DK178926B1 - Forudsigelse af resistens over for sygdom - Google Patents

Abstract

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til forudsigelse af resistens over for en virusinfektion hos et individ, hvilken fremgangsmåde omfatter bestemmelse hos individet af varianten, der er til stede i en eller flere aminosyrepositioner i et cadherin-protein, og/eller allelerne, der er til stede i en eller flere DNA-polymorfismer i genet for cadherin, og forudsigelse af, hvorvidt eller ikke indvididet er resistent over for virusinfektion på baggrund af bestemmelsen af varianten og/eller allelerne.

Description

Forudsigelse af resistens over for sygdom

Den foreliggende opfindelse angår fremgangsmåder til forudsigelse af resistens over for virusinfektion og fremgangsmåder til forebyggelse og behandling af virusinfektion.

Vira (og virions, som er viruspartiklerne) er ikke-cellulære infektionsmidler, der er i stand til at reproducere i dyreværtsceller. Et virus indbefatter en nukleinsyre (enten DNA eller RNA) i dets kerne omgivet af et proteinholdigt capsid (og i visse tilfælde en ydre kappe). Epitelbarrierer er det vigtigste indtrængningssted for vira i kroppen. Værtscellerne har flere barrierer mod virusindtrængning, og virusindtrængningsveje defineres hovedsageligt ved interaktionerne mellem viruspartikler og deres receptorer på celleoverfladen. Efter indtrængning replikerer virusset inde i værtscellen ved hjælp af interaktion med værtscellens replikative og proteindannende apparat og får herved værtscellen til at danne virions, der frigives fra værtscellen ved lysis heraf eller ved knopskydning af cellemembranen. Vira er den forårsagende agens ved en række infektioner hos mennesker og dyr, såsom influenza, mæslinger, hepatitis, rabies, mund-og klovsyge, infektiøs bursal sygdom (IBDV), infektiøs pankreasnekrose (IPN), pankreassygdom (PD), hjerte- og skeletmuskelinflammation (HSMI), infektiøs lakseanæmi (ISA) og kardiomyopatisyndrom (CMS).

Behandlinger, der er fundet mod nogle virusinfektioner, er baseret på anvendelsen af vacciner eller antivirale terapeutika (profylaktisk eller på anden vis). Vacciner benytter individet eget immunforsvar til at bekæmpe virusinfektioner, men er måske ikke effektive, hvis individets immunforsvar ikke er modtageligt for vaccinen eller kan inducere upassende immunresponser, der kan være skadelige for individet. Antivirale terapeutika opnår deres virkning på en række mulige måder (overvejende ved at forhindre viral syntese, hvilket er tilfældet for acyclovir), men man ved, at der er viruspopulationer, der er resistente over for disse terapeutika.

Bortset fra den tydelige skade vira forårsager på mennesker og ikke-humane dyr, udgør virusinfektioner en stor økonomisk trussel mod mange industrier inden for landbrug og akvakultur. For eksempel er infektiøs pankreasnekrose (IPN) en af de største trusler mod fiskeopdrætsindustrien på verdensplan. Sygdommen forårsages af et akvatisk birnavirus, som forårsager nekrose af pankreasceller og leverceller, hvilket resulterer i letargi og pludselig dødelighed. Virusset er udbredt i naturen, men synes ikke i større grad at ramme fritlevende laks. I akvakulturmiljøer forårsager sygdommen dødelighed både i yngelstadiet, når fisken stadig lever i ferskvand, og i efter-unglaks-stadiet kort efter overførsel til havvand. Branchens tab ved lakseopdræt som følge af IPN er blevet æstimeret til 8 % i ferskvandsfasen og 5 % i havvandsfasen. IPN-virusgenomet består af to genomsegmenter (A og B), der koder for henholdsvis fire (VP2-VP5) virusproteiner og ét (VP1) virusprotein. Cellulær optagelse af IPN-virus afhænger af genkendelse af et receptorprotein, mest sandsynligt ved binding af capsidproteinet VP2 til dets receptor, efterfulgt af endocytose (Granzow et al. 1997).

Infektiøs bursal sygdom (også kaldet IBD eller Gumboro-syge) er en meget smitsom sygdom, der inficerer kyllinger og forårsages af infektiøs bursal sygdomsvirus (IBDV). IBDV kan inficere kyllinger, kalkuner, ænder, gæs og perlehøns, men kun kyllinger viser kliniske tegn på sygdommen. Infektioner hos kyllinger med IBDV resulterer sædvanligvis i dødelighed, når de er 3 til 6 uger gamle.

Pankreassygdom (PD) er en anden virussygdom, der er vigtig for lakseindustrien. Den forårsagende virale agens, laksid alfavirus (SAV), inficerer atlantiske laks og regnbueørred i opdræt, og kliniske tegn er letargi og pludselig manglende appetit, reduceret vækst og øget dødelighed under vækst i havvand. I lighed med IPN er sygdommen kendetegnet ved nekrose af den exokrine pankreas, med ledsages også af svære læsioner af hjerte- og skeletmuskler. Dødelighedsrater varierer fra 0 til 50 %, og op til 15 % af de overlevende kan fremvise manglende vækst og blive vantrivninger.

Hjerte- og skeletmuskelinflammation (HSMI) er kendetegnet ved svær hjerte- og skeletmuskelinflammation med en vis lighed med PD. Sygdommen er forbundet med infektion af et fiske-reovirus (Palacios et al. 2010) og viser sig typisk 5 til 9 måneder, efter fisk er overført fra ferskvands- til havvands-netbure. I svære tilfælde kan dødeligheden nå 20 %.

Den genetiske sammensætning hos værten har stor indflydelse på dens respons på patogener, og et udsnit af individer kan have naturlig resistens overfor virusinfektion. Inden for landbrugs- og akvakulturindustrierne vil det derfor være en fordel at kunne identificere de resistente individer, således at de kan benyttes i avls/yngleprogrammer. Det kan endvidere i situationer, hvor personer skal flyttes til områder, hvor der florerer en virusinfektion, og hvor der er begrænsede medicinske behandlingscentre, være en fordel at udvælge personer, der har naturlig resistens over for den florerende virusinfektion. Ydermere kan individer, der identificeres som resistente, måske identificeres som egnede til en alternativ eller ingen behandling (sammenlignet med normale modtagelige individer) med administration af antivirale lægemidler eller vacciner. Ved at reducere eller eliminere behandlingen af sådanne resistente individer med antivirale lægemidler eller vacciner kan risikoen, der er forbundet med sådanne behandlinger, reduceres. Påvisning af resistente individer er særlig vigtig ved forsøg på håndtering af virusinfektioner, for hvilke der aktuelt ikke er nogen behandling. For eksempel kører fiskeopdrætsfirmaer fortløbende fiskeudvælgelsesprogrammer, der er rettet mod en forbedring af akvakulturstammerne med hensyn til sygdomsresistens, og der er udviklet protokoller til test af fisk for resistens overfor adskillige specifikke sygdomme. Disse provokationstests har været anvendt til udvælgelse af fisk som gydefisk, der har over gennemsnitlig resistens over for de pågældende sygdomme. Traditionelle tests inddrager kontrolleret provokationstest af søskende blandt de ynglende kandidater. Denne metodik er dog hæmmet af det faktum, at inficerede fisk ikke kan anvendes som gydefisk. Man bliver derfor nødt til at benytte sig af udvælgelse af vilkårlige (ikke-testede) dyr blandt søskende til den testede fisk, der fik det bedste resultat i provokationstestene (såkaldt familieudvælgelse).

Enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP’er) og andre DNA-polymorfismer, der er forbundet med resistens over for visse vira, er tidligere blevet identificeret. Disse SNP’er giver en vis grad af nøjagtighed ved bestemmelse uden at skulle aflive individet, hvis det er sandsynligt, at et individ er resistent over for virusinfektion, men der er identificeret meget få SNP’er eller andre typer af polymorfismer, der er direkte forbundet med virusresistens (f.eks. har mutationer i CCRS-genet vist sig at give resistens over for HIV), i.e. der er identificeret meget få SNP’er eller polymorfismer som den forårsagende mutation ved opnåelse af virusresistens overfor virussygdom. Der er til dato ikke identificeret nogen polymorfismer, der er direkte forbundet med virusinfektioner hos laverestående hvirveldyr, såsom fisk, før identifikationen af polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse.

Da behandlinger af virusinfektioner ofte er ikke-eksisterende eller suboptimale, er der et behov for behandlinger af virusinfektioner, der aktuelt ikke kan behandles, og et behov for alternative behandlinger af virusinfektioner, mod hvilke ovennævnte behandlinger aktuelt er tilgængelige. Der er endvidere et behov for alternative metoder til undersøgelse af dyrs resistens over for virusinfektioner, især metoder, der muliggør direkte undersøgelse af et dyrs resistens over for en virusinfektion uden at aflive dyret (hvorved der åbnes mulighed for anvendelse af det testede dyr som ynglestamme og frembringelse af en passende metode til test af mennesker).

Opfinderen af den foreliggende opfindelse har efter omfattende eksperimenter gjort den overraskende opdagelse, at polymorfismer i et cadherin-gen (i.e et gen, der koder for et cadherin-protein) og varianter i aminosyresekvensen af de tilsvarende cadherin-proteiner (i.e. proteinprodukterne fra cadherin-gener) er forbundet med resistens eller modtagelighed for virusinfektioner hos individer. Disse opdagelser fører direkte til en forståelse af, hvordan man kan bestemme modtagelighedsstatus for et individ enten ved bestemmelse af genvarianterne (allelerne), der bæres af individet i cadherin-generne, eller ved bestemmelse af varianterne i aminosyresekvensen af cadherin-proteiner, der udtrykkes af individet. Endvidere fører opdagelserne direkte til den idé, at modtagelige individer kan gøres resistente ved administration af vektorer, der fremfører resistensvarianten af et cadherin-gen til individet (i.e. genterapi).

Til dato har der ikke været forslag om en kobling mellem cadherin-proteiner eller generne, der koder cadherin-proteiner, og virusresistens eller mellem disse gener/proteiner og behandlingen af virusinfektion. Det er derfor overraskende, at varianter af cadherin-proteiner og polymorfismer af cadherin-gener er koblet til modtagelighed eller resistens over for virusinfektion. Følgeligt er der i et første aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebragt en fremgangsmåde til forudsigelse af resistens overfor en virusinfektion hos et individ, hvilken fremgangsmåde omfatter bestemmelse i individet af: (i) varianten, der er til stede i en eller flere aminosyrepositioner i cadherin-proteinet, og/eller allelerne, der er til stede i en eller flere DNA-polymorfismer i cadherin-genet, og forudsigelse af, hvorvidt eller ikke individet er resistent overfor virusinfektion på baggrund af bestemmelsen af varianten og/eller allelerne.

Cadheriner er ubikvitære transmembrane proteiner, der medierer dannelse af calciumafhængige celle-celle-sammenføjninger mellem polariserede epitelceller, og de er kendetegnet ved et langt extracellulært transmembrant domæne og et cytoplasmatisk domæne. Cadheriner bibringer en stærk celle-til-celle-adhæsion ved at bringe to plasmamembraner fysisk sammen, hvilket åbner mulighed for samling af andre sammenføjningskomplekser (herunder faste sammenføjninger og desmosomer). Cadheriner skal dimerisere for at danne sådanne sammenføjninger. Familien af cadheriner indbefatter N-cadherin (neuron-cadherin eller Cdh2), E-cadherin (epitel-cadherin eller Cdh-1), P-cadherin (placenta-cadherin eller Cdh3), R-cadherin (retina-cadherin eller Cdh4), Cdh5, K-cadherin (nyre-cadherin eller Cdh6), Cdh7, Cdh8, Cdh9, Cdh10, Cdh11, Cdh12, Cdh12P2, Cdh13, Cdh14, Cdh15, Cdh16, Cdh17, Cdh18, Cdh19, Cdh20, Cdh22, Cdh24, Cdh26, CELSR1, CELSR2, CELSR3, DSC1, DSC2, DSC3, DSG1, DSG2, DSG3, DSG4. Som en fagmand vil vide svarer CELSR til EGF-LAG seven-pass G-type receptor, DSC svarer til desmocolin, og DSG svarer til desmoglein. Medlemmerne af cadherin-familien er stærkt beslægtet og har vist sig at tilvejebringe succesfuld celle-celle-adhæsion ved dannelse af homo- og heterodimerer (i.e. dimerer dannet af mere end ét medlem af cadherin-familien). Polymorfismerne og varianterne ifølge den foreliggende opfindelse menes at være forbundet med domæner i genet/proteinet, der er ansvarlige for dimerisering, og vil derfor forventes at have relevans for alle medlemmer af cadherin-familien. Den foreliggende opfindelse kan derfor inddrage analyse af varianten eller polymorfismen, der er forbundet med et hvilket som helst medlem af cadherin-familien.

Cadherinet ifølge den foreliggende opfindelse kan derfor for eksempel være et hvilket som helst eller flere af: N-cadherin (neuron-cadherin eller Cdh2), E-cadherin (epitel-cadherin eller Cdh-1), P-cadherin (placenta-cadherin eller Cdh3), R-cadherin (retina-cadherin eller Cdh4), Cdh5, K-cadherin (nyre-cadherin eller Cdh6), Cdh7, Cdh8, Cdh9, Cdh10, Cdh 11, Cdh12, Cdh12P2, Cdh13, Cdh14, Cdh15, Cdh16, Cdh17, Cdh18, Cdh19, Cdh20, Cdh22, Cdh24, Cdh26, CELSR1, CELSR2, CELSR3, DSC1, DSC2, DSC3, DSG1, DSG2, DSG3, DSG4 eller en hvilken som helst kombination deraf. Hver af ovennævnte cadheriner kan betragtes individuelt som en del af den foreliggende opfindelse. Cadherin kan for eksempel være Cdh-1. DNA-polymorfismen ifølge den foreliggende opfindelse kan være en hvilken som helst polymorfisme i cadherin-genet, der kan bibringe modtagelighed for virusinfektion hos et individ afhængig af allelen med polymorfismen, der er til stede hos individet. Varianten ifølge den foreliggende opfindelse kan være en hvilken som helst variant i en eller flere aminosyrepositioner i cadherin-proteinet, der bibringer modtagelighed for virusinfektion hos et individ afhængig af tilstedeværelse eller fravær af varianten hos individet. Polymorfismer ifølge den foreliggende opfindelsen er fundet i domæner af cadherin, der er forbundet med dimerisering af cadherin, som er i det extracellulære domæne, og er i et cadherin-tandemgentagelsesdomæne (man ved, at der er tandemgentagelsesdomæner til stede i det extracellulære domæne af cadheriner, som menes at mediere celle-celle-kontakt, når de er bundet til calcium).

Varianten ifølge den foreliggende opfindelse kan følgeligt findes i et domæne af cadherin-proteinet, der er forbundet med dimerisering af cadherin. Polymorfismen ifølge den foreliggende opfindelse kan findes i nukleinsyresekvensen, der koder for dette domæne.

Varianten ifølge den foreliggende opfindelse kan findes i et extracellulært domæne af cadherin-proteinet. Polymorfismen ifølge den foreliggende opfindelse kan findes i nukleinsyresekvensen, der koder for dette domæne.

Varianten ifølge den foreliggende opfindelse kan findes i cadherin-tandemgentagelsesdomænet af cadherin-proteinet. Polymorfismen ifølge den foreliggende opfindelse kan findes i nukleinsyresekvensen, der koder for dette domæne. Som eksempel viser tabel 1 en oversigt over positionerne af cadherin-tandemdomænerne i en række cdh1-ortologer.

Tabel 1. Placering af cadherin-tandemgentagelsesdomæner (CTRD) i nogle Cdh1-ortologer. ND = Ikke bestemt (det femte cadherin-tandemgentagelsesdomæne er fraværende eller dets sekvens er for forskellig fra konsensus-CTRD-sekvensen til at blive påvist).

*Alle sekvenser er benævnt ved deres Genbank-VERSION-identifikatorer. Identifikatorerne, der er anført i tabellen, vedrører NCBI-GenBank Flat File udgave 205.0. DNA-polymorfismerne kan også være en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der fører til forskelle i ekspressionsniveauer af et cadherin-gen, eller en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der forårsager differentiel splejsning af transkriptet af et cadherin-gen.

Cadheriners karakter betyder, at de findes i mange dyr, og i alle dyr udfører cadheriner den samme rolle til dannelse af celle-celle-adhæsioner. Anvendeligheden af den foreliggende opfindelse strækker sig derfor naturligt til forudsigelse af resistens over for virusinfektion hos ethvert individ, der indbefatter endogen cadherin. Når der henvises til cadherin, angår henvisningen derfor proteinproduktet af den cadherin-ortolog, der findes i individet, der udsættes for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Når der henvises til cadherin-genet angår henvisningen den cadherin-ortolog, der findes i individet, der udsættes for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. En ikke-udtømmende liste over potentielle individer er følgende: menneske, ko, svin, krebsdyr, fisk eller fjerkræ. Hvis individet er et fjerkræ, kan fjerkræet for eksempel være en kylling eller en kalkun. Hvis individet er en fisk, kan fisken for eksempel være torsk, et medlem af tilapia-slægten, et medlem af karpefamilien, zebrafisk, en atlantisk laks (Salmo salar), stillehavslaks, ørred (for eksempel regnbueørred (Oncorhynchus mykiss)) eller en anden art, der tilhører familien Salmonidae. Hvis individet er et krebsdyr, kan individet være et medlem af reje-familien.

Fastlæggelse af de tilsvarende domæner, hvori polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse findes, i et hvilket som helst specifikt dyr er velkendt for en fagmand. Man kan fra et kendt domæne i et hvilket som helst specifikt dyr identificere tilsvarende domæner i andre dyr. Ved anvendelse af Cdh-1 som eksempel kan man udføre multipel alignment-analyse af nukleinsyrer, der koder for, eller aminosyrersekvenser for dette protein (ved anvendelse af for eksempel Clustal Omega-analyse). Se figur 1 som et eksempel.

Opfinderen har fundet, at DNA-polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse for diploide organismer kan være til stede i den ene eller den anden af to former, i.e. hver af polymorfismerne har to alleler. Den ene allel kan karakteriseres som prædiktiv for resistens over for virusinfektion (resistens-allelen), den anden som prædiktiv for ikke-resistens overfor virusinfektion (ikke-resistens-allelen). Størstedelen af dyr er diploide organismer og har således to kopier af DNA-polymorfismer, såsom polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse (én kopi i hvert sæt af kromosomer). Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at opfindelsen strækker sig til fremgangsmåder, der anvendes til polyploide organismer (såsom triploide fisk). En fagmand vil være bekendt med, hvordan beskrivelsen af den foreliggende opfindelse udvides til sådanne organismer, hvor der for eksempel ved triploide organismer vil være tre kopier af polymorfismerne til stede i individet. Trinet med bestemmelse af allelerne i fremgangsmåden i det første aspekt af den foreliggende opfindelse kan derfor indbefatte trinet med analyse af DNA-polymorfismerne, der findes i hvert sæt af kromosomer, til bestemmelse af, hvorvidt hver kopi af DNA-polymorfismen, der er til stede, er en resistensallel eller en ikke-resistensallel. Når for en diploid organisme et individ gennemgår fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, og det bestemmes, at det har to kopier af resistensallelen for DNA-polymorfismen (i.e. individet er homozygotfor resistensallelen), forudsiges det, at individet har resistens over for virusinfektion. Omvendt når det for et individ, der gennemgår fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, bestemmes, at det har to kopier af ikke-resistensallelen for DNA-polymorfismen (i.e. det er homozygot for ikke-resistensallelen), forudsiges det, at individet ikke har resistens overfor virusinfektion (i.e. det er mere modtageligt for virusinfektion end individet, der er homozygot for resistensallelen).

Det skal bemærkes, at den atlantiske laks og andre arter inden for Salmoninae-underfamilien er såkaldte pseudotetraploide arter. Én følge af denne pseudo-tetraploide tilstand er, at gener i disse arter vil være duplikeret i genomet i højere grad end hos mennesker og andre ikke-pseudotetraploide arter. Et duplikeret gen findes i to eller flere koier i genomet. Hos en pseudotetraploid art vil kopierne af det duplikerede gen have en tendens til at have lidt forskellige nukleotidsekvenser, og de vil have en tendens til at spille lidt forskellige biologiske roller. Endvidere vil nedarvningsmønstret for hver kopi af et duplikeret gen hos en pseudotetraploid art normalt være disomisk (i modsætning til tetrasomisk). I forbindelse med denne ansøgning vil pseudotetraploide arter derfor blive behandlet som diploide arter.

Det kan konkluderes, at et individ, der ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse forudsiges at have resistens over for virusinfektion, har en større end normal chance for at have resistens over for virusinfektion. Omvendt kan det konkluderes, at et individ, der forudsiges ikke at have resistens over for virusinfektion, har en lavere end normal risiko for at udvikle virusinfektion. Når det bestemmes, at et individ, der har gennemgået fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, har én kopi af resistensallelen for DNA-polymorfismen og én kopi af ikke-resistensallelen for DNA-polymorfismen (i.e. er heterozygot), vil det ifølge den foreliggende opfindelse blive forudsagt, at individet ikke har resistens over for virusinfektion. Det vil dog blive forudsagt, at individet har en større chance for at være resistent over for virusinfektion end et individ med to kopier af ikke-resistensallelen. Et sådant individ vil i det følgende blive benævnt semiresistent over for virusinfektion.

Uden ønske om yderligere begrænsning, men for klarhedens skyld er yderligere detaljer om polymorfismer og varianter ifølge den foreliggende opfindelse diskuteret nedenfor me Cdh-1 som et eksempel på et cadherin ifølge den foreliggende opfindelse. Følgeligt kan fremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse indbefatte bestemmelse hos individet af varianten, der er til stede i en eller flere aminosyrepositioner i Cdh-1, og/eller allelerne, der er til stede i en eller flere DNA-polymorfismer i genet for Cdh-1 (cdh1), og forudsigelse af, hvorvidt eller ikke individet er resistent overfor virusinfektion på baggrund af bestemmelsen af varianten og/eller allelerne.

Cdh1-proteiner er også kendt ved termerne E-cadherin, epithel-cadherin, uvomorulin, CD324, CAM 120/180 eller Cadherin-1, men benævnes i det følgende heri Cdh1. Nomenklaturen for forkortede gennavne er forskellig mellem arter. Her har vi anvendt den nomenklatur, der anvendes hos zebrafisk, hvor gennavne skrives med små bogstaver i kursiv (f.eks. cdh1), og proteinnavne skrives med ét stort bogstav (Cdh1). Denne nomenklatur vil blive anvendt gennem teksten uanset arten (i.e. uanset det faktum, at for eksempel de humane ortologer af chd1 og Cdh1 er CDH1 og CDH1).

Man ved, at den extracellulære region af Cdh1 er inddraget i intercellulære og intracellulære homeotypiske interaktioner og klyngedannelse, hvorimod dets cytoplasmatiske hale forbindes med en række intracellulære proteiner, herunder beta-catenin, hvilket medierer indirekte binding af Cdh1 til cytoskelettet. Bindingen af Cdh1 til beta-catenin kontrolleres af Wnt-signalvejen og hepatocytvækstfaktor. Genet for Cdh1 anses for at have tumoursuppressoregenskaber, idet mutationer i dette gen er koblet til progression af en række cancere. Man ved også, at Cdh1 agerer som en receptor for bakterien Listeria monocytogenes og svampen Candida albicans. Nogle vira interagerer med proteiner, der er inddraget i sammenføjningskomplekser, men der er ikke kendskab til nogen, der interagerer direkte med CDH1-proteiner (Moon og Spear, 2002)

Selvom de fleste dyr kun har ét gen for cdh1, har opfinderne fundet, at der er flere kopier af cdh1-genet i genomet hos atlantisk laks, der er tre kopier af cdh1. Den ene af disse kopier er placeret på atlantisk laks-kromosom 11 (ssa11), hvorimod de to andre kopier er placeret inden for en 50.000 basepar lang region på atlantisk laks-kromosom 26 (ssa26). Atlantisk laks-genomet er endnu ikke blevet annoteret, så de tre forskellige kopier af cdh1-genet har endnu ikke standardnavne. De to cdh1-gener på ssa26 vil her blive benævnt cdh1-1 og cdh1-2, mens cdh1-genet på ssa11 vil blive benævnt cdh1-3. De tilsvarende proteinprodukter vil blive benævnt Cdh 1 -1, Cdh1-2 og Cdh1 -3.TM formålene i den foreliggende opfindelse kan cdh1, når individet er en laks, være et hvilket som helst af cdh1-1, cdh1-2, cdh1-3 eller en hvilken som helst kombination deraf. DNA-polymorfismen ifølge den foreliggende opfindelse kan for eksempel være i cdh1-1. Varianten ifølge den foreliggende opfindelse kan være en eller flere aminosyrepositioner i proteinproduktet af et hvilket som helst af cdh1-generne, der er nævnt ovenfor.

Cdh1 findes i lighed med andre medlemmer af cadherin-familien i mange dyr. Cdh1 udfører i alle dyr den samme rolle med dannelse af celle-celle-adhæsioner. Anvendeligheden af den foreliggende opfindelse strækker sig derfor naturligt til forudsigelse af resistens overfor virusinfektion i et hvilket som helst individ, der indbefatter endogent Cdh1. Når der henvises til Cdh1 som en del af den foreliggende opfindelse angår henvisningen derfor protein produktet af cdM-ortologen, der findes i individet, som gennemgår fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Når der henvises til cdh1 angår henvisningen cdM-ortologen, der findes i individet, som gennemgår fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Fastlæggelse af ortologen for cdh 1 i et hvilket som helst specifikt dyr er velkendt for en fagmand. For eksempel kan et Cdh1-protein uanset art defineres som et protein, der er til stede i epitelceller, som indeholder fire eller fem kopier af cadherin-tandemgentagelsesdomænet (som har identifikator cd11304, cd00031 eller pfam00028 i GenBank Conserved Domains-databasen, udgave 3.12), foruden en cytoplasmatisk region af cadherin (som har identifikator pfam01049 i GenBank Conserved Domains-databasen, udgave 3.12), der fortrinsvis medierer dannelse af calciumafhængige celle-celle-samenføjninger.

Alternativt kan et protein-protein BLAST (BLASTP) mod GenBank RefSeq protein-databasen anvendes til identificering af en Cdh1-ortolog. Hvis mere end 50 % af de bedste hits (det vil sige de hits, der har en E-værdi på 0,0) markeres som et cadherin-1 protein eller et cadherin- 1-lignende protein, så er det pågældende protein en Cdh1-ortolog, som fortrinsvis medierer dannelse af calciumafhængige celle-celle-sammenføjninger.

GenBank (udgave 205.0)-identifikatorer af cDNA-sekvenser af nogle cdh1-ortologer kan findes i tabel 2. Udledning af proteinsekvensen, der svarer til en cDNA-sekvens, er velkendt for en fagmand. Derfor er kun cDNA-sekvenser (ikke proteinsekvenser) vist i tabel 2.

Alternativt eller endvidere kan det bestemmes, at ortologen har 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80, 75 %-sekvenshomologi med en hvilken som helst af de sekvenser, der er identificeret i tabel 2, idet den medierer dannelse af calciumafhængige celle-celle-sammenføjninger. Uden ønske om yderligere begrænsning, men for klarhedens skyld kan Cdh1 eller cdh1 dog være et hvilket som helst af de, der er identificeret i tabel 2 og svarer til individet som anført i tabel 2.

Det skal bemærkes, at CDH1 i nogle arter anvendes som et akronym for et andet protein, som ikke er et epitel-cadherin men APC/C-aktivatorproteinet CDH1.1 den foreliggende ansøgning henviser Cdh1 og cdh1, CDH1 og CDH1 altid til epitel-cadherin-proteiner/gener.

Tabel 2 - cdh •/-ortologer

*Alle sekvenserne er benævnt ved deres Genbank VERSION-identifikator. Identifikatorerne, der er vist i tabellen, vedrører NCBI GenBank Flat File udgave 205.0 (og da VERSION-identifikatoren er stabil, sandsynligvis til enhver senere GenBank-udgave). DNA-polymorfismen kan for eksempel være placeret på kromosom 26 og i et cdh1-gen hos atlantisk laks. En sådan DNA-polymorfisme har vist sig at kunne forudsige resistens overfor IPN, mere specifikt at være en forårsagende mutation i bestemmelsen af resistens eller ikke-resistens. Den atlantiske laks indeholder mere end ét cdh1-ger\. Hos mennesker er der kun én cdh1 -ortolog til stede, og den er placeret på kromosom 16 (placering 16q22.1). Hos kyllinger er der kun én cdh1-ortolog til stede, og den er placeret på kromosom 11.

Hver type af DNA-polymorfisme, der er anført ovenfor, kan betragtes individual som en del af den foreliggende opfindelse for bestemmelsestrinet i fremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse. DNA-polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse kan ligge inden for den kodende region af cdh1. For eksempel er DNA-polymorfismen i den atlantiske laks placeret i exon 7 af cdh1-1 (DNA-sekvensen for cdh1.1 findes i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1). DNA-polymorfismen kan også være en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der ændrer aminosyresekvensen for det tilsvarende Cdh1-protein. DNA-polymorfismen kan især være en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der forårsager et aminosyreskift i cadherin-tandemgentagelsesdomæne nummer 2 i Cdh1-proteinet. Alternativt kan DNA-polymorfismen være en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der forårsager et aminosyreskift i et af de andre cadherin-gentagelsesdomæner, der er til stede i det pågældende protein. Tabel 1 viser en oversigt over positionerne af cadherin-tandemdomænerne i nogle relevante cdh1-ortologer. Følgeligt kan DNA-polymorfismen ifølge den foreliggende opfindelse være en DNA-polymorfisme i position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1. Når cytosin er til stede i position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1, er allelen en resistent allel. Nårthymin er til stede i position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1, er allelen en ikke-resistent allel. For andre dyr kan DNA-polymorfismen udvælges blandt en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der svarer til position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1. Alternativt kan DNA-polymorfismen være en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der forårsager et aminosyreskift i en aminosyreposition, der er ortolog til aminosyrepositionerne, der skiftes ved en hvilken som helst DNA-polymorfismene, der svarer til position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1. Figur 1 viser en multipel alignment af Cdh1-ortologer fra adskillige arter. Der fremgår, at positionerne, der svarer til 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1, let og utvetydigt kan bestemmes i arter, såsom menneske og kylling. Tabel 3 viser positionerne af nukleotider i cdh1-ortologer, der svarer til position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1, og positionerne af andre nukleotider, der forårsager aminosyreændringer i i de pågældende aminosyrepositioner.

Fastlæggelse af den tilsvarende position for polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse i et hvilket som helst specifikt dyr er velkendt for en fagmand. Uden ønske om yerligere begrænsning, men for klarhedens skyld kan polymorfismerne være en hvilken som helst af de, der er identificeret i tabel 3 og svarer til individet som anført i tabel 3.

Tabel 3: Polymorfismer i cdh1-gener, der forårsager aminosyreændringer i positioner, der er ortologe til aminosyrepositionerne, der påvirkes (ændres) af DNA-polymorfismer i position 1065 af GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1.

Positionerne af polymorfismerne er i forhold til starten af de tilsvarende mRNA-GenBank-sekvenser.

*Alle sekvenser er benævnt ved Genbank VERSION-identifikatoren. Identifikatorerne, der er anført i tabellen vedrører NCBI-GenBank Flat File udgave 205.0 (og da VERSION-identifikatoren er stabil, sandsynligvis enhver senere GenBank-udgave). 1 Disse positioner er direkte ortologer til position 1065 i GenBank-sekvens BT058864.1. DNA-polymorfismerne kan også være en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der fører til forskelle i ekspressionsniveauer af et cdh 1-gen, eller en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der forårsager differentiel splejsning af transkriptet af et cdh1-gen.

Hvert af DNA-polymorfismerne betragtes individuelt som en del af den foreliggende opfindelse.

Hvis en atlantisk laks har to resistente alleler i locuset, der svarer til position 1065 i GenBank-sekvens BT058864.1, har dette dyr resistens overfor virusinfektion. Hvis en atlantisk laks har to ikke-resistente alleler i locuset, der svarer til position 1065 i GenBank-sekvens BT058864.1, vil dette dyr ikke blive bestemt som resistent over for virusinfektion. Hvis en atlantisk laks bærer én resistensallel og én ikke-resistensallel, vil dyret blive bestemt som intermediær med hensyn til resistens.

For de fleste polymorfe loci (i en hvilken som helst art) vil der være en række andre loci, der har identiske genotypemønstre eller genotypemønster med en kraftig lighed. Som illustration har to loci identiske genotypemønstre, hvis alle eller de fleste dyr med genotype AA i locus 1 har genotype CC i locus 2, alle eller de fleste dyr med genotype AB i locus 1 har genotype CD i locus 2, og alle eller de fleste dyr med genotype BB i locus 1 har genotype DD i locus 2. Udtrykt i fagtermer vil sådanne to loci være i kraftig koblings-uligevægt (LD) med hinanden.

En hvilken som helst DNA-polymorfisme, der anvendes til test for (for eksempel) resistens over for et virus, kan erstattes af andre DNA-polymorfismer, som det er i kraftig LD med. Følgeligt kan den foreliggende opfindelse derfor angå en fremgangsmåde, hvor de to polymorfismer (der er beskrevet ovenfor) erstattes af andre loci, som de er i kraftig LD med. Ansøgerne har identificeret en række af sådanne loci: AGKD01281000.1_4157[T/TA]; AGKD01281000.1_5527[T/TAT]; AGKD01021775.1_19790[G/A],

Ovennævnte loci er defineret ved henvisning til den fulde genomsekvens for Salmo salar, der er publiceret i GenBank under accessionsnummer AGKD00000000 (udgave AGKD00000000.1 GI: 354459050). Mere specifikt er polymorfismernes navne som beskrevet ovenfor sammensat som følger: GenBank-accessionsnummer, efterfulgt af en understregning efterfulgt af positionen af DNA-polymorfismen i GenBank-sekvensen, efterfulgt afen kantet parentes, der omslutter den resistente allel (der vises først) og den ikke-resistente allel (der vises som nummer to). Disse DNA-polymorfismer er i meget kraftig LD med DNA-polymorfismen, der svarer til position 1065 i GenBank-sekvens BT058864.1.

For at undgå tvivl indeholder tabel 4 en liste over DNA-sekvenser, der vedrører fire DNA-polymorfismer. Sættet af fire polymorfismer består af 1) DNA-polymorfismen, der svarer til position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1 og 2) de tre (ovennævnte) DNA-polymorfismer, der er i kraftig LD med DNA-polymorfismerne, der svarer til position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1. Hver polymorfisme har én allel (sekvensvariant), der svarer til resistens overfor IPN, og én allel, der svarer til modtagelighed (ikke-resistens) overfor IPN. Sekvensnumrene er i forhold til den medfølgende Patentin-genererede sekvensliste.

Tabel 4. DNA-sekvenser for DNA-polymorfismerne, der svarer til position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1, foruden de tre DNA-polymorfismer, der er i kraftig LD med DNA-polymorfismerne, der svarer til position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1. Hver polymorfisme har én allel (sekvensvariant), der svarer til resistens over for IPN, og én allel, der svarer til modtagelighed (ikke-resistens) over for IPN. Sekvensidentifikatorne er i forhold til den medfølgende Patentin-genererede sekvensliste.

For andre dyr er DNA-polymorfismerne, der har direkte indvirkning på resistens over for virusinfektion, i.e. de forårsagende DNA-polymorfismer, defineret ovenfor. Andre DNA-polymorfismer, der er i kraftig LD med disse forårsagende DNA-polymorfismer, betragtes som en del af den foreliggende ansøgning. To DNA-polymorfismer kan defineres som værende i kraftig LD med hinanden, hvis kvadratet af korrelationskoefficienten mellem alleler i de to DNA-polymorfismer er større end 0,7 (dette mål betegnes sædvanligvis r2, og det er et hyppigt anvendt mål for LD). cofM-polymorfismen ifølge den foreliggende opfindelse har vist sig at svare til varianter i aminosyresekvensen for Cdh1, som korrelerer med resistens eller ikke-resistens over for virusinfektion (afhængig af aminosyren, der er til stede i proteinet i varianspositionen i aminosyrekæden). Følgeligt kan en analyse af aminosyresekvensen for Cdh1 hos individet medvirke til at forudsige resistens.

Varianten er eventuelt til stede i en extracellulær del af CDH1.

For eksempel har aminosyren, der er til stede i position 325 i aminosyresekvensen for Cdh1-1 hos atlantisk laks, vist sig at styre resistens eller ikke-resistens over for virusinfektion hos individet. En bestemmelse af hvilken aminosyre, der er til stede i denne position (i.e. bestemmelse af varianten i denne position) vil derfor gøre det muligt for opfinderen at bestemme, om det er sandsynligt, at individet har virusresistens eller ikke.

For andre dyr kan varianten være til stede i positionen, der svarer til position 325 i aminosyresekvensen for Cdh1-1 (i.e. ACN10577.1), Fastlæggelse af den tilsvarende position i ortologen for et hvilket som helst specifikt dyr er velkendt for en fagmand. For eksempel kan den tilsvarende position i ortologen bestemmes ved anvendelse af multipel sekvensalignments-programmer, såsom Clustal Omega. Figur 1 viser en Clustal Omega multipel sekvensalignment af Cdh1-1-proteinsekvensen fra atlantisk laks sammen med Cdh1-ortologerfra menneske, kylling, svin og kvæg, hvor aminosyrerne, der svarer til position 325 i Cdh 1 -1, er fremhævet. Det fremgår af figuren, at de positioner, der svarer til denne position, i de forskellige arter, kan bestemmes let og utvetydigt ved en visuel inspektion. Menneske, kylling, svin og kvæg er evolutionsmæssigt meget langt fra den atlantiske laks, dog viser figur 1 en tæt homologi mellem arter. De tilsvarende positioner skulle derfor kunne identificeres med den samme præcision i andre dyrearter. Bestemmelsen af sekvensen for et protein er velkendt for en fagmand, hvis den tilsvarende cDNA-sekvens er tilgængelig. Hvis den tilsvarende cDNA-sekvens ikke er tilgængelig, er det velkendte for en fagmand at opnå denne sekvens, for eksempel ved screening af et relevant cDNA-bibliotek ved hjælp af PCR eller hybridisering ved anvendelse af primere eller hybridiseringsprober, der er afledt fra en cdh1-ortolog fra en beslægtet art, efterfulgt af DNA-sekventering af de PCR- eller hybridiseringspositive kloner og validering ved hjælp af nukleotid-BLAST mod en annoteret referencedatabase (såsom NCBI RefSeq-databasen). Alternativt kan et relevant cDNA-bibliotek sekventeres ved anvendelse af næste-generations-sekventering (RNA-seq), efterfulgt af de novo af sekvenslæsningerne til en transkriptomsekvens, efterfulgt af identifikationsvalidering af cdh1-gener ved anvendelse af nukleotid-BLAST mod en annoteret referencedatabase.

Uden ønske om yderligere begrænsning, men for klarhedens skyld kan varianten dog være en hvilken som helst af de, der er identificeret i tabel 5 og svarer til individet, der er anført i tabel 5.

Uden ønske om yderligere begrænsning, men for klarhedens skyld forudsiges det hos laks, at individet har virusresistens, når varianten bestemmes til at være prolin i position 325 i aminosyresekvensen for Cdh1-1. Når varianten bestemmes til at være serin i position 325 i aminosyresekvensen for Cdh1-1, forudsiges det, at individet ikke har virusresistens. Variantidentiteter hos andre dyr er beskrevet i tabel 5. Aminosyresekvensen for Cdh1-1 kan ses i linje 1 (“ssa-1”) af den multiple sekvensalignment i figur 1, idet position 325 er fremhævet i denne figur. De tilsvarende positioner i proteiner fra andre arter, som er ortologe til Cdh 1.1, er tilsvarende fremhævet i figur 1.

Tabel 5 Variantposition

*Kun én aminosyrevariant er kendt. **Alle sekvenser er benævnt ved deres Genbank VERSION-identifikatorer. Identifikatorerne, der er anført i tabellen, vedrører NCBI-GenBank Flat File-udgave 205.0 (og da VERSION-identifikatoren er stabil, sandsynligvis enhver senere GenBank-udgave). I en hvilken som helst art kan DNA-polymorfismen eller DNA-polymorfismerne, der forårsager virusresistens, være en hvilken som helst DNA-polymorfisme eller hvilke som helst DNA-polymorfismer, der forårsager et aminosyreskift i en Cdh1-ortolog. Alternativt kan DNA-polymorfismen være en hvilken som helst DNA-polymorfisme eller hvilke som helst DNA-polymorfismer, der forårsager variation i ekspressionniveauerne af et cdh1- gen, i.e. en hvilken som helst DNA-polymorfisme, der tager del i reguleringen af ekspressionsniveauer af et cdh1-gen. Dette indbefatter både DNA-polymorfismer i cis-virkende loci, der regulerer et cdh1- gen (DNA-polymorfismer placeret på det samme kromosom som cofM-genet, der målsøges af transkriptionsfaktorer og andre regulatorproteiner), og DNA-polymorfismer placeret i gener, der koder for transkriptionsfaktorer eller andre regulatorfaktorer, der binder til regulatorregioner af cdh1-genet (trans-virkende DNA-polymorfismer). DNA-polymorfismen eller DNA-polymorfismerne kan også være en hvilken som helst DNA-polymorfisme eller hvilke som helst DNA-polymorfismer, der forårsager alternativ splejsning af cdh1-exons eller hvilke som helst andre forskelle i proteinsekvensen af eller mængden af et Cdh1-protein.

Især kan DNA-polymorfismen eller DNA-polymorfismerne i en hvilken som helst art være en eller flere DNA-polymorfismer, der forårsager aminosyreskift i den anden cadherin-gentagelse af et Cdh1-protein. Cadherin-gentagelserne er extracellulære, Ca2+-bindende domæner i Cdh1-proteinerne, som man ved er inddraget i proteindimerisering. Position 325 i Cdh1-1 er placeret i det andet cadherin-domæne af Cdh1-1.

Trinet med bestemmelse af tilstedeværelse eller fravær af polymorfismen eller varianten hos et individ kan udføres på en prøve udtaget fra individet. Prøven kan være en hvilken som helst prøve, der åbner mulighed for analyse af nukleinsyre- eller proteinmateriale, som er velkendt for en fagmand. For at undgå tvivl kan prøven være en muskelvævsprøve, en blodprøve, en leverprøve og/eller et finneklip.

Som nævnt ovenfor ved man, at cadherin spiller en central rolle i dannelsen af tætte celle-celle-adhæsioner. Følgeligt er det efter opdagelsen af koblingen med virusresistens på baggrund af den samlede forståelse af den fysiologiske rolle af cadherin rimeligt at udlede, at virusresistens kan opnås ved hjælp af en variantform af cadherin, der er i stand til at opretholde en fastere celle-celle-adhæsion end andre former af proteinet og derved begrænse muligheden for virions for at trænge ind i intercellulære rum for at placere deres sammenkoblingsproteiner. Følgeligt vil den foreliggende opfindelse forventes at have bred anvendelighed over for et hvilket som helst virus. Uden ønske om yderligere begrænsning, men for klarhedens skyld kan virusinfektionen være bursal sygdom (IBDV), infektiøs pankreasnekrose (IPN), pankreassygdom (PD), hjerte- og skeletmuskelinflammation (HSMI), infektiøs lakseanæmi (ISA) og kardiomyopatisyndrom (CMS).

Fagmanden vil være bekendt med alle tilgængelige metoder, der kan anvendes til test for tilstedeværelse eller fravær af en DNA-polymorfisme. Metoden kan for eksempel inddrage sekvensanalyse af laksen, der skal testes. Alternativt kan metoden inddrage enkeltbaseforlængelse af DNA-fragmenter, der terminerer i det polymorfe sted (f.eks. iPLEX-assays fra Sequenom og Infinium-assays fra lllumina), allelspecifik PCR (f.eks. SNPtype-assays fra Fluidigm eller KASPar-assays fra KBiosciences), eller kompetitiv hybridisering af prober, der er komplementære til de forskellige alleler (f.eks. TaqMan-assayet fra Applied Biosystems). Følgeligt er der i et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebragt en hybridiseringsprobe, der er specifik for en eller flere af ovennævnte DNA-polymorfismer. Hybridiseringsprober, der er selektive for disse DNA-sekvenser, kan udgøre en del af den foreliggende opfindelse. PCR-primere og forlængelsesprimere, der anvendes til genotypebestemmelse af DNA-polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse (i.e. bestemmelse af hvilke alleler af polymorfismerne, der er til stede i et hvilket som helst specifikt individ), kan udgøre en del af den foreliggende opfindelse. For eksempel er primere, der er egnet til genotypebestemmelse af polymorfismen, der svarer til position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1, vist den medfølgende sekvensliste. Mere specifikt er fremad-PCR-primeren, revers-PCR-primeren og forlængelsesprimeren, der anvendes til genotypebestemmelse af polymorfismen, der svarer til position 1065 i GenBank (udgave 205.0)-sekvens BT058864.1, på iPLEX-systemet fra Sequenom (San Diego, California, USA), vist som henholdsvis SEQ ID NO: 9, 10, og 11 i den medfølgende sekvensliste. SEQ ID NO: 9 - acgttggatg ctcactctgt ttaggtgacg SEQ ID NO: 10 - acgttggatg attaacccga atccctccag SEQ ID NO: 11 - gatccctcca gtcacag

Et individ, der forudsiges at have resistens over for infektiøs pankreasnekrose ifølge det første aspekt af den foreliggende opfindelse, har større sandsynlighed end normalt for at få afkom, der har en højere end normal chance for at have resistens over for virusinfektion. Følgeligt er der i et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebragt en fremgangsmåde til udvælgelse af et ikke-humant individ til anvendelse som yngledyr, hvor det ikke-humane individ udvælges på baggrund af forudsigelsen ved hjælp af fremgangsmåden ifølge det første aspekt af den foreliggende opfindelse, at det har resistens over for virusinfektion.

Omvendt vil et ikke-humant individ, der ved hjælp af fremgangsmåden ifølge det første aspekt af den foreliggende opfindelse forudsiges ikke at have resistens over for virusinfektion, ikke blive udvalgt som yngledyr.

Den foreliggende opfindelse angår også et isoleret polynukleotid, der omfatter en eller flere af enkelt-DNA-polymorfismerne, der er anført ovenfor.

Opdagelsen af, at specifikke former af proteinet cadherin er inddraget i bibringelse af virusresistens hos et individ, giver en forståelse af den terapeutiske anvendelighed for cadherin til genterapi. Yderligere arbejde udført af opfinderne understøtter denne konklusion. Opfinderne har været de første til at vise, at den virusresistente form af cadherin forhindrer celleinvasion af virions. Ydermere har opfinderne været de første til at påvise binding af virions til cadherin. Følgeligt er der i et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebragt en sammensætning, der omfatter et middel, der er i stand til at inducere ekspression af den resistente form af Cdh1 i en celle, som sammensætningen administreres til, og/eller et middel, der er i stand til at forhindre ekspression af den ikke-resistente form af Cdh1 i en celle, som sammensætningen administreres til. For eksempel kan et middel, der er i stand til at inducere ekspression af den resistente form af Cdh1 i en celle, som sammensætningen administreres til, omfatte et nukleinsyremolekyle, der koder for Cdh1, der indbefatter den resistente variant i en eller flere aminosyrepositioner i cadherin, og/eller et middel, der er i stand til at redigere genet for Cdh1 fra den ikke-resistente til den resistente form (f.eks. ved anvendelse CRISPR-procedurer). Endvidere betragtes som et aspekt af den foreliggende opfindelse en farmaceutisk sammensætning, der omfatter en hvilken som helst af ovennævnte sammensætninger og en hvilken som helst eller alle af et farmaceutisk acceptabelt bæremateriale, excipiens og/eller fortyndingsmiddel. Ydermere betragtes som et aspekt af den foreliggende opfindelse en sammensætning, der omfatter den ene eller begge af ovennævnte midler til anvendelse i en fremgangsmåde til behandling, hvor fremgangsmåden kan være en fremgangsmåde til behandling af virusinfektion, og fremgangsmåden til behandling kan være profylaktisk eller på anden vis. I et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse er tilvejebragt en fremgangsmåde til behandling af virusinfektion ved administration til et individ af en effektiv mængde af en sammensætning, der omfatter et nukleinsyremolekyle, der koder for cadherin, som indbefatter den resistente variant i en eller flere aminosyrepositioner i cadherin.

Alle træk ved det første aspekt af den foreliggende opfindelse kan ligeledes gælde for det andet eller yderligere aspekter af den foreliggende opfindelse. For eksempel kan cadherin, som der henvises til i aspekterne af den foreliggende opfindelse efter det første aspekt, være et hvilket som helst cadherin, der er nævnt ovenfor, for eksempel Cdh1.

Formen af sammensætning, der anvendes i ovennævnte farmaceutiske sammensætning og i de ovenfor beskrevne fremgangsmåder til behandling, der afhænger af den anvendte metode til overførsel af genet til værtscellen i individet, der skal behandles, vil være velkendt for en fagmand. Der er i det væsentlige to metoder, hvor den ene inddrager de kombattante virusvektorer til overførsel af genet til værtscellen (i.e. sammensætningen vil omfatte en rekombinant virusvektor, der indbefatter ovennævnte nukleinsyresekvens), og den anden inddrager nøgent DNA eller DNA-komplekser.

Fremgangsmåder til fremstilling og administration af nukleinsyremolekyler er forklaret detaljeret i forsøgsmanualer (Supplement of Experimental Medicine, Basic Technology i genterapi, Yodosha (1996); Supplement of Experimental Medicine, Experimental Fremgangsmådes i Gene Introduction og Ekspression Analysis, Yodosha (1997); Handbook for Development og Research of Genterapi, Japan Society of Genterapi ed., NTS (1999)).

Illustrative metoder til ikke-vektor-genoverførsel til celler indbefatter lipofektionsmetoden, calciumphosphat-cofældningsmetoden, DEAE-dextranmetoden, direkte DNA-indførlngsmetoder (muligvis ved anvendelse af mlkrogiasrør) og lignende.

Repræsentave metoder, der anvender virusvektorer, indbefatter de, der anvender virusvektorer, såsom rekombinant adenovirus, retrovirus og lignende. Mere specifikt kan genet af interesse indføres i et DNA- eller RNA-virus, såsom detoksificeret retrovirus, adenovirus, adenoassocieret virus, herpesvirus, vacciniavirus, poxvirus, poliovirus, Sindbisvirus, Sendai-virus, SV4G, human immundefektvirus (HiV) og iignende, som herefter inficeres i cellen til indførelse af genet i cellen.

Som metoder til indførelse af et genterapimiddel i en patient findes in vivo-metoder, der åbner mulighed for direkte indførelse af genterapimidlet i kroppen, og ex vivo-metoder, hvorved bestemte celler fjernes fra et menneske, genterapimidlet indføres heri, og disse efterfølgende tilbageføres i kroppen (Nikkei Science, April 1994 issue pp. 20 24; Monthly Yakuji, 36(1): 23 48 (1994); Supplement til Experimental Medicine 12 (15) (1994); Handbook for Development og Research of Genterapi, NTS (1999)). Ifølge den foreliggende opfindelse foretraakkes in vivo metoden.

Doseringsformer kan antage forskellige former i overensstemmelse med de forskellige administrationsregimer, der er beskrevet ovenfor (for eksempel væsker). Når for eksempel der skal anvendes en injektion, der indeholder genet som en effektiv bestanddel, kan injektionen fremstilles ved opløsning af den eller de effektive bestanddele i et standard-opløsningsmiddel (en buffer, såsom PBS, fysiologisk saltvand, sterilt vand osv.). Injektionsvæsken kan herefter filtersteriliseres med filter efter behov og fyldes i steriliserede beholdere. Traditionelle bærematerialer osv. kan tilsættes til injektionen. Liposomer, såsom HVJ-liposom, kan have form som suspensioner, frosne formuleringer, centrifugerings-koncentrerede frosne formuleringer og iignende.

Korrekte administrationsmetoder og -steder, der er passende i forhold til sygdommen eiler symptomet, der skal behandles, udvælges til genterapimidlet ifølge denne opfindelse. Som administrationsmetoder foretrækkes parenteraie administrationsmetoder.

Eksempler på parenteraie administrationsmetoder indbefatter administration ved bjæip af ikke-invasivt kateter, ikke-invasiv injektor osv. Mere foretrukkent er administrationsmetoder, der benytter ikke-invasivt kateter, ikke-invasiv injektor og lignende under anvendelse af ultralyd.

Udtrykket “DNA-polymorfismeallel” har dets normale betydning, som vil være velkendt for en fagmand. For at undgå tvivl kan “DNA-polymorfismeallel” betyde den ene af to forskellige nukleotidsekvenser på stedet for en DNA-polymorfisme ifølge den foreliggende opfindelse (hvor den ene allel er “resistensallelen”, og den anden er “ikke-resistensallelen”).

Udtrykket “ortolog” har dets normale betydning, som vil være velkendt for en fagmand. For at undgå tvivl kan udtrykket betyde et hvilket som helst gen, der findes i én art, som svarer til et gen, der findes i en anden art, hvor de to gener har den samme funktion (f.eks. evnen til at danne celle-celle-adhæsioner) og har et fælles stamgen.

Den foreliggende opfindelse vil nu blive beskrevet ved hjælp af eksempel med henvisning til de ledsagende figurer, hvori:

Figur 1 viser en multipel alignment af cadherin-proteiner fra forskellige arter. “Ssa-1” er proteinsekvensen for Cdh1-1 fra atlantisk laks, mens “Kylling”, “Menneske”, “Svin” og “Kvæg” er proteinsekvenserne for Cdh1 (epihel-cadherin)-ortologerne fra henholdsvis Gallus gallus, Homo sapiens, Sus scrofa og Bos taurus. GenBank (udgave 205.0)-identifikatorerne for sekvensen fra laks (“Ssa-1”), kylling, menneske, svin og kvæg i figur 1 er henholdsvis ACN10577.1, P08641.2, NP_004351.1, NP_001156532.1 og NP_001002763.1.

Figur 2 er en graf, der viser det indbyrdes forhold mellem faktisk genotype og tildelt genotype (den genotype, dyret fik tildelt ved anvendelse af DNA-polymorfismen, der svarer til position 1065 af BT058864.1 (BT058864.1_1065 TC)) for 340 dyr fra AquaGen-ynglekernen.

Figur 3 viser IPN-virusniveauerne (Ct-værdier efter Taq-Man®-realtidsanalyse for IPNV) hos fisk med forskellige genotyper (i DNA-polymorfismen, der svarer til position 1065 i BT058864.1 (BT058864.1_1065-TC)) indsamlet på dag 2, 4, 6, 7, 8, 10 og 12 efter forsøgsprovokation. Baseret på tærskelværdien for den diagnostiske test er prøver negative efter 37 cyklusser, og til illustrationsformål er negative fisk tildelt en værdi på 1. Værdierne er normaliseret mod ekspressionen af referencegenet forlængelsesfaktor-1 -alfa. qq = ingen kopier af resistensallelen i BT058864.1_1065-TC, Qq = én kopi af resistensallelen i BT058864.1_1065-TC, QQ = to kopier af resistensallelen i BT058864.1_1065-TC.

Figur 4 viser en immunfluorescensanalyse af leverceller. Leverskiver fra qq og QQ atlantiske laks (henholdsvis ikke-resistente og resistente baseret på en analyse ved anvendelse DNA-polymorfismen, der svarer til position 1065 i GenBank-sekvens BT058864.1 (BT058864.1_1065-TC)) blev dyrket og inficeret med IPNV in vitro. Synliggørelse af IPN-virions blev udført ved anvendelse af immunfluorescens med et polyklonalt antistof fra kanin, der var specifikt for IPNV. Positive signaler ses som hvide pletter eller aggregater i kraftigt inficerede celler. A) Ikke-resistente fisk (qq) viser en udbredt infektion med virions på overfladecellerne samt i hepatocytter, der er placeret inde i vævsskiven. B) Hos resistente dyr ses kun nogle få IPNV-partikler, der er fanget på overfladen af skiven.

Figur 5 viser dødeligheden for AquaGen-atlantisk laks-familier fra 2005-årgangen, der er forbundet med et udbrud af pankreassygdom ved en kyst i Vestnorge. Familierne er inddelt efter deres yngleværdierfor IPN-resistens: 1: lave, 2: middel til lave, 3: middel til høje eller 4: høje yngleværdierfor IPN-resistens.

Figur 6 viser gennemsnitlig dødelighedsrate som følge af pankreassygdom hos afkom fra individuelle forældrefisk kategoriseret efter de parentale genotyper for IPN-resistens: qq = ingen kopier af resistensallelen i BT058864.1_1065-TC, Qq = én kopi af resistensallelen i BT058864.1_1065-TC, QQ = to kopier of resistensallelen i BT058864.1_1065-TC.

Figur 7 viser histopatologiske scorer for hjertemuskel og exokrin pankreas hos fisk med forskellig genotype for IPN-QTL 28 dage efter provokation med PD-virus (SAV-3-variant).

Figur 8 viser resultater af en co-immunfældningsundersøgelse (Co-IP), der bekræfter direkte binding af Cdh1-1 til IPNV. 1. Konstruktion afen referencesekvens af QTL-regionen

Der er tidligere blevet påvist et QTL for resistens over for IPN på kromosom 26 hos atlantisk laks (Houston et al. 2008, Moen et al. 2009). Ved starten af undersøgelsen, der er beskrevet i den foreliggende ansøgning, antog vi, at QTL’et var forårsaget af en enkelt, tilgrundliggende (forårsagende) mutation. Endvidere antog vi, at den forårsagende mutation havde to alleler, én allel (Q), der er forbundet med resistens over for IPN, og én allel (q), der er forbundet med modtagelighed (ikke-resistens). Individuelle dyr kunne (ved analyse af omfattende genetiske datasæt) tildeles en QTL-genotype, der afspejlede, hvilken kombination af QTL-alleler (QQ, Qq eller qq) dyret havde. QTL-regionen blev defineret som den region af genomet fra atlantisk laks, hvor man på baggrund af tidligere resultater (Moen et al., 2009) forventede, at den eller de forårsagende mutation(er), der lå til grund for QTL’et, ville være placeret med en tæt på 100 % sandsynlighed. Mere specifikt blev QTL-regionen defineret som regionen mellem SNP’erne ESTNV_31602_808 og GCR_cBin30387_Ctg1_91 på atlantisk laks-SNP-koblingskortet (Lien et al., 2011). Atlantisk laks-genomet var på dette tidspunkt endnu ikke blevet sekventeret. For at identificere den eller de forårsagende mutation(er) var vi derfor nødt til at konstruere en referencesekvens for QTL-regionen. Bakterielt kunstigt kromosom (BAC)-kloner, der matchede de to ovennævnte SNP’er, blev isoleret fra et eksisterende BAC-bibliotek (Thorsen et al., 2005). På baggrund af et fysisk kort fremstillet fra dette bibliotek (vvvvvv.asalbase.org) blev der lavet et minimalt overlappende forløb af 31 BAC’er, der forbandt de to flankerende BAC’er1. Atlantisk laks-genomisk DNA blev ekstraheret fra hvert BAC. Et individuelt mærket parret ende-bibliotek (med en gennemsnitlig indsatstørrelse på 350 bp) blev lavet for hver BAC-DNA-prøve, hvorpå prøverne blev sekventeret på en HiSeq 2000-maskine (lllumina Inc., San Diego, USA) til en gennemsnitsdybde på ca. 800 gange haploid genomdækning. Efter fjernelse af resterende adaptersekvenser, kassering af for korte sekvensresultater, trimning af enderne af sekvensresultater af dårlig kvalitet og matchning af parret ende-sekvensresultater blev der lavet en de novo-samling i hvert BAC ved anvendelse af “clc_novo_assemble”-programmetfra “CLC Assemble Cell”-sættet (CLC Bio, Aarhus, Danmark). Phrap version 1.090518 (http://phrap.ora.) blev herefter anvendt til samling af individuelle BAC-contig-sekvenser til et sæt af contigs, der spænder over alle BAC’er. Endelig blev contigs’ene fra denne reference kombineret til én fortløbende genomisk sekvens ved aligning af denne med skeletter fra en indledende version atlantisk laks-genomsekvensen (der var lavet internt ved anvendelse af Celera Assembler-softwaren baseret på data fra de første 27 batches af sekvenser, der var fremsendt af sekventeringsprojektet til NCBI Trace Archive). Denne genomiske sekvens vil i det følgende blive benævnt “referencesekvensen”. 2. Udvægelse af dyr til næste-generations-sekventering 45 atlantiske laks fra den norske ynglekerne ved Aqua Gen AS blev udvalgt til massiv parallelsekventering på lllumina HiSeq 2000. Disse 45 laks blev alle udvalgt fra forældrefisk fra 2005- og 2008-årgangene af Aqua Gen-ynglekernen. Alle laks i Aqua Gen-ynglekernen er 1 Det minimalt overlappende forløb består af følgende BAC’er: S0042J22, S0004K18, S0161004, S0243D12, S0076E15, S0021H01, S016F10, S0258L08, S0119L01, S0026N22, S0162J03, S0259M06, S0120019, S0048P16, S0170B06, S0262M03, S0126K07, S0063G22, S0201A04, S0282P22, S0457C13, S0066E05, S0215J07, S0344A15, S0001F22, S0115B04, S0227H08, S0449E20, S0001N03, S0160J02, S0236E20. Informatioom BAC’erne kan findes på www.asalbase.org. descendenter af laks fanget i norske elve. Udvælgelsen af dyr blev foretaget som beskrevet i følgende afsnit. 454 helsøskendegrupper af atlantisk lakseyngel blev IPN-provokeret i individuelle tanke kort efter fodringsstart (protokollen for provokationstesten kan findes i Moen et al., 2009). Forældrefiskene til disse helsøskendegrupper (i det følgende benævnt “kortlægningsforæld refiskene”) vil blive meget centrale for undersøgelsen, der er beskrevet i denne ansøgning. Helsøskendegrupperne bestod af 103 fisk (i gennemsnit), og der blev indsamlet vævsprøver fra de 10 første, der døde, i gruppen samt 10 overlevende (eller de 10 sidste, der døde), hvorfra DNA blev ekstraheret ved anvendelse af DNAeasy-kittet fra QIAGEN (QIAGEN, Venlo, Holland). Fra 206 udvalgte helsøskendegrupper blev angrebet og overlevende afkom genotypebestemt med tre mikrosatellitmarkører placeret i QTL-regionen, Alu333, Ssa0384BSFU/ii og Ssa0285BSFU, hvorpå koblingsfasen mellem alleler af de tre mikrosatelliter blev identificeret i hver kortlægnings-forælderfisk ved anvendelse af den observerede co-segregation af alleler fra forældrefisk til afkom (genotypebestemmelse af mikrosatellitmarkører er diskuteret mere detaljeret i ovennævnte Moen 2009-artikel). Denne genotypebestemmelse blev udført på en iterativ måde, således at til sidst næsten alle helsøskendegrupper, der kunne tænkes at have mindst én QTL-heterozygot forælder (se nedenfor) var genotypebestemt. En chi i anden-test blev anvendt til test for co-nedarvning af tre-mikrosatellit-haplotypen og den ramte/resistente fænotype, som førte til identificering af 110 QTL-heterozygote kortlægnings-forældrefisk. Ved anvendelse af data fra disse QTL-heterozygote kortlægnings-forældrefisk blev der lavet en tabel, der koblede alleler i tre-mikrosatellit-haplotypen til QTL-alleler. (Hvis en tre-mikrosatellit-allel viste sig at være koblet til både Q og q blev kun den mest fremherskende koblingsfase indført i tabellen). Denne tabel blev herefter anvendt til ekstrapolering af QTL-genotyper hos kortlægnings-forældrefiskene, der blev fundet QTL-homozygote, samt for andre dyr fra Aqua Gen-ynglekernen. 22 Aqua Gen-dyr, for hvilke det på denne måde blev udledt, at de havde QTL-genotypen QQ (i.e. forventedes at give god IPN-resistens), samt 23 Aqua Gen-dyr, der på samme måde viste sig at have qq-genotypen (i.e. forventedes at give dårlig IPN-resistens), blev udvalgt til efterfølgende helgenomsekventering. Disse sæt af 22 og 23 dyr blev sat sammen på en måde, at slægtskabet mellem dyr i gruppen blev minimeret ved maksimering af diversiteten af tre-mikrosatellit-alleler i hver gruppe. 3. Indsnævring af QTL-regionen ved næste-generations-sekventering

Ovennævnte 23 QQ-dyr og 22 qq-dyr blev sekventeret ved anvenelse af HiSeq2000-teknologi fra lllumina. Individuelt mærkede parret-ende-biblioteker blev fremstillet fra hver prøve, før prøver blev puljet til sekventering. Der blev i alt frembragt 264 x 109 sekvensresultater svarende til en pr.-dyr-dækning på to gange det haploide genom. Sekvensresultaterne blev alignet med referencesekvensen ved anvendelse af bowtie2 ved standardindstillinger (der blev udført både uparret- og parret-ende-alignments) med efterfølgende fjernelse af alignments med en Phred-gradueret p-værdi under 30 ved anvendelse af “vis”-funktionen i Samtools. Sekvensresultaterne blev alignet puljevis, i.e. alle sekvensresultater fra QQ-dyr var del af én samling, og alle sekvensresultater fra qq-dyr var del af en anden samling. SNP’er og korte insertioner/deletioner (indels) blev identificeret med Freebayes (http://arxiv.Org/abs/1207.3907) ved anvendelse af følgende streng til indstilling af værdien af parametre, der er relevante for denne alignment: "--use-best-n-alleles 2 --read-maxmismatch-fraction 0.02 --min-alternate-total 3 --no-marginals — left-align-indels -pooled —ploidy 90" (se https://wiki.gacrc.uga.edu/wiki/Freebaves for forklaringer til parametrene). Fishers eksakte test blev anvendt til test for uafhængighed mellem QTL-allel og SNP/indel-allel i sekvensresultater. SNP’erne med den mest signifikante statistik fra denne test blev genotypebestemt i de 110 QTL-heterozygote kortlægnings-forældrefisk nævnt ovenfor samt i det provokationstestede afkom fra disse dyr, og Fishers eksakte test blev udført på parentale haplotyper udledt fra dette datasæt til test for uafhængighed mellem SNP-alleler og QTL-alleler. Korrelationskoefficienten (r2) mellem alleler i SNP og i QTL, som er et mål for graden af koblings-uligevægt (LD) mellem loci, blev også beregnet for hver SNP ved anvendelse af “LD”-funktionen i def’genetiske” modul af R-statistikprogramsættet. Disse analyser identificerede én SNP og to indels, hvis genotyper var kraftigst (blandt alle de testede polymorfismer) forbundet med udledte genotyper i QTL. Disse polymorfismer var i perfekt koblings-uligevægt (LD) med hinanden, og deres co-segregation med QTL var yderst signifikant (P-værdi = 1,62 x 10'28, Fishers eksakte test for forbindelse mellem QTL-allel og SNP/indel-allel i haplotypekopier udledt fra QTL-heterozygote kortlægnings-forældrefisk). Korrelationskoefficienten (r2) mellem alleler i QTL og alleler i SNP/indel var 0,57. SNP og de to indels var placeret i en 26 kbp region, der indeholdt to fuldlængde-gener, ét epitel-cadherin-gen (cdh1-1) og genet fam96b. Endvidere blev et afkortet (manglede adskillige exons) epitel-cadherin-gen (cdh1-2) påvist opstrøms for cdh1-1.

4. Identifikation af BT058864.1_1065-TC

Cdh1-1 er en lakseversion placeret på kromosom 26 af et protein, som, man ved, er ansvarligt for Ca2+-afhængig celle-celle-adhæsion i epitelvæv hos mange forskellige arter. Som anført ovenfor har vi identificeret én SNP og to indels i umiddelbar nærhed af dette gen. Disse tre polymorfismer var emnet for vores tidligere patentansøgning.

Cdh1-1 blev amplificeret og sekventeret ved anvendelse af cDNA fra 29 forskellige QQ eller qq atlantiske laks fra Aqua Gen-populationen som template. Dyrenes QTL-genotype var blevet udledt ved anvendelse af en tre-mikrosatellit-haplotype som beskrevet ovenfor. cDNA’et blev udledt fra mRNA ekstraheret fra prøver udtaget fra voksne laks eller fra lakseyngel ved prøveindsamling underen provokationstest for IPN-resistens. 11 forskellige fragmenter blev PCR-amplificeret ved anvendelse af 11 forskellige primerpar. PCR-primerne blev konstrueret, således at der for hver primer var mindst to nukleotid-fejlparringer mellem primersekvensen og nukleotidsekvensen foren tredje kopi af epitel-cadherin-genet placeret på kromsom 11 (der ovenfor er benævnt cdh1-3). PCR-produkterne blev sekventeret direkte ved anvendelse af BigDye Terminator v3.1-sekventeringskittet (Applied Biosystems,

Carlsbad, USA) på en Applied Biosystems 3730-DNA-analysator. phredPbrap.pl-skriptet, der benytter Phred og Phrap (http://www.phrap.orq/phredphrapconsed.html), blev anvendt til basecalling, kvalitetsværditildeling og alignment af sekvensresultater. PolyPhred (http://drooq.gs.washington.edu/polyphred/) blev anvendt til variantpåvisning, og Consed (http://www.phrap.org/phredphrapconsed.htmD blev anvendt til synliggørelse af contigs og PolyPhred-påvist variation. På baggrund af DNA-sekvenserne for de amplificerede fragmenter viste en SNP sig at fremvise en særlig stor kontrast mellem de to genotypegrupper. Positionen af SNP’en svarede til position 1065 i GenBank-sekvens BT058864.1, og den havde to alleler, thymin og cytosin. SNP’en vil derfor i det følgende blive benævnt BT058864.1_1065-TC. BT058864.1_1065-TC havde genotype TT i alle 17 qq-dyr og genotype CC i alle undtagen to af de 12 QQ-dyr (de afvigende QQ-dyr havde genotyperne TT og CT). BT058864.1_1065-TC blev herefter genotypebestemt hos 340 forældrefisk fra 2005-årgangen af Aqua Gen-ynglepopulationen, herunder de fleste af de QTL-heterozygote kortlægnings-forældrefisk nævnt ovenfor. Disse 340 dyr havde alle fået tildelt en “faktisk” QTL-genotype som beskrevet ovenfor. Hvis man antager, at BT058864.1_1065-TC-genotyperne TT, CT, og CC svarede til QTL-genotyperne henholdsvis qq, Qq, og QQ, blev 306 ud af 340 dyr tildelt den korrekte genotype (figur 2). Disse resultater viste, at genotyper i BT058864.1_1065-TC er kraftigt korreleret med genotyper i QTL’et. På baggrund af de samme data fandt man også, at BT058864.1_1065-TC var i perfekt koblings-uligevægt med de tre ovennævnte DNA-polymorfismer, som man allerede havde fundet var kraftigt korreleret med IPN. Til forskel fra disse 3 DNA-polymorfismer fører BT058864.1_1065-TC dog til en ændring i aminosyresekvensen for Cdh1-1. SNP’en forårsager et prolin-til-serin-skift på en overflade-eksponeret del af det andet extracellulære cadherin (EC)-domæne af proteinet (også kaldet cadherin-tandemgentagelsesdomæne). Prolin er en aminosyre, der bibringer konformationelle begrænsninger til proteinerne, som den er en del af, på grund af den usædvanlige struktur af aminosyresidekæden. Det er derfor sandsynligt, at prolin-til-serin-aminosyreskiftet vil have store konsekvenser for proteinets egenskaber. 5. Påvisning af reduceret dødelighedsrate og reduceret virusantal hos laks, der bærer IPN-resistensallelen.

En provokationstest blev udført atlantisk lakseyngel, der var descendenter fra Aqua Gen-ynglepopulationen. Yngel med en gennemsnitsvægt på 0,2 gram ved start på fodring blev overført til forskningscenteret (Havbruksstasjonen, Tromsø, Norge) og fik mulighed for én uges akklimatisering før provokation. Forsøget blev udført af Nofima AS (Tromsø, Norge). 1600 stk. yngel, der tilhørte tre forskellige grupper af fisk, blev indbefattet i forsøget, der blev udført i 8 forskellige tanke, 200 stk. yngel i hver tank. De tre grupper var forskellige i frekvensen af IPN-resistensmarkøren (i.e. BT058864.1_1065-TC): resistent gruppe - frekvens af gunstig allel 0,84, intermediær gruppe - frekvens af gunstig allel 0,45 og modtagelig gruppe - frekvens af gunstig allel 0,22. Ynglen blev badprovokeret ved tilsætning af infektiøst pankreasnekrosevirus ved en koncentration på 105 TCID50/ml vand. Normal strømning blev sat på pause, idet vandet blev gennemluftet, og strømningen blev sat igang igen efter 3 timer. Fisk blev udtaget på dag 2, 4, 6, 7, 8, 10 og 12 efter provokation. Leverne af de udtagne fisk blev forsigtigt dissekteret og anbragt i RNAIater (Qiagen) til senere bestemmelse af virusmængde (se nedenfor). Forsøget blev afsluttet 34 dage efter provokationen. Ved afslutningen blev 10 overlevende stk. yngel udtaget fra hver af de otte tanke til bestemmelse af bærerstatus. Halerne af alle udtagne fisk blev frosset før DNA-ekstraktion og efterfølgende udledning af QTN-alleler. I den resistente gruppe var dødeligheden, der var forbundet med IPN, kun 1,3 %. I modsætning hertil varden IPN-forbundne dødelighed i den intermediære og den modtagelige gruppe henholdsvis 22,3 % og 52,5 %, hvilket viser, hvordan markørassisteret udvælgelse i signifikant grad reducerer omfanget af IPN-induceret dødelighed. For at vurdere, om fisken var i stand til at modstå infektion eller blot at overleve en infektion, blev IPN-virus kvantificeret hos de overlevende fisk fra provokationstesten ved anvendelse af en Taq-Man-realtids-RT-qPCR-analyse udført af et akkrediteret kommercielt laboratorium (PatoGen Analyse AS, Ålesund, Norge) og sammenlignet med ekspressionen af et referencegen (forlængelsesfaktor- 2-a). Blandt de overlevende fra den modtagelige, den intermediære og den resistente gruppe var henholdsvis 90 %, 60 % og 10 % bærere af virusset. En tilsvarende tendens blev fundet i prøver udtaget dag 2, 4, 6, 7, 8, 10 og 12 efter infektion (dpi), hvor kun qq-fisk viste de høje virusniveauer, der er kendetegnende for syge/døende fisk (se figur 3). Udelukkende QQ-fisk fra den resistente gruppe var overvejende negative, bortset fra nogle få positive fisk med meget lave virusniveauer, hvorimod heterozygote fisk (der har begge alleler) havde intermediære niveauer. Resultaterne indikerede såldes, at Q-alleler fungerer ved at forhindre virusset i at inficere celler i stedet for at hjælpe fisken med at overleve ved forekomst af infektion. 6. Test af IPNV-infektion

Opfinderne har vist, at atlantiske laks, der som beskrevet ovenfor er forudsagt at være resistente over for IPN, er meget mere resistente over for IPN end atlantiske laks, der er forudsat ikke at være resistente over for IPN. Endvidere har de vist, at IPN-virusset ikke trænger ind i hepatocytter dyrket in vitro fra resistente laks, hvorimod det trænger ind i hepatocytter, der dyrkes på tilsvarende vis, fra modtagelige celler.

Til test af IPNV-infektion in vitro blev resistente og modtagelige laks (identificeret som sådan ved hjælp af fremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse) aflivet, og leverbiopsier blev indlejret i 2,5 % agarose med ultralavt smeltepunkt opløst i Hanks buffer. Leversnit på 250 mm blev fremstillet i iskold Hanks buffer ved anvendelse afen vibratom (Compressotome VF300, Precisionary Instruments, USA) og overført til L15 Glutamax med 1% PenStrep (Life Technologies, USA). Efter 24 timer i kultur ved 15 °C var henholdsvis 90 % af overfladecellerne og alle celler i vævet levedygtige. De organotypiske leverkulturer blev provokeret med IPNV og inkuberet natten over, vasket i iskold Hanks buffer og herefter fikseret ved anvendelse frysesubstitution ved -100 °C. I korte træk blev snittene blev frosset i isobutanol ved -100 °C i 3 minutter og herefter overført til ren ethanol også ved -100 °C. Snittene blev langsomt bragt til stuetemperatur efter mindst 3 dage ved -80 °C. Immunfluorescens blev udført ved anvendelse af antistoffer mod IPNV (1), Cdh1 (Dako, Danmark) og clathrin (Abeam, UK). I korte træk blev snittene rehydreret og blokeret med 4 % tørmælk i PBS med 0,4 % saponin (PBSS). Efter inkubering natten over med primære antistoffer fortyndet i PBSS blev Alexa-konjugerede sekundære antistoffer (Life Technologies) tilført i 2 timer efter omhyggelig vask. Snittene blev monteret med 2,2’-thiodiethanol efter vask med PBSS og undersøgt i et fluorescensmikroskop (Zeiss Axio Observer, Carl Zeiss Microimaging GmbH, Tyskland). Billeder af snit fra modtagelige fisk viste en udbredt IPNV-infektion (se figur 4). Virusset var til stede over hele vævsskiven og viste intracellulær forekomst. På overfladen af hepatocytterne var IPNV placeret sammen med cdh1 og clathrin i tidlige clathrinbelagte pits, der dannede tidlige endosomer. Disse fund tyder på, at IPNV trænger ind i celler ved binding til cdh1, og efterfølgende indtrængen afhænger af clathrin-medieret endocytose. En analyse af leversnit fra resistente fisk viste tilstedeværelse af kun nogle få vira og kun på overfladen af snittet. Disse vira er antageligt indfanget af cellulært debris. IPNV blev aldrig påvist i vævet, og der blev ikke observeret lokalisering af IPNV sammen med cdh1 eller clathrin. 7. Undersøgelse af pankreassygdom 7.1 Indførelse af pankreassyqdom

Pancreassygdom (PD) er en viral fiskesygdom med signifikant indvirkning på lakse-akvakulturer i Norge, Skotland og Irland. Sygdommen forårsages af et medlem af Togaviridae-familien, et alfa-virus, der kaldes salmonid alfa-virus (SAV). Nogle stammer af virusset forårsager en beslægtet sygdom (sovesyge) hos regnbueørred i opdræt i adskillige europæiske lande. Udbrud af PD kan forekomme på alle stadier af den marine produktionscyklus for atlantisk laks (McLoughlin & Graham, 2007), og dødelighedsrater kan ligge i intervallet fra 0 % op til 50 % dødelighed. Kliniske tegn er kendetegnet ved pludseligt tab af appetit, letargi, fremkomst af fækale afkast i netburet og en stigning i dødeligheden. En signifikant del af de overlevende vil ikke vokse og blive vantrivninger. En histopatologisk undersøgelse af fisk, der lider af PD, viser pankreasnekrose, myokardiedegeneration samt inflammation af hjerte- og skeletmuskler. Vaccination har vist sig at give nogen, men ikke fuld beskyttelse mod sygdommen. 7.2 Feltundersøgelse 21.725 fisk fra 394 familier blev overført til en lokalitet på Norges vestkyst i maj 2006, i en region, hvor man ved, at SAV-3-varianten af PD-virusset har en endemisk udbredelse. Familierne stammede fra ca. 400 forældrefisk, hvor hver han var blevet krydset med to moderfisk og omvendt. Familierne blev inddelt efter deres yngleværdi for IPN-resistens på baggrund af resultaterne i en forudgående IPN-provokationsundersøgelse til at have: 1: lave, 2: middel til lave, 3: middel til høje eller 4: høje yngleværdierfor IPN-resistens. Et udbrud af pankreassygdom startede i april 2007 og resulterede i et samlet tab på 13,6 % af fiskene på stedet. Den samlede dødelighed for populationen samt de PD-specifikke dødeligheder var lavest i familierne med høj eller middel til høj IPN-resistens (figur 5). Der blev udtaget vævsprøver fra ca. 50 % af de døde fisk. Individuelle prøver blev knyttet til forældrepar ved anvendelse af et panel af 9 mikrosatellitmarkører, hvor 936 dyr blev succesfuldt knyttet til et forældrepar. Dødelighedsraten inden for en familie lå i intervallet fra 0 % til 36 %. Dyr med to kopier af højresistensallelen (QQ) for BT058864.1_1065-TC viste sig at være mere resistente over for PD end dyr, der bar én eller to kopier af lavresistensallelen (Qq eller qq (p-værdi = 0,12) (figur 6). 8. Provokationsundersøgelse til test af beskyttelsen af IPN-QTL-markørerne mod pankreassygdom I oktober 2011 blev gydefisk, der tidligere var genotypebestemt for IPN-QTL-genotypemarkørerne, udvalgt som forældrefisk til en batch af testfisk (i.e. ved anvendelse af IPN-resistensmarkøren BT058864.1_1065-TC). 6 hunner med qq-genotypen og 4 hunner med QQ-genotypen blev anvendt sammen med 4 hanner med qq-genotypen og 6 hanner med QQ-genotypen. Der blev lavet 100 kryds mellem disse fisk, som resulterede i batches af afkom, som bar qq-, Qq- eller QQ-genotyperne. Kun afkom med qq- og QQ-genotyperne blev anvendt til en pankreassygdoms-provokationsundersøgelse. Fiskene blev opdrættet i ferskvands-klækningsanlægget AquaGen Kyrksæterøra Norge, PIT-mærket og vaccineret ved anvendelse afen kommerciel vaccine, der kun indeholdt bakterieantigener, før transport til VESO Vikan reshvert-stationen ved ca. 75 gram. Provokationen blev udført i ferskvand ved 15 °C. 60 fisk af hver genotype blev holdt i den samme tank sammen med 20 % virusspredningsfisk, der forinden var injiceret med et norsk SAV-3-isolat af PD-virusset. 12 fisk fra hver genotype blev indsamlet 18 dage efter provokation, og PD-infektion blev bekræftet ved hjælp af realtids-RT-PCR-påvisning af SAV-3-virusset i hjerterne fra fisk fra alle de tre genotypekategorier. 28 dage efter provokation blev hjerte, pankreas og muskel (rød og hvid muskel) indsamlet fra de resterende fisk i tanken (48 fisk i hver gruppe af fisk) til undersøgelse for histopatologi. Der var ingen dødelighed som følge af PD i løbet af provokationsperioden. Prøver blev blindet og klargjort, undersøgt og vurderet for histopatologi af Aquatic Veterinary Services, Belfast, Irland, ved anvendelse af et semikvantitativt scoresystem, der omfattede intervallet fra 0 til 4 afhængig af sværhedsgraden aflæsionerne. Der blevudført en statistisk undersøgelse af resultaterne, som viste en signifikant lavere frekvens af hjertelæsioner hos fisk af Qq- og QQ-genotyperne. Der var også en tendens mod en lavere frekvens af pankreas- og muskellæsioner hos Qq- og QQ-fiskene (figur 7). Det blev således bekræftet, at fisk, der bærer IPN-QTL, fremviser en højere resistens også over for PD-virusset. 9. Virus/cadherin-bindingsundersøgelse

Co-immunfældning blev udført ved anvendelse af et IPNV-specifikt polyklonalt antistof bundet til protein A-belagte magnetiske korn. I korte træk blev et proteinlysat fremstillet fra en lakselever og blandet med IPNV i 30 minutter før tilsætning af de belagte magnetiske korn og inkubation i 30 minutter. Efter selektiv ekstraktion af protein-IPNV, der var bundet til de magnetiske korn, blev eluatet udsat for SDS-PAGE-gelelektroforese sammen med et leverproteinlysat (positiv Cdh1-1-kontrol) og en negativ kontrol-co-immunfældningsreaktion uden IPNV. Efter gelseparering blev proteinerne overført til en membran, og Cdh1 -1, der var immunfældet ved hjælp af IPNV, blev påvist ved anvendelse af et specifikt antistof mod Cdh1- 1. Tilstedeværelsen af Cdh1-1 i gelen viser klart, at IPNV binder til Cdh1-1-proteinet. Se resultaterne i figur 8.

Referencer

Granzow H, Weiland F, Fichtner D and Enzmann PJ (1997) Studies of the ultrastructure and morphogenesis offish pathogenic viruses grown i cell culture. Journal of Fish Diseases 20: 1-10

Falk K, Namork E, Dannevig BH (1998) Characterization and applications of a monoclonal antibody against infectious salmon anaemia virus. Dis Aquat Organ 8: 77-85.

Houston RD, Haley CS, Hamilton A, Guy DR, Tinch AE, Taggart JB, McAndrew BJ, Bishop SC (2008) Major quantitative trait loci affect resistance to infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon (Salmo salar). Genetics 178: 1109-15.

Houston RD, Davey JW, Bishop SC, Lowe, NR, Mota-Velasco JC et al. (2012) Characterisation of QTL-linked og genome-wide restriction site-associated DNA (RAD) markers i farmed Atlantic salmon. BMC Genomics 13: 244.

KuznarJ, Soller M, Fabias G, Espinoza JC (1995) Attachment og entry of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) into CHSE-214 cells. Arch Virol 140: 1833-40.

Lien S, Gidskehaug L, Moen T, Hayes BJ, Berg PR, Davidson WS, Omholt SW, Kent MP (2011) A dense SNP-based linkage map for Atlantic salmon (Salmo salar) reveals extended chromosome homeologies og striking differences in sex-specific recombination patterns. BMC Genomics 12: 615.

Madsen and Jensen (2008) DMU: A user's guide. A package for analysing multivariate mixed models, version 6, release 5.0. Århus Universitet, Tjele, Danmark.

McLoughlin MF, Graham DA (2007). Alphavirus infections in salmonids. A review. J. Fish Dis. 30:511-531.

Moen T, Hayes B, Baranski M, Berg PR, Kjøglum S, Koop BF, Davidson WS, Omholt SW, Lien S (2008) A linkage map of the Atlantic salmon (Salmo salar) based on EST-derived SNP markers. BMC Genomics 9: 223.

Moen T, Baranski M, Sonesson AK, Kjøglum S (2009) Confirmation and fine-mapping of a major QTL for resistance to infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon (Salmo salar): population-level associations between markers and trait. BMC Genomics 10: 368.

Palacios G, Lovoll M, Tengs T, Hornig M, Hutchison S et al. (2010) Heart and Skeletal Muscle Inflammation of Farmed Salmon Is Associated with Infection with a Novel Reovirus. PLoS ONE 5: e11487

Shifman S, Kuypers J, Kokoris M, Yakir B, Darvasi A (2003) Linkage disequilibrium patterns of the human genome across populations. Human Molecular Genetics 12: 771-776.

Thorsen J, Zhu B, Frengen E, Osoegawa K, de Jong, PJ, Koop BF, Davidson WS, Høyheim B (2005) A highly redundant BAC library of Atlantic salmon (Salmo salary an important tool for salmon projects. BMC Genomics 6: 50.

Yoon M, Spear PG (2002). Disruption of adherens junctions liberates nectin-1 to serve as receptor for herpes simplex virus and pseudorabies virus entry. J Virol. 76:7203-8.

Claims (25)

1. Fremgangsmåde til forudsigelse af resistens overfor en virusinfektion hos et individ, hvilken fremgangsmåde omfatter bestemmelse i en prøve fra individet af varianten, der er til stede i en eller flere aminosyrepositioner i et cadherin-protein, og/eller allelerne, der er til stede i en eller flere DNA-polymorfismer i genet for cadherin, og forudsigelse af, hvorvidt eller ikke individet er resistent overfor virusinfektion på baggrund af bestemmelsen af varianten og/eller allelerne.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor DNA-polymorfismen er udvalgt blandt en hvilken som helst eller flere, der findes i: a. nukleinsyresekvensen, der koder for et domæne af cadherin, der er forbundet med dimerisering af cadherin; b. nukleinsyresekvensen, der koder for et ekstracellulært domæne af cadherin; og/eller c. nukleinsyresekvensen, der koder for et cadherin-tandemgentagelsesdomæne.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor varianten er udvalgt blandt en hvilken som helst eller flere, der findes i: d. et domæne af cadherin-proteinet, der er forbundet med dimerisering af cadherin; e. det ekstracellulære domæne; og/eller f. cadherin-tandemgentagelsesdomænet.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, hvor individet er et menneske, en ko, et svin, et krebsdyr, en fisk eller et fjerkræ.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor individet er en laksefisk eller et fjerkræ

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor individet er en atlantisk laks.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor individet er en kylling.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, hvor cadherin er Cdh1, og genet, der koder for cadherin, er cdh1.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvor varianten er tilvejebragt i eller svarende til position 325 i aminosyresekvensen for Cdh1-1.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvor individet forudsiges at have viral resistens, når det bestemmes, at varianten har prolin i eller svarende til position 325 i aminosyresekvensen for Cdh1-1, og individet forudsiges ikke at have viral resistens, når det bestemmes, at varianten har serin i eller svarende til position 325 i aminosyresekvensen for Cdh1-1,

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, hvor DNA-polymorfismen er i det kodende område af cdh1.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, hvor DNA-polymorfismen er i eller svarende til position 1065 i GenBank-sekvens BT058864.1.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, hvor allelen er en resistent allel, når cytosin er til stede i ellersvarende til position 1065 i GenBank-sekvens BT058864.1.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, hvor allelen er en ikke-resistent allel, nårthymin er til stede i ellersvarende til position 1065 i GenBank-sekvens BT058864.1.

15. Fremgangsmåde til selektion af et individ til anvendelse som gydefisk, hvor individet er udvalgt på baggrund af forudsigelsen ved hjælp af fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 14, at individet vil have resistens overfor virusinfektion.

16. Sammensætning, der omfatter et middel, der er i stand til at inducere ekspression af den resistente form af Cdh1 i en celle, som sammensætningen administreres til.

17. Sammensætning ifølge krav 16, hvor midlet omfatter et nukleinsyremolekyle, der koder for Cdh1, der indbefatter den resistente variant i en eller flere aminosyrepositioner.

18. Sammensætning ifølge krav 16, hvor midlet er i stand til at redigere genet for Cdh1 fra den ikke-resistente til den resistente form.

19. Sammensætning, der omfatter et middel, der er i stand til at forhindre ekspression af den ikke-resistente form af Cdh1 i en celle, som sammensætningen administreres til.

20. Sammensætning ifølge krav 19, hvor midlet omfatter et nukleinsyremolekyle, der koder for Cdh1, der indbefatter den resistente variant i en eller flere aminosyrepositioner i cadherin.

21. Sammensætning ifølge krav 19, hvor midlet er i stand til at redigere genet for Cdh1 fra den ikke-resistente til den resistente form.

22. Sammensætning ifølge krav 19, hvor midlet omfatter et RNA, der er i stand til at binde til transkriptionsproduktet af genet for den ikke-resistente variant af cadherin og derved forhindre dets translation.

23. Farmaceutisk sammensætning, der omfatter sammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 16 til 22, der yderligere omfatter et farmaceutisk acceptabelt bæremateriale, excipiens og/eller fortyndingsmiddel.

24. Sammensætning, der omfatter en hvilken som helst af sammensætningerne eller de farmaceutiske sammensætninger ifølge et hvilket som helst af kravene 16 til 23, til anvendelse i en fremgangsmåde til behandling.

25. Sammensætning ifølge krav 24, hvor fremgangsmåden er til behandling af en virusinfektion.