EA045252B1 - Новый т-клеточный рецептор - Google Patents
Новый т-клеточный рецептор Download PDFInfo
- Publication number
- EA045252B1 EA045252B1 EA202091015 EA045252B1 EA 045252 B1 EA045252 B1 EA 045252B1 EA 202091015 EA202091015 EA 202091015 EA 045252 B1 EA045252 B1 EA 045252B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- tcr
- cell
- cancer
- clone
- Prior art date
Links
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 title claims description 130
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 title claims description 125
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 191
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 103
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 87
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 31
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 29
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 101000866855 Homo sapiens Major histocompatibility complex class I-related gene protein Proteins 0.000 description 143
- 102100031328 Major histocompatibility complex class I-related gene protein Human genes 0.000 description 143
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 76
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 52
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 24
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 23
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 16
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 16
- DDBCPKAHJKOGKK-UHFFFAOYSA-N N(2)-acetyl-6-formylpterin Chemical compound O=CC1=CN=C2NC(NC(=O)C)=NC(=O)C2=N1 DDBCPKAHJKOGKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 102220471943 Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1_K43A_mutation Human genes 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 9
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 9
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 8
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 8
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 8
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 6
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 5
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 5
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 5
- LXKLTDXEFFOBPT-CEKOQDAHSA-N 5-(2-oxopropylideneamino)-6-D-ribitylaminouracil Chemical compound CC(=O)\C=N\C1=C(NC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO)NC(=O)NC1=O LXKLTDXEFFOBPT-CEKOQDAHSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 4
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 4
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- POVNCJSPYFCWJR-USZUGGBUSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-[(2s)-2-[[2-[(2s)-2-[[(2s)-1-[[(2s,3r)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-methylpropyl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1- Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 POVNCJSPYFCWJR-USZUGGBUSA-N 0.000 description 3
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 3
- 101100125371 Caenorhabditis elegans cil-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 3
- 101150082764 MR1 gene Proteins 0.000 description 3
- -1 Miltenyi Biotec) Proteins 0.000 description 3
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 3
- 102100021043 Regulatory factor X-associated protein Human genes 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000005880 cancer cell killing Effects 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101000705592 Cucumis melo Phytoene synthase, chloroplastic Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021044 DNA-binding protein RFXANK Human genes 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 101001075464 Homo sapiens DNA-binding protein RFXANK Proteins 0.000 description 2
- 101001075466 Homo sapiens Regulatory factor X-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 101000645329 Homo sapiens T cell receptor alpha joining 31 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000013968 STAT6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010011005 STAT6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100026276 T cell receptor alpha joining 31 Human genes 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 229940127174 UCHT1 Drugs 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000000215 ciliated epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 208000030381 cutaneous melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 239000003909 protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 2
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 2
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000003708 skin melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- CRCPLBFLOSEABN-BEVDRBHNSA-N (2r)-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-amino-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-naphthalen-2-yl-1-oxopropan-2-yl]-n'-hydroxy-2-(2-methylpropyl)butanediamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(=O)NO)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(N)=O)=CC=C21 CRCPLBFLOSEABN-BEVDRBHNSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101100156338 Caenorhabditis elegans vit-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000016216 Choristoma Diseases 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N Chromium-51 Chemical compound [51Cr] VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 1
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000756759 Homo sapiens MHC class II regulatory factor RFX1 Proteins 0.000 description 1
- 101000772138 Homo sapiens T cell receptor alpha variable 1-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 239000002067 L01XE06 - Dasatinib Substances 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102100022819 MHC class II regulatory factor RFX1 Human genes 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000005945 Regulatory Factor X1 Human genes 0.000 description 1
- 108010030933 Regulatory Factor X1 Proteins 0.000 description 1
- 101710189356 Regulatory factor X-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 229940126530 T cell activator Drugs 0.000 description 1
- 230000037453 T cell priming Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102100029308 T cell receptor alpha variable 1-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000033383 cell-cell recognition Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011181 container closure integrity test Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 229960002448 dasatinib Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000009258 post-therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000012418 validation experiment Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к новому Т-клеточному рецептору (TCR), в частности, по крайней мере одному из его определяющих комплементарность участков (CDR); Т-клетке, экспрессирующей указанный TCR; клону, экспрессирующему указанный TCR; вектору, кодирующему указанный TCR; растворимому варианту указанного TCR; фармацевтической композиции, или иммуногенному агенту, или биспецифическому средству, или вакцине, содержащей указанный TCR, указанную клетку, указанный клон или указанный вектор; применению указанного TCR, или указанной клетки, или указанного клона, или указанного вектора, или указанной фармацевтической композиции, или иммуногенного агента, или биспецифического средства, или вакцины для лечения рака; и способу лечения рака с использованием указанного TCR, указанной клетки, указанного клона, указанного вектора, указанной фармацевтической композиции, иммуногенного агента, биспецифического средства или вакцины, содержащей указанный TCR.
Предпосылки создания изобретения
Авторы настоящего изобретения открыли новый класс Т-клеток, эффективный для лечения рака, который распознает раковые клетки через родственный главному комплексу гистосовместимости, инвариантный в популяции белок (MR)1. Идентификация этой новой Т-клетки произошла в результате экспериментов по поиску Т-клеток, распознающих раковые клетки без необходимости в специфическом антигене лейкоцитов человека (HLA). Локус HLA сильно варьирует, и сегодня было описано более 17000 различных аллелей. Поэтому любой терапевтический подход, который работает через HLA, может быть эффективен только у меньшинства пациентов. Напротив, вся популяция людей экспрессирует MR1.
Известный основной тип рестриктированных по MR1 Т-клеток называется ассоциированными со слизистой оболочкой, инвариантными Т-клетками (MAIT). Известно, что MAIT распознают промежуточные продукты биосинтеза рибофлавина микобактериями. Недавние исследования, проведенные авторами настоящего изобретения и другими лабораториями, показали, что существуют также другие типы MR1-рестриктированных Т-клеток, которые распознают отличные лиганды, связанные с MR1. Представленный здесь труд показывает, что новый класс Т-клеток обладает специфичностью к мишени через MR1, но TCR не связывается с MR1 как таковым или с MR1, нагруженным известными инфекционными лигандами, скорее эта Т-клетка распознает специфический для рака лиганд в связывающем желобке MR1; MR1 представляет собой специфический для рака или активируемый на этапе экспрессии раком лиганд для TCR.
Новый клон Т-клеток, MC.7.G5, был открыт авторами настоящего изобретения во время скрининга Т-клеток от здорового донора, у которого HLA не соответствовал линии клеток альвеолярного эпителия базальной мембраны аденокарциномы, А549 (номер в АТСС® - CCL-185 для информации). Экспериментальный подход включал инкубацию Т-клеток с клетками А549, затем выделение и клонирование Тклеток, которые пролиферировали в ответ на клетки А549. Дальнейшие исследования показали, что Тклеточный клон MC.7.G5 был способен распознавать и уничтожать раковые клетки, а сверх того, раковые клетки из ряда органов и типов тканей, таким образом показывая, что клон потенциально способен к лечению большинства типов рака.
Как известно и показано на фиг. 12, TCR представляет собой связанный дисульфидными связями, закрепленный в мембране гетеродимерный белок, обычно состоящий из сильно вариабельных альфа (α) и бета (β) цепей, которые связываются с инвариантными молекулами CD3-цепи с образованием полностью функционирующего TCR. Т-клетки, экспрессирующие этот рецептор, называют α:β (или αβ) Тклетками.
α- и β-цепи состоят из экстраклеточных доменов, содержащих константную (С) область и вариабельную (V) область. Константная область является проксимальной к клеточной мембране, за ней следуют трансмембранная область и короткий цитоплазматический хвост, в то время как вариабельная область связывается с лигандом. Лиганд для большинства αβ Т-клеток представляет собой пептид, связанный с молекулой МНС.
Каждый вариабельный домен и α-цепи, и β-цепи TCR имеет три вариабельных участка, называемых определяющими комплементарность участками (CDR). Существует также дополнительная область вариабельности β-цепи (HV4), которая обычно не связывается с антигеном и поэтому не считается CDR. Как правило, антигенсвязывающий сайт образован петлями CDR α-цепи и β-цепи TCR. CDR1a и CDR2a кодируются отдельными генами Vα, тогда как CDR1β и CDR2β кодируются отдельными генами Vβ. CDR3 α-цепи TCR является гипервариабельным из-за возможности добавления и удаления нуклеотидов вокруг места соединения V-области и соединительной области (J-области). CDR3 β-цепи TCR обладает еще большей способностью к вариации, поскольку он также может включать ген разнообразия (D).
CDR3 является основным CDR, ответственным за распознавание процессированного антигена, хотя было также установлено, что CDR1 альфа-цепи взаимодействует с N-концевой частью антигенного пептида, а CDR1 β-цепи взаимодействует с С-концевой частью пептида.
В 2015 г. приблизительно 90,5 млн человек страдали раком. Приблизительно 14,1 млн новых случаев происходят в год (не считая рака кожи, кроме меланомы). Он приводит к приблизительно 8,8 млн
- 1 045252 смертей (15,7%) людей. Самыми распространенными типами рака у мужчин являются рак легкого, рак предстательной железы, колоректальный рак и рак желудка. У женщин самыми распространенными типами рака являются рак молочной железы, колоректальный рак, рак легкого и рак шейки матки. Если бы рак кожи, кроме меланомы, был включен в общее число новых случаев заболевания раком в год, он бы составил приблизительно 40% случаев. У детей самыми распространенными являются острый лимфобластный лейкоз и опухоли головного мозга, за исключением Африки, где неходжкинская лимфома встречается чаще. В 2012 г. у приблизительно 165000 детей в возрасте до 15 лет был диагностирован рак. Риск рака значительно возрастает с возрастом, и многие раки встречаются чаще в развитых странах. Частоты растут по мере того, как все больше людей доживают до старости, и по мере возникновения изменений образа жизни в развивающихся странах. По состоянию на 2010 г. финансовые затраты на лечение рака были оценены в 1,16 триллиона долларов США в год. Из этого следует, что существует потребность в более эффективных и безопасных способах лечения или искоренения этого заболевания. Иммунотерапия, при которой используют природные защитные системы организма для уничтожения аберрантных тканей, признана более безопасной, чем меры химического воздействия, но для эффективности иммунотерапия должна быть специфической для рака. Кроме того, открытие иммунотерапии, которая является эффективной против любого типа рака, было бы чрезвычайно полезным, поскольку она не только могла бы назначаться индивидуумам, страдающим множеством различных типов рака (т.е. она могла бы применяться для всей популяции), но также могла бы назначаться одному индивидууму, страдающему более чем одним типом рака. Кроме того, идентификация иммунотерапии, которая не была бы рестриктированной по МНС, также была бы чрезвычайно полезной, поскольку это означает, что она могла бы назначаться любому индивидууму независимо от МНС-типа ткани.
Т-клетки, которые идентифицированы здесь авторами настоящего изобретения, обладают вышеуказанными преимущественными характеристиками, поскольку они эффективны против любого типа рака, и они не рестриктированы по МНС, а значит, применимы для всей популяции из-за повсеместной экспрессии молекулы рестрикции MR1.
Заявления об изобретении
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предоставляется опухолеспецифический Т-клеточный рецептор (TCR), характеризующийся определяющим комплементарность участком, включающим или состоящим из (CDR) CAYRSAVNARLMF (SEQ ID NO:1) и/или CASSEARGLAEFTDTQYF (SEQ ID NO: 2).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный CDR включает или состоит из (CDR) CAYRSAVNARLMF (SEQ ID NO: 1) и/или CASSEARGLAEFTDTQYF (SEQ ID NO: 2) или CDR, который идентичен ему на по крайней мере 88%, например 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.
Описанные здесь CDR представляют собой CDR3 указанного TCR и, следовательно, являются основными CDR, ответственными за распознавание процессированного антигена или лиганда. Другие CDR (CDR1-альфа, CDR2-альфа, CDR1-бета и CDR2-бета) кодируются зародышевой линией. Следовательно, настоящее изобретение, кроме того, касается TCR, также включающего один или более из этих других CDR, т.е. CDR1-альфа, CDR2-альфа, CDRl-бета или CDR2-бета.
Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления указанный TCR включает или состоит из одного или более, включая любую комбинацию, следующих определяющих комплементарность участков:
TSESDYY (CDR1a) SEQ ID NO: 3
ATEN (CDR2a) SEQ ID NO: 4
MGHDK (CDR1e) SEQ ID NO: 5
SYGVNS (CDR2e) SEQ ID NO: 6
Ссылка здесь на опухолеспецифический TCR относится к TCR, который специфически распознает опухолевую клетку или лиганд опухолевой клетки, в связи с MR1, и активируется тем же, но не активируется неопухолевой клеткой или лигандом неопухолевой клетки, в связи с MR1.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный TCR представляет собой αβ TCR, имеющий a-цепь и β-цепь, и указанный CDR указанной a-цепи включает или состоит из CDR: CAYRSAVNARLMF (SEQ ID NO: 1) или CDR, который идентичен ему на по крайней мере 88%, например 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%; а указанный CDR указанной βцепи включает или состоит из CASSEARGLAEFTDTQYF (SEQ ID NO: 2) или CDR, который идентичен ему на по крайней мере 88%, например 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Соответственно, указанный TCR может содержать один или оба из вышеупомянутых CDR, а в предпочтительном варианте осуществления содержит оба из указанных CDR.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанный TCR является необычным в том смысле, что он не рестриктирован по МНС, точнее он связывается с опухолеспецифическим лигандом в связи с MR1, альтернативной МНС-подобной молекулой. До сих пор считалось, что MR1рестриктированные αβ Т-клетки были исключительно ассоциированными со слизистой оболочкой инва
- 2 045252 риантными Т-клетками (MAIT-клетками), однако здесь авторы настоящего изобретения демонстрируют, что существует еще один класс MR1-рестриктированных Т-клеток, которые не экспрессируют α-цепь TCR MAIT; более того, преимущественно эти Т-клетки и их TCR являются опухолеспецифическими (т.е. реагируют на опухолевые клетки, но не на неопухолевые клетки), но, что удивительно, способны идентифицировать любую опухоль независимо от происхождения или типа ткани, а значит, обладают возможность лечить любой рак. Кроме того, тот факт, что эти Т-клетки и их TCR не рестриктированы по МНС, означает, что они обладают возможность лечить всю популяцию, а значит, представляют собой чрезвычайно важную новую противораковую терапию.
В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная αцепь TCR включает или состоит из:
AQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNA TENRFSVNFOKAAKSFSLKISDSOLGDAAMYFCAYRSAVNARLMFGDGTQLVVKPNIO NPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSA VAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS (SEQ Ш ΝΟ:7) или последовательности, которая идентична ей на по крайней мере 88%, например 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.
В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная βцепь TCR включает или состоит из:
EADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSOTMGHDKMYWYOQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKG DLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSOYLCASSEARGLAEFTDTOYFGPGTRLTVLED LKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQ PLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQI VSAEAWGRAD (SEQ ID NO:8) или последовательности, которая идентична ей на по крайней мере 88%, например 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.
В вышеприведенных абзацах жирный и подчеркнутый текст представляет собой CDR.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный TCR содержит указанную выше α-цепь TCR и указанную выше β-цепь TCR.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанный TCR представляет собой растворимый TCR или sTCR, а значит в нем отсутствуют трансмембранный домен и, в идеале, также внутриклеточный домен.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный TCR является частью химерного рецептора, обладающего описанной здесь функциональностью.
В соответствии с дальнейшим аспектом настоящего изобретения предоставляется Т-клетка, экспрессирующая указанный TCR по настоящему изобретению, в идеале, в растворимой или мембранносочетаемой форме, т.е. имеющий трансмембранную область и внутриклеточную область.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предоставляется клон Т-клеток, экспрессирующий указанный TCR по настоящему изобретению, в идеале, или в растворимой, или мембранно-сочетаемой форме, т.е. имеющий трансмембранную область и внутриклеточную область. Предпочтительно, когда указанный клон представляет собой клон MC.7.G5, описанный здесь.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предоставляется вектор, кодирующий указанный TCR по настоящему изобретению.
В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящего изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, или иммуногенный агент, или биспецифическое средство, или вакцина, содержащая указанный TCR или клетку, или клон, или вектор.
В предпочтительном варианте осуществления указанную фармацевтическую композицию, или иммуногенный агент, или биспецифическое средство используют для лечения любого рака, но в идеале колоректального рака, рака легкого, почки, предстательной железы, мочевого пузыря, шейки матки, меланомы (рака кожи), рака кости, молочной железы, яичника или крови.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается применение указанного TCR, или клетки, или клона, или вектора для лечения рака.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предоставляется способ лечения рака, включающий введение указанного TCR или клетки, или клона, или вектора индивидууму, подлежащему лечению.
В идеале указанный рак относится к любому типу, но в особенности к колоректальному раку, раку легкого, почки, предстательной железы, мочевого пузыря, шейки матки, меланоме (раку кожи), раку кости, молочной железы, яичника или крови.
В предпочтительном способе по настоящему изобретению указанный TCR, клетку, клон или вектор вводят в комбинации с противоопухолевым средством, таким как, но без ограничения этим, биспецифическое средство.
Ссылка здесь на биспецифическое средство является ссылкой на биспецифическое моноклональное антитело (BsMAb, BsAb), которое представляет собой искусственный белок, который может одновре- 3 045252 менно связываться с двумя различными типами антигена.
Тем не менее, альтернативно, указанный TCR может образовывать часть биспецифического средства, причем указанное биспецифическое средство включает указанный TCR, с целью связывания с его лигандом на раковой клетке, а также активирующий иммунную клетку компонент или лиганд, который связывает и таким образом активирует иммунную клетку, такую как Т-киллер.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается применение указанного TCR, или клетки, или клона, или вектора для производства лекарственного средства для лечения рака.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предоставляется комбинированное терапевтическое средство для лечения рака, включающее:
a) указанный TCR, или клетку, или клон или вектор в комбинации с
b) дополнительным противораковым терапевтическим средством.
В формуле изобретения, которая следует, и в предшествующем описании настоящего изобретения, за исключением случаев, когда контекст требует иного вследствие языка представления или необходимого значения, слово содержат (включает) или такие варианты, как содержит или содержащий, используется в смысле включения, т.е. для указания наличия заявленных признаков, а не для исключения наличия или добавления дополнительных признаков в различных вариантах осуществления настоящего изобретения.
Все ссылки, включая любой патент или заявку на патент, приведенные в этом описании, тем самым включены посредством ссылки. Не допускается, что какая-либо ссылка представляет собой известный уровень техники. Кроме того, не допускается, что какой-либо из предшествующего уровня техники является частью общих знаний в данной области техники.
Предпочтительные признаки каждого аспекта настоящего изобретения могут быть такими, как описано в связи с любым из других аспектов.
Другие признаки настоящего изобретения станут очевидными из следующих примеров. Вообще говоря, настоящее изобретение распространяется на любой новый признак или любую новую комбинацию признаков, раскрытых в этом описании (включая прилагаемую формулу изобретения и чертежи). Таким образом, следует понимать, что признаки, целые числа, характеристики, соединения или химические компоненты, описанные в связи с конкретным аспектом, вариантом осуществления или примером настоящего изобретения, применимы к любому другому аспекту, варианту осуществления или примеру, описанному здесь, если они не являются несовместимыми с ним.
Кроме того, если не указано иное, любой раскрытый здесь признак может быть заменен альтернативным признаком, служащим той же или аналогичной цели.
Во всем описании и формуле этого изобретения единственное число охватывает множественное число, если контекст не требует иного. В частности, когда используется неопределенный артикль, описание следует понимать как предполагающее множественность, а также единственность, если контекст не требует иного.
Вариант осуществления настоящего изобретения теперь будет описан только в качестве примера со ссылкой на следующее, где фиг. 1 показывает, каким образом был выделен MC.7.G5, и его начальную характеристику. А. Тклетки метили красителем CFSE и инкубировали в течение 2 недель с А549. Снижение флуоресценции CFSE представляло те Т-клетки, которые пролиферировали, что позволило выделить реагирующие на А549 Т-клетки. В. Реактивности MC.7.G5 на клетки А549, на основе высвобождении TNFa, не препятствовали блокирующие антителами против МНС класса I или II. Супернатанты от анализов собирали для анализа с помощью TNFa-специфического ELISA. С. Панель фенотипирования с помощью антител клона MC.7.G5 показала, что он представляет собой γδ- αβ+ CD8+ (с повтором на фиг. 16А).
На фиг. 2 показано, что MC.7.G5 не реагирует на нормальные (не раковые) клетки. В эксперименте сравнивается высвобождение TNFa из клона MC.7.G5 в ответ на линию клеток меланомы ММ909.24 (рак-мишень для MC.7.G5) и четыре первичные (неопухолевые, неиммортализованные) линии клеток. SMC3 является линий гладкомышечных клеток; CIL-1 представляет собой реснитчатую эпителиальную клетку, MCR5 представляет собой линию клеток фибробластов, трансдуцированных hTERT; Hep2 является линией клеток гепатоцитов (линии нормальных клеток также протестированы на фиг. 15 и 17).
На фиг. 3 показана последовательность α- и β-цепей TCR MC.7.G5.
На фиг. 4 показано, что клон MC.7.G5 реагирует на широкий ряд опухолей-мишеней. Супернатанты собирали из анализа активации Т-клеток, показывающего ответную реакцию MC.7.G5 на ряд опухолей, и исследовали на продукцию TNFa и MIP1e.
В. Анализ высвобождения хрома, показывающий специфическое уничтожение раковых клеток при указанных соотношениях Т-клеток и раковых клеток.
А & В выполнялись в двух повторах с планками погрешностей.
На фиг. 5 продемонстрировано введение вставок/делеций в гены при подходе к функциональному скринингу всего генома с использованием системы CRISPR, использованном для идентификации MR1 в качестве лиганда клона MC.7.G5. Данные скрининга полученной с использованием CRISPR библиотеки
- 4 045252 клона MC.7.G5 показаны на фиг. 13.
На фиг. 6 показано, что клон MC.7.G5 демонстрирует специфичность к мишени с помощью MR1. А. Антитело против MR1 препятствовало распознаванию клеток А549. Продукция TNFa и MIP1e в соответствии ELISA. В. MC.7.G5 распознавал нокауты MR1 (с помощью технологии CRISPR/Cas9) в А549с9 и меланоме ММ909.24с4. С. Не было специфического уничтожения нокаутированных по MR1 клеток А549с9 или линии первичных клеток MRC5. Также показано уничтожение MM909.24wt и A549wt. D. Сверхэкспрессия MR1 в этой линии клеток в результате трансдукции лентивирусом слегка усиливает распознавание. Линия LCL pt146 не распознается клоном MC.7.G5, даже когда она была трансдуцирована для сверхэкспрессии MR1. Часть этого MR1 представлена на поверхности клетки и может быть обнаружена с помощью антитела против MR1 (справа).
На фиг. 7 показано, что клон MC.7.G5 не окрашивается тетрамерными формами лиганда для MAIT MR1-5-(2-оксопропилиденамино)-6-d-рибитиламиноурацилом (MR1-5-OP-RU) или MR1-ацетил-6формилптерином (Ac-6-FP). В параллельных экспериментах клон MAIT хорошо окрашивался тетрамером MR1-5-OP-RU. Существует также небольшая популяция клеток, которые окрашиваются MR1-5-OPRU, в популяции РВМС. Ожидается, что в образцах РВМС будут обнаруживаемые MAIT-клетки. Этот результат показывает, что TCR MC.7.G5 не связывается с MR1 как таковым или с MR1, нагруженным известными инфекционными лигандами, и выдвигает в качестве предположения, что эта Т-клетка распознает специфический для рака лиганд в связывающем желобке MR1. Эксперименты с повторным окрашиванием тетрамером представлены на фиг. 14Е, включая эксперименты с пустым тетрамером MR1).
Фиг. 8 показывает, что Ac-6-FP и обусловленная М. smeg инфекция ослабляет распознаванием клоном MC.7.G5, несмотря на усиление экспрессии MR1 на поверхности клетки. Инкубация клеток А549 или ММ909.24 с 50 мкг/мл Ac-6-FP в течение 12 часов увеличивает экспрессию MR1 на поверхности, но ослабляет распознаванием клоном MC.7.G5. Эффекты инфекции, обусловленной M.smeg, еще более драматичны и существенно уменьшают ответную реакцию клона MC.7.G5, действуя в качестве мощного активатора клона MAIT. Повторные эксперименты с М. smeg и Ac-6-FP представлены на фиг. 14F & G.
Фиг. 9 показывает, что трансдукция поликлональных Т-клеток с использованием TCR MC.7.G5 (как показано на фиг. 2) обеспечивает распознавание опухоли. Дальнейшие эксперименты с TCR MC.7.G5 и Т-клетками пациента представлены на фиг. 15.
Фиг. 10 представляет собой схему, показывающую, что TCR клона MC.7.G5 распознает только раковые клетки. Распознавание требует MR1 и ингибируется известными нераковыми лигандами MR1, что позволяет предположить, что MR1 представляет специфический для рака или активируемый на этапе экспрессии раком лиганд для TCR МС.7.О5;
Фиг. 11 представляет собой схему, показывающую, что известные лиганды MR1 ингибируют распознавание раковых клеток с помощью TCR MC.7.G5;
Фиг. 12 демонстрирует структуру мРНК и белка Т-клеточного рецептора. Структуры мРНК (наверху) показывают, что для каждой цепи CDR1 и CDR2 кодируются в зародышевой линии. CDR3 является продуктом множественности J-сегментов в соединениях V-J цепи α-цепи Т-клеточного рецептора (TCR) и соединениях V-D-J в β-цепи TCR. Следовательно, CDR3 является гипервариабельным. Цветная маркировка, принятая для петель CDR, сохраняется на протяжении всей фигуры. Области, окрашенные серым цветом, представляют константные и вариабельные домены TCR (не включая гипервариабельные петли CDR). На нижней панели показано ожидаемое свертывание белка. TCR принимают аналогичные третичные структуры, которые располагают петли определяющих комплементарность участков (CDR) на дистальном от мембраны конце молекул. Вместе шесть петель CDR образуют антигенсвязывающий сайт.
Фиг. 13. Скрининг охватывающей весь геном библиотеки CRISPR-Cas9 выявляет MR1 в качестве кандидата-мишени для MC.7.G5. (А) Обзор подхода, использованного для выявления лиганда MC.7.G5. Охватывающие весь геном MC.7.G5 GeCKO v2 библиотеки CRISPR-Cas9 (А и В) использовали в виде лентивируса для трансдукции линии клеток-мишеней HEK293T. MC.7.G5 лизировали HEK293T, экспрессирующие sgRNA, нацеленные на гены, которые не имеют отношения к распознаванию HEK293T, тем самым обогащая sgRNA, нацеленные на гены, которые необходимы для лизиса раковых клеток с помощью MC.7.G5. Были проведены два цикла селекции с использованием MC.7.G5, и подвергнутые селекции библиотеки сравнили с не подвергнутыми селекции HEK293T (без MC.7.G5) для выявления обогащенных sgRNA. (В) Распознавание с помощью MC.7.G5 отобранной библиотеки HEK293T после селекции значительно ослаблено по сравнению с HEK293T дикого типа, что позволяет предположить, что основные гены были удалены с помощью подхода к функциональному скринингу всего генома с использованием системы CRISPR/Cas9. Активация в течение ночи и TNF-специфический ELISA. (С) MR1 был идентифицирован как один из основных генов для распознавания с помощью MC.7.G5 HEK293T. Анализ MAGeCK и выделенные (окрашенные) гены, sgRNA для которых были обогащены в>2 sgRNA в отобранных клетках HEK293T. Валидация MR1 в качестве мишени для MC.7.G5 представлены на фиг. 14.
Фиг. 14. Валидация и исследование распознавания MR1 с помощью MC.7.G5. (A-D) MR1 является экспрессируемой раковыми клетками мишенью MC.7.G5. (А) Распознавание меланомы ММ909.24 было
- 5 045252 ослаблено в присутствии блокирующего MR1 антитела. Антитела против MHCI и II использовали в качестве отрицательного контроля. Активация в течение ночи и TNF-специфический ELISA. (В) Устранение экспрессии MR1 из линий раковых клеток предотвращало опосредованное MC.7.G5 распознавание и уничтожение. Клетки меланомы ММ909.24 и аденокарциномы легкого А549 трансдуцировали sgRNA для нокаута (-/-) гена MR1 с помощью CRIPSRCas9. Активация в течение ночи и TNF-специфический ELISA. Анализ цитотоксичности на основе высвобождения хрома в течение 6 ч (ММ909.24) или 18 ч (А549). (С) Сверхэкспрессия (+) MR1 увеличивала уничтожение раковых клеток с помощью MC.7.G5. Линии раковых клеток dR и HeLa, которые, как было показано, вызывают относительно низкую активацию MC.7.G5, были трансдуцированы лентивирусом для стабильной сверхэкспрессии MR1. Меланома ММ909.24 была включена в качестве положительного контроля. Анализ цитотоксичности на основе высвобождения хрома проводили в течение 6 ч. (D) Экспрессия MR1 в MR1-/- клетках восстанавливает активацию MC.7.G5. Клетки А549 дикого типа, MR1-/- и MR1-/- с трансгеном MR1 (+) использовали в анализе активации в течение ночи с MC.7.G5. TNF-специфический ELISA. (E&F) MC.7.G5 не распознает MR1 с помощью известных механизмов: (Е) клон MC.7.G5, канонический MAIT клон (распознает MR1 со связанным 5-OP-RU) и MHCI-рестриктированный клон (MEL5/13, HLAA2-рестриктированный, распознающий пептид из Melan A: ELAGIGILTV) использовали для окрашивания следующими тетрамерами: пустым тетрамером MR1 (с мутацией К43А для обеспечения возможности рефолдинга в отсутствие лиганда MR1), тетрамерами MR1 5-OP-RU и MHCI (HLA A2 ELAGIGILTV). MHCIрестриктированный клон использовали в качестве положительного контроля для нерелевантного тетрамера MHCI. (F) A549, нагруженные MAIT-активирующей бактерией Mycobacterium smegmatis, уменьшали распознавание А549 с помощью MC.7.G5. Канонический MAIT клон из Е использовали в качестве положительного контроля. А549 MR1-/- использовали в качестве отрицательного контроля для обоих клонов. Окрашивание на CD107а на поверхности и внутриклеточный TNF. Дискриминационное окно устанавливалось только на клон. (G) Экзогенный Ac-6-FP, известная MR1-связывающαя молекула, ослаблял распознавание с помощью MC.7.G5 меланомы ММ909.24. Псевдообработанные WT и обработанные Ac-6-FP MR1-/- мишени использовали в качестве контролей. Левая панель: окрашивание на внутриклеточный CD107a, TNF и IFNy в случае тройной позитивностью анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo. Планки погрешностей меньше, чем графические символы, представляющие два эксперимента. Правая панель: экспрессия MR1 в обработанных Ac-6-FP клетках-мишенях.
Фиг. 15. Перенос Т-клеточного рецептора MC.7.G5 перенаправляет Т-клетки пациента на уничтожение аутологичной меланомы. (А) Т-клетки от пациентов с метастатической меланомой (ММ909.11 и ММ909.24), трансдуцированные Т-клеточным рецептором MC.7.G5, распознавали аутологичные и неаутологичные меланомы. Нетрансдуцированные Т-клетки использовали в качестве отрицательного контроля. Окрашивание на CD107а на поверхности и внутриклеточный TNF после активации в течение 4 ч. (В) Т-клетки от пациента ММ909.11, трансдуцированные TCR MC.7.G5, уничтожали аутологичные и неаутологичные меланомы, но не здоровые клетки. Анализ цитотоксичности на основе высвобождения хрома с использованием нетрансдуцированных (-) и трансдуцированных TCR MC.7.G5 (+) Т-клеток от пациента ММ909.11 в сравнении с аутологичной меланомой, меланомой от пациента ММ909.24 (дикий тип и нокаут MR1 (-/-)) и здоровыми клеточными линиями: SMC3 (гладкомышечных клеток); CIL-1 (клеток реснитчатого эпителий; и Нер2 (гепатоцитов). Выполняли в соотношении Т-клеток и клеток-мишеней, составляющем 5:1, в течение 6 и 18 ч.
Фиг. 16. (А) Фенотипирование с помощью проточной цитометрии MC.7.G5. (В) Геномная последовательность локуса MR1 меланомы ММ909.24 с индуцированной с помощью CRISPR-Cas9 двуаллельной делецией в экзоне 2 MR1. (С) Экспрессию MR1 в клетках-мишенях, использованных на фиг. 14A-D, оценивали с помощью антитела против MR1. (D) Окрашивание на rCD2 Т-клеток от пациентов с меланомой ММ909.11 и ММ909.24 с и без трансдуцированного TCR MC.7.G5.
Фиг. 17. Уничтожение с помощью MC.7.G5 ряда линий раковых клеток (ось х) различного происхождения (разъяснение) после совместной инкубации в течение 48 часов (длительный анализ уничтожения) (А). Показано, что MC.7.G5 был способен уничтожать 95-99,9% каждой клеточной линии, дополняя тем самым данные сравнительно более коротких анализов уничтожения, представленных на фиг. 4. Инкубировали в соотношении Т-клеток и клеток-мишеней, составляющем 5:1, и степень уничтожения определяли путем подсчета шариков или контрольных клеток, меченных CFSE. (В) MC.7.G5 не уничтожал нормальные клетки при совместной инкубации в течение 7 дней. Соотношение Т-клеток и клетокмишеней составляло 5:1, и подсчет шариков использовали для определения количества оставшихся клеток-мишеней. SMC3 (гладкомышечные клетки), Нер2 (гепатоциты) и MRC5 (фибробласты кожи). Меланому ММ909.11 использовали в качестве положительного контроля. С представлением в виде количества клеток-мишеней (здоровых или меланомы) на 1000 счетных шариков ± MC.7.G5. (С) MC.7.G5 точно уничтожал меланому ММ909.24. Инкубировали в течение 7 дней, и контрольные клетки, меченные CFSE, использовали для установления степени уничтожения. В этом же анализе нормальная клеточная линия Нер2 не подвергалась уничтожению.
На фиг. 18 показано, что сверхэкспрессия MR1 с мутацией К43А (пустого) в клетках CIR не при- 6 045252 водила к активации M.7.G5 (А), несмотря на высокую степень окрашивания CIR-K43A антителом MR1 (В). Напротив, сверхэкспрессия MR1 дикого типа в CIR вызывала активацию MC.7.G5. Это дополнительно демонстрирует, что TCR MC.7.G5 распознает MR1 со связанным грузом, и подкрепляет данные на фиг. 14Е, показывающие отсутствие окрашивания MC.7.G5 пустым тетрамером MR1 с К43А.
Подробное описание Методы и материалы Получение и характеристика Т-клеточного клона MC.7.G5
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) из крови здорового донора очищали с помощью стандартного разделения в градиенте плотности, а затем стимулировали с использованием линии клеток альвеолярного эпителия базальной мембраны аденокарциномы человека, А549 (номер в АТСС® CCL-185 для условий культивирования и справочной информации). Для отслеживания пролиферации Тклеток в ответ на А549, РВМС метили красителем для клеток сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE, Molecular Probes, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). PBMC тщательно промывали в PBS, затем инкубировали при 37°С в течение 10 мин в темноте с 1 мкл CFSE, с последующим гашением избыточным количеством фетальной бычьей сыворотки. РВМС, меченные CFSE, культивировали отдельно или с А549 в 24-луночных планшетах для культивирования тканей с плотностью 6-8x106 РВМС и 0,1-0,2x106 А549 в среде для примирования Т-клеток (Theaker et al., 2016). Культуральные среды меняли (50% по объему) три раза в неделю, и клетки инкубировали в общей сложности в течение 2 недель. Для оценки степени пролиферации в ответ на А549, клетки собирали из культуры, промывали в PBS и метили красителем для жизнеспособных клеток Vivid (в разведении 1:40 в PBS, затем 2 мкл на пятно в 50 мкл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин перед добавлением антитела против CD3 (BW264/56, Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Германия) в течение еще 20 мин на льду. Путем установки дискриминационного окна осуществляли сортировку клеток на лимфоциты (прямое рассеяние на фоне бокового рассеяния), одиночные (прямое рассеяние на фоне бокового рассеяния) и Vivid CD3+ клетки, а для анализа двумерных графиков представляли как антитело против CD3 в функции CFSE. Клетки CFSE™3™ уровень (подвергшиеся пролиферации Т-клетки) сортировали с использованием BD FACS Aria (Central Biotechnology Services, Cardiff University, Великобритания) для клонирования методом предельных разведений, как описано ранее (Theaker et al., 2016). Перед выполнением анализов активации, MC.7.G5 собирали, промывали и инкубировали в течение 24 ч в среде с пониженным содержанием сыворотки, как описано ранее (Wooldridge et al., 2012). Впоследствии MC.7G.5 (30000 на лунку планшета с 96 U-образными лунками) инкубировали с А549 (60000 на лунку), которые либо оставляли немечеными, либо метили с использованием 10 мкг/мл антител против МНС класса I W6/32, BioLegend, San Diego, СА) или против МНС класса II (Tu39, BioLegend) в течение 1 ч. Без промывки MC.7G.5 добавляли в лунки до конечного объема 100 мкл, при этом этот клон также инкубировали отдельно или с 10 мкг/мл фитогемаглюттинина (РНА). После инкубации в течение ночи супернатанты собирали и анализировали с использованием TNFa-специфического ELISA (R&D Research, Minneapolis, MN). MC.7.G5 окрашивали антителами для обнаружения экспрессии на поверхности CD3 (Miltenyi Biotec), CD8 (BW135/80, Miltenyi Biotec), CD4 (M-T466, Miltenyi Biotec), γδ TCR (11F2, Miltenyi Biotec) и αβ TCR (BW242/412, Miltenyi Biotec). Для окрашивания клон собирали из культуры, промывали PBS и метили красителем для жизнеспособных клеток Vivid при комнатной температуре (RT), а затем каждым из антител отдельно в течение 20 мин на льду. Сбор данных выполняли на Becton Dickinson FACS Canto II, и данные анализировались с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star). Сортировку путем установки дискриминационного окна на размер клеток (дискриминационного окна на лимфоциты), vivid- клетки, а затем представляющий интерес маркер клеточной поверхности представляли в виде гистограммы.
МС.7. G5 не реагирует на нормальные клетки
Клетки от здоровых индивидуумов и запатентованную для них культуральную среду получали от Sciencell (Carlsbad, CA) и использовали в качестве клеток-мишеней в анализах активации и цитотоксичности, описанных здесь в другом месте в разделе Материалы и методы. SMC3 (гладкомышечные клетки ободочной кишки человека), CIL-1 (клетки непигментированного цилиарного эпителия человека) и Нер2 (гепатоциты человека) все использовали в количестве 60000 клеток на лунку планшета с 96 Uобразными лунками. Кроме того, MRC-5 (фибробласты легких, номер в АТСС® - CCL-171), который экспрессирует hTERT для задержки старении, также использовался в тех же анализах.
Последовательность α- и β-цепей TCR МС. 7.G5
РНК экстрагировали, используя набор RNEasy Micro (Qiagen). кДНК синтезировали, используя набор 5'/3' SMARTer (Clontech, Paris, Франция) в соответствии с инструкциями производителя. В подходе с использованием SMARTer использовалась обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (MMLV), 3' олиго-dT праймер и 5' олигонуклеотид для получения кДНК-матриц, которые были фланкированы известной универсальной якорной последовательностью. Затем проводили ПЦР, используя одну пару праймеров. Обратный праймер, специфичный для константной области TCR-β, (Ce-R1, 5'GAGaCcCtCaGGcGgCTGCTC-3', SEQ ID NO: 9, Eurofins Genomics, Ebersberg, Германия) и специфи- 7 045252 ческий для якоря прямой праймер (Clontech) использовали в следующей ПЦР-реакции: 2,5 мкл_ кДНКматрицы, 0,25 мкл высокоточной Taq полимеразы Phusion, 10 мкл 5Х буфера Phusion, 0,5 мкл DMSO (все от Thermo Fisher Scientific), 1 мкл dNTP (50 мМ каждый, Life Technologies), 1 мкл каждого праймера (10 мкл) и не содержащая нуклеаз вода до конечного объема реакции, равного 50 мкл. Впоследствии, 2,5 мкл продуктов первой ПЦР брали для проведения вложенной ПЦР, как описано выше, с использованием пары вложенных праймеров (Cp-R2, 5'-TGTGTGGCCAGGCACACCAGTGTG-3, SEQ ID NO: 10, Eurofins Genomics и специфичного для якоря праймера от Clontech). Для обеих ПЦР-реакций условия циклирования были следующими: 94°С в течение 5 мин, 30 циклов, каждый состоящий из 94°С в течение 30 с, 63°С в течение 30 с, 72°С в течение 90 с и, наконец, 72°С в течение 10 мин. Конечные продукты ПЦР вносили на 1% агарозный гель и очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAEX II (Qiagen). Очищенные продукты клонировали в Zero-Blunt ТОРО и трансформировали в химически компетентные клетки E.coli One Shot для стандартного секвенирования (оба от Life Technologies).
Клон MC.7.G5 реагирует на широкий ряд опухолей-мишеней
Анализы активации выполняли, как описано выше, а анализы на цитотоксичность, используя либо меченные хроматом натрия (Хром51) клетки-мишени (Ekeruche-Makinde et al., 2012), либо длительный анализ уничтожения на основе проточной цитометрии (смотрите в другом месте в разделе Материалы и методы). Для анализов высвобождения хрома каждую линию клеток метили 30 мкКи Cr51 (Perkin Elmer, Waltham, MA) на 1x106 клеток, и 2000 клеток-мишеней использовали на лунку (планшетов с Uобразными лунками) с MC.7.G5 для достижения желаемых соотношений Т-клеток и клеток-мишеней. После инкубации в течение ночи супернатанты собирали, смешивали со сцинтиллятором и считывали, используя счетчик Microbeta, и специфический лизис рассчитывали, как описано ранее (EkerucheMakinde et al., 2012). В дополнение к А549 и HEK293T, приведенным выше, особенностями используемых линий раковых клеток является следующее: название клеточной линии (номер в АТСС® или номер в ЕСАСС для справочной информации и информации о культуре)/ткань или орган происхождения: HEK293T (эмбриональная почка, CRL-1573); LnCaP (CRL-1740)/предстательная железа; SiHa (НТВ-35) и HeLa (CCL-2)/шейка матки; MCF7 (НТВ-22), MDA-MB-231 (CRM-HTB-26) и T47D (НТВ-133)/молочная железа; TK143 (CRL-8303) и U20S (НТВ-96)/кость; НСТ-116 (CCL-247)/ободочнαя кишка; Jurkat (TIB152), Т2 (0,174хСЕМ.Т2) (CRL-1992), K562 (CCL-243), CIR, экспрессирующая HLA-A2 (CRL-1193), ТНР-1 (TIB-202), U266 (JIB-196) и Molts (CRL-1552)/все кровь; FM74 (ЕСАСС 13012422), SK-Mel-28 (HTB-72) и FM45 (ЕСАСС 13012410)/все меланомы кожи. RC177 (почки, почечно-клеточная карцинома), ММ909.11, ММ909.15 и ММ909.24 (все меланомы кожи) были получены от пациентов с раком, получавших лечение в Center for Cancer Immune Therapy (CCIT, Herlev Hospital, Copenhagen, Дания).
Клоны Т-клеток
HLA-А*0201-рестриктированный клон MEL5/13, распознающий пептиды EAAGIGILTV и ELAGIGILTV (гетероклитик L в положении 2) из Melan A (Woodridge et al. (2010); Lissina et al. (2009)) и канонический MAIT клон культивировали, как описано ранее (Tungatt et al. (2014)).
Введения вставок/делеций в гены с помощью CRISPR по всему геному
Был использован подход к созданию охватывающей весь геном библиотеки CRISPR/Cas9 (фиг. 5 и 14 для обзора, а также описанный недавно (Patel et al., 2017)). HEK293Т с целенаправленным нокаутом по всему геному, используя суббиблиотеки А и В GeCKO v2 (плазмиду Adgene, № 1000000048, депонированной Dr. Feng Zhang), использовали для селекции с помощью MC.7G.5. Вкратце, успешно трансдуцированные HEK293Т (MOI 0,4), отобранные с использованием пуромицина, инкубировали вместе с MC.7G.5 в предопределенном соотношении, составляющим 1:1, в течение 2-3 недель в 96-луночных плоскодонных планшетах. Геномную ДНК из HEK293Т, которые выдерживали два цикла селекции с использованием MC.7G.5, использовали для секвенирования следующего поколения для выявления вставленных направляющих РНК и, следовательно, генов, которые становились мишенями для удаления.
Клон MC.7.G5 демонстрирует специфичность к мишени через MR1
Используя тот же подход, что и выше, для блокирующих МНС антител также проводили анализ активации с использованием антитела против MR1, фиг. 6 и фиг. 14 (клон 26.5, BioLegend). MC.7.G5 использовали в анализе активации с клетками А549 и ММ909.24, на которые была направлена технология CRISPR/Cas9, чтобы устранить экспрессию гена MR1, как описано ранее (Laugel et al., 2016). Линии клеток использовали в анализах активации и высвобождения хрома, как указано выше. Полноразмерный ген MR1, оптимизированный в отношении частоты использования кодонов, конструировали в виде лентивирусных частиц и трансдуцировали в клетки-мишени, используя аналогичные методы (в данном случае один ген, а не CD2 крысы), описанные ниже для TCR MC.7G.5, для создания линий сверхэкспрессирующих (с высоким уровнем экспрессии) MR1 клеток. Экспрессию MR1 оценивали с использованием 10 мкг/мл антитела против MR1 (как указано выше) и 50000 клеток на пятно в 50 мкл PBS с 2% FBS. Нокаут MR1 в ММ909.24 был достигнут, как описано выше для А549 (6). Анализы активации выполняли, как описано выше, с линиями клеток: ММ909.24 wt, MM909.24 MRU, MM909.24 мR1Высокии уровень, pt146 wt (линия В-лимфобластоидных клеток), pt146 MR1’/_ и pt146 mr^1™™ уровень.
Клон MC.7.G5 не окрашивается тетрамерными формами лиганда для MAIT MR1-5-OP-RU или
- 8 045252
MR1-Ac-6-FP.
MC.7.G5 собирали из культуры, промывали PBS+2% FBS, затем обрабатывали 50 нМ ингибитора протеинкиназы (PKI), Дазатинибом (Lissina et al., 2009), затем метили РЕ-конъюгированными тетрамерами, собранными с использованием MR1, подвергнутым рефолдингу вместе с либо Ac-6-FP, либо 5-OPRU, фиг. 6 и 14. Окрашенные тетрамером клетки метили неконъюгированным антителом против РЕ, как описано ранее (Tungatt et al., 2015), а затем Vivid и антителом против CD8. Реагирующий с MR1-5-OPRU клон MAIT окрашивали таким же образом, чтобы он служил в качестве положительного контроля. Клетки сортировали по размеру путем установки дискриминационного окна, затем Vivid CD8+ и представляли в виде гистограмм флуоресценции тетрамера с получением и анализом данных, как описано выше.
Ac-6-FP и обусловленная М. smeg инфекция ослабляет распознавание клоном MC.7.G5, несмотря на усиление экспрессии MR1 на поверхности клеток.
MC.7.G5 использовали в анализе активации с использованием клеток-мишеней (ММ909.24 и А549), которые были предварительно инкубированы с 50 мкг/мл (фиг. 8) и 1, 10 или 100 мкг/мл (фиг. 14) Ac6FP. Кроме того, также использовались клетки А549, нагруженные М. smeg. Клетки-мишени, которые оставляли без обработки/без загрузки, использовали в качестве отрицательных контролей, фиг. 8 и 14. А549 инкубировали с М. smeg при MOI, составляющей 100:1 для соотношения М. smeg и А549, в течение 2 ч в среде без антибиотиков, с последующим промыванием клеток в колбе для культивирования, а затем культивированием в течение 2 ч в R10. MC.7.G5 и MAIT клон инкубировали в течение 4-5 ч в присутствии ингибитора процессинга TNF (TAPI)-0 (30 мкМ) и антитела против CD107a (H4A3, BD), затем окрашивали антителом против TNF (cA2, Miltenyi Biotec), антителом против CD3, антителом против CD8 и Vivid. Сортировали путем установки дискриминационного окна на размер, одиночные, Vivid- CD3+ клетки, затем CD8+ на фоне CD107а или TNFa с получением и анализом данных, как описано выше. Каждую из клеток-мишеней также окрашивали антителом против MR1 после инкубации с Ac-6FP или M. smeg в концентрации 10 мкг/мл используя 50000 клеток на пятно в 50 мкл в PBS с 2% FBS.
Трансдукция поликлональных Т-клеток с использованием TCR MC.7.G5 (как показано на фиг. 2) обеспечивает распознавание опухоли.
Оптимизированные в отношении частоты использования кодонов, полноразмерные цепи TCR, разделенные саморасщепляющейся последовательностью 2А, были синтезированы (Genewiz) и клонированы в лентивирусный вектор для переноса 3-го поколения pELNS (любезно предоставлен Dr. James Riley, University of Pennsylvania, PA). Вектор содержит маркерный ген CD2 крысы (rCD2), отделенный от TCR другой саморасщепляющейся последовательностью 2А. Лентивирусные частицы получали путем трансфекции с использованием хлорида кальция клеток HEK293T. Векторы для переноса TCR котрансфицировали вместе с плазмидами для упаковки и оболочки pMD2.G, pRSV-Rev и pMDLg/pRRE. Лентивирусные частицы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования перед трансдукцией CD8+ Тклеток с использованием 5 мкг/мл полибрена, при этом CD8+ Т-клетки от здоровых доноров (фиг. 9) или пациентов с меланомой (фиг. 15) очищали с помощью магнитного отделения (Miltenyi Biotec) за 24 ч и активировали в течение ночи шариками с CD3/CD28 (Dynabeads, Life Technologies) в соотношении шариков и Т-клеток, составляющем 3:1. Т-клетки, которые захватили вирус, отбирали путем обогащения с использованием РЕ-конъюгированного антитела против rCD2 (OX-34, BioLegend), а затем магнитных шариков против РЕ (Miltenyi Biotec). Через 14 дней после трансдукции Т-клетки размножали с использованием аллогенных фидерных клеток. Для всех функциональных экспериментов Т-клетки, трансдуцированные TCR MC.7.G5, были позитивными по rCD2 на >95% и использованы для функционального анализа (фиг. 16). Трансдуцированные клетки инкубировали с клетками-мишенями в течение 4-5 ч в присутствии 30 мМ антитела против CD107a TAPI-0 и затем окрашивали антителами против TNFa, CD3, CD8, а также Vivid. Сортировали путем установки дискриминационного окна на размер, одиночные, vivid- CD3+ клетки, затем CD8+ против CD107а или TNFa. Сбор данных и анализ, как указано выше. Трансдуцированные TCR Т-клетки от пациентов также использовали для анализа цитотоксичности на основе высвобождения хрома (фиг. 15), как описано выше.
Проточная цитометрия
Клетки окрашивали фиксируемым фиолетовым красителем Live/Dead™ (Life Technologies) и антителами против следующих поверхностных структур: pan-αβ TCR с РЕ (клон IP26, Biolegend), pan-γδ TCR-FITC (клон REA591, Miltenyi Biotec), CD3 с PerCP (клон UCHT1, Biolegend), CD4-APC (клон VIT4, Miltenyi Biotec), CD8 с РЕ (клон BW135/80, Miltenyi Biotec), крысиного CD2 сРЕ (клон ОХ-34, Biolegend) и MR1 с РЕ (клон 26.5, Biolegend). Для окрашивания конъюгированными с РЕ антителами против MR1 использовали Fc Block (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя. Для окрашивания тетрамерами мономеры MR1 были предоставлены Jamie Rossjohn (Monash University), а мономеры рМНС получали собственными силами. Тетрамеры собирали и использовали для оптимизированного окрашивания, как описано ранее (Tungatt et al (2014)). Данные получали на BD FACS Canto II (BD Biosciences) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar).
- 9 045252
Нокаут MRl-нокаут и экспрессия трансгена
Лентивирус, кодирующий одноцепочечную направляющую РНК (sgRNA) для MR1 и CRISPR/Cas9, получали и использовали, как описано ранее (Laugel et al. (2016)). Трансген MR1 клонировали в основу лентивирусного вектора pRRL.sin.cppt.pgk-gfp.wpre второго поколения, разработанную в лаборатории Didier Trono (Addgene № 12252), лишенную промотора PGK человека и кДНК для GFP, и лентивирусные частицы получали, как описано для sgRNA для MR1 (Laugel et al. (2016)). Клетки-мишени подвергали трансфекции при центрифугировании в присутствии 8 мкг/мл полибрена, 500xg в течение 2 ч при 37°С (Shalem et al. (2014)). Позитивные по конъюгированному с РЕ антителу против MR1 (клону 26.2, Biolegend) клетки обогащали магнитным способом, используя магнитные шарики против РЕ, в соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi Biotec).
Секвенирование TCR и трансдукция с его использованием
TCR MC.7.G5 секвенировали собственными силами, используя набор SMARTer RACE (Clontech) и двухстадийную полимеразную цепную реакцию с использованием универсальных прямых праймеров и обратных праймеров, специфичных для константных областей TCR-α и TCR-β. Затем TCR синтезировали с оптимизацией в отношении частоты использования кодонов (Genewiz), при этом полноразмерные цепи TCR были разделены саморасщепляющейся последовательностью 2А (Ryan et al 1991). TCR клонировали в лентивирусный вектор pELNS третьего поколения (любезно предоставленный James Riley, University of Pennsylvania), который содержит rCD2, отделенный от TCR второй саморасщепляющейся последовательностью 2А. Лентивирусные частицы получали путем трансфекции с использованием хлорида кальция клеток HEK293T и концентрировали путем ультрацентрифугирования. РВМС после терапии получали от пациентов ММ909.1 и ММ909.24, и CD8 и CD4 Т-клеток очищали путем магнитного обогащения (Miltenyi Biotec). Впоследствии Т-клетки активировали путем инкубации в течение ночи с шариками с CD3/CD28 (Dynabeads; Life Technologies) при соотношении шариков и Т-клеток, составляющем 3:1. Затем Т-клетки трансдуцировали с использованием TCR MC.7.G5 в присутствии 5 мкг/мл полибрена (Santa Cruz Biotechnology). В соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi Biotec) Т-клетки, которые поглотили вирус, обогащали магнитным способом с использованием магнитных шариков с антителами против rCD2 и РЕ. Через 14 дней после трансдукции Т-клетки размножали, как описано ранее (Tungatt et al (2014)). Для всех функциональных экспериментов трансдуцированные Т-клетки были на >85% rCD2+ (фиг. 16D).
Скрининг GeCKOv.2 no всему геному
Получали лентивирусные частицы для библиотеки GeCKOv.2 (плазмида была любезно предоставлена Feng Zhang (Sanjana et al (2014)) (Addgene плазмида # 1000000048)). Библиотека GeCKOv.2 состоит из 12341 одиночных направляющих РНК (sgRNA), нацеленных на 19050 кодирующих белки генов (6 sgRNA на ген), и 1864 микроРНК (4 sgRNA на микроРНК) и использовалась в виде лентивируса для трансдукции линии клеток-мишени НЕК293Т. 4х107 клеток НЕК-293Т трансдуцировали с MOI=0,4 для обеспечения 100-кратного перекрытия каждой библиотеки. Клетки, которые поглотили лентивирус, отбирали с помощью пуромицина. Через 14 дней половину библиотеки замораживали в качестве контроля. MC.7.G5 добавляли к остальным трансдуцированным клеткам НЕК-293Т в соотношении Т-клеток и НЕК293Т, составляющем 0,25:1, в среде с 20 ME IL-2. Через 14 дней MC.7.G5 снова добавляли в соотношении 0,5:1. Через 7 дней клетки НЕК293Т использовали для секвенирования. Геномную ДНК из 3х107 клеток НЕК-293Т (контрольных без отбора и отобранных с использованием MC.7.G5) выделяли (с использованием набора GenElute Mammalian Genom DNA Miniprep Kit, Sigma Aldrich). Всю выделенную геномную ДНК (2,5 мкг на 50 мкл реакции) использовали для последующей ПНР, чтобы обеспечить полное представление библиотек. Двустадийную ПЦР проводили, как описано ранее (Shalem et al. (2014)), используя очищенные с помощью HPLC праймеры и NEBNext High Fidelity PCR MasterMix (New England BioLabs). Продукты ПЦР размером <300 п.н. впоследствии выделяли из агарозного геля и секвенировали на приборе HiSeq (Iliumina) с 80 циклами считывания 1 (для определения последовательности sgRNA) и 8 циклами считывания 2 (для идентификации специфического для образца баркода). Анализ обогащенных направляющих проводили с использованием анализа MAGeCK (Li et al. (2014)).
Длительный анализ уничтожения
Для анализов уничтожения на основе проточной цитометрии 5000-10000 раковых или нормальных клеточных линий помещали в планшеты с 96 U-образными лунками, и добавляли клон MC.7.G5, чтобы получить пять Т-клеток на каждую клетку-мишень (экспериментальные лунки). Клетки сокультивировали в 200 мкл среды для клеток-мишеней с добавлением 20 ME IL-2 и 25 нг/мл IL-15. Клетки-мишени (контрольные лунки), MC.7.G5 и CSFE-меченные CIR также культивировали отдельно для способствования анализу. Клетки инкубировали в течение 48 ч. Для анализа чувствительности количество MC.7.G5 титровали относительно клеток-мишеней и инкубировали в течение 7 дней. В дополнение к клеточным линиям, описанным в другом месте в разделе Материалы и методы, также использовалась линия клеток рака яичника А2780 (ЕСАСС 931 12519). Перед сбором в каждую лунку добавляли 0,1х106 меченных CFSE (0,1 мкМ) клеток CIR, чтобы можно было определить количество клеток-мишеней, оставшихся в экспериментальной и контрольной лунках. Клетки трижды промывали охлажденным D-PBS с добавле
- 10 045252 нием 2 мМ EDTA, затем окрашивали в аналитических планшетах с использованием фиксируемого фиолетового красителя Live/Dead™ (Life Technologies), затем антител против CD3 с PerCP (клон UCHT1, BioLegend) и/или против TCR с АРС TRBV25.1 (TRBV11 в соответствии с номенклатурой Arden: каталожный номер А66905, Beckman Coulter), чтобы сделать возможным путем установки дискриминационного окна отделение мертвых клеток и Т-клеток, оставляя жизнеспособные клетки-мишени для анализа. Процент уничтожения рассчитывался, используя следующее уравнение: % уничтожения=100 - ((экспериментальные события с клетками-мишенями + экспериментальные события с шариками или CFSEмеченными клетками CIR) + (контрольные события с клетками-мишенями + контрольные события с шариками или CFSE-меченными клетками CIR)x100).
Анализы активации с использованием клеток CIR, экспрессирующих пустой (K43A) MR1
Клетки CIR трансдуцировали MR1 с мутацией К43А (R. Reantragoon et al.), как в случае MR1 дикого типа. Анализы активации и проточную цитометрию проводили, как описано в другом месте в разделе Материалы и методы.
Результаты Характеристика клона
1. Т-клеточный клон MC.7.G5 распознает клетки А549 (фиг. 1А). Добавление 10 мкг/мл блокирующих MHC-I и МНС-II антител не препятствовало распознаванию (фиг. 1В).
2. Окрашивание антителами и проточная цитометрия подтвердили, что клон MC.7.G5 экспрессирует αβ TCR и является CD8+ (фиг. 1С и с повтором на фиг. 16А).
3. Важно, что Т-клеточный клон MC.7.G5 не реагирует на нормальные (не раковые) клеточные линии (фиг. 2 и фиг. 17В и С). Когда TCR MC.7.G5 экспрессировали в первичных CD8 Т-клетках, он не опосредовал уничтожение нормальных клеток (фиг. 15В). Клон MC.7.G5 не реагировал ни на самого себя, ни на свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (не показано). Т-клеточный клон MC.7G.5 был выделен от нормального здорового донора, у которого он не наносил видимых повреждений. Авторы настоящего изобретения делают заключение, что Т-клеточный клон MC.7G.5 является опухолеспецифическим.
4. Т-клеточный клон MC.7.G5 экспрессирует TCR, образуемый из TRAV38.2/DV8 TRAJ31 и TRBV25.1 TRBJ2.3 последовательности, показанной на фиг. 3. MR1-рестриктированный клон MC.7.G5 не является MAIT, и он не экспрессирует α-цепь TCR MAIT.
5. Т-клеточный клон MC.7.G5 образует MTP1e (фиг. 4А) и TNFa (фиг. 4А) в ответ на широкий ряд линий раковых клеток. MC.7.G5 также обладает высокой цитотоксичностью по отношению ко многим раковым клеткам (фиг. 4В и 17А) даже при очень низких соотношениях эффектора и мишени (фиг. 4В и 17С). MC.7G.5 распознал все типы протестированных раков: рака крови, кости, меланому (кожи), рак ободочной кишки, почки, легкого, шейки матки, молочной железы, яичника и предстательной железы. Кроме того, эта цитотоксичность была эффективной и чувствительной: данные длительного (48часового) анализа уничтожения показали составляющее >95% уничтожение линий раковых клеток (фиг. 17А) и при низком соотношении Т-клеток и клеток-мишеней (фиг. 17С).
6. Охватывающие весь геном рака-мишени MC.7.G5 библиотеки CRISPR/Cas9 позволили выявить MR1 в качестве лиганда MC.7.G5 путем создания линии-мишени, устойчивой к лизису клоном MC.7.G5. Секвенирование направляющих РНК в этой резистентной линии показало, что они в основном нацелены на гены, участвующие в метаболизме и иммунной системе. Направляющие РНК для MR1 и β2 микроглобулина были очень обогащены в популяции клеток, которые были устойчивы к лизису клоном MC.7.G5. Эти гены сразу привлекли внимание авторов настоящего изобретения из-за их связи с активацией MAITклеток (для свертывания MR1 требуется в2-микроглобулин).
7. Блокирование антителом против MR1 устраняет распознавание линии клеток А549 (фиг. 6А и с повтором на фиг. 14).
6. Линии раковых клеток А549 (клон с9) и ММ909.24 (клон с4) не распознавались при нокауте MR1 в этих линиях (фиг. 6В и С и 14). Сверхэкспрессия MR1 в ММ909.24 с помощью трансдукции лентивирусом слегка усиливает распознавание (фиг. 6D и 14).
8. Линия LCL pt146 не распознается Т-клеточным клоном MC.7.G5. MC.7.G5 также не распознает клетки pt146, даже когда они трансдуцированы MR1-экспрессирующим лентивирусом и демонстрируют некоторую экспрессию MR1 на клеточной поверхности. Линия LCL pt146 не экспрессирует лиганд для Т-клеток MC.7.G5. Это говорит о том, что MC.7.G5 не реагирует на MR1 как таковой, а скорее распознает уникальный специфический для рака лиганд в связывающем желобке MR1 (фиг. 6).
9. Клон MC.7.G5 не окрашивается тетрамерами MR1, нагруженными Ac-6-FP или 5-OP-RU (фиг. 7 и с повтором на фиг. 14Е). MAIT Т-клеточные клоны окрашиваются тетрамерами MR1-5-OP-RU в параллельном анализе. Авторы настоящего изобретения заключают, что MC.7.G5 не связывается с лигандами для MAIT. Этот вывод согласуется с тем, что MC.7.G5 не экспрессирует а-цепь инвариантного TRAV1-2 канонического MAIT. Это было подтверждено с использованием пустых (К43А) тетрамеров MR1, которые не окрашивали MC.7.G5. Мутация К43А в MR1 делает возможным рефолдинг MR1 в отсутствие связанного груза, фиг. 14. Аналогично, экспрессия пустого (К43А) MR1 не приводит к распознаванию
- 11 045252 клоном MC.7.G5, несмотря на хорошую экспрессию MR1 на поверхности клеток C1R (окрашивание с использованием антител против MR1 - правая панель), фиг. 18. Это дополнительно демонстрирует, что экспрессируемый раком лиганд, связанный с MR1, важен для активации MC.7.G5.
10. Добавление 10, 50 или 100 мкг/мл лиганда для MR1 Ac-6-FP (http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=4pj5) на 12 ч существенно усиливает экспрессию MR1 на поверхности клеток ММ909.24 (фиг. 8 и 14G), но ослаблял распознавание этих клеток клоном MC.7.G5 (фиг. 8 и 14G). Этот результат убедительно свидетельствует о том, что клон MC.7.G5 распознает связанный с MR1 лиганд, который отличается от Ac-6-FP, на поверхности клеток ММ909.24. Аналогичные результаты были обнаружены с клетками А549. Инкубация клеток А549 с Ac-6-FP ослабляла распознавание, увеличивая при этом экспрессию MR1 на поверхности. Подвергание клеток А549 воздействию Mycobacterium smegmatis (M.smeg) также усиливало экспрессию MR1. Это ожидалось, поскольку известно, что М. smeg продуцирует лиганды для MR1. Эти лиганды могут распознаваться MAIT клетками. Клетки А549, инфицированные М. smeg, были хорошим лигандом для MAIT клона в параллельном эксперименте (фиг. 8 и 14F). Подвергание клеток А549 воздействию М. smeg существенно ослаблял распознавание клоном MC.7.G5. Авторы настоящего изобретения заключают, что клон MC.7.G5 распознает раковые клетки через лиганд в связывающем желобке MR1, который присутствует только на раковых клетках.
11. Трансдукция TCR MC.7.G5 в поликлональные Т-клетки позволяет им распознавать опухолевые мишени (фиг. 9). Действительно, CD8 Т-клетки от пациента с метастатической меланомой ММ909.11, трансдуцированные TCR MC.7.G5, уничтожали аутологичные и неаутологичные меланомы, но не нормальные клетки (фиг. 15). Авторы настоящего изобретения заключают, что распознавание опухоли клоном MC.7.G5 происходит с помощью Т-клеточного рецептора MC.7.G5, представленного на фиг. 3, через лиганд, презентируемый молекулой MR1.
Подход к функциональному скринингу всего генома с использованием системы CRISPR/Cas9, используя библиотеку GeCKOv.2, в котором на каждый кодирующий белок ген в геноме человека нацелено шесть различных одиночных направляющих (sg) РНК, был использован для идентификации генов, необходимых для распознавания клеток-мишеней клоном МС. 7.G5 (фиг. 13А). После двух циклов селекции с использованием MC.7.G5 выжившие трансдуцированные клетки HEK293T продемонстрировали уменьшенную способность к стимуляции MC.7.G5, что позволяет предположить, что основные гены, участвующие в их распознавании, были удалены (фиг. 13В). Секвенирование sgRNA системы CRISPR в устойчивых к лизису клетках HEK293T показало, что мишенями для более чем одной обогащенной sgRNA являются только 6 генов: в2М (пять sgRNA), MR1 (две sgRNA), регуляторный фактор X (RFX, пять sgRNA), связанный с RFX анкирин-содержащий белок (RFXANK, пять sgRNA), ассоциированный с RFX белок (RFXAP, три sgRNA) и преобразователь сигнала и активатор транскрипции 6 (STAT6, две sgRNA) (фиг. 13С). RFX, RFXANK и RFXAP являются важными компонентами белкового комплекса, ответственного за трансактивацию промоторов в2М, MHCI и MHCII. В сочетании с тем фактом, что в2М и MR1 объединяются, образуя неполиморфную стабильную антигенпрезентирующую молекулу, о которой известно, что она активирует MAIT и другие MR1-рестриктированные Т-клетки, эти данные убедительно свидетельствуют о том, что Т-клетки MC.7.G5 распознают раки-мишени через инвариантную молекулу MR1. Соответственно, антитело против MR1, но не антитела против MHCI или MHCII, предотвращало распознавание клеток-мишеней с помощью MC.7.G5 (фиг. 14А). CRISPR-опосредованный нокаут MR1 из А549 и меланомы ММ909.24 (делеционная мутация показана на фиг. 16В) защищал от MC.7.G5опосредованного распознавания и лизиса (фиг. 14В). Меланома ММ909.24 не окрашивалась антителом против MR1, что свидетельствует о том, что для распознавания мишени необходимы очень низкие уровни MR1 (фиг. 16С). Сверхэкспрессия MR1 приводила к сильному распознаванию слабо распознаваемых мишеней, HeLa и C1R, и слегка улучшала распознавание меланомы ММ909.24 (фиг. 14С). Повторное введение MR1 в клетки А549 с нокаутом MR1 с помощью CRISPR/Cas9 восстанавливало распознавание с помощью MC.7.G5 (фиг. 14D), вселяя дополнительную уверенность в том, что распознавание раковых клеток было MR1-зависимым.
Известно, что MR1 презентирует промежуточные продукты биосинтеза рибофлавина на поверхности MAIT клеток и, как полагают, не экспрессируется на клеточной поверхности без связанного груза. MC.7.G5 не окрашивался тетрамерами, состоящими из MR1 с мутацией К43А, которая делает возможным рефолдинг MR1 без связанного лиганда. MR1-зависимое распознавание раковых клеток наводило на мысль о том, что MC.7.G5 может распознавать MR1-связанный метаболит, который специфически экспрессируется или активируется в злокачественных клетках. В соответствии с этой гипотезой MC.7.G5 не окрашивался тетрамерами, собранными с MR1, презентирующим активатор Т-клеток микробного происхождения 5-OP-RU. Кроме того, распознавание клеток-мишеней было ослаблено при загрузке либо MAIT-активирующей бактерии Mycobacterium smegmatis (M smeg) (фиг. 14F), либо лиганда для MR1 ацетил-6-формилптерин (Ac-6-FP) (22, 23) (фиг. 14G), несмотря на увеличение экспрессии MR1 на поверхности (фиг. 14G). Эти результаты указывают на то, что MC.7G.5 не распознает MR1 как таковой или MR1 с помощью известных механизмов, а скорее MR1 со связанным грузом, который специфичен для раковых клеток или связан с ними.
- 12 045252
Секвенирование TCR MC.7.G5 позволило выявить новый TCR, состоящий из а-цепи TRAJ31 TRAV38.2/DV8, соединенной с β-цепью TRBJ2.3 TRBV25.1. Чтобы исследовать терапевтический потенциал нацеливания MR1 на раковые клетки, авторы настоящего изобретения очистили Т-клетки из РВМС от пациентов с меланомой стадии IV и трансдуцировали их лентивирусом, кодирующим TCR MC.7.G5, что привело к распознаванию и уничтожению аутологичных и неаутологичных меланом (фиг. 15), но не здоровых клеток (фиг. 15В). Уничтожение было специфическим для MR1, поскольку клетки, трансдуцированные TCRMC.7.G5, не лизировали меланомы с нокаутом MR1 (фиг. 15В). Авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что TCR MC.7.G5 может перенаправлять Т-клетки пациента на уничтожение раковых клеток пациента, не требуя специфического HLA. MR1 является привлекательной мишенью для иммунотерапии рака благодаря своей неполиморфной, повсеместно представленной природе. Последние достижения в области MR1-тетрамеров и открытиях лигандов продвинули знания в этой области, но многое еще предстоит открыть. Здесь авторы настоящего изобретения подтвердили распознавание раковых клеток клоном Т-клеток, который реагировал на множество линии раковых клеток из различных типов тканей.
Длительные анализы уничтожения (фиг. 17) показывают уничтожение с помощью MC.7.G5 ряда линий раковых клеток различного происхождения. Фактически, MC.7.G5 был способен уничтожать 9599,9% каждой клеточной линии. Кроме того, MC.7.G5 не уничтожал здоровые клетки.
Сверхэкспрессия мутированного К43А (пустого) MR1 в клетках CIR не приводила к активации M.7.G5 (фиг. 18А), несмотря на сильное окрашивание CIR-K43A антителом против MR1 (фиг. 18В). Напротив, сверхэкспрессия MR1 дикого типа в CIR вызывала активацию MC.7.G5. Это показывает, что TCR MC.7.G5 распознает MR1 со связанным грузом.
Находящиеся в обращении антитела против MR1 не способны обнаружить низкую экспрессию MR1 на поверхности раковых клеток, несмотря на обнаруживаемую экспрессию мРНК. Действительно, уровень экспрессии MR1 на поверхности, необходимый для распознавания раковых клеток с помощью MC.7.G5, часто был ниже порога, необходимого для окрашивания антителами, что позволяет предположить, что TCR MC.7.G5 может быть способен реагировать на низкое количество копий лиганда для MR1, родственного Т-клеткам, распознающим рМНС. Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, также демонстрируют огромные возможности скрининга всего генома с использованием системы CRISPR/Cas9 как платформы для обнаружения нетрадиционных Т-клеточных лигандов. Действительно, авторы настоящего изобретения также использовали эту технику, чтобы найти облигатные экспрессируемые на клеточной поверхности молекулы, необходимые для распознавания раковых клеток с помощью γδ TCR, и авторы настоящего изобретения ожидают, что применяемые здесь методологии быстро революционизируют область нетрадиционных Т-клеток в результате открытия новых лигандов.
Таким образом, скрининг всего генома с использованием системы CRISPR был использован для выявления экспрессируемого раком лиганда MC.7.G5. Эксперименты по валидации MR1 показали, что активацию MC.7.G5 клетками А549 может предотвратить антитело против MR1, и клон не реагирует на нокаутированную по MR1 клетку А549, созданную в лаборатории авторов настоящего изобретения (Laugel et al. 2012), или миелому-мишень ММ9909.24 с CRISPR/Cas9-опосредованным нокаутом MR1. MC.7.G5 реагировал на большинство линий раковых клеток, но не реагировал на первичные (неопухолевые) клетки. Для распознавания раковых клеток-мишеней с помощью MC.7.G5 требовалась экспрессии MR1. Единственный полиморфизм в MR1 является молчащим (Parra-Cuadrado et al. 2000), так что MR1рестриктированные TCR могут реагировать на клетки от любого человека в популяции. Это делает MR1 особенно привлекательным кандидатом для подходов к адоптивной клеточной терапии, поскольку один продукт мог бы использоваться для всех пациентов (Guo et al. 2015).
Заключение
TCR MC.7.G5 позволяет Т-клеткам распознавать широкий ряд опухолей. Распознавание происходит через инвариантную в популяции молекулу MR1. MR1 обычно не экспрессируется на поверхности клетки в отсутствие лиганда в его связывающем желобке (Chua et al. 2011). Экспрессия лиганда, который связывается с MR1, позволяет молекуле перемещаться на поверхность клетки для презентации этого лиганда (фиг. 10). Добавление известных лигандов MR1 ослабляет распознавание опухоли клоном Т-клеток MC.7.G5 и предполагает, что MC.7.G5 распознает специфический для раковых клеток лиганд в связи с MR1 (фиг. 11) (т.е. другие лиганды конкурируют с раковым лигандом за связывания с MR1). Учитывая то, что известно о MR1, кажется вероятным, что этот лиганд является промежуточным продуктом в метаболическом пути, который активируется при онкогенезе. Текущие эксперименты направлены на определение природы этого лиганда.
Это изобретение сосредоточено вокруг TCR, идентифицированного в Т-клеточном клоне MC.7.G5. Этот TCR распознает широкий ряд раковых клеток через консервативный, родственный МНС белок (MR)1. Этот TCR не распознает неопухолевые клетки. Нокаут с помощью CRISPR/Cas9 MR1 в опухолевых линиях или блокирование антителом против MR1 предотвращает распознавание TCR. Инкубация с известными MR1-связывающими лигандами ослабляет распознавание TCR, что позволяет предположить, что лиганд для Т-клеточного рецептора (TCR) является специфическим для рака метаболитом, который
- 13 045252 находится или презентируется TCR в связывающем желобке MR1. TCR MC.7.G5 можно использовать в ряде различных стратегий иммунотерапии рака. Широкое распознавание опухолей и независимость распознавания от лейкоцитарного антигена человека (HLA) открывают захватывающие возможности для иммунотерапии против любого типа рака для всей популяции, используя TCR.
Список литературы
Chua WJ, Kim S, Myers N, Huang S, Yu L, Fremont DH, et al. (2011) Endogenous MHCrelated protein 1 is transiently expressed on the plasma membrane in a conformation that activates mucosal-associated invariant T cells. Journal of Immunology, 186, 4744-50.
Ekeruche-Makinde, J., M. Clement, D.K. Cole, E.S.J. Edwards, K. Ladell, J.J. Miles, K.K. Matthews, A. Fuller, K.A. Lloyd, F. Madura, G.M. Dolton, J. Pentier, A. Lissina, E. Gostick, T.K. Baxter, B.M. Baker, P.J. Rizkallah, D.A Price, L. Wooldridge and A.K. Sewell (2012). T cell receptor optimized skewing of the repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry, 287, 37269-81.
Guo T, Chamoto K, Hirano N. (2015) Adoptive T Cell Therapy Targeting CD1 and MR1. Frontiers in immunology. 6:247.
Laugel B, Lloyd A, Meermeier EW, Crowther MD, Connor TR, Dolton G, et al. (2016) Engineering of Isogenic Cells Deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 Lentiviral System: Tools To Study Microbial Antigen Processing and Presentation to Human MR1-Restricted T Cells. Journal of Immunology, 197, 971-82.
Li W., H. Xu, T. Xiao, L. Cong, Μ. I. Love, F. Zhang, R. A. Irizarry, J. S. Liu, M. Brown, X. S. Liu, (2014) MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554.
Lissina A., K. Ladell, A. Skowera, M. Clement, E. Edwards, R. Seggwiss, H. van den Berg, E. Gostick, K. Gallagher, E. Jones, J.J. Melenhorst, A.J. Godkin, M. Peakman, D.A. Price, A.K. Sewell and L. Wooldridge (2009) Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-МНС tetramers. Journal of Immunological Methods, 340, 11-24.
Parra-Cuadrado JF, Navarro P, Mirones I, Setien F, Oteo M, Martinez-Naves E. A study on the polymorphism of human MHC class I-related MR1 gene and identification of an MRl-like pseudogene. Tissue Antigens. 2000;56(2): 170-2.
Patel, S.J. et al 2012 Identification of essential genes for cancer immunotherapy. Nature, 584, 537-542.
R. Reantragoon, A. J. Corbett, I. G. Sakala, N. a Gherardin, J. B. Furness, Z. Chen, S. B. G. Eckle, A. P. Uldrich, R. W. Birkinshaw, O. Patel, L. Kostenko, B. Meehan, K. Kedzierska, L. Liu, D. P. Fairlie, T. H. Hansen, D. I. Godfrey, J. Rossjohn, J. McCluskey, L. Kjer-Nielsen, Antigen-loaded MR1 tetramers define T cell receptor heterogeneity in mucosal-associated
-
Claims (8)
- invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 210, 2305-2320 (2013).Ryan M.D., A. M. Q. King, G. P. Thomas, (1991) Cleavage of foot-and-mouth disease virus polyprotein is mediated by residues located within a 19 amino acid sequence. Journal of General Virology. 72, 2727-2732.Sanjana N.E., O. Shalem, F. Zhang, (2014) Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784.Shalem, Ν. E. Sanjana, E. Hartenian, X. Shi, D. A. Scott, T. S. Mikkelsen, D. Heckl, B. L.Ebert, D. E. Root, J. G. Doench, F. Zhang, (2014) Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87.Theaker, S.M., C. Rius, A. Greenshields-Watson, A. Lloyd, A. Trimby, A. Fuller, J.J.Miles, D.K. Cole, M. Peakman and A.K. Sewell G Dolton (2016) T-cell libraries allow simple parallel generation of multiple peptide-specific human T-cell clones. Journal of Immunological Methods 430, 43-50.Tungatt, К., V. Bianchi, M.D. Crowther, W. E. Powell, A. J. Schauenburg, A.Trimby, M.Donia, A. Skowera, J. J. Miles, C. J. Holland, D. K. Cole, A. J. Godkin, M. Peakman, P. T. Straten,I. M. Svane, A.K. Sewell and G, Dolton (2015) Antibody stabilization of peptide-МНС multimers reveals functional T-cells bearing extremely low affinity TCRs. Journal of Immunology 194, 46374.Wooldridge L., M. Clement, A. Lissina, E. S. J. Edwards, K. Ladell, J. Ekeruche, R. E.Hewitt, B. Laugel, E. Gostick, D. K. Cole, R. Debets, C. Berrevoets, J. J. Miles, S. R. Burrows, D.A. Price, A. K. Sewell (2010) MHC Class I Molecules with Superenhanced CD8 Binding Properties Bypass the Requirement for Cognate TCR Recognition and Nonspecifically Activate CTLs. The Journal of Immunology. 184, 3357-3366.Wooldridge’ L., J. Ekeruche-Makinde, H.A. van den Berg, A. Skowera, J.J. Miles, M.P.Tan, G. Dolton, M. Clement, S. Llewellyn-Lacey, D A. Price, M. Peakman and A.K. Sewell (2012) A single autoimmune T-cell receptor recognises over a million different peptides. Journal of Biological Chemistry, 287, 1168-77.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Опухолеспецифический Т-клеточный рецептор (TCR), характеризующийся определяющими комплементарность участками, включающими или состоящими из CAYRSAVNARLMF (SEQ ID NO: 1) или CDR, который идентичен CDR3a по крайней мере на 92%; CASSEARGLAEFTDTQYF (SEQ ID NO: 2) или CDR, который идентичен CDR3e по крайней мере на 92%; TSESDYY (SEQ ID NO: 3) в качестве CDR1a; ATEN (SEQ ID NO: 4) в качестве CDR2a; MGHDK (SEQ ID NO: 5) в качестве CDR1e; и SYGVNS (SEQ ID NO: 6) в качестве CDR2e.
- 2. Опухолеспецифический Т-клеточный рецептор (TCR) по п.1, который не является TCR, который экспрессируется и связан с инвариантной, ассоциированной со слизистой оболочкой Т-клеткой (MAIT клеткой).
- 3. Опухолеспецифический Т-клеточный рецептор (TCR) по п.1 или 2, который представляет собой α-цепь, дополнительно включающую или состоящую изAOTVTOSOPEMSVOEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKOPPSROMILVIROEAYKOQNAT ENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYRSAVNARLMFGDGTQLVVKPNIQNP DPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAW SNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS (SEQ Ш NO:7) или α-цепь, которая идентична ей на по крайней мере 88%.
- 4. Опухолеспецифический Т-клеточный рецептор (TCR) по любому из пп.1-3, который представляет собой β-цепь, дополнительно включающую или состоящую изEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGD LSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSOYLCASSEARGLAEFTDTOYFGPGTRLTVLEDLK NVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLK EQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAE AWGRAD (SEQ ID NO :8), или β-цепь, которая идентична ей по крайней мере на 88%.
- 5. Опухолеспецифический Т-клеточный рецептор (TCR) по любому из пп.1-4, который является растворимым.
- 6. Опухолеспецифический Т-клеточный рецептор (TCR) по любому из пп.1-5, который является MR1-рестриктированным.
- 7. Т-клетка, экспрессирующая указанный TCR по любому из пп.1-6, модифицированная нуклеиновой кислотой, кодирующей TCR по любому из пп.1-6.
- 8. Клон Т-клетки, экспрессирующий указанный TCR по любому из пп.1-6, модифицированный нуклеиновой кислотой, кодирующей TCR по любому из пп.1-6.-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1717578.7 | 2017-10-26 | ||
| GB1806155.6 | 2018-04-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045252B1 true EA045252B1 (ru) | 2023-11-09 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11078252B2 (en) | T-cell receptor | |
| Shafer et al. | Cancer therapy with TCR-engineered T cells: current strategies, challenges, and prospects | |
| EP3169773B1 (en) | Engineered cells for adoptive cell therapy | |
| WO2018106732A1 (en) | Production of engineered cells for adoptive cell therapy | |
| Engels et al. | Long-term persistence of CD4+ but rapid disappearance of CD8+ T cells expressing an MHC class I-restricted TCR of nanomolar affinity | |
| EP3664820B1 (en) | Methods for producing genetically engineered cell compositions and related compositions | |
| Karpanen et al. | T-cell receptor gene therapy–ready to go viral? | |
| CN117355327A (zh) | 表达用于下调mhc i类和ii类表达的嵌入人工微rna中的shrna的car nkt | |
| Kozani et al. | CRISPR/Cas9-medaited knockout of endogenous T-cell receptor in Jurkat cells and generation of NY-ESO-1-specific T cells: An in vitro study | |
| US20200316124A1 (en) | Novel gamma delta t-cell receptor and its ligand | |
| CN109804246B (zh) | 用于快速克隆t细胞受体的组合物和方法 | |
| Yang et al. | Chimeric immune receptors (CIRs) specific to JC virus for immunotherapy in progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) | |
| EA045252B1 (ru) | Новый т-клеточный рецептор | |
| US20220363732A1 (en) | Cd5 specific t cell receptor cell or gene therapy | |
| Wang et al. | Natural killer cells in cancer immunotherapy | |
| Wheeler | Identifying a novel γδ T-cell stress ligand: Potential for cancer immunotherapy | |
| US20240009235A1 (en) | T cell receptors directed against bob1 and uses thereof | |
| RU2780156C2 (ru) | Продуцирование сконструированных клеток для адоптивной клеточной терапии | |
| Theaker | Developing peptide vaccines for breast cancer | |
| Rosenberger | Comparing the therapeutic potential of T cell receptors from tumors and healthy donors for adoptive T cell therapy in cancer | |
| WO2023077100A1 (en) | T cell receptor recognizing r175h mutation in p53 and its application | |
| Blaeschke | Generation of Ewing's Sarcoma Antigens CHM1-and EZH2-selective and HLA-A* 0201-restricted T-cell Receptor Transgenic T Cells |