KR20210023822A - 암-특이적 t-세포 수용체 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 신규한 항암 펩티드; 이를 코딩하는 벡터; 상기 항암 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체 또는 백신; 암을 치료하기 위한 상기 항암 펩티드, 벡터, 약제학적 조성물, 면역원성 제제, 이중특이적 항체 또는 백신의 용도; 상기 항암 펩티드, 벡터, 약제학적 조성물, 면역원성 제제, 이중특이적 항체 또는 백신을 사용하여 암을 치료하는 방법; 및 상기 항암 펩티드, 벡터, 약제학적 조성물, 면역원성 제제, 이중특이적 항체 또는 백신을 포함하는 암 치료용 병용 치료제에 관한 것이다.
Description
본 개시내용은 신규한 항암 펩티드; 이를 코딩하는 벡터; 상기 항암 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체 또는 백신; 암을 치료하기 위한 상기 항암 펩티드, 벡터, 약제학적 조성물, 면역원성 제제, 이중특이적 항체 또는 백신의 용도; 상기 항암 펩티드, 벡터, 약제학적 조성물, 면역원성 제제, 이중특이적 항체 또는 백신을 사용하여 암을 치료하는 방법; 및 상기 항암 펩티드, 벡터, 약제학적 조성물, 면역원성 제제, 이중특이적 항체 또는 백신을 포함하는 암 치료용 병용 치료제에 관한 것이다.
본 발명자들은 암의 치료에 효과적인 신규 부류(class)의 T-세포를 발견했다.
T-세포는 동족 T-세포 수용체를 통해 개개 암 펩티드를 인식하는 것으로 생각되어 왔다. 따라서, 단일 TCR은 통상, 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 또는 부류 II 분자와 관련하여 세포 표면에 제시되는 경우, 단일 암 항원 펩티드를 인식하는 것으로 생각되어 왔다.
본원에 제시된 이러한 새로운 연구는, 현저히 및 유의적으로, 일부 T-세포가 동일한 T-세포 수용체(TCR)를 사용하여 상이한 암 항원 펩티드(상이한 서열)을 인식하는 것을 나타내고, 따라서 단일 TCR이 복수의 상이한 암 항원을 인식하는 능력을 갖는 것을 나타낸다. 이는, 상식에 반하는 독특한 발견이고, 다면적 질환인 것으로 생각되고 있는 암의 치료에 매우 유익한 의미를 갖는다.
본 발명자들의 연구는, 이러한 T-세포가, 동일한 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 분자와 관련하여 세포 표면에 제시되는 경우, 상이한 암 항원으로부터 유래하는 복수의 상이한 펩티드를 인식할 수 있음을 나타낸다. 대부분의 경우, 펩티드는 동일한 암 세포의 표면에 존재하지만, 이는 이전에는 설명되어 있지 않다.
따라서, 일부 희귀 T-세포는 이들의 동족 T-세포 수용체를 통해 소정 범위의 개개 암 항원 펩티드를 인식할 수 있는 것 같다. 이러한 신규 유형의 T-세포는, 동일한 T-세포 수용체(TCR)를 사용하여, 복수의 상이한 암 펩티드를 통해 암 세포를 인식한다. 본 발명자들은 이러한 T 세포를 "다면적 T-세포"라 지칭하고, 이들은 이들의 동족 TCR을 사용하여, 하나 이상의 항원을 통해 암 세포를 인식 및 공격하고, 이에 의해 암 세포에 의한 면역 회피의 기회를 광범위하게 회피할 수 있다.
2015년에, 약 9050만명이 암에 걸렸다. 1년에 약 1410만건의 새로운 사례가 발생한다(흑색종 이외의 피부암은 포함하지 않음). 암은 인간 사망의 약 880만건의 사망(15.7%)을 야기한다. 남성에서 가장 흔한 유형의 암은 폐암, 전립선암, 결장직장암 및 위암이다. 여성에서 가장 흔한 유형의 암은 유방암, 결장직장암, 폐암 및 자궁경부암이다. 흑색종 이외의 피부암이 매년의 전체 신규암에 포함된다면, 이는 사례의 대략 40%를 차지할 것이다. 아동에서는 급성 림프모구성 백혈병 및 뇌종양이 아프리카(비-호지킨 림프종이 더 종종 발생한다)를 제외하고 가장 흔하다. 2012년에, 15세 이하의 아동 약 165,000명이 암으로 진단되었다. 암의 위험성은 나이에 따라 현저하게 증가하며 다수의 암은 선진국에서 더 흔하게 발생한다. 보다 많은 사람이 오래 살고 개발도상국에서는 생활양식의 변화가 발생함에 따라 비율이 증가하고 있다. 암의 금융 비용은 2010년 현재 매년 1조1600억 달러(USD)로 추산되었다. 상기 질병을 치료하거나 근절할 보다 양호하고 보다 안전한 방법을 제공할 필요가 발생한다. 이상 조직을 사멸시키는 신체의 자연 방어 시스템을 사용하는 면역요법이 화학적인 중재보다는 더 안전한 것으로 인정되고 있으나, 유효하기 위해서는 상기 면역요법은 질환을 치료할 수 있어야 한다. 더욱이, 임의의 유형의 암 또는 다수의 암에 대해 유효한 면역요법의 발견은, 상기 요법을 다수의 상이한 유형의 암을 앓고 있는 개체에게 투여할 수 있을 뿐만 아니라(즉 상기는 범-집단 적용을 가질 것이다) 하나 이상의 암 유형을 앓고 있는 단일 개체에게도 투여할 수 있기 때문에 대단히 이로울 것이다.
본원에서 동정된 T-세포 및 이들의 수용체는, 그들이 하나 이상의 암 유형에 대해 유효하고 따라서 면역계의 유효성을 회피하는 암으로부터 보호한다는 점에서 전술한 유리한 특성을 갖는다. 추가로, 이 유리한 T 세포 및 이들의 수용체의 생성은 본원에 기재된 신규 항암 펩티드의 사용에 의해 가져올 수 있다.
본 발명의 제1 태양에 따르면, 암 펩티드 항원이 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 분자에 의해 세포 표면에 제시될 때에 복수의 암 펩티드 항원을 인식하는 단리된 항암 T-세포 수용체(TCR) 또는 이의 단편이 제공되고, 여기서 상기 항원은 서로 상이하고 하나 이상의 유형의 암을 대표한다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 복수의 암 항원을 인식하는 항암 TCR 또는 암 특이적 TCR 또는 이의 단편이 제공되고, 여기서 상기 TCR은 하기 서열을 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상보성-결정 영역, 또는 하나 이상의 상기 상보성 결정 영역과 적어도 85% 동일성(identity)을 갖는 상보성-결정 영역을 갖는다:
추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 상보성-결정 영역은, 하나 이상의 상기 상보성 결정 영역과 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 복수의 항원은 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 분자와 관련하여 세포 표면에 제시되고, 보다 바람직하게는 상기 인식은 하기 활성의 임의의 조합을 포함하여 하기 활성 중의 임의의 하나 이상에 의해 발생하거나 발생하는 것으로 보인다:
상기 TCR, 또는 상기 TCR을 발현하는 T 세포는 임의의 하나 이상의 상기 항원을 발현하는 암 세포의 사멸을 유발 또는 야기하는 것; 및/또는
상기 TCR, 또는 상기 TCR을 발현하는 T 세포는, TNF 및 IFN 감마 등의 염증유발성 사이토킨의 생성을 유발하거나 생성하는 것(이는 면역억제 종양 미소환경을 역전시키는데 유용하다); 및/또는
상기 TCR, 또는 상기 TCR을 발현하는 T 세포는 탈과립화를 유발하거나 탈과립화를 겪는 것; 및/또는
상기 TCR, 또는 상기 TCR을 발현하는 T 세포는 CD107a, 베타-케모킨(MIP 1베타), 및 인터페론 감마(IFN감마) 및 종양 괴사 인자(TNF) 등의 사이토킨 중의 임의의 하나 이상을 상향조절하는 것.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 TCR은 하기 서열을 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상보성-결정 영역, 또는 임의의 하나 이상의 상기 상보성-결정 영역과 적어도 85% 동일성을 갖는 상보성-결정 영역을 갖는다:
추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 상보성-결정 영역은 임의의 하나 이상의 상기 상보성-결정 영역과 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 암은, 비인두암(nasopharyngeal cancer), 활막암(synovial cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 신장암(renal cancer), 결합 조직 암(cancer of connective tissues), 흑색종(melanoma), 폐암(lung cancer), 장암(bowel cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 뇌암(brain cancer), 인후암(throat cancer), 구강암(oral cancer), 간암(liver cancer), 골암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 융모암(choriocarcinoma), 위장종(gastrinoma), 갈색세포종(pheochromocytoma), 프롤락티노마(prolactinoma), T-세포 백혈병/림프종(T-cell leukemia/lymphoma), 편도선(tonsil), 비장(spleen), 신경종(neuroma), 폰 히펠-린다우 병(von Hippel-Lindau disease), 졸린저-엘리슨 증후군(Zollinger-Ellison syndrome), 부신암(adrenal cancer), 항문암(anal cancer), 담관암(bile duct cancer), 방광암(bladder cancer), 요관암(ureter cancer), 신경교종(glioma), 희소돌기교종(oligodendroglioma), 신경모세포종(neuroblastoma), 수막종(meningioma), 척수 종양(spinal cord tumour), 골암(bone cancer), 골암(osteochondroma), 골연골종(chondrosarcoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 원발 부위의 불명 암(cancer of unknown primary site), 카르시노이드(carcinoid), 위장관 카르시노이드(carcinoid of gastrointestinal tract), 섬유육종(fibrosarcoma), 유방암(breast cancer), 근육암(muscle cancer), 파제트병(Paget's disease), 자궁경부암(cervical cancer), 난소(ovarian), 혈액(blood), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 식도암(oesophagus cancer), 담낭암(gall bladder cancer), 담관암(cholangioma cancer), 두부암(head cancer), 안암(eye cancer), 비인두암(nasopharynx cancer), 목암(neck cancer), 신장암(kidney cancer), 윌름스 종양(Wilms' tumor), 간암(liver cancer), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 전립선암(prostate cancer), 정소암(testicular cancer), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 피부암(skin cancer), 중피종(mesothelioma), 골수종(myeloma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 난소암(ovarian), 내분비암(endocrine), 글루카곤종(glucagonoma), 부갑상선암(parathyroid cancer), 음경암(penis cancer), 뇌하수체암(pituitary cancer), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 소장암(small intestine cancer), 위암(stomach cancer), 흉선암(thymus cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 영양모세포암(trophoblastic cancer), 포상기태(hydatidiform mole), 자궁암(uterine cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 질암(vagina cancer), 외음부암(vulva cancer), 청신경종(acoustic neuroma), 균상식육종(mycosis fungoides), 인슐린종(insulinoma), 카르시노이드 증후군(carcinoid syndrome), 체세포스타틴종(somatostatinoma), 잇몸암(gum cancer), 심장암(heart cancer), 입술암(lip cancer), 수막암(meninges cancer), 구강암(mouth cancer), 신경암(nerve cancer), 구개암(palate cancer), 이하선암(parotid gland cancer), 복막암(peritoneum cancer), 인두암(pharynx cancer), 흉막암(pleural cancer), 타액선암(salivary gland cancer), 혀암(tongue cancer) 및 편도선암(tonsil cancer)을 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 암은 췌장, 혈액, 난소, 피부, 유방, 자궁경부, 전립선, 골, 폐, 간, 결장 및 신장을 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
서로 구별되는 암 항원에 대한 본원에서의 언급은 상이한 유형의 암을 나타내는 암 항원에 대한 언급이고, 따라서 이들이 파생하는 서열 구조 또는 분자, 통상적으로 단백질의 측면에서 명백하게 상이한 항원에 대한 언급이다.
그럼에도, 항원 서열에서의 이러한 차이에도 불구하고, 본 발명의 TCR은 복수의 이들 별개의 또는 상이한 암 항원을 인식할 수 있다. 당업자가 이해되는 바와 같이, 암 세포가 하나 이상의 상이한 암 항원을 통해 이들을 표적화하는 T-세포로부터 탈출하는 것은 매우 곤란한데, 이는 탈출이 모든 동족 펩티드의 제시를 저하시키거나 제거하는 모든 표적의 동시 돌연변이를 필요로 하기 때문이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 분자는 MHC 부류 I(A, B 또는 C)이다. 보다 구체적으로는, 상기 HLA는 HLA A2 또는 HLA A24 또는 HLA A1 또는 HLA A3이다.
MHC 부류 I은 세포 내로부터의 펩티드를 제시한다. 예를 들면, 암 세포의 문맥에서, HLA 시스템은, 암-발현 단백질의 단편 또는 펩티드를 세포의 표면으로 가져 와서, 세포가 암으로 인식되고 면역계에 의해 파되될 수 있도록 한다. 이러한 펩티드는 프로테아좀에서 분해되는 소화된 단백질로부터 생성된다. 일반적으로, 이러한 특정 펩티드는 길이가 약 7 내지 20, 전형적으로 9 또는 10개 아미노산의 작은 폴리머이다. MHC 부류 I 시스템에 의해 제시된 발암 항원은 암 세포를 파괴하는 킬러 T-세포(CD8 양성- 또는 세포독성 T-세포로도 불리움)을 유인한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 TCR은 알파 베타(αβ) TCR이다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 상기 TCR은 가용성 TCR(sTCR)이고, 따라서 막관통 도메인, 이상적으로는 세포내 도메인을 결여한다.
본 발명의 여전히 또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 TCR은 본원에 기재된 기능성을 갖는 키메라 수용체의 일부이다. 이상적으로는, 상기 TCR은 TCR 불변 도메인 또는 TCR 신호전달 도메인에 융합된다.
대체 실시형태에서, 이의 단량체 일부, 이상적으로는 TCR의 일본쇄 형태 등의 상기 TCR의 단편이 제공된다.
추가의 대체 실시형태에서, 이의 상보성 결정 영역 등의 상기 TCR의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 본 발명의 상기 TCR을, 이상적으로는, 가용성 형태 또는 막 적합성 형태 중의 어느 하나로, 즉 막관통 영역 및 세포내 영역을 갖는 TCR을 발현하는 T 세포가 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 본 발명의 상기 TCR을, 이상적으로는, 막관통 도메인 및 이상적으로는 또한 세포내 도메인을 결여하는 가용성 형태, 또는 막 적합성 형태 중의 어느 하나로, 즉 막관통 영역 및 이상적으로는 또한 세포내 도메인을 갖는 TCR을 발현하는 T-세포 클론이 제공된다.
바람직하게는, 상기 클론은 본원에 기재된 T-세포 클론 CR24, GD1, GD2, VB6G4.24, CR1 또는 VB10이다.
이상적으로는, 상기 클론은 복수의 항원성 암 펩티드를 인식하는 CR24이고, 가장 바람직하게는 클론 CR24는 멜란 A(잔기 26-35)로부터의 EAAGIGILTV(서열번호 71), BST2(잔기 22-31)로부터의 LLLGIGILVL(서열번호 72) 및 IMP2(잔기 367-376)로부터의 NLSALGIFST(서열번호 73)를 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 복수의 상기 펩티드를 인식한다. 바람직하게는, 이러한 인식은 HLA A2 제시의 맥락에서 이루어진다.
이상적으로는, 상기 클론 GD1 또는 GD2는 복수의 항원성 암 펩티드를 인식하고, 가장 바람직하게는 클론 GD1 또는 GD2는 하기 펩티드를 인식한다: 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)(잔기 855-873)로부터의 RLVDDFLLV(서열번호 74) 및 항원 C2와 연관된 흑색종(MAGE C2)(잔기 336-344)로부터의 ALKDVEERV(서열번호 75). 클론 GD1은 유방, 혈액 및 흑색종 암 세포주를 사멸시킬 수 있다.
이상적으로는, 상기 클론 VB6G4.24, CR1 및 VB10은 멜란 A 펩티드(EAAGIGILTV(서열번호 71))를 인식하지만, BST2(LLLGIGILVL(서열번호 72) 또는 IMP2(NLSALGIFST(서열번호 73)) 펩티드를 인식하지 않는다(외인성 펩티드로서도, MOLT3에 의해 발현된 형질도입된 단백질로부터도). VB6G4.24로부터 베타 TCR 쇄의 CDR3 서열이 도 2의 10개 모든 암 세포주에 대한 클론형 데이터에 나타났기 때문에, 이러한 클론은 복수 암 세포주에 반응하지만, IMP2 또는 BST2 펩티드의 인식에 의한 것은 아니다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 본 발명의 상기 TCR을 코딩하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 본 발명의 상기 TCR 또는 T-세포 또는 T-세포 클론 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체 또는 백신이 제공된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체 또는 백신은 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 암의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 TCR 또는 T-세포 또는 T-세포 클론 또는 벡터가 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 상기 TCR 또는 T-세포 클론 또는 벡터 또는 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체 또는 백신을 치료되는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 개체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
이상적으로는, 상기 암은 임의 유형의 것이다. 보다 이상적으로는, 상기 암은 비인두암, 활막암, 간세포암, 신장암, 결합 조직 암, 흑색종, 폐암, 장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모암, 위장종, 갈색세포종, 프롤락티노마, T-세포 백혈병/림프종, 편도선, 비장, 신경종, 폰 히펠-린다우 병, 졸린저-엘리슨 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 신경교종, 희소돌기교종, 신경모세포종, 수막종, 척수 종양, 골암, 골암, 골연골종, 유잉 육종, 원발 부위의 불명 암, 카르시노이드, 위장관 카르시노이드, 섬유육종, 유방암, 근육암, 파제트병, 자궁경부암, 난소, 혈액, 결장암, 직장암, 식도암, 담낭암, 담관암, 두부암, 안암, 비인두암, 목암, 신장암, 윌름스 종양, 간암, 카포시 육종, 전립선암, 정소암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 피부암, 중피종, 골수종, 다발성 골수종, 난소암, 내분비암, 글루카곤종, 부갑상선암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직 육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 영양모세포암, 포상기태, 자궁암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 청신경종, 균상식육종, 인슐린종, 카르시노이드 증후군, 체세포스타틴종, 잇몸암, 심장암, 입술암, 수막암, 구강암, 신경암, 구개암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 타액선암, 혀암 및 편도선암을 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 상기 암은 췌장, 혈액, 난소, 피부, 유방, 골, 신장, 결장, 자궁경부, 간, 전립선 또는 폐암이다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 TCR, 세포, 클론 또는 벡터는, 이로써 한정되지 않지만, 이중특이적 항체 등의 항암제와 조합하여 투여된다.
이중특이적에 대한 본원에서의 언급은, 2개의 상이한 유형의 항원에 동시에 결합할 수 있는 인공 단백질인 이중특이적 모노클로날 항체(BsMAb, BsAb)에 대한 언급이다.
또는 여전히, 상기 TCR은 이중특이성 항체의 부분을 형성할 수 있으며, 여기에서 상기 이중특이성 항체는 암 세포상의 그의 리간드에의 결합을 위한 상기 TCR, 및 또한 킬러 T-세포 등의 면역 세포와 결합하고 따라서 이를 활성화시키는 면역 세포 활성화 성분 또는 리간드를 포함한다.
본 발명의 더욱 추가의 태양에 따르면, 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서 상기 TCR 또는 세포 또는 클론 또는 벡터의 용도가 제공된다.
본 발명의 더욱 추가의 태양에 따르면,
a) 상기 TCR 또는 세포 또는 클론 또는 벡터 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체 또는 백신을
b) 추가의 암 치료제
와 함께 포함하는, 암 치료를 위한 병용 치료제가 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 이상적이지만 배타적이지는 않지만, 본 발명의 상기 TCR 또는 이의 일부를 인식하는 항암 T-세포를 유발할 수 있는 항암 펩티드 또는 펩티드 항원이 제공되고, 이는, 대상체에게 투여되는 경우, 효과기 T-세포(effector T-cell)로서 작용하는 항암 T-세포, 및/또는 상기 펩티드 항원이 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 분자에 의해 세포 표면에 제시될 때에 복수의 암 항원을 인식하는 T-세포의 생산을 프라이밍(priming)하고, 상기 암 항원은 서로 상이하고 하나 이상의 유형의 암을 대표한다.
추가의 태양에 따르면 또는 바람직한 실시형태에서, 상기 항원 펩티드는 하기 서열을 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
ITSAIGVLPV (서열번호 76);
ITSAIGILPV (서열번호 77);
MTSAIGVLPV (서열번호 78);
QTSAIGVLPV (서열번호 79);
MTSAIGILPV (서열번호 80);
LTSAIGVLPV (서열번호 81);
ITSGIGVLPV (서열번호 82);
ITSAIGVLPI (서열번호 83);
QTSAIGILPV (서열번호 84);
ITSAIGVLFV (서열번호 85)
가장 이상적으로는, 상기 항암 펩티드는 MTSAIGILPV이다. 보다 이상적으로는, 상기 펩티드는 상기 펩티드 중의 하나와 80% 또는 90% 동일성을 갖고, 따라서 1 또는 2개의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 상기 항암 펩티드를 포함하는 백신이 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 상기 항암 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 태양에 따르면, 항암 펩티드를 이의 천연 형태로 또는 백신, 약제학적 조성물, 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체로서 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 암의 치료에 사용하기 위한 항암 펩티드의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 따르면, 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서 항암 펩티드의 용도가 제공된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 암은 본원에 개시된 것들, 특히 피부암 또는 흑색종으로부터 선택된다.
하기의 청구범위 및 본 발명의 선행 기재에서, 표현이나 필요한 암시를 나타냄으로 인해 문맥상 요구됨을 제외하고, "포함하다"란 단어 또는 "포함하는"과 같은 변형은 포괄적인 의미로, 즉 서술된 특징의 존재를 명시하지만 본 발명의 다양한 실시형태에서 추가의 특징의 존재 또는 부가를 제외하지 않는데 사용된다.
본 명세서에 인용된 임의의 특허 또는 특허 출원을 포함한 모든 참고문헌은 본 명세서에 참고로 인용된다. 임의의 참고문헌이 종래 기술을 구성함을 인정하는 것은 아니다. 더욱이, 종래 기술 중 임의의 기술이 당해 분야의 통상적인 일반적인 지식의 부분을 구성함을 인정하는 것은 아니다.
본 발명의 각 태양의 바람직한 특징은 다른 태양 중 어느 하나와 관련하여 기재되는 바와 같을 수 있다.
본 발명의 다른 특징은 하기의 실시예로부터 자명해질 것이다. 일반적으로 말하자면, 본 발명은 본 명세서(첨부된 청구범위 및 도면을 포함하여)에 개시된 특징 중 임의의 신규의 것, 또는 임의의 신규의 조합으로 확장된다. 따라서, 본 발명의 특정 태양, 실시형태 또는 실시예와 함께 기재된 특징, 정수, 특성, 화합물 또는 화학적 부분은 서로 양립할 수 없지 않은 한, 본 명세서에 기재된 임의의 다른 태양, 실시형태 또는 실시예에 적용 가능한 것으로 이해해야 한다.
더욱이, 달리 서술되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 임의의 특징은 동일하거나 또는 유사한 목적으로 제공되는 대안의 특징에 의해 교체될 수 있다.
본 명세서의 기재 및 청구항 전체를 통해, 단수는 문맥상 달리 요구되지 않는 한 복수를 포함한다. 특히, 부정관사가 사용되는 경우, 본 명세서는 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수뿐만 아니라 복수를 고려하는 것으로서 이해해야 한다.
이제, 본 발명의 실시형태는 이하를 참조하여 예로서만 설명된다.
도 1은, 전이성 흑색종의 MM909.24가 복수의 HLA A2+ 암 세포 유형을 인식할 수 있는 HLA A2+ 환자의 치유에 사용된 종양 침윤성 림프구(TIL)을 나타낸다. (A) TIL은 상이한 조직 기원의 자가 흑색종 및 암 세포주에 대하여 시험했다. (B) 자가 흑색종 및 HLA A2+ 암 세포주를 나타낸 크롬 방출 세포독성 검정. 세포주는 이들의 기원 조직(A)에 따라 색 구분되어 있다. 18시간의 인큐베이션 후의 특이적 용해가 표시된다. (C) TAPI-0 검정에 의한 TIL은 표시된 HLA A2+ 암 세포주와 5시간 인큐베이션하고, 모노클로날 항체에 의한 TNF 및 CD107a의 검출에 의해 활성화를 평가했다. 활성화 게이트(TNF+ 및/또는 CD107a+)는 TIL 단독 대조군에 기초하여 설정했다. 반응하는 T-세포는 유세포분석에 의해 분류하고, T-세포 수용체(TCR)의 α 및 β 쇄의 후속 생성 서열분석에 사용했다.
도 2는, HLA A2+ 환자 MM909.24의 TIL로부터, 자가 흑색종(MM909.24) 뿐만 아니라 암 세포주에 반응할 수 있는, 기능성 T 세포의 T-세포 수용체(TCR) β 쇄 클론형을 나타낸다. 세포는, (도 1)에 제시된 HLA A2+ 암 세포주와 함께 5시간 인큐베이션 후에 기능(CD107a 및 TNF 항체에 의한 TAPI-0 검정)에 기초하여 분류하고, TCR 쇄의 고처리량 일루미나 서열분석에 사용했다. (A) TCR β 쇄 CDR3은 좌측에 표시되어 있고, 챠트의 각 음영 청색 세그먼트는 CDR3이 챠트 상부에 제시된 암 세포주에 반응하는 모집단에 존재하는 것을 나타낸다. (B)는 각 세그먼트에 인접하여 제시된 암 세포주의 수를 인식한 CDR3의 비율을 나타낸다. 예를 들면, 2개 세포주 = 자가 흑색종 + 1개 기타 암 세포주; 10개 세포주 = 자가 흑색종 + 9개 기타 암 세포주. 또한, HLA 2A+ 자가 흑색종에 반응하는 클론형 중의 50% 이상은 4개 이상의 기타 암 유형에 반응한다.
도 3은 암 에피토프 발견 파이프라인을 나타낸다. 이 도면은, 복수의 암 세포 유형에 반응하는 T-세포에 의해 인식된 펩티드(들)를 발견하는데 사용된 전략을 도시한다. (A) CD8 T-세포는 한계 희석에 의해 TIL MM909.24로부터 클로닝하고, 이어서 자가 MM909.24 흑색종에 대한 세포독성에 대해 스크리닝했다. 일부 경우에, 다른 암 세포 유형을 또한 스크리닝 동안 사용했다. 목적 클론을 확장시키고, 추가의 검정에 사용했다. (B) 키(key) CD8 T-세포 클론에 대해 조합 펩티드 라이브러리 스크리닝을 수행하여, 펩티드의 각 위치에서 아미노산 잔기 우선도를 나타냈다. 개략도는 펩티드 서브-라이브러리로 구성된 CPL 라이브러리의 설계를 나타내고; 각 서브-라이브러리는 펩티드의 정의된 위치에 고정된 아미노산 잔기(개방 원)(20개 단백질생성 아미노산 중의 1개)를 갖고, 동일한 서브-라이브러리의 기타 모든 위치는 잔기의 랜덤 혼합물이다(회색 사각형). (C) CPL 데이터(도 5에 제시한 예)를 사용하여, 암 단백질 데이터베이스(준비 중의 원고)를 스크리닝하여, 클론에 의해 인식될 것으로 예상되는 후보 펩티드를 추가했다. (D) CD8 클론에 의해 인식된 것을 밝히기 위한 후보 암 펩티드의 기능 시험.
도 4는, T-세포 클론 CD24가 상이한 조직 기원의 다중 HLA A2+ 암 세포주를 인식할 수 있음을 나타낸다. TAPI-O 검정을 사용하여, 제시된 암 세포주에 대한 CR24의 반응성을 평가했다. 반응성의 퍼센트(CD107a+ 및/또는 TNF+)가 표시되어 있다. (A) CR24는 HLA A2+ 흑색종을 인식했지만, HLA A2-음성 흑색종을 인식하지 않았다. (B) HLA A2가 발현될 때, 백혈병 세포주 CIR이 인식되었다. (C) 상이한 조직 기원(키)의 비흑색종 HLA A2+ 세포주의 인식.
도 5는 CD8 T-세포 클론 CR24의 조합 펩티드 라이브러리(CPL) 스크린을 나타낸다. 십량체 CPL 스크린의 각 서브-라이브러리를 CR24와 함께 이중으로 인큐베이팅하고, TAP(항원 처리와 연관된 트랜스포터) 결핍 세포주 T2를 항원 제시 세포로서 사용했다. CR24의 펩티드 길이(10mer) 우선도는 크기 스캔 검정을 사용하여 이미 결정되어 있다(데이터는 제시하지 않음). 밤새 인큐베이션 후, 상청액을 회수하고, 클론 활성화를 MIP1-β ELISA에 의해 평가했다. 각 그래프는 CPL 스크린의 1개 펩티드 위치를 나타내고, 아미노산(일문자 코드)는 해당 특정 위치에서 고정된 x-축 상에 제시되어 있다. 녹색의 바는 멜란 A의 CR24, EAAGIGILTV(잔기 26-35)에 의해 인식된 펩티드 중의 하나에 대한 아미노산 잔기를 나타낸다. CPL 데이터는, CR24에 의해 인식될 가능성이 가장 높은 후보 펩티드를 제공하기 위해 맞춤형 암 항원 웹도구를 통해 실행했다(도 6).
도 6은 T-세포 클론 CR24가 상이한 암 단백질로부터 유래하는 3개의 상이한 펩티드를 인식하는 것을 나타낸다. 도 4에서 실행된 조합 펩티드 라이브러리 스크린에 의해 동정된 후보 펩티드 중에서, 3개의 펩티드가 CR24; EAAGIGILTV(T-세포 1에 의해 인식된 흑색종 항원/멜라노사이트 항원(MART-1/멜란 A, 잔기 26-35) http://www.iedb.org/epId/10987), LLLGIGILVL(골수 간질 항원 2(BST2, 잔기 22-31), 및 인슐린-유사 성장 인자 2 mRNA 결합 단백질로부터의 NLSALGIFST(IMP2, 잔기 367-376)에 의해 인식되었다. 3개 모든 펩티드에 공통하는 2개 아미노산 잔기는 키에서 적색으로 제시되어 있다. 멜란 A 펩티드는 흑색종을 인식하는 T-세포의 표적으로 잘 설명되어 있다. BST2 펩티드의 9-아미노산 길이 버젼은 이전에 기재되어 있다(10: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16569595). IMP2 펩티드는 이전에 기재되지 않은 신규한 에피토프이다(준비 중의 원고). (A) CR24에 의한 활성화 검정 및 각 펩티드의 적정, 밤새 배양하고, 상청액을 MIP-1β ELISA에 사용했다. (b) CR24를 펩티드에 대해 HLA A2 사량체로 염색하여, 동족 TCR이 이러한 항원에 관여할 수 있음을 확인한다. 최적화 염색 프로토콜이 사용되었다. 대조군 사량체는 HLA A2 ALWGPDPAAA(프리프로인슐린 잔기 15-24)이다. (c) 3개의 암 펩티드가 유래하는 단백질을 발현하는 CR24 및 항원 제시 세포를 사용한 활성화 검정. 세포주, MOLT3(천연 HLA-A2 음성, 멜란 A 음성, BST2 음성 및 IMP2 음성)는 HLA A2, 멜란 A, BST2, IMP2, 콜라겐 유형 IV의 α2 아단위 및 지카(Zika) 바이러스의 앵커 캡시드 단백질의 발현을 위해 유전자로 형질도입시켰다. 콜라겐 및 지카 단백질은 형질도입/무관한 단백질 대조군으로 작용했다. CR24를 각각의 MOLT3 세포주와 함께 밤새 인큐베이팅하고, TNF ELISA를 위해 상청액을 회수했다.
도 7은 T-세포 클론 CR24가 적어도 2개 항원을 통해 자가 흑색종을 인식하는 것을 나타낸다. (A) 자가 MM909.24 흑색종 중의 멜란 A 유전자는, 가이드 (g) RNA 및 CRISPR-Cas9를 사용하여 절제를 위해 표적화했다. 야생형 멜란 A 아미노산 서열은 EAAGIGILTV(서열번호 71) 펩티드와 함께 청색으로 제시되어 있다. 멜란 A 유전자좌의 서열분석은, EAAGIGILTV(서열번호 71) 서열의 하류에 있는 양 대립유전자에서 초기 STOP 코돈(적색)에 기인하여 유전자 파괴를 확인했다. (B) 비접합 항-멜란 A 항체 및 PE 접합된 이차 항체에 의한 멜란 A의 세포내 염색은 멜란 A 단백질의 부재를 확인했다. (C&D) 야생형 및 멜란 A 녹-아웃(KO) 자가 흑색종을 사용한 TIL MM909.24(C) 및 CR24(D)의 활성화 검정(TNF 및 CD107a 항체를 갖는 TAPI-0). 멜란 A 펩티드 EAAGIGILTV(서열번호 71)를 CR24에 대한 양성 대조군으로 사용했다. CR24는 여전히 멜란 A 발현, 따라서 HLA A2-EAAGIGILTV(서열번호 71) 제시를 결여하는 자가 흑색종을 인식할 수 있었고, 이는 적어도 하나의 다른 펩티드가 CR24, 및 가장 가능하게는 BST2 및/또는 IMP2로부터 유래하는 것들에 의해 인식되고 있음을 시사한다.
도 8은, 멜란 A(EAAGIGILTV(서열번호 71)), BST2(LLLGIGILVL(서열번호 72)) 및 IMP2(NLSALGIFST(서열번호 73)) 펩타이드에 대해 교차 반응하는 T 세포가 건강한 공여체(들)로부터 생성될 수 있음을 나타낸다. (A) 2개 HLA A2+ 공여체로부터의 CD8 T-세포(1개 공여체로부터의 대표적 데이터가 제시됨)는, 멜란 A, BST2 또는 IMP2 펩티드를 사용한 별개의 배양물로서 프라이밍했다(1). 프라이밍한지 2주 후, 각 배양물을 대조군(프리프로인슐린 15-24의 ALWGPDPAAA(서열번호 86)), 멜란 A, BST2 및 IMP2 사량체로 염색했다(2). 세포 염색의 퍼센트는 각 샘플에 대해 제시되어 있다. (B) 각각의 프라이밍된 T-세포주는 암 세포주와 함께 밤새 IFNγ ELISpot 검정에 사용했다; MDA-MB-231(유방), MM909.24(흑색종) 및 Saos-2(골). T-세포를 또한 단독으로 인큐베이팅했다. 50,000 세포당 스팟 형성 세포(SFC)의 수가 제시되어 있다.
도 9 는 다면적 T-세포를 위한 슈퍼-작용제 펩티드가 야생형 펩티드보다 많은 암-펩티드 특이적 T-세포를 프라이밍하는 것을 나타낸다. 후보 슈퍼-작용제는 CR24의 CPL 데이터(도 5) 및 예측 알고리즘 (http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user_cases.php)을 사용하여 설계하고; 이는 EPL 데이터에 의해 밝혀진 아미노산 우선도에 기초하여 슈퍼-작용제로서 작용할 가능성이 가장 높은 펩티드를 동정한다(2: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22952231). 펩티드는 야생형 펩티드와는 서열이 상이하고, 변경 펩티드 리간드로서 불리운다. 상부 10개 펩티드는 (A)에 제시되어 있고, 야생형 펩티드 EAAGIGILTV(서열번호 71)(멜란 A), LLLGIGILVL(서열번호 72)(BST2) 및 NLSALGIFST(서열번호 73)(IMP2)와 함께(볼드체로 제시됨), 위치 6에서 글리신(변경된 펩티드 리간드(APL), 1, 3, 4, 6, 7, 8 및 10) 또는 각각 위치 6 및 7에서 글리신 및 이소류신(APL 펩티드 2, 5 및 9)을 공유한다. (B) 슈퍼-작용제 특성에 대해 APL을 시험하기 위해, 각각의 WT 및 APL 펩티드를 사용하여, HLA A2+ 건강한 공여체로부터의 CD8+ T-세포를 프라이밍했다. 각각의 펩티드에 대한 반응의 크기는, T-세포를 HLA A2-EAAGIGILTV(멜란 A)(서열번호 71), -LLLGIGILVL(서열번호 72)(BST2) 또는 -NLSALGIFST(서열번호 73)(IMP2)의 사량체로 염색함으로써 평가했다. 전체로서, APL 5(MTSAIGILPV)(서열번호 80)는, 시험된 3개 모든 공여체 전체에서 프라이밍 멜란 A, BST2 및 IMP2 T-세포에서 가장 효과적 슈퍼-작용제인 것으로 생각되었다.
도 10은 슈퍼-작용제 펩티드 번호 5(MTSAIGILPV)(서열번호 80)가, WT EAAGIGILTV 멜란 A 펩티드(서열번호 71)를 인식할 수 있는 전이성 흑색종 환자로부터 보다 많은 CD8 T-세포를 프라이밍했음을 나타낸다. 환자 37 및 12로부터 이용가능한 제한된 수의 PBMC에 기인하여, 멜란 A 펩티드만을 펩티드 번호 5와의 비교에 사용했다. 환자 37은 종래 또는 TIL 요법에 반응하지 않고 현재 사망했다. 환자 12는 치료를 받고 있었다. (A) EAAGIGILTV(WT)(서열번호 71) 및 MTSAIGILPV(서열번호 80)(번호 5) 펩티드를 사용한 CD8+ T-세포의 프라이밍 후의 HLA A2-EAAGIGILTV(WT 멜란 A)(서열번호 71) 사량체 염색 데이터. 무관한 HLA A2-ALWGPDPAAA(프리프로인슐린)(서열번호 86) 사량체를 무관한 대조군으로 사용했다. (B) 자가 흑색종을 사용하여 환자 37의 T-세포주에 대해 실시한 크롬 방출 세포독성 검정. 표시된 T-세포주 대 흑색종 세포 비율은 합계 T-세포 수에 기초한다. 사멸 검정을 수행하기 위해 불충분한 세포가 환자 12로부터 이용가능하다. (C) (B)와 동일한 세포독성 검정, 그러나 (A)에 제시된 EAAGIGILTV(서열번호 71) 사량체 양성에 따라 세포 수를 조정하고, EAAGIGILTV 및 MTSAIGILPV 둘 다에 대해서, 3개 흑색종 세포당 2개 EAAGIGILTV 사량체 세포를 제공하기 위해 T-세포주를 프라이밍했다. P 값은 대응하지 않는 편측 t-검정에 대해 표시되어 있다.
도 11은 다른 잠재적 다면적 T-세포로부터의 요약된 예비 데이터를 나타낸다. TIL 환자 MM909.24로부터 또한 성장한 T-세포 클론(VB6G4.24, CR1 및 VB10)은 멜란 A 펩티드(EAAGIGILTV)(서열번호 71)을 인식하지만, BST2(LLLGIGILVL)(서열번호 72) 또는 IMP2(NLSALGIFST)(서열번호 73) 펩티드를 인식하지 않는다(외인성 펩티드로서도, MOLT3에 의해 발현된 형질도입 단백질로부터도). VB6G4.24로부터 베타 TCR 쇄의 CDR3 서열은 도 2의 10개 모든 암 세포주에 대한 클론형 데이터에 나타났고, 이는 이러한 클론이 복수의 암 세포주에 반응하지만, IMP2 또는 BST2 펩티드의 인식에 의한 반응은 아닌 것을 시사한다.
도 12는 다른 다면적 T-세포의 펩티드 교차-반응성을 나타낸다. 클론 GD1 및 GD2는 클론 CR24와는 상이한 펩티드를 인식한다. (A) 상이한 공여체로부터 성장한 HLA A2-제한된 클론 GD1 및 GD2는 상이한 T-세포 수용체를 발현하지만, 제시된 바와 같이, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT) 및 MAGE C2로부터의 동일한 펩티드를 인식한다. 적색 아미노산 잔기만이 각각의 펩티드에 공통이다. 각 펩티드의 저하 농도를 사용하는 각 클론에 의한 밤새 활성화 검정. 상청액을 회수하고 MIP-1β ELISA에 사용했다. (B) 상이한 조직 기원의 암 세포주를 인식하기 위한 GD1의 예비 스크리닝. 밤새 활성화 검정 및 MIP-1β ELISA. (C) GD1의 우수한 표적으로서 (B)에서 동정된 세포주를 사용한 크롬 방출 세포독성. 4시간 및 밤새 인큐베이이션 후에 평가된 특이적 용해 퍼센트.
도 13은 다면적 암 특이적 T-세포 및 T-세포 수용체가 통상의 항암 T-세포와는 상이함을 나타낸다. (A) 종래, 항암 T-세포는, TCR이 A에 제시된 바와 같이 암 항원으로부터 유래하는 펩티드에 결합하는 경우, 암 세포를 인식한다. 이러한 T-세포는 다른 암-유래 펩티드에 반응하지 않는다. (B) 비정상적으로, 다면적 항암 T-세포는 복수의 상이한 암 펩티드를 인식하는 TCR을 갖는다. 암 세포 및 발생중의 종양이 다면적 T-세포로부터 탈출하는 것은 매우 곤란하다. 결과적으로, 다면적 TCR의 사용은 암 면역요법 접근법에서 바람직하다.
도 14는, 슈퍼-작용제 펩티드 MTSAIGILPV가 보다 많은 비율의 암-특이적 T-세포를 프라이밍하여 자가 암의 사멸을 증강시키는 것을 나타낸다. (A) 신장 세포암(RCC) 및 만성 림프구 백혈병(CLL) 환자의 CD8 T-세포는 프라이밍하지 않거나, 28일 동안 MTSAIGILPV 펩티드로 프라이밍시켰다. TAPI-0 검정(RCC 환자) 또는 사량체 염색(CLL 환자)는 MTSAIGILPV(서열번호 80) 특이적 T-세포의 존재를 입증했다. MTSAIGILPV(서열번호 80) 프라이밍된 CD8은 프라이밍되지 않은 T-세포보다 많은 자가 암 세포를 사멸시켰다. (B) 급성 골수성 백혈병(AML) 환자 및 2명의 CLL 환자로부터의 CD8 T-세포를 프라이밍하지 않거나, 28일 동안 야생형 IMP-2(NLSALGIFST)(서열번호 73) 또는 MTSAIGILPV(서열번호 80) 펩티드로 프라이밍시켰다. IMP-2 사량체로 수행한 분석은 프라이밍되지 않은 조건 및 IMP-2 프라이밍된 조건이 유사한 비율의 IMP-2 특이적 T-세포를 가졌고, MTSAIGILPV는 내성을 파괴하고 보다 높은 비율의 IMP-2 세포를 유도한 것으로 밝혀졌다. CLL 환자 3으로부터의 T-세포를 사멸 검정에 사용했고, MTSAIGILPV(서열번호 80) 프라이밍된 T-세포는 IMP-2 프라이밍된 CD8보다 많은 CLL 세포를 사멸시켰다.
도 15는 다면적 T 세포가 동일한 암 세포의 표면에서 상이한 암-특이적 항원으로부터 유래하는 복수의 상이한 펩티드를 어떻게 인식하는지를 나타낸다.
도 16은 다면적 T-세포가 상가적으로 및 저농도에서 펩티드를 인식하는 것을 나타낸다. 다면적 T-세포 클론 CR24는 BST2(LLLGIGILVL)(서열번호 72), 멜란 A(EAAGIGILTV)(서열번호 71) 및 IMP2(NLSALGIFST)(서열번호 73)의 펩티드를 인식했다. CR24는 10-6M에서 3개 모든 각 펩티드에 반응했지만, 펩티드가 10-8M로 존재하면 반응이 저하되었다. 그러나, CR24는, 각 펩티드가 펩티드 혼합물 내에 10-8M로 존재하는 경우, 우수한 활성화를 나타냈다. 이는, 동일한 세포에 의해 발현된 상이한 단백질로부터의 복수 펩티드를 인식함으로써 다면적 T-세포가 어느 암 세포를 고감도로 표적화하는지를 입증한다.
도 1은, 전이성 흑색종의 MM909.24가 복수의 HLA A2+ 암 세포 유형을 인식할 수 있는 HLA A2+ 환자의 치유에 사용된 종양 침윤성 림프구(TIL)을 나타낸다. (A) TIL은 상이한 조직 기원의 자가 흑색종 및 암 세포주에 대하여 시험했다. (B) 자가 흑색종 및 HLA A2+ 암 세포주를 나타낸 크롬 방출 세포독성 검정. 세포주는 이들의 기원 조직(A)에 따라 색 구분되어 있다. 18시간의 인큐베이션 후의 특이적 용해가 표시된다. (C) TAPI-0 검정에 의한 TIL은 표시된 HLA A2+ 암 세포주와 5시간 인큐베이션하고, 모노클로날 항체에 의한 TNF 및 CD107a의 검출에 의해 활성화를 평가했다. 활성화 게이트(TNF+ 및/또는 CD107a+)는 TIL 단독 대조군에 기초하여 설정했다. 반응하는 T-세포는 유세포분석에 의해 분류하고, T-세포 수용체(TCR)의 α 및 β 쇄의 후속 생성 서열분석에 사용했다.
도 2는, HLA A2+ 환자 MM909.24의 TIL로부터, 자가 흑색종(MM909.24) 뿐만 아니라 암 세포주에 반응할 수 있는, 기능성 T 세포의 T-세포 수용체(TCR) β 쇄 클론형을 나타낸다. 세포는, (도 1)에 제시된 HLA A2+ 암 세포주와 함께 5시간 인큐베이션 후에 기능(CD107a 및 TNF 항체에 의한 TAPI-0 검정)에 기초하여 분류하고, TCR 쇄의 고처리량 일루미나 서열분석에 사용했다. (A) TCR β 쇄 CDR3은 좌측에 표시되어 있고, 챠트의 각 음영 청색 세그먼트는 CDR3이 챠트 상부에 제시된 암 세포주에 반응하는 모집단에 존재하는 것을 나타낸다. (B)는 각 세그먼트에 인접하여 제시된 암 세포주의 수를 인식한 CDR3의 비율을 나타낸다. 예를 들면, 2개 세포주 = 자가 흑색종 + 1개 기타 암 세포주; 10개 세포주 = 자가 흑색종 + 9개 기타 암 세포주. 또한, HLA 2A+ 자가 흑색종에 반응하는 클론형 중의 50% 이상은 4개 이상의 기타 암 유형에 반응한다.
도 3은 암 에피토프 발견 파이프라인을 나타낸다. 이 도면은, 복수의 암 세포 유형에 반응하는 T-세포에 의해 인식된 펩티드(들)를 발견하는데 사용된 전략을 도시한다. (A) CD8 T-세포는 한계 희석에 의해 TIL MM909.24로부터 클로닝하고, 이어서 자가 MM909.24 흑색종에 대한 세포독성에 대해 스크리닝했다. 일부 경우에, 다른 암 세포 유형을 또한 스크리닝 동안 사용했다. 목적 클론을 확장시키고, 추가의 검정에 사용했다. (B) 키(key) CD8 T-세포 클론에 대해 조합 펩티드 라이브러리 스크리닝을 수행하여, 펩티드의 각 위치에서 아미노산 잔기 우선도를 나타냈다. 개략도는 펩티드 서브-라이브러리로 구성된 CPL 라이브러리의 설계를 나타내고; 각 서브-라이브러리는 펩티드의 정의된 위치에 고정된 아미노산 잔기(개방 원)(20개 단백질생성 아미노산 중의 1개)를 갖고, 동일한 서브-라이브러리의 기타 모든 위치는 잔기의 랜덤 혼합물이다(회색 사각형). (C) CPL 데이터(도 5에 제시한 예)를 사용하여, 암 단백질 데이터베이스(준비 중의 원고)를 스크리닝하여, 클론에 의해 인식될 것으로 예상되는 후보 펩티드를 추가했다. (D) CD8 클론에 의해 인식된 것을 밝히기 위한 후보 암 펩티드의 기능 시험.
도 4는, T-세포 클론 CD24가 상이한 조직 기원의 다중 HLA A2+ 암 세포주를 인식할 수 있음을 나타낸다. TAPI-O 검정을 사용하여, 제시된 암 세포주에 대한 CR24의 반응성을 평가했다. 반응성의 퍼센트(CD107a+ 및/또는 TNF+)가 표시되어 있다. (A) CR24는 HLA A2+ 흑색종을 인식했지만, HLA A2-음성 흑색종을 인식하지 않았다. (B) HLA A2가 발현될 때, 백혈병 세포주 CIR이 인식되었다. (C) 상이한 조직 기원(키)의 비흑색종 HLA A2+ 세포주의 인식.
도 5는 CD8 T-세포 클론 CR24의 조합 펩티드 라이브러리(CPL) 스크린을 나타낸다. 십량체 CPL 스크린의 각 서브-라이브러리를 CR24와 함께 이중으로 인큐베이팅하고, TAP(항원 처리와 연관된 트랜스포터) 결핍 세포주 T2를 항원 제시 세포로서 사용했다. CR24의 펩티드 길이(10mer) 우선도는 크기 스캔 검정을 사용하여 이미 결정되어 있다(데이터는 제시하지 않음). 밤새 인큐베이션 후, 상청액을 회수하고, 클론 활성화를 MIP1-β ELISA에 의해 평가했다. 각 그래프는 CPL 스크린의 1개 펩티드 위치를 나타내고, 아미노산(일문자 코드)는 해당 특정 위치에서 고정된 x-축 상에 제시되어 있다. 녹색의 바는 멜란 A의 CR24, EAAGIGILTV(잔기 26-35)에 의해 인식된 펩티드 중의 하나에 대한 아미노산 잔기를 나타낸다. CPL 데이터는, CR24에 의해 인식될 가능성이 가장 높은 후보 펩티드를 제공하기 위해 맞춤형 암 항원 웹도구를 통해 실행했다(도 6).
도 6은 T-세포 클론 CR24가 상이한 암 단백질로부터 유래하는 3개의 상이한 펩티드를 인식하는 것을 나타낸다. 도 4에서 실행된 조합 펩티드 라이브러리 스크린에 의해 동정된 후보 펩티드 중에서, 3개의 펩티드가 CR24; EAAGIGILTV(T-세포 1에 의해 인식된 흑색종 항원/멜라노사이트 항원(MART-1/멜란 A, 잔기 26-35) http://www.iedb.org/epId/10987), LLLGIGILVL(골수 간질 항원 2(BST2, 잔기 22-31), 및 인슐린-유사 성장 인자 2 mRNA 결합 단백질로부터의 NLSALGIFST(IMP2, 잔기 367-376)에 의해 인식되었다. 3개 모든 펩티드에 공통하는 2개 아미노산 잔기는 키에서 적색으로 제시되어 있다. 멜란 A 펩티드는 흑색종을 인식하는 T-세포의 표적으로 잘 설명되어 있다. BST2 펩티드의 9-아미노산 길이 버젼은 이전에 기재되어 있다(10: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16569595). IMP2 펩티드는 이전에 기재되지 않은 신규한 에피토프이다(준비 중의 원고). (A) CR24에 의한 활성화 검정 및 각 펩티드의 적정, 밤새 배양하고, 상청액을 MIP-1β ELISA에 사용했다. (b) CR24를 펩티드에 대해 HLA A2 사량체로 염색하여, 동족 TCR이 이러한 항원에 관여할 수 있음을 확인한다. 최적화 염색 프로토콜이 사용되었다. 대조군 사량체는 HLA A2 ALWGPDPAAA(프리프로인슐린 잔기 15-24)이다. (c) 3개의 암 펩티드가 유래하는 단백질을 발현하는 CR24 및 항원 제시 세포를 사용한 활성화 검정. 세포주, MOLT3(천연 HLA-A2 음성, 멜란 A 음성, BST2 음성 및 IMP2 음성)는 HLA A2, 멜란 A, BST2, IMP2, 콜라겐 유형 IV의 α2 아단위 및 지카(Zika) 바이러스의 앵커 캡시드 단백질의 발현을 위해 유전자로 형질도입시켰다. 콜라겐 및 지카 단백질은 형질도입/무관한 단백질 대조군으로 작용했다. CR24를 각각의 MOLT3 세포주와 함께 밤새 인큐베이팅하고, TNF ELISA를 위해 상청액을 회수했다.
도 7은 T-세포 클론 CR24가 적어도 2개 항원을 통해 자가 흑색종을 인식하는 것을 나타낸다. (A) 자가 MM909.24 흑색종 중의 멜란 A 유전자는, 가이드 (g) RNA 및 CRISPR-Cas9를 사용하여 절제를 위해 표적화했다. 야생형 멜란 A 아미노산 서열은 EAAGIGILTV(서열번호 71) 펩티드와 함께 청색으로 제시되어 있다. 멜란 A 유전자좌의 서열분석은, EAAGIGILTV(서열번호 71) 서열의 하류에 있는 양 대립유전자에서 초기 STOP 코돈(적색)에 기인하여 유전자 파괴를 확인했다. (B) 비접합 항-멜란 A 항체 및 PE 접합된 이차 항체에 의한 멜란 A의 세포내 염색은 멜란 A 단백질의 부재를 확인했다. (C&D) 야생형 및 멜란 A 녹-아웃(KO) 자가 흑색종을 사용한 TIL MM909.24(C) 및 CR24(D)의 활성화 검정(TNF 및 CD107a 항체를 갖는 TAPI-0). 멜란 A 펩티드 EAAGIGILTV(서열번호 71)를 CR24에 대한 양성 대조군으로 사용했다. CR24는 여전히 멜란 A 발현, 따라서 HLA A2-EAAGIGILTV(서열번호 71) 제시를 결여하는 자가 흑색종을 인식할 수 있었고, 이는 적어도 하나의 다른 펩티드가 CR24, 및 가장 가능하게는 BST2 및/또는 IMP2로부터 유래하는 것들에 의해 인식되고 있음을 시사한다.
도 8은, 멜란 A(EAAGIGILTV(서열번호 71)), BST2(LLLGIGILVL(서열번호 72)) 및 IMP2(NLSALGIFST(서열번호 73)) 펩타이드에 대해 교차 반응하는 T 세포가 건강한 공여체(들)로부터 생성될 수 있음을 나타낸다. (A) 2개 HLA A2+ 공여체로부터의 CD8 T-세포(1개 공여체로부터의 대표적 데이터가 제시됨)는, 멜란 A, BST2 또는 IMP2 펩티드를 사용한 별개의 배양물로서 프라이밍했다(1). 프라이밍한지 2주 후, 각 배양물을 대조군(프리프로인슐린 15-24의 ALWGPDPAAA(서열번호 86)), 멜란 A, BST2 및 IMP2 사량체로 염색했다(2). 세포 염색의 퍼센트는 각 샘플에 대해 제시되어 있다. (B) 각각의 프라이밍된 T-세포주는 암 세포주와 함께 밤새 IFNγ ELISpot 검정에 사용했다; MDA-MB-231(유방), MM909.24(흑색종) 및 Saos-2(골). T-세포를 또한 단독으로 인큐베이팅했다. 50,000 세포당 스팟 형성 세포(SFC)의 수가 제시되어 있다.
도 9 는 다면적 T-세포를 위한 슈퍼-작용제 펩티드가 야생형 펩티드보다 많은 암-펩티드 특이적 T-세포를 프라이밍하는 것을 나타낸다. 후보 슈퍼-작용제는 CR24의 CPL 데이터(도 5) 및 예측 알고리즘 (http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user_cases.php)을 사용하여 설계하고; 이는 EPL 데이터에 의해 밝혀진 아미노산 우선도에 기초하여 슈퍼-작용제로서 작용할 가능성이 가장 높은 펩티드를 동정한다(2: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22952231). 펩티드는 야생형 펩티드와는 서열이 상이하고, 변경 펩티드 리간드로서 불리운다. 상부 10개 펩티드는 (A)에 제시되어 있고, 야생형 펩티드 EAAGIGILTV(서열번호 71)(멜란 A), LLLGIGILVL(서열번호 72)(BST2) 및 NLSALGIFST(서열번호 73)(IMP2)와 함께(볼드체로 제시됨), 위치 6에서 글리신(변경된 펩티드 리간드(APL), 1, 3, 4, 6, 7, 8 및 10) 또는 각각 위치 6 및 7에서 글리신 및 이소류신(APL 펩티드 2, 5 및 9)을 공유한다. (B) 슈퍼-작용제 특성에 대해 APL을 시험하기 위해, 각각의 WT 및 APL 펩티드를 사용하여, HLA A2+ 건강한 공여체로부터의 CD8+ T-세포를 프라이밍했다. 각각의 펩티드에 대한 반응의 크기는, T-세포를 HLA A2-EAAGIGILTV(멜란 A)(서열번호 71), -LLLGIGILVL(서열번호 72)(BST2) 또는 -NLSALGIFST(서열번호 73)(IMP2)의 사량체로 염색함으로써 평가했다. 전체로서, APL 5(MTSAIGILPV)(서열번호 80)는, 시험된 3개 모든 공여체 전체에서 프라이밍 멜란 A, BST2 및 IMP2 T-세포에서 가장 효과적 슈퍼-작용제인 것으로 생각되었다.
도 10은 슈퍼-작용제 펩티드 번호 5(MTSAIGILPV)(서열번호 80)가, WT EAAGIGILTV 멜란 A 펩티드(서열번호 71)를 인식할 수 있는 전이성 흑색종 환자로부터 보다 많은 CD8 T-세포를 프라이밍했음을 나타낸다. 환자 37 및 12로부터 이용가능한 제한된 수의 PBMC에 기인하여, 멜란 A 펩티드만을 펩티드 번호 5와의 비교에 사용했다. 환자 37은 종래 또는 TIL 요법에 반응하지 않고 현재 사망했다. 환자 12는 치료를 받고 있었다. (A) EAAGIGILTV(WT)(서열번호 71) 및 MTSAIGILPV(서열번호 80)(번호 5) 펩티드를 사용한 CD8+ T-세포의 프라이밍 후의 HLA A2-EAAGIGILTV(WT 멜란 A)(서열번호 71) 사량체 염색 데이터. 무관한 HLA A2-ALWGPDPAAA(프리프로인슐린)(서열번호 86) 사량체를 무관한 대조군으로 사용했다. (B) 자가 흑색종을 사용하여 환자 37의 T-세포주에 대해 실시한 크롬 방출 세포독성 검정. 표시된 T-세포주 대 흑색종 세포 비율은 합계 T-세포 수에 기초한다. 사멸 검정을 수행하기 위해 불충분한 세포가 환자 12로부터 이용가능하다. (C) (B)와 동일한 세포독성 검정, 그러나 (A)에 제시된 EAAGIGILTV(서열번호 71) 사량체 양성에 따라 세포 수를 조정하고, EAAGIGILTV 및 MTSAIGILPV 둘 다에 대해서, 3개 흑색종 세포당 2개 EAAGIGILTV 사량체 세포를 제공하기 위해 T-세포주를 프라이밍했다. P 값은 대응하지 않는 편측 t-검정에 대해 표시되어 있다.
도 11은 다른 잠재적 다면적 T-세포로부터의 요약된 예비 데이터를 나타낸다. TIL 환자 MM909.24로부터 또한 성장한 T-세포 클론(VB6G4.24, CR1 및 VB10)은 멜란 A 펩티드(EAAGIGILTV)(서열번호 71)을 인식하지만, BST2(LLLGIGILVL)(서열번호 72) 또는 IMP2(NLSALGIFST)(서열번호 73) 펩티드를 인식하지 않는다(외인성 펩티드로서도, MOLT3에 의해 발현된 형질도입 단백질로부터도). VB6G4.24로부터 베타 TCR 쇄의 CDR3 서열은 도 2의 10개 모든 암 세포주에 대한 클론형 데이터에 나타났고, 이는 이러한 클론이 복수의 암 세포주에 반응하지만, IMP2 또는 BST2 펩티드의 인식에 의한 반응은 아닌 것을 시사한다.
도 12는 다른 다면적 T-세포의 펩티드 교차-반응성을 나타낸다. 클론 GD1 및 GD2는 클론 CR24와는 상이한 펩티드를 인식한다. (A) 상이한 공여체로부터 성장한 HLA A2-제한된 클론 GD1 및 GD2는 상이한 T-세포 수용체를 발현하지만, 제시된 바와 같이, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT) 및 MAGE C2로부터의 동일한 펩티드를 인식한다. 적색 아미노산 잔기만이 각각의 펩티드에 공통이다. 각 펩티드의 저하 농도를 사용하는 각 클론에 의한 밤새 활성화 검정. 상청액을 회수하고 MIP-1β ELISA에 사용했다. (B) 상이한 조직 기원의 암 세포주를 인식하기 위한 GD1의 예비 스크리닝. 밤새 활성화 검정 및 MIP-1β ELISA. (C) GD1의 우수한 표적으로서 (B)에서 동정된 세포주를 사용한 크롬 방출 세포독성. 4시간 및 밤새 인큐베이이션 후에 평가된 특이적 용해 퍼센트.
도 13은 다면적 암 특이적 T-세포 및 T-세포 수용체가 통상의 항암 T-세포와는 상이함을 나타낸다. (A) 종래, 항암 T-세포는, TCR이 A에 제시된 바와 같이 암 항원으로부터 유래하는 펩티드에 결합하는 경우, 암 세포를 인식한다. 이러한 T-세포는 다른 암-유래 펩티드에 반응하지 않는다. (B) 비정상적으로, 다면적 항암 T-세포는 복수의 상이한 암 펩티드를 인식하는 TCR을 갖는다. 암 세포 및 발생중의 종양이 다면적 T-세포로부터 탈출하는 것은 매우 곤란하다. 결과적으로, 다면적 TCR의 사용은 암 면역요법 접근법에서 바람직하다.
도 14는, 슈퍼-작용제 펩티드 MTSAIGILPV가 보다 많은 비율의 암-특이적 T-세포를 프라이밍하여 자가 암의 사멸을 증강시키는 것을 나타낸다. (A) 신장 세포암(RCC) 및 만성 림프구 백혈병(CLL) 환자의 CD8 T-세포는 프라이밍하지 않거나, 28일 동안 MTSAIGILPV 펩티드로 프라이밍시켰다. TAPI-0 검정(RCC 환자) 또는 사량체 염색(CLL 환자)는 MTSAIGILPV(서열번호 80) 특이적 T-세포의 존재를 입증했다. MTSAIGILPV(서열번호 80) 프라이밍된 CD8은 프라이밍되지 않은 T-세포보다 많은 자가 암 세포를 사멸시켰다. (B) 급성 골수성 백혈병(AML) 환자 및 2명의 CLL 환자로부터의 CD8 T-세포를 프라이밍하지 않거나, 28일 동안 야생형 IMP-2(NLSALGIFST)(서열번호 73) 또는 MTSAIGILPV(서열번호 80) 펩티드로 프라이밍시켰다. IMP-2 사량체로 수행한 분석은 프라이밍되지 않은 조건 및 IMP-2 프라이밍된 조건이 유사한 비율의 IMP-2 특이적 T-세포를 가졌고, MTSAIGILPV는 내성을 파괴하고 보다 높은 비율의 IMP-2 세포를 유도한 것으로 밝혀졌다. CLL 환자 3으로부터의 T-세포를 사멸 검정에 사용했고, MTSAIGILPV(서열번호 80) 프라이밍된 T-세포는 IMP-2 프라이밍된 CD8보다 많은 CLL 세포를 사멸시켰다.
도 15는 다면적 T 세포가 동일한 암 세포의 표면에서 상이한 암-특이적 항원으로부터 유래하는 복수의 상이한 펩티드를 어떻게 인식하는지를 나타낸다.
도 16은 다면적 T-세포가 상가적으로 및 저농도에서 펩티드를 인식하는 것을 나타낸다. 다면적 T-세포 클론 CR24는 BST2(LLLGIGILVL)(서열번호 72), 멜란 A(EAAGIGILTV)(서열번호 71) 및 IMP2(NLSALGIFST)(서열번호 73)의 펩티드를 인식했다. CR24는 10-6M에서 3개 모든 각 펩티드에 반응했지만, 펩티드가 10-8M로 존재하면 반응이 저하되었다. 그러나, CR24는, 각 펩티드가 펩티드 혼합물 내에 10-8M로 존재하는 경우, 우수한 활성화를 나타냈다. 이는, 동일한 세포에 의해 발현된 상이한 단백질로부터의 복수 펩티드를 인식함으로써 다면적 T-세포가 어느 암 세포를 고감도로 표적화하는지를 입증한다.
방법 및 재료
일반적 세포 배양 시약 및 세포주
2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신(RO로 지칭)을 갖는 RPMI-1640에 5%(R5) 또는 10%(R10) 태소 혈청을 보충했다. T-세포 배지는, 10mM HEPES 완충액, 0.5X 비-필수 아미노산, 1mM 나트륨 피루베이트, 20-200IU/mL의 IL-2(Aldesleukin, Proleukin, Prometheus, San Diego, CA, USA) 및 25ng/mL의 IL-15(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)를 첨가한 R10이었다. D10-F12 배지는, DMEM-F12를 사용하여 R10과 동일하게 제조했다. 달리 언급하지 않는 한, 조직 배양 시약은 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(Carlsband, CA, USA)로부터 입수했다. 세포주 C1R, T2 및 IM9를 R10 중의 현탁 세포로서 배양했다. 악성 흑색종 세포주 Mel-526, Mel-624, FM-2, FM-56, SK-MEL-37 및 A-375를 R10중의 부착 세포로서 배양했다. 흑색종 MM909.24 및 신장 세포암 RCC17는 CCIT로 처리된 환자로부터 수득하고, 각각 R10 및 D10-F12 중의 현탁 세포로서 배양했다. 다른 암 세포주는, ATCC; 유방 선암 MDA-MB-231(ATCC® HTB-26TM) 및 MCF-7(ATCC® HTB-22TM); 전립선 선암 LnCAP(ATCC® CRL-1740TM); 결장직장 선암 COLO 205(ATCC® CCL-222TM) 및 HCT116(ATCC® CCL-247TM); 폐 선암 H69(ATCC® HTB-119TM); 간장 간세포암 HepG2(ATCC® HB-8065TM); 자궁경부암 MS751(ATCC® HTB-34TM); 급성 림프구성 백혈병 MOLT3(ATCC® CRL-1552TM); 만성 골수성 백혈병 K562(ATCC® CRL-3344TM); 골수종/형질세포종 U266(ATCC® TIB-196TM), 골육종 U-2 OS(ATCC® HTB-96TM), Saos-2(ATCC® HTB-85TM) 및 TK143(ATCC® CRL-8303TM); HEK293T 배아 신장세포(ATCC® CRL-1573TM); 급성 단구성 백혈병 THP-1(ATCC® TIB-202TM); 및 신장암 A-498(ATCC® HTB-44TM)에 의해 기재된 바와 같이 유지했다.
흑색종 종양 침윤 림파구는 복수의 암 세포 유형을 인식한다
IV기의 전이성 흑색종 환자 MM909.24는, 코펜하겐, 헤르레브(Herlev) 병원의 암 면역요법 센터(Centre for Cancer Immunotherapy(CCIT))에서 급속 종양 침윤 요법을 받았다[1]. 현재까지, 이 환자는 지속적 관해를 경험하고 있다. 암 세포주: 자가 흑색종(MM909.24), MDA-MB-231, MCF-7, LnCAP 및 RCC17에 대한 반응성을 평가하기 위해 크롬 방출 세포독성 검정을 사용했다. 세포주(1×106 세포)를 30μCi의 나트륨 크로메이트(51Cr)(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 1시간 동안 표지하고, 1시간 침윤시킨 다음, 밤새 TIL로 배양했다. 10:1 TIL 대 표적 세포(웰당 2000 세포) 비율을 사용했다. 밤새 인큐베이션 후, 상청액을 회수하고, 섬광제와 혼합하고, 마이크로베타 계수기를 사용하여 판독하고, 특이적 용해를 계산했다[2]. TNF 처리 억제제-0(TAPI-O) 검정을 사용하여 추가로 암 세포주를 시험하고[3]; RO로 세척한 배양물로부터 TIL을 회수하고, R5 배지에서 밤새 정치시켰다. 활성화 검정의 일자에, 세포를 회수하여 계수하고, 100,000을 96 U 웰 플레이트의 웰 중의 30μM TAPI-O(Sigma-Aldrich) 항-TNF-PE-Vio770TM(클론 cA2, Miltenyi Biotech) 및 항-CD107a-PE(클론 H4A3, BD Biosciences) 항체와 인큐베이팅했다. 암 세포주를 첨가하여, 1:2의 TIL 대 표적 세포 비율을 수득했다. 상기 암 세포주 이외에, 하기를 또한 사용했다: COLO 205, H69, HepG2, MS751 및 Saos-2. 세포를 37℃에서 4 내지 5시간 동안 인큐베이팅한 다음, PBS를 사용하여 1:40으로 희석시킨 2㎕의 LIVE/DEAD 고정 사멸 세포 염색 ViVid(Life Technologies)로 RT에서 5분 동안 염색했다. 표면 마커를 검출하기 위한 항체는 세척 없이 각 샘플에 직접 첨가했다; 항-CD8-APC(클론 BW135/80, Miltenyi Biotech) 및 항-CD3-페리디닌 클로로필(PerCP)(클론 BW264/56, Miltenyi Biotech). 데이터는 BD FACS Canto II(BD Biosciences)로 취득하고, FlowJo 소프트웨어(TreeStar Inc., Ashland, OR, USA)로 분석했다. 활성화된 TIL(CD107a+ 및/또는 TNF+)는 BD FACS Aria(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분류하고, 전술한 바와 같이 T-세포 수용체(TCR)의 차세대 서열분석에 사용했다[4].
오르판 CD8 클론에 의해 인식된 펩티드를 동정하기 위한 전략
미지의 펩티드 특이성의 T-세포 클론(오르판 클론으로 지칭됨)은 T-세포 배지에서 96 U 웰 플레이트의 0.5 세포/웰을, 3개 공여체로부터의 50,000개 조사된(3000-3100cGy) 동종 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 1-2㎍/mL의 피토헤마글루티닌(PHA)과 함께 배양함으로써 생성했다. PBMC는 표준 밀도 구배 원심분리에 의해 혈액으로부터 분리했다. 필요한 경우, 염화암모늄 용액을 사용하여 적혈구 세포를 용해시켰다. 혈액은 웰쉬(Welsh) 혈액 서비스(Pontyclun, Wales, UK)로부터 "퍼피 코트(puffy coat)"로서 조달되었다. 모든 인간 조직은, UK 인간 조직법(Human Tissue Act) 2004에 준거하기 위해 카디프 대학의 가이드라인에 따라 수득 및 처리했다. T-세포 클론은 자가 흑색종(MM909.24) 및 일부 경우에 상이한 조직 기원의 암 세포주에 대하여 스크리닝했다. 상기한 바와 같이 PBMC 및 PHA 방법을 사용하여, T25 플라스크 내에서 목적 클론을 대량으로 성장시켰다. 조합 펩티드 라이브러리(CPL) 및 암 항원 데이터베이스 스크리닝을 실시하여, 오르판 클론에 의해 인식된 펩티드를 발견했다. 조합 펩티드 라이브러리를 합성하고, 이전에 기재된 바와 같이 사용했다[5,6]. 요약하면, 장기간 저장은, RO(R10과 동일, 그러나 혈청 없음)을 갖는 밀봉가능한(실리콘 밀봉 매트, AxyGen® AxyMatTM, Corning, New York, US) 2mL 깊은 원형 웰 플레이트(AxyGen®, Corning)에서 제조한 1mM 실행 희석액을 갖는 30mM DMSO 스톡으로서 -80℃로 존재했고, 이는 4℃에서 저장한 다음, 1300rpm에서 1분 동안 와동시키고(MixMate®, Eppendorf®, Hamburg, Germany), 이어서 사용 전에 원심분리했다(400g, 5mins). 각각의 서브-라이브러리는 총 펩티드 농도에 대하여 100μM의 농도로 사용했다. CPL 데이터는, 암에 의해 발현된 단백질의 아미노산 서열을 함유하는, 데이터베이스를 통해 실행했다(원고 준비중). 암 항원 데이터베이스는 와르윅(Warwick) 대학의 시스템 생물학 센터(Systems Biology Centre)(http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user_cases.php)에 의해 호스팅된 PI CPL(펩티드 동정 조합 펩티드 라이브러리) 웹도구의 일부로서 온라인에서 이용가능하다. 데이터베이스로부터의 후보 펩티드는 클론에 의해 인식될 가능성에 기초하여 자동적으로 랭크되었고, 상위 20은 펩티드 적정 검정에서 시험되었다.
CR24는 복수의 암 세포 유형을 인식한다
HLA A2+ 흑색종, MM909.24(자가), Mel-526, Mel-624, 및 HLA A2+ 비-흑색종, CIR-HLA A2, MDA-MB-231, Saos-2, U2OS, A498, TK143, HEK293T, COLO 205, HCT116, HeLa, HepG2 및 THP1을 상기 기재되어 있는 TAPI-O 검정에서 표적 세포로서 사용했다. HLA A2neg 흑색종 FM-2 및 FM-56, 및 야생형 C1R(HLA A2neg)을 대조군으로 사용했다.
조합 펩티드 라이브러리(CPL) 및 클론 CR24의 암 항원 데이터베이스 스크리닝
CR24를 RO에서 밤새 정치시킨 후, 30,000개를 십량체 CPL 스크린의 웰당 사용했다(상세는 상기 참조). CR24의 펩티드 길이 우선도는, 사이징 스캔 검정을 사용하여 확립했다[7](데이터는 제시하지 않음). T2 세포(웰당 60,000)를 항원 제시 세포로서 사용했다. 검정은 R5에서 수행하고, 상청액은 제조업자의 지시(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에 따라 MIP-1β 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 위해 수거했다.
CR24는 상이한 암 단백질로부터의 3개 HLA A2 제한 펩티드를 인식한다
CR24를 R5에서 밤새 배양한 후, 펩티드의 농도를 저하시키면서 96 U 웰 플레이트의 웰당 30,000개를 사용했다. 밤새 인큐베이션 후, 상청액을 제조업자의 지시(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에 따라 MIP-1β ELISA에 사용했다. 사량체 분석을 위해, CR24(샘플당 20,000-50,000)은 유세포분석에 적합한 5mL 폴리프로필렌 튜브에서 염색시켰다. 세포는 50nM Dasatinib(단백질 키나제 억제제)으로 30분 동안 37℃에서 100㎕의 FACS 완충액(PBS+2% FBS)에서 처리하고, 피코에리트린(PE) 접합된 사량체(0.5㎍)을 샘플에 직접 첨가한 다음, 추가로 30분 동안 아이스로 이동시켰다[8]. 사량체를 3mL의 FACS 완충액(700g, 5분)으로 세척한 다음, 아이스 상에서 추가로 20분 동안 0.5㎍(10㎍/mL)의 마우스 항-PE 비접합된 항체(클론 PE001, BioLegend, London, UK)로 표지했다[8]. CR24가 내인적으로 발현하는 항원을 인식할 수 있는지를 시험하기 위해, MOLT3 세포를 사용하여 다양한 단백질을 발현시켰다. 코돈 최적화된 전장 인간 HLA A2(IMGT/HLA Acc No: HLA00005), MLANA(Melan A)(UniProtKB Q16655), BST2(UniProtKB Q10589), IGF2BP2(IMP2)(UniProtKB Q9Y6M1), COL6A2(콜라겐 유형 VI의 α2 아단위)(UniProtKB P12110) 및 지카 바이러스(Rio-U1) ancC(GenBank KU926309.2) 유전자를 합성하고(Genewiz, South Plainfield, NJ, USA), 제3 세대 렌티바이러스 전달 벡터 pELNS(미국, 펜실베니아주, 펜실베이나 대학 제임스 릴리 박사가 친절하게 제공함)에 클로닝했다. pELNS 벡터는 자가-절단 2A 서열에 의해 목적 유전자로부터 분리된 랫트 CD2(rCD2) 마커를 함유한다. 렌티바이러스 입자 생산, 염화칼슘 형질감염 및 세포의 rCD2-기반 정제는 이전에 기재된 바와 같이 실시했다[9].
클론 CR24는 멜란 A 발현을 결여하는 자가 흑색종을 인식할 수 있다.
CR24가 복수의 항원을 통해 자가 흑색종을 표적화할 수 있음을 입증하기 위해, CRISPR/Cas9를 사용하여 멜란 A 발현을 제거하는 가이드 RNA를, cripsr.mit.edu 웹도구를 사용하여 설계하고, 적용하고, 멜란 A 유전자를 서열분석하여 파괴를 확인한다(데이터는 제시하지 않음). 멜란 A의 세포내 염색은, Cytofix/CytopermTM 시약을 제조업자의 지시(BD Biosciences)에 따라 사용하여 실시했다. 일차 비접합된 래빗 항-멜란 A 항체(클론 EP1422Y)(Abcam, Cambridge, UK)를 2차 PE 접합된 염소 항-래빗 항체와 함께 사용했다. 야생형 및 멜란 A KO MM909.24 흑색종은, 상기 기재된 바와 같이, TIL 및 CR24 둘 다로 TAPI-O를 사용했다.
CR24와 동일한 3개 펩티드를 인식하는 T-세포는 건강한 HLA 2A+ 공여체에 존재한다.
T-세포 펩티드 주를 생성하기 위해, CD8 마이크로비드를 제조업자의 지시(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)에 따라 사용하여, HLA A2+ 공여체의 PBMC로부터 CD8 T-세포를 정제했다. 정제된 CD8 세포(3×106)를, 2mL의 T-세포 배지 중의 24 웰 플레이트에서 자가 CD8neg 세포(6-8×106)와 공-인큐베이팅하지만, IL-15는 포함되어 있지 않았다. 25μM의 각 펩티드를 사용했다. 배양물은 배지의 50%를 주 3회 교환했다. 사량체 염색은 튜브당 500,000개 세포를 사용하여 상기한 바와 같이 실행했다. 각 T-세포주는, 세포주 MDA-MB-231, 흑색종 MM909.24 및 Saos-2를 사용하여 IFNγ 효소 결합 면역흡착 스폿(ELISpot) 검정에 사용했다. 50,000개 T-세포 및 15,000개 암 세포를 웰당 사용했다. 인큐베이션을 48시간 동안 수행하고, 제조업자의 지시(Mabtech, Nacka Strand, Sweden)에 따라 검정을 개발했다.
슈퍼-작용제 펩티드는 암 세포 인식을 개선하기 위해 다면적 T-세포를 프라이밍한다.
CR24의 CPL 검정은 상기 기재된 바와 같이 실시했다. 후보 펩티드 작용제는 CR24 및 온라인 알고리즘(http://wsbc.warwick.ac.uk/wsbcToolsWebpage/user_cases.php)을 사용하여 설계했다. 건강한 공여체로부터의 CD8 T-세포의 프라이밍, 사량체 염색 및 크롬 방출 세포독성 검정은 상기 기재된 바와 같이 실시했다.
다른 멜란 A 클론은 CR24에 의해 발견된 BST2 및 IMP2 펩티드를 인식하지 않는다.
TAPI-0 및 활성화 검정(ELISA)은 CR24에 대해 상기한 바와 같이 VB6G4.24, CR1 및 VB10에 대해 수행했다. 데이터는 표에 요약되어 있다.
암 항원 hTERT 및 MAGE C2로부터의 펩티드의 클론 인식
클론 GD1 및 GD2는, 상이한 HLA A2+ 건강한 공여체의 말초혈로부터 성장시켰다. 클론은, 각 펩티드의 농도를 감소시키면서 밤새 활성화 검정에 사용하고, 상청액을 상기 기재된 바와 같이 MIP-1β ELISA에 사용했다. 밤새 활성화는 GD1 및 표적 세포; K562, K562 HLA A2, CIR, CIR HLA A2, HEK 293T, MCF-7, COLO 205, U266, HCT116, Mel-526, Mel-624, SK-MEL-37, A375, IM9 및 LnCAP로 수행했다. 상청액을 회수하고, MIP-1β ELISA에 사용했다. 크롬 방출 세포독성 검정은, 상기한 바와 같이, 세포주 MCF-7, U266 및 Mel-624로 실시했다. T-세포 대 표적 세포 비율을 변경하여 4시간 및 밤새의 인큐베이션 시간을 사용했다.
결과
1. 성공적 면역요법을 받은 전이성 흑색종 환자로부터 유래하는 종양 침윤 림프구(TIL)은 광범위한 암: 유방, 결장, 폐, 간, 전립선, 자궁경부, 골 및 신장으로부터 유래하는 자가 흑색종 및 HLA A2+ 암 세포주를 사멸 및 인식할 수 있다(도 1).
2. 암 반응성 TIL의 T-세포 수용체 클론형은 동일한 T-세포가 복수의 HLA A2+ 암 세포주를 인식함을 나타냈다(도 2). 50%의 T-세포(TCR)은 4개 이상의 암 세포주를 인식했고, 8.6%(5 TCR)은 시험된 10개 모든 세포주를 인식했다. 범 암 세포주 인식의 이해를 목적으로 하는 추가의 실험은, 단일 T-세포가 상이한 암 단백질로부터 유래하는 복수의 펩티드를 인식할 수 있다는 발견을 제공했다.
3. TIL로부터 T-세포의 펩티드 특이성을 맵핑하기 위해, T-세포를 먼저 클로닝하고, 이어서 다양한 암 세포주에 대한 반응성에 대해 스크리닝했다. 클론 CR24는 유방, 골, 신장, 혈액, 결장, 자궁경부 및 간의 자가 흑색종 및 암 세포주에 대해 반응성을 나타냈다(도 4). 이 반응성은, HLA A2neg 흑색종 및 야생형 CIR 세포(HLA A2neg)가 인식되지 않았기 때문에, HLA A2를 통해 매개되었다.
4. CR24(도 5)의 조합 펩티드 라이브러리 및 암 항원 데이터베이스 스크리닝(도 3에 기재됨)은 CR24에 의해 발견될 것으로 예상되는 복수 펩티드를 나타냈고(데이터는 제시하지 않음), 이중의 3개는, 외인성 펩티드로 시험하는 경우에 인식된다(도 6). CR24는 또한 3개 펩티드를 함유하는 HLA A2 사량체로 염색했다(도 6). 펩티드; 멜란 A(잔기 26-35)의 EAAGIGILTV(서열번호 71), BST2(잔기 22-31)의 LLLGIGILVL(서열번호 72) 및 IMP2(잔기 367-376)의 IMPNLSALGIFST(서열번호 73). 이러한 데이터는 CR24가 상이한 암 단백질로부터 유래하는 상이한 펩티드에 대해 교차-반응성인 것을 입증한다.
5. CR24는 멜란 A, BST2 또는 IMP2를 안정하게 발현하도록 제조된 항원 제시 세포(MOLT3)을 인식할 수 있기 때문에, CR24에 의해 인식된 펩티드는 외인적으로 발현된 단백질로부터 처리 및 제시된다(도 6).
6. 탈출은, 모든 동족 펩티드의 제시를 저하 또는 제거하는 모든 표적의 동시 돌연변이를 필요로 하기 때문에, 암 세포가, 하나 이상의 상이한 암 항원을 통해 이들을 표적화하는 T-세포로부터 탈출하는 것은 매우 곤란하다. 이를 입증하기 위해, 본 발명자들은 멜란 A 유전자의 제거를 위해 자가 흑색종(MM909.24)을 표적화하고, 이는 항체 염색에 의해 멜란 A 단백질 발현을 결여하고 있는 것을 확인했다(멜란 A 녹아웃 (KO))(도 7). 환자 MM909.24의 TIL 및 클론 CR24 둘 다는 멜란 A 녹아웃 흑색종을 인식했다(도 7). CR24의 경우, 야생형 자가 종양에 대한 반응성은 71%이고, 멜란 A KO의 경우에는 55%였다. CR24가 BST2 및/또는 IMP2 펩티드를 통해 멜란 A KO 흑색종을 인식하기 때문에, 흑색종의 파괴를 매개할 가능성이 높다.
7. CR24에 의해 발견된 멜란 A, BST2 및 IMP2 펩티드를 인식할 수 있는 CD8 T-세포는 건강한 HLA A2+ 공여체의 말초혈로부터 생성할 수 있다(도 8).
8. 다면적 T-세포용으로 설계된 슈퍼-작용제는, WT 펩티드를 사용한 병행 프라이밍과 비교하여, WT 멜란 A(EAAGIGILTV)(서열번호 71), BST2(LLLGIGILVL)(서열번호 72) 및 IMP2(NLSALGIFST)(서열번호 73) 펩티드를 인식할 수 있는 CD8 T-세포의 보다 큰 비율을 프라이밍했다. 슈퍼-작용제 MTSAIGVLVP(서열번호 80)(펩티드 5)는, 프라이밍에서 후보 슈퍼-작용제 중에서 가장 효과적인 것 같고(도 9B), 시험된 모든 공여체(n=3)에서 멜란 A, BST2 및 IMP2 반응성 T-세포를 유발했다. 추가로, MTSAIGILPV(서열번호 80) 및 ITSAIGILPV(서열번호 77)는, WT EAAGIGILTV 펩티드(도 10A)와 비교하여 전이성 흑색종 환자의 멜란 AA(EAAGIGILTV) T-세포의 프라이밍에서 우수했고, MTSAIGILPV(서열번호 80)는 신장 세포암(RCC) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자(도 14A) 및 급성 골수성 백혈병(AML) 환자(도 14B)에서 우수했다. 중요하게는, MTSAIGILPV(서열번호 80) 슈퍼-작용제 펩티드 프라이밍된 T-세포는 WT 멜란 A 펩티드 프라이밍된 T-세포보다도 우수한 자가 흑색종 세포의 용해를 나타냈다(도 10B 및 10C).
9. 2명의 건강한 HLA A2+ 공여체의 말초혈로부터 성장한 클론(GD1 및 GD2)는 CR24에 의해 인식된 것들과는 상이한 펩티드와 교차-반응한다. 이러한 펩티드는 CR24 T-세포 클론에 의해 인식된 것들과는 상이한 단백질로부터 유래한다; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)(잔기 855-873)로부터의 RLVDDFLLV(서열번호 74) 및 흑색종 연관된 항원 C2(MAGE C2)(잔기 336-344)로부터의 ALKDVEERV(서열번호 75). GD1은 유방, 혈액 및 흑색종 암 세포주를 사멸시켰다(도 9).
결론
현재의 합의 관점은, 암-특이적 T-세포가 HLA와 관련하여 세포 표면에서 펩티드로서 제시된 단일 펩티드 항원을 통해 암 세포를 인식한다는 것이다(도 10A). 본 발명자들은, 일부 희귀 T-세포가 2개 이상의 아미노산에 의해 서열이 상이하고 상이한 암 항원으로부터 유래하는 복수의 펩티드 에피토프를 통해 암 세포를 인식할 수 있음을 발견했다(도 10B). 이러한 유형의 다면적 T-세포로부터의 암 탈출은 매우 곤란할 가능성이 있다.
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<210> 41
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<213> Homo sapiens
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Cys Ser Ala Thr Gly Leu Ala Gly Leu Gly Glu Gln Phe Phe
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Cys Ala Thr Ser Asp Leu Gly Thr Gly Val Gly Glu Gln Phe Phe
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Cys Ser Val Gly Pro Gly Ser Thr Gly Glu Leu Phe Phe
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Cys Ala Ser Ser Pro Thr Gly Glu Lys Leu Phe Phe
1 5 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Cys Ala Ser Ser Gln Glu Gly Gly Thr Trp Gly Asp Gly Tyr Thr Phe
1 5 10 15
<210> 46
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Cys Ala Thr Ser Asp Leu Leu Leu Ala Gly Gly Arg Ser Ser Tyr Asn
1 5 10 15
Glu Gln Phe Phe
20
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<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Cys Ala Ser Ser Glu Ala Ala Ser Gly Arg Pro Gln Thr Phe
1 5 10
<210> 48
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Cys Ala Thr Ser Asp Ala Thr Ala Gly Thr Ser Gly Ser Leu Tyr Glu
1 5 10 15
Gln Tyr Phe
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<213> Homo sapiens
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Cys Ala Ser Ser Leu Thr Gly Leu Gly Gln Pro Gln His Phe
1 5 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Cys Ala Ser Ser Pro Ala Val Leu Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Cys Ser Ala Arg Glu Ser Leu Ala Glu Thr Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10 15
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<211> 14
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Cys Ala Ser Ser Pro Gly Leu Thr Ala Asn Val Leu Thr Phe
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<213> Homo sapiens
<400> 53
Cys Ala Ser Ser Leu Gly Leu Ala Gly Asn Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Cys Ala Ser Ser Asn Gly Phe His Phe Asn Thr Gln Tyr Phe
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 56
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Cys Ala Thr Ser Asp Arg Gly Gln Gly Ala Asn Trp Asp Glu Gln Phe
1 5 10 15
Phe
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 62
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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1 5 10
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Ile Thr Ser Ala Ile Gly Val Leu Phe Val
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<213> Homo sapiens
<400> 86
Ala Leu Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala
1 5 10
Claims (14)
- 하기 서열을 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항암 펩티드:
MTSAIGILPV (서열번호 80)
ITSAIGILPV (서열번호 77)
ITSAIGVLPV (서열번호 76)
MTSAIGVLPV (서열번호 78)
QTSAIGVLPV (서열번호 79)
LTSAIGVLPV (서열번호 81)
ITSGIGVLPV (서열번호 82)
ITSAIGVLPI (서열번호 83)
QTSAIGILPV (서열번호 84)
ITSAIGVLFV (서열번호 85). - 제1항에 있어서, 상기 항암 펩티드가 MTSAIGILPV(서열번호 80) 또는 ITSAIGILPV(서열번호 77)인, 항암 펩티드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩티드가 제1항 또는 제2항의 상기 펩티드와 적어도 80% 또는 90% 동일성(identity)을 갖는, 항암 펩티드.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항암 펩티드가, HLA A, HLA A2 또는 HLA 24 또는 HLA A1 또는 HLA A3을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 인간 백혈구 항원(HLA) 부류(class) I 분자에 의해 제시되는, 항암 펩티드.
- 제4항에 있어서, 상기 분자가 HLA A2인, 항암 펩티드.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여되는 경우, 효과기 T-세포(effector T-cell)로서 작용하는 항암 T-세포, 및/또는 암 항원이 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 분자에 의해 세포 표면에서 동일한 암 세포에 의해 제시될 때에 복수의 암 항원을 인식하는 상기 TCR을 발현하는 T-세포의 생산을 프라이밍(priming)하고, 상기 항원이 서로 상이하고 상이한 유형의 암으로부터의 세포에 의해 제시되는, 항암 펩티드.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따르는 상기 항암 펩티드를 포함하는 백신.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따르는 상기 항암 펩티드 또는 제7항에 따르는 백신을 포함하는, 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체.
- 추가의 암 치료제와 조합하여, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항암 펩티드 또는 백신 또는 벡터 또는 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체 또는 백신을 포함하는, 암을 치료하기 위한 병용 치료제.
- 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한, 항암 펩티드, 또는 백신, 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체, 또는 병용 치료제.
- 암 치료용 의약의 제조 시의, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따르는 항암 펩티드, 또는 제7항의 백신, 또는 제8항에 따르는 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체, 또는 제9항에 따르는 병용 치료제의 용도.
- 암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따르는 항암 펩티드, 또는 제7항의 백신, 또는 제8항에 따르는 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체, 또는 제9항에 따르는 병용 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암(들)이 비인두암(nasopharyngeal cancer), 활막암(synovial cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 신장암(renal cancer), 결합 조직 암(cancer of connective tissues), 흑색종(melanoma), 폐암(lung cancer), 장암(bowel cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 뇌암(brain cancer), 인후암(throat cancer), 구강암(oral cancer), 간암(liver cancer), 골암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 융모암(choriocarcinoma), 위장종(gastrinoma), 갈색세포종(pheochromocytoma), 프롤락티노마(prolactinoma), T-세포 백혈병/림프종(T-cell leukemia/lymphoma), 혈액(blood), 편도선(tonsil), 비장(spleen), 신경종(neuroma), 폰 히펠-린다우 병(von Hippel-Lindau disease), 졸린저-엘리슨 증후군(Zollinger-Ellison syndrome), 부신암(adrenal cancer), 항문암(anal cancer), 담관암(bile duct cancer), 방광암(bladder cancer), 요관암(ureter cancer), 신경교종(glioma), 희소돌기교종(oligodendroglioma), 신경모세포종(neuroblastoma), 수막종(meningioma), 척수 종양(spinal cord tumour), 골암(bone cancer), 골암(osteochondroma), 골연골종(chondrosarcoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 원발 부위의 불명 암(cancer of unknown primary site), 카르시노이드(carcinoid), 위장관 카르시노이드(carcinoid of gastrointestinal tract), 섬유육종(fibrosarcoma), 유방암(breast cancer), 근육암(muscle cancer), 파제트병(Paget's disease), 자궁경부암(cervical cancer), 직장암(rectal cancer), 식도암(oesophagus cancer), 담낭암(gall bladder cancer), 담관암(cholangioma cancer), 두부암(head cancer), 안암(eye cancer), 비인두암(nasopharynx cancer), 목암(neck cancer), 신장암(kidney cancer), 윌름스 종양(Wilms' tumor), 간암(liver cancer), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 전립선암(prostate cancer), 정소암(testicular cancer), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 피부암(skin cancer), 중피종(mesothelioma), 골수종(myeloma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 난소암(ovarian), 내분비암(endocrine), 글루카곤종(glucagonoma), 부갑상선암(parathyroid cancer), 음경암(penis cancer), 뇌하수체암(pituitary cancer), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 소장암(small intestine cancer), 위암(stomach cancer), 흉선암(thymus cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 영양모세포암(trophoblastic cancer), 포상기태(hydatidiform mole), 자궁암(uterine cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 질암(vagina cancer), 외음부암(vulva cancer), 청신경종(acoustic neuroma), 균상식육종(mycosis fungoides), 인슐린종(insulinoma), 카르시노이드 증후군(carcinoid syndrome), 체세포스타틴종(somatostatinoma), 잇몸암(gum cancer), 심장암(heart cancer), 입술암(lip cancer), 수막암(meninges cancer), 구강암(mouth cancer), 신경암(nerve cancer), 구개암(palate cancer), 이하선암(parotid gland cancer), 복막암(peritoneum cancer), 인두암(pharynx cancer), 흉막암(pleural cancer), 타액선암(salivary gland cancer), 혀암(tongue cancer) 및 편도선암(tonsil cancer)을 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항암 펩티드, 백신, 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체, 병용 치료제, 또는 용도, 또는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 암이 피부암 또는 흑색종 또는 신장 세포암 또는 백혈병인, 항암 펩티드, 백신, 약제학적 조성물 또는 면역원성 제제 또는 이중특이적 항체, 방법, 또는 용도, 또는 병용 치료제.
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