que podem ser geradas de doador(es) saudável(eis). (A) Células T CD8 de dois doadores HLA A2+ (são mostrados dados representativos de um doador) foram iniciadas como culturas separadas com peptídeo Melan A, BST2 ou IMP2 (1). Duas semanas após a iniciação, cada cultura foi corada com controle (ALWGPDPAAA (SEQ ID NO: 86) de pré-pró- insulina 15-24), tetrâmeros Melan A, BST2 e IMP2 (2). A porcentagem de coloração de células é mostrada para cada amostra. (B) Cada uma das linhagens de células T iniciadas foi usada no ensaio ELISpot de IFNy durante a noite com as linhagens de células cancerosas: MDA- MB-231 (mama), MM909.24 (melanoma) e Saos-2 (osso). Células T também foram incubadas sozinhas. O número de células formadoras de manchas (SFCs) por 50.000 células é mostrado.

[00068] A Figura 9 mostra que o peptídeo superagonista para células T multifacetadas origina mais células T específicas de peptídeos de câncer do que os peptídeos do tipo selvagem. Superagonistas candidatos foram projetados usando dados de CPL para CR24 (Figura 5) e um algoritmo de predição (http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user cases.php), que identifica os peptídeos com maior probabilidade de atuar como um superagonista, com base nas preferências de aminoácidos reveladas pelos dados da CPL (2: https://www.ncbi.njm.nih.gov/pubmed/22952231). Os peptídeos são sequências diferentes do peptídeo do tipo selvagem e denominados ligantes peptídicos alterados. Os dez principais peptídeos são mostrados em (A) e compartilham uma glicina na posição 6 (ligantes de peptídeos alterados (APL), 1, 3, 4, 6, 7, 8 e 10) ou glicina e isoleucina nas posições 6 e 7, respectivamente (peptídeos APL 2, 5 e 9), com peptídeos do tipo selvagem EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71) (Melan A), LLLGIGILVL (SEQ ID NO: 72) (BST2) e NLSALGIFST (SEQ ID NO: 73) (IMP2) (mostrados em negrito). (B) Para testar os APLs quanto às propriedades superagonistas, cada um dos peptídeos WT e APL foi usado para iniciar células T CD8 + de dadores saudáveis de HLA A2+. A magnitude da resposta a cada um dos peptídeos foi avaliada pela coloração das células T com tetrâmeros para HLA A2-EAAGIGILTV (Melan A) (SEQ ID NO: 71), -LLLGIGILVL (SEQ ID NO: 72) (BST2) ou - NLSALGIFST (SEQ ID NO: 73) (IMP2). No geral, APL 5 (MTSAIGILPV) (SEQ ID NO: 80) parecia ser o superagonista mais eficaz na iniciação de células T de Melan A, BST2 e IMP2 em todos os três doadores testados, com APL 2 (ITSAIGILPV) (SEQ ID NO : 77) também exibindo efeito em cada doador.

[00069] A Figura 10 mostra que o peptídeo superagonista número 5 (MTSAIGILPV) (SEQ ID NO: 80) inicializou mais células T CD8 de pacientes com melanoma metastático capazes de reconhecer o peptídeo de Melan A WT EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71). Devido ao número limitado de PBMCs disponíveis dos pacientes 37 e 12, apenas o peptídeo Melan A foi usado para comparação com o peptídeo número

5. O paciente 37 faleceu, não tendo respondido à terapia convencional ou TIL. O paciente 12 estava em terapia. (A) Dados de coloração do tetrâmero HLA A2-EAAGIGILTV (WT Melan A) (SEQ ID NO: 71) após a iniciação de células T CD8+ com os peptídeos EAAGIGILTV (WT) (SEQ ID NO: 71) e MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80) (número 5). O tetrâmero irrelevante HLA A2-ALWGPDPAAA (pré-pró-insulina) (SEQ ID NO: 86) usado como um controle irrelevante. (B) Ensaio de citotoxicidade de liberação de cromo realizado para as linhagens de células T do paciente 37 usando melanoma autólogo. A razão de linhagem de células T para células de melanoma apresentada baseia-se no número total de células T. Estavam disponíveis células insuficientes do paciente 12 para realizar o ensaio de morte. (C) Ensaio de citotoxicidade como em B, mas com número de células ajustado de acordo com a positividade do tetrâmero EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71) mostrado em (A), para fornecer 2 células de tetrâmero* EAAGIGILTV+ por 3 células de melanoma, para as linhagens de células T iniciadas tanto com EAAGIGILTV quanto com MTSAIGILPV. Os valores P são apresentados para um teste t unilateral não emparelhado.

[00070] A Figura 11 mostra dados preliminares resumidos de outras células T potencialmente multifacetadas. Clones de células T (VB6G4.24, CR1 e VB10) também cultivados a partir do paciente TIL MM909.24 reconhecem o peptídeo Melan A (EAAGIGILTV) (SEQ ID NO: 71), mas não os peptídeos BST2 (LLLGIGILVL) (SEQ ID NO: 72) ou IMP2 (NLSALGIFST) (SEQ ID NO: 73) (nem como peptídeo exógeno, nem de proteína transduzida expressa por MOLT3s). A sequência de CDR3 da cadeia beta de TOR de VB6G4.24 apareceu em dados de clonotipagem para todas as dez linhagens de células cancerosas na Figura 2, sugerindo que esse clone responde a várias linhagens de células cancerosas, mas não por reconhecimento dos peptídeos IMP2 ou BST?2.

[00071] A Figura 12 mostra a reatividade cruzada do peptídeo de outras células T multifacetadas. Os clones GD1 e GD2 reconhecem peptídeos diferentes do clone CR24. (A) Os clones GD1 e GD? restritos a HLA A2 cultivados de diferentes doadores expressam diferentes receptores de células T, mas reconhecem os mesmos peptídeos da telomerase transcriptase reversa humana (hTERT) e MAGE C2, como mostrado. Apenas os resíduos de aminoácidos vermelhos são comuns a cada um dos peptídeos. Ensaio de ativação durante a noite com cada um dos clones usando concentrações decrescentes de cada um dos peptídeos. Os sobrenadantes foram colhidos e usados para ELISA de MIP-1E. (B) Rastreio preliminar de GD1 para reconhecimento de linhagens de células cancerígenas com diferentes origens de tecidos. Ensaio de ativação durante a noite e ELISA de MIP-1B. (C) Ensaio de citotoxicidade de liberação de cromo com linhagens celulares identificadas em (B) como sendo bons alvos de GD1. Percentagem de lise específica avaliada após 4 h e incubação durante a noite.

[00072] A Figura 13 mostra células T específicas do câncer multifacetadas e os receptores de células T diferem das células T anticâncer normais. (A) Convencionalmente, as células T anticâncer reconhecem as células cancerosas quando o TCR liga-se a um peptídeo derivado de antígenos cancerígenos, como mostrado em A. Essas células T não respondem a outros peptídeos derivados de câncer. (B) Excepcionalmente, as células T anticâncer multifacetadas carregam TCRs que reconhecem vários peptídeos cancerígenos diferentes. É muito mais difícil para as células cancerosas e um tumor em desenvolvimento — escapar — das células T multifacetadas. Consequentemente, o uso de TCRs multifacetados é desejável em abordagens de imunoterapia contra o câncer.

[00073] A Figura 14 mostra o peptídeo superagonista MTSAIGILPV iniciado em uma proporção maior de células T específicas de câncer, levando ao aumento de morte do câncer autólogo. (A) Células T CD8 de um paciente com carcinoma de células renais (RCC) e leucemia linfocítica crônica (LLC) foram deixadas sem imunização ou iniciadas com o peptídeo MTSAIGILPV durante 28 dias. Um ensaio TAPI-O (paciente RCC) ou coloração com tetrâmero (paciente CLL) demonstrou a presença de células T específicas de MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80). Os CDB8s iniciados com MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80) mataram mais células cancerosas autólogas do que as células T não ativadas. (B) Células T CD8 de um paciente com leucemia mieloide aguda (LMA) e dois pacientes com CLL foram deixadas sem imunização ou iniciadas com peptídeo IMP-2 do tipo selvagem (NLSALGIFST) (SEQ ID NO: 73) ou MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80) durante 28 dias. Análise realizada com o tetrâmero IMP-2 revelou que as condições não ativadas e iniciadas com IMP-2 tinham proporções semelhantes de células T específicas de IMP-2, enquanto MTSAIGILPV rompeu a tolerância e induziu uma proporção maior de células IMP-2. Células T do paciente CLL 3 foram usadas em um ensaio de morte e células T iniciadas com MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80) mataram mais células CLL do que os CDB8s iniciados com IMP-2.

[00074] A Figura 15 mostra um esquema de como as células T multifacetadas reconhecem uma pluralidade de diferentes peptídeos derivados dos diferentes antígenos específicos do câncer na superfície da mesma célula cancerosa.

[00075] A Figura 16 mostra que células T multifacetadas reconhecem peptídeos aditivamente e em baixa concentração. O clone de células T multiprongado CR24 reconhece peptídeos de BST2 (LLLGIGILVL) (SEQ ID NO: 72), Melan A (EAAGIGILTV) (SEQ ID NO:

71) e IMP2 (NLSALGIFST) (SEQ ID NO: 73). CR24 respondeu a todos os três peptídeos individuais em 10-6 M, mas as respostas caíram quando os peptídeos estavam em 10-8 M. No entanto, CR24 exibiu boa ativação quando cada peptídeo estava presente em 10-8 M em uma mistura de peptídeos. Isso demonstra como células T multifacetadas podem ter como alvo de forma sensível células cancerosas, mediante reconhecimento de vários peptídeos de diferentes proteínas expressos pela mesma célula. Descrição detalhada Métodos e Materiais Reagentes de cultura de células gerais e linhagens de células

[00076] RMPI-1640 com 2 mM de L-glutamina, 100 U/rml de penicilina e 100 upugml de estreptomicina (denominad RO) foi suplementado com 5% (R5) ou 10% (R10) de soro fetal de bezerro. O meio de células T foi RIO com tampão HEPES 10 mM adicionado, aminoácidos não essenciais 0,5X, piruvato de sódio 1 mM, 20-200 Ul/rmL de IL-2 (Aldesleucina, Proleucina, Prometheus, San Diego, CA, EUA) e 25 ng/mL de IL-15 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, EUA). Meio D10- F12 foi preparado do mesmo modo que para R10 usando DMEM-F12. Salvo indicação em contrário, os reagentes de cultura de tecidos foram da Life Technologies (Carlsband, CA, EUA). Linhagens de células C1R, T2 e IM9 foram cultivadas como células em suspensão em R10. Linhagens de células de melanoma maligno Mel-526, Mel-624, FM-2, FM-56, SK-MEL-37 e A-375 foram cultivadas como células aderentes em R10. Melanoma MM909.24 e carcinoma de células renais ROC17 foram obtidos de pacientes tratados no CCIT e cultivados como células em suspensão em R10 e D10-F12, respectivamente. Outras linhagens de células cancerosas foram mantidas conforme descrito pela ATCC; adenocarcinoma da mama MDA-MB-231 (ATCCG6 HTB-26'"Y“) e MCF-7 (ATCCO FITB-227Y); adenocarcinoma de próstata LNCAP (ATCCO

CRL-17407Y); carcinomas colorretais COLO 205 (ATCCO CCL-2227TY) e HCT116 (ATCCO CCL-2477TY); carcinoma pulmonar H69 (ATCCO HTB-1197Y); carcinoma hepatocelular do fígado FlepG2 (ATCCG FIB- 80657”); carcinoma cervical MS751 (ATCCEO FITB-34""); leucemia linfoblástica aguda MOLT3 (ATCCO CRL-15527Y); leucemia mieloide crônica K562 (ATCC&O CRL-33447"); mieloma/plasmacitoma U266 (ATCCO TIB-1967Y); osteossarcomas U-2 OS (ATCCG& HTB-96"“); Saos-2 (ATCCO HTB-85'"") e TK143 (ATCCO CRL-8303TY); célula renal! embrionária HEK293T (ATCCO CRL-1573""); leucemia monocítica aguda TH P-1 (ATCCG TIB-2027Y); e carcinoma renal A-498 (ATCCO HTB-447Y).

Linfócitos de infiltração em tumor de melanoma reconhecem vários tipos de células cancerosas

[00077] O paciente MM909.24 com melanoma metastático estágio IV foi submetido a uma terapia de infiltração tumoral rápida no Centro de Imunoterapia do Câncer (CCIT), Hospital Flerlev, Copenhague [1]. Até o momento, esse paciente apresentou remissão duradoura. O ensaio de citotoxicidade de liberação de cromo foi usado para avaliar reatividade em relação às linhagens de células cancerígenas: melanoma autólogo (MM909.24), MDA-MB-231, MCF-7, LnCAP e RCC17. Linhagens celulares (1 x106 células) foram marcadas por 1 h com 30 uCi de cromato de sódio (51Cr) (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA), lixiviadas por 1 h e depois cultivadas com TIlLs durante a noite. Foi usada uma proporção de 10:1 de TIL para célula-alvo (2.000 células por poço). Após incubação durante a noite, os sobrenadantes foram colhidos, misturados com cintilante e lidos usando um contador microbeta e a lise específica calculada [2]. Outras linhagens de células cancerosas foram testadas usando um ensaio de inibidor de processamento de TNF-O (TAPI-O) [3]. TlLs foram colhidos de cultura lavada com RO e colocadas em repouso durante a noite em meio R5.

No dia do ensaio de ativação, células foram colhidas, em seguida contadas e 100.000 incubadas com TAPI-O 30 mM (Sigma-Aldrich) anti- TNF-PE-Vio770'Y (clone cA2, Miltenyi Biotech) e anti-CD107a-PE (clone H4A3, BD Biosciences) em poços de uma placa de 96 poços em U. Linhagens de células cancerosas foram adicionadas para fornecer uma razão 1:2 de TIL para células-alvo. Além das linhagens de células cancerosas acima, também foram utilizadas as seguintes: COLO 205, H69, HepG2, MS751 e Saos-2. As células foram incubadas durante 4-5 h a 37ºC, em seguida, coradas a temperatura ambiente por 5 min com 2 ul de corante de células mortas fixáveis LIVE/DEAD ViVid (Life Technologies) que tinha sido diluído 1:40 usando PBS. Anticorpos para detectar marcadores de superfície foram adicionados diretamente a cada amostra sem lavagem; anti-CD8-APC (clone BW135/80, Miltenyi Biotech) e clorofila anti-CD3-peridinina (PerCP) (clone BW264/56, Miltenyi Biotech). Dados foram adquiridos em um BD FACS Canto || (BD Biosciences) e analisados com o software FlowJo (TreeStar, Inc., Ashland, OR, EUA). TlLls ativados (CD107a+ e/ou TNF+) foram classificados em um BD FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e usados para sequenciamento da nova geração das cadeias do receptor de células T (TOR) como anteriormente descrito [4).

A estratégia para identificar peptídeos reconhecidos por clones de CD8s órfãos

[00078] Clones de células T de especificidade peptídica desconhecida (denominados clones órfãos) foram gerados cultivando 0,5 célula/poço em placas de 96 poços em U em meio de células T com

50.000 células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) alogênicas irradiadas (3.000-3.100 cGy) de três doadores e 1-2 ug/mL de fito-hnemaglutinina (PHA). PBMCs foram separados do sangue por centrifugação em gradiente de densidade padrão. Se necessário, glóbulos vermelhos foram lisados com solução de cloreto de amônio. O sangue foi obtido como 'casacos bufantes' do Welsh Blood Service (Pontyclun, País de Gales, Reino Unido). Todo tecido humano foi obtido e manuseado de acordo com as diretrizes da Cardiff University para cumprir o UK Human Tissue Act 2004. Clones de células T foram rastreados contra melanoma autólogo (MM909.24) e, em alguns casos, linhagens de células cancerosas de diferentes origens de tecido. Clones de interesse cresceram em grande número em frascos T25 usando o método PBMC e PHA como acima. Biblioteca combinatória de peptídeos (CPL) e rastreamento do banco de dados de antígenos de câncer foram realizados para encontrar peptídeos reconhecidos por clones órfãos. Bibliotecas de peptídeos combinatórios foram sintetizadas e utilizadas conforme descrito anteriormente [5,6]. Resumidamente, armazenamento de longo prazo foi realizado a -80ºC como estoques de DMSO 20 mM com diluições de trabalho de 1 mM feitas em placas de poços redondos com 2 mL de profundidade seláveis (mat de vedação de silicone, AxyGenO AxyMatrm, Corning, Nova lorque, EUA) (AxyGenG, Corning) com RO (do mesmo modo que para R10, mas sem soro), que foram armazenados a 4ºC, depois agitados em vórtice (MixMateGO, Eppendorf&, Hamburgo, Alemanha) a 1.300 rpm por 1 min, depois centrifugados (400 g, 5 minutos) antes de usar. Cada sub- biblioteca foi usada sob uma concentração de 100 pM com respeito à concentração total de peptídeo. Os dados de CPL foram executados por meio de um banco de dados, que contém as sequências de aminoácidos de proteínas expressas por cânceres (manuscrito em preparação). O banco de dados de antígenos de câncer estará disponível online como parte da ferramenta de internet PI CPL (biblioteca de peptídeos combinatórios de identificação de peptídeos) hospedada pelo Centro de Biologia de Sistemas da Warwick University (http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user cases.php).

Peptídeos candidatos do banco de dados foram classificados automaticamente com base na probabilidade de serem reconhecidos por um clone, com os 20 melhores sendo testados em ensaios de titulação de peptídeos. CR24 reconhece vários tipos de células cancerosas

[00079] “Melanomas HLA A2+, MM909.24 (autólogo), Mel-526, Mel- 624 e não melanomas HLA A2+, CIR-HLA A2, MDA-MB-231, Saos-?, U20S, A498, TK143, HEK293T, COLO 205 , HOCT1 16, HeLa, HepG2 e THP1 foram usados como células-alvo em um ensaio TAPI-O, que é descrito acima. Melanomas HLA A2neg FM-2 e FM-56 e C1 Rs do tipo selvagem (HLA A2neg) foram usados como controles. Biblioteca de peptídeos combinatórios (CPL) e triagem de banco de dados de antígenos de câncer do clone CR24

[00080] — CR24 foi colocado em repouso durante a noite em RO, em seguida, 30.000 usados por poço da tela decâmero CPL (detalhes acima). A preferência de comprimento de peptídeo de CR24 foi previamente — estabelecida usando ensaios de varredura de dimensionamento [7] (dados não mostrados). Células T2 (60.000 por poço) foram usadas como células que apresentam antígeno. O ensaio foi realizado em R5 e os sobrenadantes colhidos para ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) de MIR-16 de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). CR24 reconhece três peptídeos restritos a HLA A2 de diferentes proteínas do câncer

[00081] —CR24foicultivado durante a noite em R5, em seguida 30.000 foram usados por poço de uma placa de 96 poços em U com concentrações decrescentes de peptídeos. Após incubação durante a noite, os sobrenadantes foram usados em ELISA de MIR-16 de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Para análise de tetrâmero, CR24 (20.000-50.000 por amostra) foi corado em tubos de polipropileno de 5 mL adequados para citometria de fluxo. Células foram tratadas em 100 uL de tampão FACS (PBS + FBS 2%) com Dasatinib 50 nM (um inibidor da proteína cinase) durante min a 37ºC e tetrâmero conjugado com ficoeritrina (PE) (0,5 ug) adicionado diretamente à amostra antes de ser movida para gelo por mais 30 min [8]. O tetrâmero foi lavado com 3 mL de tampão FACS (700 g, 5 min), em seguida, marcado com 0,5 ug (10 ug/mL) de anticorpo não conjugado anti-PE de camundongo (clone PEO01, BioLegend, London, Reino Unido) por mais 20 min em gelo [8]. Para testar se CR24 poderia reconhecer o antígeno expresso endogenamente, células MOLT3 foram usadas para expressar várias proteínas. Códon FILA A2 humano de comprimento total otimizado (IMGT/HLA Nº de Acesso: HLAOO0005), MLANA (Melan A) (UniProtKB Q16655), BST2 (UniProtKB Q10589), IGF2BP2 (IMP2) (UniProtKB Q9Y6M1), COL6A?2 (subunidade a2 de colágeno tipo VI) (UniProtKB P12110) e vírus Zika (Rio-U1) genes ancC (GenBank KU926309.2) foram sintetizados (Genewiz, South Plainfield, NJ, EUA) e clonados no vetor de transferência lentiviral de 3º geração pELNS (gentilmente cedido pelo Dr. James Riley, Universidade da Pensilvânia, PA, EUA). O vetor pELNS contém um gene marcador CD2 (rCD2) de rato separado do gene de interesse por uma sequência 2A autoclivável. A produção de partículas lentivirais, transfecção com cloreto de cálcio e purificação de células baseada em rCD2 foram realizadas conforme descrito anteriormente [9].

O clone CR24 é capaz de reconhecer melanoma autólogo sem expressão de Melan A

[00082] Para demonstrar que CR24 pode ter como alvo melanoma autólogo por vários antígenos, RNAs-guia para ablação da expressão de Melan A usando CRISPR/Cas9 foram projetados usando a ferramenta de internet cripsr.mit.edu, aplicados e o gene Melan A sequenciado para confirmar interrupção (dados não mostrados). Coloração intracelular para Melan A foi realizada usando reagentes

Cytofix/Cytoperm"" de acordo com instruções do fabricante (BD Biosciences). Um anticorpo primário não conjugado de coelho anti- Melan A (clone EP1422Y) (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi usado com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado com PE. Melanomas do tipo selvagem e Melan A KO MM909.24 foram usados em ensaios TAPI-O, como descrito acima, com ambos os TIlLs e CR24. Células T que reconhecem os mesmos três peptídeos que CR24 estão presentes em doadores HLA A2+ saudáveis

[00083] Para gerar linhagens de peptídeos de células T, células T CD8 foram purificadas a partir de PBMCs de doadores HLA A2+ usando microesferas de CD8 de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha). Células CD8 purificadas (3 x108) foram coincubadas com células CD8neg. autólogas (6-8 x106) em placas de 24 poços em 2 mL de meio de células T, mas sem IL-15. Foram usados 25 uM de cada peptídeo. As culturas tinham 50% do meio trocado três vezes por semana. Coloração de tetrâmero foi realizada como acima, usando 500.000 células por tubo. Cada linhagem de células T foi usada em um ensaio de ponto imunossorvente ligado a enzima IFNy (ELISpot) com linhagens de células MDA-MB-231, melanoma MM909.24 e Saos-2. 50.000 células T e 15.000 células cancerosas foram usadas por poço. Incubação foi realizada durante 48 horas e o ensaio desenvolvido de acordo com as instruções do fabricante (Mabtech, Nacka Strand, Suécia). Peptídeos superagonistas iniciam células T multifacetadas para um melhor reconhecimento de células cancerígenas

[00084] Ensaio de CPL de CR24 foi realizado como descrito acima. Agonistas de peptídeos candidatos foram projetados usando a CPL de CR24 e um algoritmo online (http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user cases.php). Iniciação de células T CD8 de doadores saudáveis, coloração de tetrâmero e ensaios de citotoxicidade de liberação de cromo foram realizados como descrito acima. Outros clones de Melan A não reconhecem os peptídeos BST2 e IMP?2 vistos por CR24

[00085] “Ensaios TAPI-O e de ativação (ELISA) foram realizados para VB6G4.24, CR1 e VB10, conforme descrito acima para CR24. Os dados foram resumidos em forma de tabelas. Reconhecimento de clones de peptídeos a partir de antígenos cancerígenos hTERT e MAGE C2

[00086] Clones GD1 e GD2 foram cultivados a partir do sangue periférico de diferentes dadores saudáveis de HLA A2+. Os clones foram usados em ensaios de ativação durante a noite com concentrações decrescentes dos respectivos peptídeos, e os sobrenadantes usados para ELISA de MIR-18, como descrito acima. Uma ativação noturna foi realizada com GD1 e células-alvo: K562, K562 HLA A2, CIR, CIR HLA A2, HEK 293T, MCF-7, COLO 205, U266, HOCT1 16, Mel-526, Mel-624, SK-MEL-37, A375, IM9 e LnNnCAP. Os sobrenadantes foram colhidos e usados para ELISA de MIR-1B. Um ensaio de citotoxicidade de liberação de cromo foi realizado, como acima, com as linhagens celulares MCF-7, U266 e Mel-624. Foram usados tempos de incubação de 4 horas e durante a noite, com razões variáveis de células T para células-alvo. Resultados

1. Linfócitos de infiltração em tumor (TILs) derivados de um paciente com melanoma metastático que foi submetido a imunoterapia com sucesso são capazes de matar e reconhecer melanoma autólogo e linhagens de células de câncer HLA A2+ originadas de uma variedade de cânceres: mama, cólon, pulmão, fígado, próstata, colo do útero, osso e rim (Figura 1).

2. Clonotipagem do receptor de células T de TILs reativos ao câncer revelou que as mesmas células T reconheceram várias linhagens de células cancerosas HLA A2+ (Figura 2). 50% das células T (TCRs) reconheceram mais de quatro linhagens de células de câncer e 8,6% (5 TCRs) reconheceram todas as 10 linhagens celulares testadas. Outros experimentos com o objetivo de compreender o reconhecimento da linhagem de células de câncer pan resultaram na identificação de que uma única célula T pode reconhecer vários peptídeos originários de diferentes proteínas de câncer.

3. A fim de mapear as especificidades de peptídeo das células T dos TIlLs, as células T foram primeiro clonadas e, em seguida, rastreadas quanto à reatividade em relação a várias linhagens de células cancerosas. O clone CR24 exibiu reatividade para melanoma autólogo e linhagens de células cancerosas de mama, osso, rim, sangue, cólon, colo do útero e fígado (Figura 4). Essa reatividade foi mediada por HLA A2, uma vez que melanomas HLA A2neg e células CIR do tipo selvagem (HLA A2neg) não foram reconhecidas.

4. Biblioteca de peptídeos combinatórios e triagem de banco de dados de antígenos de câncer (conforme descrito na Figura 3) de CR24 (Figura 5) revelou vários peptídeos que foram previstos serem vistos por CR24 (dados não mostrados), com três deles sendo reconhecidos quando testados como peptídeo exógeno (Figura 6). CR24 também corado com tetrâmeros HLA A2 contendo os três peptídeos (Figura 6). Os peptídeos EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 71) de Melan A (resíduos 26-35), LLLGIGILVL (SEQ ID NO: 72) de BST2 (resíduos 22-31) e NLSALGIFST (SEQ ID NO: 73) de IMP2 (resíduos 367-376). Esses dados demonstram que CR24 apresenta reação cruzada para peptídeos distintos derivados de diferentes proteínas de câncer.

5. Os peptídeos reconhecidos por CR24 são processados e apresentados a partir de proteínas expressas endogenamente, uma vez que CR24 foi capaz de reconhecer células que apresentam antígenos

(MOLT3) feitas para expressar de forma estável Melan A, BST2 ou IMP2 (Figura 6).

6. Seria extremamente difícil para células cancerosas escaparem de células T que as almejavam por meio de mais de um antígeno de câncer diferente, pois o escape exigiria mutação simultânea de todos os alvos que diminuíram ou eliminaram a apresentação de todos os peptídeos cognatos. Para demonstrar isso, direcionou-se melanoma autólogo (MM909.24) para ablação do gene Melan A, que foi confirmado por coloração de anticorpos como não tendo expressão da proteína Melan A (nocaute de Melan A (KO)) (Figura 7). Tanto o TIL do paciente MMA909.24 quanto o clone CR24 reconheceram os melanomas de Melan A nocaute (Figura 7). Para CR24, a reatividade contra tumor autólogo do tipo selvagem foi de 71% e para Melan A KO de 55%. É altamente provável que CR24 estava reconhecendo o melanoma Melan A KO por meio dos peptídeos BST2 e/ou IMP? e, portanto, ser capaz de mediar a destruição do melanoma.

7. Células T CD8 capazes de reconhecer os peptídeos Melan A, BST2 e IMP2 vistos por CR24 podem ser geradas a partir do sangue periférico de doadores HLA A2+ saudáveis (Figura 8).

8. Superagonistas projetados para células T multifacetadas iniciaram uma proporção maior de células T CD8 capazes de reconhecer WT Melan A (EAAGIGILTV) (SEQ ID NO: 71), BST2 (LLLGIGILVL) (SEQ ID NO: 72) e peptídeos IMP2 (NLSALGIFST) (SEQ ID NO: 73), em comparação com iniciação paralela com os peptídeos WT. O superagonista MTSAIGVLVP (SEQ ID NO; 80) (peptídeo 5) pareceu ser o mais eficaz dos superagonistas candidatos na iniciação (Figura 9B), induzindo células T reativas com Melan A, BST2 e IMP2 em todos os doadores testados (n = 3). Além disso, MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80) e ITSAIGILPV (SEQ ID NO: 77) foram superiores na iniciação de células T Melan A (EAAGIGILTV) de pacientes com melanoma metastático, em comparação com o peptídeco WT EAAGIGILTV (Figura 10A) e MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80), também em pacientes com carcinoma de células renais (RCC) e leucemia linfocítica crônica (CLL) (Figura 14A) e pacientes com leucemia mieloide aguda (AML) (Figura 14B). É importante notar que as células T iniciadas com o peptídeo superagonista MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80) exibiram lise de células de melanoma autólogas superior à das células T iniciadas com o peptídeo WT Melan A (Figuras 10B e 10 C).

9. Clones (GD1 e GD2) cultivados a partir do sangue periférico de dois doadores HLA A2+ saudáveis apresentam reação cruzada com peptídeos diferentes daqueles reconhecidos por CR24. Esses peptídeos são derivados de proteínas diferentes daquelas reconhecidas pelo clone de células T CR24; RLVDDFLLV (SEQ ID NO: 74) da telomerase transcriptase reversa humana (hTERT) (resíduos 855-873) e ALKDVEERV (SEQ ID NO: 75) do antígeno C2 associado a melanoma (MAGE C2) (resíduos 336-344). GD1 matou linhagens de células de câncer de mama, sangue e melanoma (Figura 9). Conclusão

[00087] A visão de consenso atual é que células T específicas de câncer reconhecem células cancerosas por meio de um único antígeno peptídico apresentado como um peptídeo na superfície celular em associação com HLA (Figura 10A). Foi identificado que algumas células T raras são capazes de reconhecer células cancerosas por meio de epítopos de peptídeos múltiplos que diferem na sequência por dois ou mais aminoácidos e são derivados de diferentes antígenos de câncer (Figura 10B). É provável que a fuga do câncer desse tipo de células T multifacetadas seja extremamente difícil.

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[6] Szomolay B, Liu J, Brown PE, Miles JJ, Clement M, Llewellyn-Lacey S, et al. Identification of human viral protein-derived ligands recognized by individual MHCI-restricted T-cell receptors. Immunol Cell Biol 2016; 94:573-82. doi: 10.1038/icb.2016.12.

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[8] Tungatt K, Bianchi V, Crowther MD, Powell WE, Schauenburg AJ, Trimby A, et al. Antibody stabilization of peptide-MHC multimers reveals functional T cells bearing extremely low-affinity TCRs. J Immunol 2015;194:463-74.

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Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo anticâncer, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que compreende ou consiste em: MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80), ITSAIGILPV (SEQ ID NO: 77), ITSAIGVLPV (SEQ ID NO: 76), MTSAIGVLPV (SEQ ID NO: 78), QTSAIGVLPV (SEQ ID NO: 79), LTSAIGVLPV (SEQ ID NO: 81), ITSGIGVLPV (SEQ ID NO: 82), ITSAIGVLPI (SEQ ID NO: 83), QTSAIGILPV (SEQ ID NO: 84), ITSAIGVLFV (SEQ ID NO: 85).

2. Peptídeo anticâncer, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é MTSAIGILPV (SEQ ID NO: 80) ou ITSAIGILPV (SEQ ID NO: 77).

3. Peptídeo anticâncer, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 80% ou 90% de identidade com o peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2.

4. Peptídeo anticâncer, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é apresentado por uma molécula de antígeno leucocitário humano (HLA) classe | e é selecionado do grupo que compreende: HLA A, HLA A2 ou HLA 24 ou HLA A1 ou HLA A3.

5. Peptídeo anticâncer, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula referida é HLA A2.

6. Peptídeo anticâncer, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, quando administrado a um indivíduo, inicia a produção de células T anticâncer que atuam como células T efetoras e/ou células T que expressam TOR que reconhece uma pluralidade de antígenos de câncer quando os antígenos são apresentados pela mesma célula cancerosa em uma superfície celular por molécula de antígeno leucocitário humano (HLA) classe |, e em que os antígenos são distintos uns dos outros e são apresentados por células de diferentes tipos de câncer.

7. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo anticâncer, como definido em qualquer uma das reivindicações 1ab.

8. Composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespeciífico, caracterizados pelo fato de que compreendem o peptídeo anticâncer, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou vacina, como definida na reivindicação 7.

9. Combinação terapêutica para o tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende: o peptídeo anticâncer ou vacina ou vetor ou composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico, ou vacina, de como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em combinação com outro agente terapêutico contra câncer.

10. Peptídeo anticâncer, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou vacina, de acordo com a reivindicação 7, ou composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico, de acordo com a reivindicação 8, ou combinação terapêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizados pelo fato de que se destinam a uso no tratamento câncer.

11. Uso do peptídeo anticâncer, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou da vacina, como definida na reivindicação 7, ou da composição farmacêutica ou do agente imunogênico ou do biespecífico, como definidos na reivindicação 8, ou da combinação terapêutica, como definida na reivindicação 9, caracterizados pelo fato de que se destinam à produção de um medicamento para o tratamento de câncer.

12. Método de tratamento de um indivíduo com ou suspeito de ter câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do peptídeo anticâncer, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou da vacina, como definida na reivindicação 7, ou da composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico, como definidos na reivindicação 8, ou da combinação terapêutica, como definida na reivindicação 9, ao referido indivíduo.

13. Peptídeo anticâncer, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 9, vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 e 9, composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 e 9, combinação terapêutica de acordo com a reivindicação 9, ou uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, ou método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizados pelo fato de que o(s) câncer(es) é(são) selecionado(s) do grupo que compreende ou consiste em: câncer de nasofaringe, câncer sinovial, câncer hepatocelular, câncer renal, câncer de tecidos conjuntivos, melanoma, câncer de pulmão, câncer de intestino, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer de cérebro, câncer de garganta, câncer oral, câncer de fígado, câncer ósseo, câncer de pâncreas, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de células T, sangue, amígdala, baço, neuroma, doença de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, câncer suprarrenal, câncer anal, câncer do ducto biliar, câncer de bexiga, câncer de ureter, glioma, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor da medula espinhal, câncer ósseo, osteocondroma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, câncer de local primário desconhecido, carcinoide, carcinoide do trato gastrointestinal, fibrossarcoma, câncer de mama, câncer muscular, doença de Paget, câncer cervical, câncer retal, câncer de esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer de colangioma, câncer de cabeça, câncer de olho, câncer de nasofaringe, câncer de pescoço, câncer de rim, tumor de Wilms, câncer de fígado, sarcoma de Kaposi, câncer de próstata, câncer testicular, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer de pele, mesotelioma, mieloma, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer endócrino, glucagonoma, câncer de paratireoide, câncer de pênis, câncer de hipófise, sarcoma de tecidos moles, retinoblastoma, câncer de intestino delgado, câncer de estômago, câncer de timo, câncer de tireoide, câncer trofoblástico, mola hidatiforme, câncer uterino, câncer endometrial, câncer de vagina, câncer de vulva, neuroma acústico, micose fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, câncer de gengiva, câncer de coração, câncer de lábio, câncer de meninges, câncer de boca, câncer de nervo, câncer de palato, câncer de glândula parótida, câncer de peritônio, câncer de faringe, câncer de pleura, câncer de glândula salivar, câncer de língua e câncer de amígdala.

14. Peptídeo anticâncer, vacina, composição farmacêutica ou agente imunogênico ou biespecífico, ou método ou uso ou combinação terapêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizados pelo fato de que o câncer é câncer de pele ou melanoma ou carcinoma de células renais ou leucemia.