RU2798051C2

RU2798051C2 - Новый totivirus рыб

Info

Publication number: RU2798051C2
Application number: RU2021119020A
Authority: RU
Inventors: Стиан НЮЛУНН; Лив САННЛУНН; Арнфинн Л. ЭКЛАНН
Original assignee: Фармак Ас
Priority date: 2019-02-05
Filing date: 2020-02-04
Publication date: 2023-06-15

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено применение по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера в способе обнаружения вируса в биологическом образце рыбы. Геном указанного вируса содержит SEQ ID NO: 6 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80% идентичную ей, или по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 1-5 или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична ей. Геном указанного вируса содержит основание урацила (U) вместо основания тимина (T). Праймер содержит последовательность из по меньшей мере 12-40 последовательных нуклеотидов, и причем указанная последовательность комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме указанного вируса. Предложен способ обнаружения вируса и набор для обнаружения вируса в биологическом образце рыбы. Изобретение позволяет обнаружить биологическом образце рыбы вирус, геном которого содержит SEQ ID NO: 6 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80% идентичную ей, или по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 1-5 или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична ей. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 табл., 4 пр.

Description

Область техники

Изобретение, среди прочего, относится к новому вирусу рыб, обозначенному как Totivirus, который вызывает гибель рыб, и к способам обнаружения указанного вируса в рыбе и защите рыб от заражения указанным вирусом, и к связанным (ре)агентам и применениям.

Уровень техники

Рыба является одним из основных источников питания человека, и рыбоводство стало важной отраслью, особенно в связи с тем, что уровень вылова диких рыб является невысоким или снижается в результате чрезмерного вылова рыбы и потери среды обитания. Примеры выращиваемой рыбы включают атлантический лосось (Salmo salar) и пинагор (Cyclopterus lumpus).

Однако инфекционные заболевания в аквакультуре угрожают производству рыбы и также могут влиять на популяции диких рыб. Например, известно, что воспаление сердечных и скелетных мышц (HSMI) является часто смертельным заболеванием у выращиваемого на фермах атлантического лосося. У пораженных рыб часто снижается прием корма, что приводит к аномальному поведению при плавании и, в некоторых случаях, к внезапному падежу. Обычно внешние поражения не распознаются. При вскрытии сердце часто выглядит бледным и несколько рыхлым. В некоторых случаях перикардиальный мешок наполнен кровью. Гистологические исследования показывают, что у большинства рыб в пораженных сетчатых садках обнаруживаются серьезные повреждения, хотя они кажутся здоровыми. Впервые обнаруженное в Норвегии в 1999 г. (Kongtorp et al., J. Fish Dis., 27, 2004), впоследствии HSMI было вовлечено в нескольких вспышках инфекции на других фермах Норвегии и Великобритании. Полагается, что рыбный реовирус (PRV), реовирус рыб относится к семейству Reoviridae, подсемейству Spinareovirinae, и является вероятным возбудителем HSMI (Kibenge et al., Virol. J., 10, 2013). С 1999 г. наблюдается рост числа вспышек инфекции, и полагается, что данное заболевание оказывает пагубное экономическое влияние на лососеводство.

Кардиомиопатический синдром (CMS) представляет собой тяжелое заболевание сердца, поражающее главным образом крупного атлантического лосося на второй год пребывания в морской воде в преддверии отлова. Больные рыбы могут внезапно пасть, не проявляя внешних признаков заболевания, или у них могут проявляться такие симптомы, как аномальное плавание и анорексия. Заболевание было впервые выявлено у выращиваемого атлантического лосося в Норвегии в 1985 году, и затем у выращиваемого лосося на Фарерских островах, в Великобритании и Ирландии. CMS также был описан у дикого атлантического лосося в Норвегии. В 2010 г. двухцепочечный РНК-вирус семейства Totiviridae, названный вирусом рыбного миокардита (PMCV), был описан как возбудитель CMS (Haugland et al., J. Virol., 85, 2011). PMCV считается одной из самых больших проблем в производстве атлантического лосося, приводящей к крупным экономическим потерям для компаний-производителей лосося.

Проблемы, связанные с болезнями при производстве пинагора (Cyclopterus lumpus), в определенной степени обусловлены бактериальными инфекциями. Среди них Aeromonas salmonicida subsp. (возбудитель атипичного фурункулеза), Pasteurella sp., Vibrio anguillarum и Tenacibaculum sp. были наиболее значимыми видами. Применение программ целевой вакцинации, систематический мониторинг заболевания и совершенствование производства привели к постепенному снижению числа случаев атипичного фурункулеза, вибриоза и пастереллеза. Однако несколько видов вирусов были обнаружены у диких пинагор, включая вирусную геморрагическую септицемию (VHSV) (Guðmundsdóttir et al., J. Fish Dis., 42, 2019), вирусный нервный некроз (VNN) и новый ранавирус. Недавно был идентифицирован вирус, поражающий выращиваемого пинагора: флавивирус пинагора (LFV/CLuV) (Skoge et al., Arch. Virol., 163, 2018). LFV/CLuV демонстрирует низкое, но отчетливое сходство с неотнесенным вирусом летучих мышей Tamana (TABV). Было обнаружено, что LFV/CLuV присутствует во всех видах тканей пинагора у пораженных рыб, но патологию в основном наблюдали в печени и почках. Вирус ассоциируется с тяжелым заболеванием пинагора. После того, как LFV/CLuV был охарактеризован, результаты картирования распространения вируса и определения его связи с заболеванием показали, что он широко распространен с относительно высокой ассоциированной распространенностью.

В некоторых рыбоводческих хозяйствах в настоящее время наблюдается высокий уровень смертности - например, до 80% в некоторых популяциях пинагора, несмотря на то, что ОТ-ПЦР в режиме реального времени и гистологические исследования не позволяют обнаружить любые известные патогены в рыбе.

Таким образом, существует постоянная потребность в идентификации новых патогенов, которые инфицируют и приводят к гибели рыб, в частности, на фермах выращивания пинагора. Кроме того, существует постоянная потребность в способах мониторинга производства выращиваемой рыбы на предмет наличия инфекции патогенами, чтобы избежать вспышек инфекции и, возможно, лечить инфицированную рыбу.

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением неожиданно был обнаружен новый вирус у рыбы пинагор, названный здесь Totivirus Cyclopterus lumpus (CLuTV). Длина и организация генома вместе с анализом последовательности показывают, что CLuTV является тотирусом, ближайшим представителем которого является вирус атлантического лосося PMCV.

Следовательно, один аспект изобретения относится к нуклеиновой кислоте, содержащей по меньшей мере последовательность одной открытой рамки считывания (ORF), выбранной из группы, состоящей из ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z; где:

ORF-1 по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1,

ORF-2 по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2,

ORF-X по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3,

ORF-Y по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4, и

ORF-Z по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5.

Другой аспект изобретения относится к нуклеиновой кислоте, где (а) последовательность указанной нуклеиновой кислоты комплементарна SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2; и/или (b) последовательность указанной нуклеиновой кислоты комплементарна SEQ ID NO: 6.

Еще один аспект изобретения относится к вирусному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11, или которая представляет собой любую из SEQ ID NO: 7-11 или ее консервативно замещенный вариант.

Еще один аспект изобретения относится к вирусу, который инфицирует и способен приводить к гибели рыбы пинагор (Cyclopterus lumpus), где геном вируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытую здесь, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит основание урацил (U) вместо основания тимин (Т), и/или вирус содержит вирусный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11, или которая представляет собой любую из SEQ ID NO: 7-11 или ее консервативно замещенный вариант.

Еще один аспект изобретения относится к олигонуклеотидному праймеру, который содержит последовательность по меньшей мере из 9 нуклеотидов, где указанная последовательность комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь.

Еще один аспект изобретения относится к олигонуклеотидному праймеру, который (а) содержит последовательность по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов, где указанная последовательность комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь, (b) содержит по меньшей мере 9 последовательных нуклеотидов последовательности, которая представляет собой или комплементарна фрагменту референсной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, или (c) содержит по меньшей мере 9 последовательных нуклеотидов последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, которая представляет собой последовательность или комплементарна последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 40; предпочтительно при условии, что указанный олигонуклеотидный праймер не содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41 - SEQ ID NO: 49.

Еще один аспект изобретения относится к способу обнаружения вируса, который инфицирует и способен приводить к гибели рыбы, включающему стадии:

(а) контактирование нуклеиновой кислоты, экстрагированной из биологического образца рыбы по меньшей мере с одним олигонуклеотидным праймером, с образованием смеси, где по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер комплементарен последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь, и

(b) определение того, присутствует ли продукт амплификации при подвергании смеси а) амплификации, где присутствие продукта амплификации указывает на присутствие РНК, ассоциированной с вирусом, и следовательно, на присутствие вируса в биологическом образце.

(а) секвенирование нуклеиновой кислоты, экстрагированной из биологического образца рыбы, и

(b) сравнение полученной последовательности нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая представляет собой или является комплементарной референсной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, где по меньшей мере 80% идентичность последовательности между двумя последовательностями указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

(b) трансляцию полученной последовательности нуклеиновой кислоты в аминокислотную последовательность или трансляцию последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарной указанной полученной последовательности нуклеиновой кислоты, в аминокислотную последовательность, и

(c) сравнение полученной аминокислотной последовательности с референсной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-11, где по меньшей мере 80% идентичность последовательности между двумя последовательностями указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

Еще один аспект изобретения относится к антителу, которое связывается с полипептидом, где полипептид кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь, и/или где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11, или которая представляет собой любую из SEQ ID NO: 7-11 или ее консервативно замещенный вариант.

Еще один аспект изобретения относится к набору для обнаружения вируса в биологическом образце рыбы, где набор включает олигонуклеотидный праймер, раскрытый здесь, и/или антитело, описанное здесь.

Еще один аспект изобретения относится к антителу для применения в лечении рыб, инфицированных вирусом, раскрытым здесь.

Еще один аспект изобретения относится к применению вируса, раскрытого здесь, для получения вакцины.

Еще один аспект изобретения относится к вакцине, содержащей:

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь;

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытую здесь;

(iii) вирусный полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь;

(iv) вирусный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11, или которая представляет собой любую из SEQ ID NO: 7-11 или ее консервативно замещенный вариант; или

(v) вирус, раскрытый здесь.

Еще один аспект изобретения относится к молекуле интерферирующей РНК (iRNA) для применения в лечении рыбы, инфицированной вирусом, где молекула iРНК содержит по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидов, или комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в геноме вируса, раскрытого здесь.

Краткое описание фигур

На фиг. 1: представлено схематическое изображение последовательности CLuTV, идентифицированной здесь, которая имеет длину 6353 нуклеотида и содержит пять возможных открытых рамок считывания (ORF).

На фиг. 2: представлена нуклеотидная последовательность генома CLuTV.

На фиг. 3: представлена нуклеотидная последовательность ORF-1 CLuTV.

На фиг. 4: представлена нуклеотидная последовательность ORF-2 CLuTV.

На фиг. 5: представлены нуклеотидные последовательности ORF-X, ORF-Y и ORF-Z CLuTV.

На фиг. 6: представлена аминокислотная последовательность ORF-1 CLuTV.

На фиг. 7: представлена аминокислотная последовательность ORF-2 CLuTV.

На фиг. 8: представлены аминокислотные последовательности ORF-X, ORF-Y и ORF-Z CLuTV.

На фиг. 9: показано окрашивание гематоксилином и эозином полного среза пораженного пинагора, показывающее скопление жидкости в желудке (стрелка).

На фиг. 10: показано окрашивание гематоксилином и эозином среза кишечника пинагора, показывающее скопление слизи и клеточные выделения (стрелки).

На фиг. 11: показано окрашивание гематоксилином и эозином среза кишечника пинагора, показывающее скопление слизи (стрелка) и клеточные выделения.

На фиг. 12: показано окрашивание гематоксилином и эозином среза кишечника пинагора, показывающее скопление слизи (стрелка).

Подробное описание изобретения

Определения

Для облегчения понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые определения терминов, используемых в описании изобретения.

В рамках настоящего изобретения, термин «пинагор» или «рыба-воробей» предназначен для обозначения любого вида, выбранного из полного семейства Cyclopteridae. Наиболее предпочтительным видом согласно изобретению является Cyclopterus lumpus.

Термин «нуклеиновая кислота» включает молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием аналогов нуклеотидов (например, пептидные нуклеиновые кислоты и не встречающиеся в природе аналоги нуклеотидов), и их гибриды. Таким образом, несмотря на то, что в последовательностях нуклеиновых кислот, представленных на фиг. 2-5 и SEQ ID NO: 1-6, используются основания гуанин, цитозин, аденин и тимин, варианты осуществления изобретения относятся к их соответствующим последовательностям РНК, в которых используются основания гуанин, цитозин, аденин и урацил (т.е. с урацилом вместо тимина), следовательно, эти последовательности РНК, также обеспечиваются здесь. Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой одноцепочечную или двухцепочечную. Если не указано иное, то левый конец любой одноцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты, обсуждаемой здесь, представляет собой 5’-конец. Направление добавления от 5’ к 3’ растущих транскриптов РНК является направлением транскрипции.

Термин «олигонуклеотид» означает нуклеиновую кислоту, содержащую 200 или меньше нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть одноцепочечными, например, для использования в качестве праймеров, праймеров для клонирования или гибридизационных зондов, или они могут быть двухцепочечными, например, для использования в конструировании мутантного гена. Олигонуклеотиды могут быть смысловыми или антисмысловыми олигонуклеотидами. Олигонуклеотид может включать метку, включая радиоактивную метку, флуоресцентную метку, гаптен или антигенную метку, для анализов детектирования.

В рамках настоящего изобретения, термин «олигонуклеотидный праймер» или «праймер» следует понимать как относящийся к последовательности нуклеиновой кислоты (например по меньшей мере длиной из 9 нуклеотидов, и длиной меньше чем 60 нуклеотидов), подходящей для направления активности на область нуклеиновой кислоты, например, для амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или для гибридизации in situ.

В рамках настоящего изобретения, термин «комплементарные» в контексте последовательностей нуклеиновых кислот означает последовательности нуклеиновых кислот, которые образуют двухцепочечную структуру посредством совпадения пар оснований (от A до T (или U) и от G до C). Например, последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарная G-T-A-C, представляет собой C-A-T-G. Другими примерами комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот являются следующими:

Комплементарная последовательность нуклеиновой кислоты (например, если нуклеиновая кислота представляет собой ДНК):

5’-ATTCGCTTAACGCAA-3’

3’-TAAGCGAATTGCGTT-5’

Соответствующие комплементарные последовательности, в которых урацил заменен на тимин (например, в случае, если нуклеиновая кислота представляет собой РНК):

5’-AUUCGCUUAACGCAA-3’

3’-UAAGCGAAUUGCGUU-5’

В рамках настоящего изобретения, термин «аминокислота» относится к одной из 20 встречающихся в природе аминокислот или любых неприродных аналогов. Предпочтительно термин «аминокислота» относится к одной из 20 встречающихся в природе аминокислот.

Термины «полипептид» или «белок» означают макромолекулу, состоящую из последовательности аминокислот. Белок может быть нативным белком, т.е. белком, продуцированным природной и нерекомбинантной клеткой; или он может продуцироваться сконструированной или рекомбинантной клеткой и содержать молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или молекулы, содержащие делеции, добавления и/или замены одной или более аминокислот нативной последовательности. Термины также включают аминокислотные полимеры, в которых одна или более аминокислот являются химическими аналогами соответствующего встречающегося в природе аминокислотного полимера.

Термин «идентичность последовательностей» указывает количественное измерение степени гомологии между двумя последовательностями, которые могут представлять собой последовательности нуклеиновых кислот (также называемыми нуклеотидами) или аминокислотными последовательностями. Если две сравниваемые последовательности не имеют равной длины, то они должны выравниваться для обеспечения наилучшего соответствия, позволяя вставку гэпов или, альтернативно, усечение на концах последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей.

В случае нуклеотидной последовательности, например, термин «по меньшей мере на 80% идентична» означает, таким образом, что по меньшей мере 80% нуклеотидов по всей последовательности можно выравнить с идентичными нуклеотидами из другой последовательности. Определенный процент нуклеотидов можно обозначить, например, как 80% идентичных, 85% идентичных, 90% идентичных, 95% идентичных, 99% идентичных или более в указанной области при сравнении и выравнивании для максимального соответствия. Например, последовательность длиной 10 нуклеотидов, например GGGAAACCTT, может быть на 80% идентична непрерывной последовательности (например, GGGAAACCGG) или прерывистой последовательности (например, GGGACCCCTT):

Пример 100% идентичности:

GGGAAACCTT

││││││││││

GGGAAACCTT

Пример 80% идентичности:

GGGAAACCTT

││││││││

GGGAAACCGG

Пример 80% идентичности:

GGGAAACCTT

││││ ││││

GGGACCCCTT

Специалисту в данной области понятно, что доступны различные методы для сравнения последовательностей (см. ниже).

В рамках настоящего изобретения, термин «консервативно замещенная» по отношению к аминокислоте означает, что аминокислота может быть замещена другой аминокислотой из своей соответствующей группы в соответствии со следующими шестью группами: [1] аланин (A), серин (S), треонин (T); [2] аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E); [3] аспарагин (N), глутамин (Q); [4] аргинин (R), лизин (K); [5] изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); и [6] фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W). «Консервативно замещенный вариант» применительно к полипептиду или белку означает, что любая из аминокислот в указанном полипептиде или белке может подвергнуться консервативной замене, как здесь определено выше.

В рамках настоящего изобретения, термин «антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные дисульфидными связями, или его фрагменту (антигенсвязывающий участок) антитела. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), между которыми находятся более консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с клетками-хозяевами или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Антитела по изобретению включают моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела) и поликлональные антитела, полные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела или гибридные антитела с двойной или множественной антигенной или эпитопной специфичностью, фрагменты антител и субфрагменты антител, например, фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и т.п., включая гибридные фрагменты любого иммуноглобулина или любого природного, синтетического или сокнструированного белка, который функционирует в качестве антитела, связываясь со специфическим антигеном с образованием комплекса. Антитела по изобретению также могут представлять собой Fc-слитые белки.

«Вектор» представляет собой нуклеиновую кислоту, которую можно использовать для введения другой нуклеиновой кислоты (или «конструкции»), связанной с ней, в клетку. Одним из типов вектора является «плазмида», которая относится к линейной или кольцевой двухцепочечной молекуле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты нуклеиновой кислоты. Другим типом вектора является вирусный вектор (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), где дополнительные сегменты ДНК могут быть вставлены в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальный ориджин репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяин и культивирования под селективным давлением и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Вектор можно использовать для направления экспрессии выбранной нуклеиновой кислоты в клетке.

«Клетка-хозяин» представляет собой клетку, которую можно использовать для экспрессии нуклеиновой кислоты, например, нуклеиновой кислоты, описанной здесь. Клеткой-хозяином может быть прокариотическая клетка, например, E. coli, или эукариотическая клетка, например, одноклеточный эукариот (например, дрожжи или другой гриб), растительная клетка (например, клетка растения табака или помидора), клетка животного (например, клетка человека, клетка обезьяны, клетка хомяка, клетка крысы, клетка мыши или клетка насекомого) или гибридома. Примеры клеток-хозяев включают клеточные линии яичника китайского хомячка (СНО) или их производные. Обычно клетка-хозяин представляет собой культивируемую клетку, которую можно трансформировать или трансфицировать нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, которая затем может быть экспрессирована в клетке-хозяине. Понятно, что термин «клетка-хозяин» относится не только к конкретной рассматриваемой клетке, но и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Поскольку определенные модификации могут происходить в последующих поколениях в результате, например, мутации или влияния окружающей среды, то такое потомство может фактически не быть идентичным родительской клетке, но все же оно включается в объем термина, используемого здесь.

Термины «лечить» и «лечение» включают терапевтическое лечение, профилактическое лечение и применения, которые ослабляют симптомы расстройства или снижают риск того, что у субъекта (например, рыбы) разовьется расстройство (например, симптомы вирусной инфекции).

В рамках настоящего изобретения, термин «вакцина» относится к материалу, который может индуцировать иммунный ответ, который блокирует инфекционность, частично или полностью, инфекционного агента, которым по отношению к настоящему изобретению является вирус, поражающий рыбу, например, пинагор. Таким образом, при введении рыбам вакцина по изобретению иммунизирует рыбу против заболевания, вызываемого вирусом. Иммунизирующий компонент вакцины может представлять собой, ДНК, как, например, в ДНК-вакцине, РНК, как, например, в РНК-вакцине, рекомбинантный белок или его фрагмент по настоящему изобретению, или живой или аттенуированный рекомбинантный вирус.

В рамках настоящего изобретения, «iРНК-средство» (аббревиатура «средства на основе интерферирующей РНК») представляет собой РНК-средство, которое может подавлять (снижать) экспрессию гена-мишени, например белка, кодированного ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y или ORF-Z. iРНК-средство может функционировать посредством одного или нескольких механизмов, включая посттранскрипционное расщепление мРНК-мишени, иногда называемое в данной области как «РНКi», или претранскрипционные или претрансляционные механизмы. iРНК-средство может быть двухцепочечным (ds) iРНК-средством. iРНК-средство также может быть «малой интерферирующей РНК» (siРНК).

В рамках настоящего изобретения, термины «по изобретению» или «согласно изобретению» предназначены для обозначения всех аспектов и вариантов осуществления изобретения, раскрытых и/или заявленных здесь. И наоборот, любые аспекты, элементы или варианты осуществления, упомянутые в данном документе как «раскрытые в данном документе» или «описанные в данном документе», следует понимать как аспекты, элементы или варианты осуществления «по изобретению» или «согласно изобретению».

В рамках настоящего изобретения, термин «содержащий» следует толковывать как охватывающий термины как «включающий», так и «состоящий из», где оба значения специально предназначены и, следовательно, индивидуально раскрывают варианты осуществления согласно настоящему изобретению.

В данном контексте форма единственного числа элемента или компонента также включает множественное число, если только число явно не подразумевается как единственное число.

В рамках настоящего изобретения, термин «приблизительно», модифицирующий количество используемого вещества, ингредиента, компонента или параметра, относится к изменению числового количества, которое может происходить, например, посредством типичных процедур измерения и обработки, например, используемых процедур обращения с жидкостью для приготовления концентратов или растворов. Кроме того, изменение может происходить из-за непреднамеренной ошибки в процедурах измерения, различий в производстве, источнике или чистоте ингредиентов, используемых для выполнения методов, и т.п. В одном варианте осуществления термин «приблизительно» означает в пределах 10% от указанного числового значения. В более конкретном варианте осуществления термин «приблизительно» означает в пределах 5% от указанного числового значения.

Последовательности вирусных нуклеиновых кислот и вирусные полипептиды

Один аспект изобретения относится к нуклеиновой кислоте, содержащей по меньшей мере последовательность одной открытой рамки считывания (ORF), выбранной из группы, состоящей из ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z; где:

В некоторых вариантах осуществления:

ORF-1 по меньшей мере на 85% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1,

ORF-2 по меньшей мере на 85% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2,

ORF-X по меньшей мере на 85% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3,

ORF-Y по меньшей мере на 85% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4, и

ORF-Z по меньшей мере на 85% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5.

В предпочтительных вариантах осуществления:

ORF-1 по меньшей мере на 90% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1,

ORF-2 по меньшей мере на 90% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2,

ORF-X по меньшей мере на 90% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3,

ORF-Y по меньшей мере на 90% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4, и

ORF-Z по меньшей мере на 90% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5.

В более предпочтительных вариантах осуществления:

ORF-1 по меньшей мере на 95% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1,

ORF-2 по меньшей мере на 95% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2,

ORF-X по меньшей мере на 95% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3,

ORF-Y по меньшей мере на 95% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4, и

ORF-Z по меньшей мере на 95% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5.

В еще более предпочтительных вариантах осуществления:

ORF-1 по меньшей мере на 98% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1,

ORF-2 по меньшей мере на 98% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2,

ORF-X по меньшей мере на 98% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3,

ORF-Y по меньшей мере на 98% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4, и

ORF-Z по меньшей мере на 98% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5.

ORF-1 по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1,

ORF-2 по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2,

ORF-X по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3,

ORF-Y по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4, и

ORF-Z по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления:

ORF-1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1,

ORF-2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2,

ORF-X представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3,

ORF-Y представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4, и

ORF-Z представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5.

В конкретных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, раскрытая здесь, содержит по меньшей мере ORF-1 и/или ORF-2 согласно любому из их вариантов осуществления, раскрытых здесь.

Последовательность нуклеиновой кислот, раскрытая здесь, может быть по меньшей мере на 80% идентична вирусному геному согласно SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытая здесь, по меньшей мере на 85% идентична вирусному геному согласно SEQ ID NO: 6. В предпочтительных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытая здесь, по меньшей мере на 90% идентична вирусному геному согласно SEQ ID NO: 6. В более предпочтительных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытая здесь, по меньшей мере на 95% идентична вирусному геному согласно SEQ ID NO: 6. В еще более предпочтительных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытая здесь, по меньшей мере на 98% идентична вирусному геному согласно SEQ ID NO: 6. В еще более предпочтительных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытая здесь, по меньшей мере на 99% идентична вирусному геному согласно SEQ ID NO: 6. В особенно предпочтительных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытая здесь, имеет 100% идентичность с последовательностью вирусного генома согласно SEQ ID NO: 6 (CLuTV).

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, последовательность которой комплементарна последовательности любой из нуклеиновых кислот, раскрытых здесь.

Последовательность указанной нуклеиновой кислоты может быть комплементарной ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y или ORF-Z согласно любому из их вариантов осуществления, раскрытых здесь. Последовательность нуклеиновой кислоты также может быть комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере на 85% идентична, в предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере на 90% идентична, в более предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере на 95% идентична, в еще более предпочтительных вариантах осуществления, на 98% идентична, в еще более предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере на 99% идентична, и в особенно предпочтительных вариантах осуществления на 100% идентична последовательности вирусного генома согласно SEQ ID NO: 6 (CLuTV).

Следовательно, изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, где (а) последовательность указанной нуклеиновой кислоты комплементарна любой из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 5; и/или (b) последовательность указанной нуклеиновой кислоты комплементарна SEQ ID NO: 6.

Следовательно, изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, где (а) последовательность указанной нуклеиновой кислоты комплементарна SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2; и/или (b) последовательность указанной нуклеиновой кислоты комплементарна SEQ ID NO: 6.

В предпочтительных вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, раскрытые здесь, представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты РНК, т.е. они содержат основание урацил (U) вместо основания тимин (T). Соответственно, вирусы, раскрытые здесь, содержат их генетическую информацию в форме таких нуклеиновокислотных последовательностей РНК.

Специалист в данной области также понимает, что изменения последовательности нуклеиновой кислоты, приводящие к модификациям аминокислотной последовательности белка, который она кодирует, могут иметь незначительное влияние, если оно вообще имеет место, на результирующую трехмерную структуру белка. Например, кодон аминокислоты аланин, гидрофобной аминокислоты, может быть заменен кодоном, кодирующим другой менее гидрофобный остаток, такой как глицин, или более гидрофобный остаток, такой как валин, лейцин или изолейцин. Аналогично можно ожидать, что изменения, которые приводят к замене одного отрицательно заряженного остатка на другой, такого как аспарагиновая кислота на глутаминовую кислоту, или одного положительно заряженного остатка на другой, например лизин на аргинин, также могут привести к образованию белка с практически такой же функциональной активностью.

Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые являются типичными консервативными заменами друг друга: [1] аланин (A), серин (S), треонин (T); [2] аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E); [3] аспарагин (N), глутамин (Q); [4] аргинин (R), лизин (K); [5] изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); и [6] фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W) (см., например, публикацию заявки на патент США 20100291549).

Предпочтительно ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z кодируют вирусные полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7-11 соответственно, или аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны (например по меньшей мере на 85% идентичны или по меньшей мере на 90% идентичны, или по меньшей мере на 91% идентичны по меньшей мере на 92% идентичны по меньшей мере на 93% идентичны по меньшей мере на 94% идентичны по меньшей мере на 95% идентичны по меньшей мере на 96% идентичны по меньшей мере на 97% идентичны по меньшей мере на 98% идентичны или по меньшей мере на 99% идентичны) аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 7-11 соответственно. В некоторых вариантах осуществления ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z кодируют вирусные полипептиды, которые являются консервативно замещенными вариантами SEQ ID NO: 7-11 соответственно, как описано выше.

Следовательно, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вирусным полипептидам, содержащим аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7-11 соответственно, или аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны (например по меньшей мере на 85% идентичны или по меньшей мере на 90% идентичны или по меньшей мере на 91% идентичны по меньшей мере на 92% идентичны по меньшей мере на 93% идентичны по меньшей мере на 94% идентичны по меньшей мере на 95% идентичны по меньшей мере на 96% идентичны по меньшей мере на 97% идентичны по меньшей мере на 98% идентичны или по меньшей мере на 99% идентичны) аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 7-11 соответственно. В некоторых вариантах осуществления вирусные полипептиды представляют собой консервативно замещенные варианты SEQ ID NO: 7-11 соответственно, как описано выше. Также настоящее изобретение относится к векторам, например, плазмидным векторам или вирусным векторам, содержащим последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие вирусные полипептиды по изобретению, описанные выше.

Идентичность (гомологию) последовательностей белков и/или нуклеиновых кислот можно оценить с использованием любого из множества алгоритмов и программ сравнения последовательностей, известных в данной области. Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность функционирует в качестве референсной последовательности (например, последовательности, описанной здесь), с которой сравнивают тестовые последовательности. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей рассчитывают процент идентичности последовательностей для тестовых последовательностей относительно референсной последовательности на основе параметров программы.

Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определить, например, сравнением информации о последовательности с использованием компьютерной программы «GAP», т.е. Висконсинский пакет программ Генетической Компьютерной Группы (GCG, Madison, Wisconsin) (Devereux, et al., (1984), Nucl. Acids Res., 12: 387-395). При расчете процентной идентичности сравниваемые последовательности выравнивают таким образом, чтобы обеспечить наибольшее сопоставление между последовательностями. Предпочтительные значения параметров по умолчанию для программы «GAP» включают: (1) использование GCG унарной матрицы сравнения (содержащей значение «1» для идентичностей и значение «0» для отсутствия идентичности) для нуклеотидов, и взвешенную матрицу сравнения аминокислот Gribskov and Burgess, ((1986) Nucl. Acids Res., 14: 6745), как описано в «Atlas of Polypeptide Sequence and Structure», Schwartz и Dayhoff, eds., National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) или другие аналогичные матрицы сравнения; (2) штраф за наличие любого гэпа - 8 и дополнительный штраф за каждый символ в гэпе - 2 для аминокислтных последовательностей, или штраф за наличие любого гэпа - 50, и дополнительный штраф за каждый символ в гэпе - 3 для нуклеотидных последовательностей; (3) отсутствие штрафа за концевые гэпы; и (4) отсутствие максимального штрафа за длинные гэпы.

Идентичность и/или сходство последовательностей также можно определить с использованием алгоритма локальной идентичности последовательностей Смита-Уотермана, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, алгоритм идентичности последовательности Нидлмана-Вунша, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, поиск сходства последовательностей методом Пирсона-Липмана, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, компьютеризованные варианты данных алгоритмов (BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

Еще одним примером подходящего алгоритма является PILEUP. Алгоритм PILEUP позволяет осуществлять выравнивание множества последовательностей из группы родственных последовательностей путем последовательного попарного выравнивания. Для осуществления выравнивания может быть также построена древовидная схема, иллюстрирующая кластерные взаимосвязи. В программе PILEUP используется упрощенный метод последовательного выравнивания, описанный Feng и Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360; метод аналогичен описанному Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153. Подходящими параметрами PILEUP являются: «цена» гэпа 3,00 по умолчанию, «цена» длины гэпа 0,10 по умолчанию и взвешенные значения концевых гэпов.

Еще одним примером подходящего алгоритма является алгоритм BLAST, описанный в публикациях: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; and Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Особенно пригодной программой BLAST является программа WU-BLAST-2, полученная от Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266: 460-480. В программе WU-BLAST-2 используется несколько параметров поиска, большинство из которых имеют значения по умолчанию. В программе WU-BLAST-2 используется несколько параметров поиска, большинство из которых принимаются как величины по умолчанию. Корректируемые параметры установлены со следующими величинами по умолчанию: охват с перекрыванием=1, перекрывающаяся фракция=0,125, предельная длина слова (T) = 11. Параметрами HSP S и HSP S2 являются динамические величины, и эти параметры устанавливаются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, в которой осуществляется поиск представляющей интерес последовательности; однако для повышения чувствительности эти величины могут быть скорректированы.

Дополнительным применяемым алгоритмом является gapped BLAST, описанный в публикации Altschul et al., 1993 год, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. В программе gapped BLAST используется матрица весовых оценок замен BLOSUM-62; пороговый параметр Т установлен на 9; метод двух совпадений для запуска продлений без гэпов, затраты на длину гэпа к стоимостью 10+k; X_u установлен на 16, и X_g установлен на 40 на стадии поиска в базе данных и на 67 на выходной стадии алгоритмов. Выравнивание с гэпами запускается при оценке, соответствующей приблизительно 22 битам.

Способы получения вирусных полипептидов, описанных здесь, хорошо известны специалистам в данной области. Например, и без ограничений, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие вирусные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 7-11, или последовательности по меньшей мере на 80% идентичные им, включая консервативно замещенные варианты SEQ ID NO: 7-11, можно клонировать в вектор, например, такой как плазмидный или вирусный вектор, и экспрессировать в подходящем хозяине, таком как клетки рыб, клетки млекопитающих, бактериальные клетки, клетки растений и клетки насекомых, и выделить экспрессированные вирусные полипептиды из них.

Вирусы

Еще один аспект изобретения относится к вирусу, который инфицирует и способен приводить к гибели рыбы пинагор (Cyclopterus lumpus), где геном вируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытую здесь, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит основание урацил (U) вместо основания тимин (Т).

Еще один аспект изобретения относится к вирусу, который инфицирует и способен вызывать гибель рыбы пинагор (Cyclopterus lumpus), где вирус содержит вирусный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11, или которая представляет собой любую из SEQ ID NO: 7-11 или ее консервативно замещенный вариант.

Еще один аспект изобретения относится к вирусу, который инфицирует и способен вызывать гибель рыбы пинагор (Cyclopterus lumpus), где геном вируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытую здесь, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит основание урацил (U) вместо основания тимин (T), и вирус содержит вирусный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11, или которая представляет собой любую из SEQ ID NO: 7-11 или ее консервативно замещенный вариант.

В предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, содержащаяся в вирусе, находится в форме двухцепочечной РНК (дцРНК).

В некоторых вариантах осуществления геном вируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одну из ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y или ORF-Z согласно любому из их вариантов осуществления, раскрытых здесь. В предпочтительных вариантах осуществления последовательность вирусного генома включает по меньшей мере ORF-1 и ORF-2 согласно любому из их вариантов осуществления, раскрытых здесь. В некоторых вариантах осуществления геном вируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой или комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно на 98%, особенно предпочтительно на 99% или даже на 100% идентична последовательности вирусного генома согласно SEQ ID NO: 6 (CLuTV).

В некоторых вариантах осуществления вирус включает ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z; где:

ORF-Z по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5;

и где ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z кодируют вирусные полипептиды, содержащие SEQ ID NO: 7-11 соответственно, или последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 7-11 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления геном вируса кодирует вирусные полипептиды, содержащие соответствующие аминокислотные последовательности, содержащие SEQ ID NO: 7-11, или последовательности, которые по меньшей мере на 80% (например по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны SEQ ID NO: 7-11). Предпочтительно вирус содержит ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z, как здесь определено, где указанные ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z кодируют вирусные полипептиды, которые по меньшей мере на 95% идентичны SEQ ID NO 7-11 соответственно. Более предпочтительно, вирус содержит ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z, как здесь определено, где указанные ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z кодируют вирусные полипептиды, которые представляют собой консервативно замещенные варианты SEQ ID NO: 7-11 соответственно, или вирусные полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7-11 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления геном вируса кодирует по меньшей мере SEQ ID NO: 7 и 8 или последовательности, которые идентичны им по меньшей мере на 80% (например по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%), включая консервативно замещенные варианты SEQ ID NO: 7 и 8.

В некоторых вариантах осуществления инфицирование рыбы пинагор вирусом, раскрытым здесь, вызывает у рыб следующие симптомы:

(i) повреждение тканей в кишечнике и/или

(ii) диарею; или

(iii) кардиомиопатию.

В предпочтительных вариантах осуществления инфицирование рыбы пинагор вирусом, раскрытым здесь, вызывает кардиомиопатию.

Повреждение тканей в кишечнике можно диагностировать с помощью гистологии или электронной микроскопии, чтобы видеть разрушение ткани кишечника, например, разрушение структуры ворсинок, увеличение толщины других слоев. Предпочтительно, тканевые срезы окрашивают с использованием гистологического красителя гематоксилин и эозин (H&E). При использовании такого красителя у инфицированных особей можно наблюдать скопление жидкости и непереваренных частиц корма в желудке и в кишечнике (см., например, фиг. 9-12), что приводит к диарее у этих рыб. Кроме того, может наблюдаться повреждение стенки кишечника с клеточными выделениями и повышенным образованием слизи (см., например, фиг. 10-12). Диарею у рыб можно наблюдать в водных резервуарах с выращиваемой рыбой.

Изменения компонентов биомакромолекул (белков в общем, сидерофильных белков, нейтральных мукополисахаридов, гликогена и кислых мукополисахаридов) также можно увидеть в образцах ткани кишечника с помощью обычных методов, например, вестерн-блоттинга, ELISA, окрашивания тканевых срезов и т. д.

Кардиомиопатию можно диагностировать с помощью гистопатологии, с наличием тяжелого воспаления и дегенерацией губчатого слоя миокарда (желудочка) и с аналогичными изменениями в предсердии, также предпочтительно с использованием гистологического окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Дегенерация миоцитов и воспалительные изменения не часто наблюдаются в компактном слое сердца и всегда возникают позднее, чем изменения губчатых слоев. Также возможно нарушение кровообращения с мультифокальным некрозом печени. У рыб, страдающих CMS, могут проявляться такие симптомы, как аномальное плавание. При вскрытии обнаруживается тампонада сердца с кровью в перикардиальном мешке и умеренный или выраженный асцит (Haugland et al., J. Virol., 85, 2011).

В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус без оболочки. В отличие от вирусов с оболочкой, вирусы без оболочки характеризуются более высокой устойчивостью к химическим и физическим воздействиям, например, они являются термостойкими.

В предпочтительных вариантах осуществления вирус представляет собой Totivirus. Такие вирусы не имеют оболочки, имеют икосаэдрическую симметрию и архитектуру T=2. Диаметр обычно составляет приблизительно 40 нм.

В некоторых вариантах осуществления вирус, описанный здесь, содержит 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), которая функционирует в качестве внутреннего сайта входа в рибосому (IRES).

В предпочтительных вариантах осуществления ORF-1 и ORF-2 кодируют капсидный белок (CP) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (RDRP).

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере одну открытую рамку считывания, как здесь раскрыто во всех их вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует полный вирус, раскрытый здесь. Вектор можно использовать для введения указанной нуклеиновой кислоты(т) в клетку, такую как клетка-хозяин.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей вирус, описанный здесь. Клетка-хозяин может быть бактериальной клеткой, клеткой рыбы или клеткой млекопитающего.

Олигонуклеотидные праймеры

Еще один аспект изобретения относится к олигонуклеотидному праймеру, который (а) содержит последовательность по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов, где указанная последовательность комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь, (b) содержит по меньшей мере 9 последовательных нуклеотидов последовательности, которая представляет собой или комплементарна фрагменту референсной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, или (c) содержит по меньшей мере 9 последовательных нуклеотидов последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, которая представляет собой или комплементарна последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 40; предпочтительно при условии, что указанный олигонуклеотидный праймер не содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41 - SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотидный праймер имеет длину от 9 до 60 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления олигонуклеотидный праймер имеет длину от 12 до 40 нуклеотидов. В более предпочтительных вариантах осуществления олигонуклеотидный праймер имеет длину от 15 до 30 нуклеотидов. В еще более предпочтительных вариантах воплощения олигонуклеотидный праймер имеет длину от 18 до 25 нуклеотидов.

Специалист в данной области легко поймет, что олигонуклеотидный праймер, комплементарный последовательности нуклеиновой кислоты, будет гибридизоваться с этой последовательностью в жестких условиях. «Жесткие условия» относятся к условиям по температуре, ионной силе и присутствию других соединений, таких как органические растворители, при которых проводят гибридизацию нуклеиновых кислот. В жестких условиях спаривание оснований нуклеиновых кислот будет происходить только между последовательностями нуклеиновых кислот, имеющими высокую частоту комплементарных оснований. Жесткие условия гибридизации известны специалистам в данной области (см., например, Green M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th edition, 2012 г.). Точные условия жесткой гибридизации обычно зависят от последовательности и будут различаться в разных обстоятельствах, что легко поймет специалист в данной области. Более длинные последовательности гибридизуются при более высоких температурах по сравнению с более короткими последовательностями. Обычно выбираются жесткие условия, которые приблизительно на 5°C ниже температуры плавления (Tm) для конкретной последовательности. Tm определяется как температура, при которой 50% дуплексных молекул диссоциировали на составляющие их одиночные цепи. Поскольку последовательности-мишени обычно присутствуют в избытке, то при Tm 50% праймеров нуклеиновых кислот обычно будут заняты при равновесии. Как правило, жесткими условиями будут такие, в которых концентрация соли ниже приблизительно 1,0 М ионов натрия, обычно приблизительно от 0,01 до 1,0 М ионов натрия (или других солей) при рН от 6,8 до 8,3, и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких праймеров (например, от 10 нуклеотидов до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°C для более длинных праймеров. Жесткие условия также могут быть достигнуты добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Специалист в данной области легко поймет, что за счет комплементарности последовательностей олигонуклеотидный праймер по изобретению, следовательно, гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь.

Олигонуклеотидный праймер по настоящему изобретению можно метить молекулярным маркером для обеспечения визуализации гибридизации с последовательностью-мишенью или количественной оценки амплификации последовательности-мишени. Специалисту в данной области известны различные молекулярные маркеры или метки.

В конкретном варианте осуществления в настоящем документе обеспечивается олигонуклеотидный праймер, который содержит по меньшей мере 9 последовательных нуклеотидов последовательности, которая представляет собой или комплементарна фрагменту (например, длиной от 9 до 60 нуклеотидов, предпочтительно длиной от 12 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 18 до 25 нуклеотидов) референсной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6; предпочтительно при условии, что указанный олигонуклеотидный праймер не содержит последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41 - SEQ ID NO: 49. В особенно предпочтительном варианте осуществления последовательность указанного олигонуклеотидного праймера состоит из указанной последовательности из последовательных нуклеотидов.

В еще одном конкретном варианте осуществления в настоящем документе обеспечивается олигонуклеотидный праймер, который содержит по меньшей мере 9 (предпочтительно по меньшей мере 12, более предпочтительно по меньшей мере 15, еще более предпочтительно по меньшей мере 18) последовательных нуклеотидов последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, которая представляет собой или комплементарна последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 40; предпочтительно при условии, что указанный олигонуклеотидный праймер не содержит последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41 - SEQ ID NO: 49.

Еще один аспект изобретения относится к применению по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера в способе обнаружения вируса, раскрытого здесь, где по меньшей мере один праймер содержит последовательность по меньшей мере из 9 нуклеотидов, например, 9 последовательных нуклеотидов (предпочтительно по меньшей мере 12, более предпочтительно по меньшей мере 15, еще более предпочтительно по меньшей мере 18), и где указанная последовательность комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме указанного вируса.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер представляет собой пару праймеров, т.е. два праймера, один прямой праймер и один обратный праймер, которые комплементарны двум областям последовательности нуклеиновой кислоты и которые можно использовать для амплификации последовательности между двумя указанными областями. Это хорошо известно специалисту в данной области, и в пределах его/ее навыков найти олигонуклеотидные праймеры, подходящие для образования пары. Согласно применению по изобретению, «пара праймеров» может использоваться для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, описанного здесь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения используется синтез кДНК в способе обнаружения вируса, раскрытого здесь. Например, случайные олигонуклеотидные праймеры (например, гексануклеотиды) используются для синтеза кДНК из последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме указанного вируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения используется ПЦР в способе обнаружения вируса, раскрытого здесь. В некоторых вариантах осуществления изобретения используется ОТ-ПЦР в способе обнаружения вируса, раскрытого здесь. В некоторых вариантах осуществления изобретения используется ОТ-кПЦР в способе обнаружения вируса, раскрытого здесь. В некоторых вариантах осуществления используется случайная мультиплексная ОТ-ПЦР в способе обнаружения вируса, раскрытого здесь; в данном способе используется смесь праймеров, разработанных таким образом, чтобы быть устойчивыми к амплификации праймер-димер (см. Clem et al., Virol. J, 4, 2007). В некоторых вариантах осуществления изобретения используется опосредованная транскрипцией амплификация (TMA) в способе обнаружения вируса, раскрытого здесь. В некоторых вариантах осуществления изобретения используется амплификация замещением цепей (SDA) в способе обнаружения вируса, раскрытого здесь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения используется детектирование in situ, также называемое гибридизацией in situ (ISH) в способе обнаружения вируса, раскрытого здесь, например флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). В методе ISH используется меченная комплементарная ДНК, РНК или модифицированная последовательность олигонуклеотидного праймера (зонд) для визуализации специфических нуклеиновых кислот в морфологически сохраненных клетках и тканевых срезах. Зонд можно метить радиоактивными, флуоресцентными или антигенными метками (например, дигоксигенином), которые затем можно локализовать и количественно определить в ткани с помощью авторадиографии, флуоресцентной микроскопии или иммуногистохимии соответственно.

Диагностические способы

Еще один аспект изобретения относится к способу обнаружения вируса, который инфицирует и способен вызывать гибель рыбы, включающему стадии:

(а) контактирование нуклеиновой кислоты, экстрагированной из биологического образца рыбы по меньшей мере с одним олигонуклеотидным праймером с образованием смеси, где по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер комплементарен последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь, и

(b) определение того, присутствует ли продукт амплификации при подвергании смеси а) амплификации, где присутствие продукта амплификации указывает на присутствие РНК, ассоциированной с вирусом, и, следовательно, на присутствие вируса в биологическом образце.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту на стадии (а) способа, например РНК, экстрагируют из биологических образцов с использованием твердофазной экстракции, например, очистки на колонке с использованием твердой фазы из силикагелевой мембраны. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту на стадии (а) способа, например РНК, экстрагируют из биологических образцов с использованием экстракции смесью фенол/хлороформ.

В способе можно использовать любой подходящий олигонуклеотидный праймер, раскрытый здесь. Обычно по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер на стадии (а) способа выбирают для получения продукта амплификации согласно стадии (b), который имеет длину от 45 нуклеотидов до 3000 нуклеотидов. Однако продукты амплификации, даже меньшей или большей длины, могут быть соответственно получены с использованием способов и олигонуклеотидного праймера, раскрытых здесь.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер на стадии (а) способа выбирается для получения продукта амплификации согласно стадии (b) для анализа ПЦР или ОТ-ПЦР, который имеет длину от 100 нуклеотидов до 2500 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер на стадии (а) способа выбирается для получения продукта амплификации согласно стадии (b) для анализа ПЦР или ОТ-ПЦР, который имеет длину от 200 нуклеотидов до 1500 нуклеотидов. В более предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер на стадии (а) способа выбирается для получения продукта амплификации согласно стадии (b) для анализа ПЦР или ОТ-ПЦР, который имеет длину от 300 нуклеотидов до 1000 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер на стадии (а) способа выбирается для получения продукта амплификации согласно стадии (b) для анализа ОТ-ПЦР в режиме реального времени, который имеет длину от 45 нуклеотидов до 500 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер на стадии (а) способа выбирается для получения продукта амплификации согласно стадии (b) для анализа ОТ-ПЦР в режиме реального времени, который имеет длину от 50 нуклеотидов до 350 нуклеотидов. В более предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер на стадии (а) способа выбирается для получения продукта амплификации согласно стадии (b) для анализа ОТ-ПЦР в режиме реального времени, который имеет длину от 55 до 250 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления для амплификации на стадии (b) способа используется ПЦР. В некоторых вариантах осуществления для амплификации на стадии (b) способа используется ОТ-ПЦР. В некоторых вариантах осуществления амплификация на стадии (b) способа используется ОТ-кПЦР.

В некоторых вариантах осуществления продукт амплификации на стадии (b) способа определяют с помощью саузерн-блоттинга. В некоторых вариантах осуществления продукт амплификации на стадии (b) способа определяют с помощью нозерн-блоттинга. В некоторых вариантах осуществления продукт амплификации на стадии (b) способа определяют спектрофотометрией. В некоторых вариантах осуществления продукт амплификации на стадии (b) способа определяется с использованием красителя для ДНК. В некоторых вариантах осуществления продукт амплификации на стадии (b) способа определяют количественной оценкой присутствия меченого олигонуклеотидного праймера, например, количественным определением присутствия флуоресцентно меченого олигонуклеотидного праймера.

(b) сравнение полученной последовательности нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая представляет собой или комплементарна референсной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, где по меньшей мере 80% идентичность последовательностей между двумя последовательностями указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

В некоторых вариантах осуществления секвенирование на стадии (а) способа выполняется секвенированием по Сэнгеру (метод обрыва цепи). В предпочтительных вариантах осуществления секвенирование на стадии (а) способа выполняется секвенированием нового поколения (NGS), предпочтительно секвенированием Illumina (Solexa), секвенированием Roche 454, ионным полупроводниковым секвенированием или секвенированием через лигирование SOLiD (Goodwin S, et al., (2016) Goodwin S, et al., (2016) Coming of age: Ten years of next-generation sequencing technologies. Nature reviews, Genetics, 17, 333-351).

В предпочтительных вариантах осуществления секвенирование на стадии (а) способа обеспечивает последовательность ДНК, которую можно напрямую сравнивать с референсными последовательностями ДНК, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере 85% идентичность последовательности между двумя последовательностями на стадии (b) способа указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере 90% идентичность последовательности между двумя последовательностями на стадии (b) способа указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

В более предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере 95% идентичность последовательности между двумя последовательностями на стадии (b) способа указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

В еще более предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере 98% идентичность последовательности между двумя последовательностями на стадии (b) способа указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

В еще более предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере 99% идентичность последовательности между двумя последовательностями на стадии (b) способа указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

В особенно предпочтительном варианте осуществления 100% идентичность последовательности двух последовательностей на стадии (b) способа указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

Антитела

Еще один аспект изобретения относится к антителу, которое связывается с полипептидом, где полипептид кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь, и/или где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11, или представляет собой любую из SEQ ID NO 7-11 или ее консервативно замещенный вариант.

В некоторых вариантах осуществления полипептид выбран из группы, состоящей из:

(i) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична или представляет собой SEQ ID NO: 7;

(ii) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична или представляет собой SEQ ID NO: 8;

(iii) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична или представляет собой SEQ ID NO: 9;

(iv) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична или представляет собой SEQ ID NO: 10; и

(v) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична или представляет собой SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой поликлональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.

Антитела, раскрытые здесь, можно получить методами генетической иммунизации, в которых нативные белки экспрессируются in vivo с нормальными посттранскрипционными модификациями, избегая выделения или синтеза антигена. Например, гидродинамическую доставку экспрессионных векторов плазмидной ДНК в вену хвоста или конечности можно использовать для получения представляющего интерес антигена in vivo у мышей, крыс и кроликов и, таким образом, индукции антигенспецифических антител (Tang et al., Nature 356 (6365): 152-4 (1992); Tighe et al., Immunol. Today, 19 (2) 89-97 (1998); Bates et al., Biotechniques, 40 (2) 199-208 (2006)). Данная процедура позволяет эффективно генерировать антигенспецифические антитела с высоким титром. Антитела также можно получить методами in vitro. Подходящие примеры включают, не ограничиваясь этим, гибридомные технологии, фаговый дисплей, дрожжевой дисплей и т.п.

Наборы

Еще один аспект изобретения относится к набору для обнаружения вируса в биологическом образце рыбы, где набор содержит олигонуклеотидный праймер, раскрытый здесь, и/или антитело, раскрытое здесь.

В некоторых вариантах осуществления набор представляет собой набор для анализа ОТ-ПЦР в режиме реального времени, например, набор представляет собой набор для анализа ОТ-кПЦР в режиме реального времени.

В некоторых вариантах осуществления набор предназначен для обнаружения тотивируса в биологическом образце рыбы. В предпочтительных вариантах осуществления набор предназначен для обнаружения тотивируса в биологическом образце рыбы пинагор.

Лечебные применения и вакцины

В еще одном аспекте изобретение относится к антителу для лечения рыб, в частности, рыбы пинагор, против заболевания, вызванного тотивирусной инфекцией. В предпочтительном варианте осуществления антитело предназначено для применения в лечении рыб, в частности рыбы пинагор, страдающей заболеванием, вызванным вирусом, описанным здесь (CLuTV). Антитело связывается с полипептидом, кодированным последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащейся в геноме вируса, раскрытого здесь.

В предпочтительных вариантах осуществления рыба представляет собой рыбу пинагор.

В некоторых вариантах осуществления у рыбы проявляются следующие симптомы:

(i) повреждение тканей кишечника и/или

(ii) диарея; или

(iii) кардиомиопатия.

Симптомы можно определить, как описано выше. В предпочтительных вариантах осуществления у рыб проявляются симптомы кардиомиопатии.

В еще одном аспекте изобретение относится к применению вируса, раскрытого здесь, для получения вакцины против заболевания, вызываемого указанным вирусом.

В еще одном аспекте изобретение относится к вакцине, содержащей:

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытой здесь;

(iv) вирусный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере на 95% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11, или которая представляет собой любую из SEQ ID NO: 7-11 или его консервативно замещенный вариант; или

(v) вирус, раскрытый здесь.

В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит несколько вирусных полипептидов, например, первый полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 7, и второй полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере 80% идентична SEQ ID NO: 8. Вакцина может содержать один, два, три, четыре или пять вирусных полипептидов.

Вакцина предназначена для защиты рыб, в частности, рыбы пинагор, от болезней, вызванных тотивирусной инфекцией. В предпочтительном варианте осуществления вакцина предназначена для защиты рыб, в частности, рыбы пинагор, от заболевания, вызванного инфицированием вирусом, раскрытым здесь (CLuTV).

В некоторых вариантах осуществления, где вакцина содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащуюся в геноме вируса, раскрытого здесь, указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну из ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y или ORF-Z, согласно любому из их вариантов осуществления, раскрытых здесь. В предпочтительных вариантах осуществления, где вакцина содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащуюся в геноме вируса, раскрытого здесь, указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере ORF-1 и ORF-2 согласно любому из их вариантов осуществления, раскрытых здесь. В некоторых вариантах осуществления, где вакцина содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащуюся в геноме вируса, раскрытого здесь, указанная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична последовательности вирусного генома согласно SEQ ID NO: 6 (CLuTV).

Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК.

В некоторых вариантах осуществления, где вакцина содержит вирусный полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса, раскрытого здесь, где указанный полипептид выбран из группы, состоящей из:

В некоторых вариантах осуществления, где вакцина содержит вирус, раскрытый здесь, геном указанного вируса включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты РНК, содержащую по меньшей мере одну из ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y или ORF-Z согласно любому из их вариантов осуществления, раскрытых здесь. В некоторых вариантах осуществления, где вакцина содержит вирус, раскрытый здесь, геном указанного вируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты РНК, которая представляет собой или которая комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно, на 98%, особенно предпочтительно на 99% или даже на 100% идентична последовательности вирусного генома согласно SEQ ID NO: 6 (CLuTV).

В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит количество антигена в диапазоне от 0,05 до 1,0 мг/мл, например от 0,1 до 0,5 мг/мл, от 0,15 до 0,4 мг/мл или от 0,2 до 0,3 мг/мл. Вакцину можно вводить в дозах от 0,005 до 0,5 мг/особь, предпочтительно от 0,01 до 0,05 мг/особь, более предпочтительно от 0,01 до 0,02 мг/особь.

В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит количество антигена, соответствующее TCID₅₀ от 10⁵ до 10¹⁰ на дозу, предпочтительно TCID₅₀ от 10⁶ до 10⁹на дозу.

Вакцина может находиться в форме суспензии вируса или может быть лиофилизирована. В лиофилизированную вакцину может полезным добавить один или более стабилизаторов. Подходящими стабилизаторами являются, например, углеводы, такие как сорбит, маннит, крахмал, сахароза, декстран; белок-содержащие агенты, такие как бычья сыворотка или обезжиренное молоко; и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов.

Вакцина по изобретению может дополнительно находиться в составе, содержащем адъювант. Примерами адъювантов, часто используемых при выращивании рыбы и моллюсков, являются мурамилдипептиды, липополисахариды, некоторые глюканы и гликаны, минеральное масло, Montanide™ и Carbopol^®. Обзор адъювантов, подходящих для рыбных вакцин, приведен в обзорной статье Sommerset (Expert Rev. Vaccines, 4 (1), 89-101 (2005)).

Вакцина по изобретению может дополнительно содержать подходящий фармацевтический носитель. В некоторых вариантах осуществления вакцина формулирована в виде эмульсии «вода в масле». Вакцина также может содержать так называемый «носитель». Носитель представляет собой материал, к которому антиген прикрепляется, но не связывается с ним ковалентно. Такие носители, среди прочего, представляют собой биоразлагаемые нано/ микрочастицы или капсулы из PLGA (сополимера лактида и гликолевой кислоты), альгината или хитозана, липосомы, ниосомы, мицеллы, множественные эмульсии и макросоли, все известные в данной области техники. Особой формой такого носителя, в котором антиген частично встроен в носитель, является так называемый иммуностимулирующий комплекс ISCOM.

Кроме того, вакцина может содержать одно или более подходящих поверхностно-активных соединений или эмульгаторов, например Cremophore®, Tween® и Span®. Также можно использовать адъюванты, такие как интерлейкин, CpG и гликопротеины.

В некоторых вариантах осуществления вакцина вводится в корм для рыб, где указанный корм может представлять собой, например, гранулированный или экструдированный корм.

Еще в одном аспекте изобретение относится к молекуле интерферирующей РНК (iРНК) для применения в лечении рыб, в частности, рыбы пинагор, страдающей заболеванием, вызванным тотивирусной инфекцией. В предпочтительном варианте осуществления iРНК предназначена для применения в лечении рыб, в частности рыбы пинагор, страдающей заболеванием, вызванным вирусом, раскрытым здесь (CLuTV). В конкретном варианте осуществления молекула iРНК содержит по меньшей мере 12 (предпочтительно смежных) нуклеотидов или комплементарных последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в геноме вируса, раскрытого здесь.

(i) повреждение тканей кишечника и/или

(ii) диарея; или

(iii) кардиомиопатия.

В некоторых вариантах осуществления молекула iРНК содержит по меньшей мере 12 (предпочтительно смежных) нуклеотидов последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y или ORF-Z, или комплементарная ей, в соответствии с любым их вариантов осуществления, раскрытых здесь. В некоторых вариантах осуществления молекула iРНК содержит по меньшей мере 12 (предпочтительно смежных) нуклеотидов или комплементарных последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно на 98%, особенно предпочтительно на 99% или даже на 100% идентична последовательности вирусного генома согласно SEQ ID NO: 6 (CLuTV).

Последовательности

Последовательности, приведенные в настоящем раскрытии, представляют собой следующие (см. также фигуры и список последовательностей):

Таблица 1
Последовательность	Описание
SEQ ID NO: 1	нуклеотидная последовательность CLuTV_ORF-1
SEQ ID NO: 2	нуклеотидная последовательность CLuTV_ORF-2
SEQ ID NO: 3	нуклеотидная последовательность CLuTV_ORF-X
SEQ ID NO: 4	нуклеотидная последовательность CLuTV_ORF-Y
SEQ ID NO: 5	нуклеотидная последовательность CLuTV_ORF-Z
SEQ ID NO: 6	нуклеотидная последовательность генома CLuTV_Genome
SEQ ID NO: 7	аминокислотная последовательность CLuTV_ORF-1
SEQ ID NO: 8	аминокислотная последовательность CLuTV_ORF-2
SEQ ID NO: 9	аминокислотная последовательность CLuTV_ORF-X
SEQ ID NO: 10	аминокислотная последовательность CLuTV_ORF-Y
SEQ ID NO: 11	аминокислотная последовательность CLuTV_ORF-Z
SEQ ID NO: 12	прямой праймер CLP01
SEQ ID NO: 13	зонд CLP01 Taqman
SEQ ID NO: 14	обратный праймер CLP01
SEQ ID NO: 15	прямой праймер CLP02
SEQ ID NO: 16	зонд CLP02 Taqman Probe
SEQ ID NO: 17	обратный праймер CLP02
SEQ ID NO: 18	прямой праймер CLP03
SEQ ID NO: 19	зонд CLP03 Taqman
SEQ ID NO: 20	обратный праймер CLP03

Другие подходящие олигонуклеотидные праймеры, приведенные в данном документе, представлены в таблице 2:

Таблица 2
SEQ ID NO	Название праймера	Последовательность праймера
21	PCL_F1	ATGGACGCAAACAAAGAAACA
22	PCL_R1	CCAATGCTGTTCATGAAACC
23	PCL_F2	CCGGACCTCTTTCAAGTAGTG
24	PCL_R2	GCATCTCACTCACGATGGCT
25	PCL_F3	TGGGAACACACAGGACTGGG
26	PCL_R3	CTCCATGCAATCTGACCTTG
27	PCL_F4	ACTTGTGCTGGTGAGCTAGTGA
28	PCL_R4	ATCCAGGACGGTGGCGT
29	PCL_F5	TTAGAGAAAACAAACTTGACCCATC
30	PCL_R5	CGACGAGTATGTCAACTAGCATATT
31	PCL_F6	CAAATGACAGACGACGTCAGG
32	PCL_R6	CCAGTGCTGAAGGTGTTTGA
33	PCL_F7	CCGATATTGCGGGTTTAACCCA
34	PCL_R7	CGCTACGAAAGCTGAGACCG
35	PCL_F8	GTTGTTACAGTGTAAGTGCTGTGTT
36	PCL_R8	TTACCGAGAGTGAGTAGAAACTGAA
37	PCL_F9	ACGCCACCGTCCTGGAT
38	PCL_R9	CCTGACGTCGTCTGTCATTTG
39	PCL_F10	CGGTCTCAGCTTTCGTAGCG
40	PCL_R10	AACACAGCACTTACACTGTAACAAC

Дополнительные олигонуклеотидные праймеры, приведенные в данном документе, представлены в таблице 3:

Таблица 3
SEQ ID NO	Последовательность праймера
41	CCTACACTTACAGCCACAGAGTGCC
42	TGGTGGCGGCGCTAGCTGTCAGGAGAGGAAAGAGAAG
43	ACTCAACATAAAGTTATACTCATGGCTAAAATTTATTACACTACAGGAACAGCAG GAAAACGATGGGTGTAGGTGAAGGCTAGAGAAGCCAAATACAGGTTTTCTTATC TTCCTTTTGTGGG
44	TGCAGGTATTTCCTCACCCGTCAGC
45	AGTACATCATACAATACATGATCAACTGCTCTGATTACATTATTAATTGAAATT
46	CAGGTTCACAATGACCACCTCAT
47	CGATGTGGGATAACGAACCGGGTAA
48	TTACAGGGTTCCTGCCTAAATGAATCATCATCCAAGGATTTACAAAAAATTATAG CTTGKCACCCCAACCATTATAGCTATCATAACCCTACTCAACCTGTACTCTTAC ATACACCTCAT
49	TATCACATCCACTTGATCCAAAGCTGAGTTGAGGTTCTGAATACCTTTGTTAATTT TCTGTCTCAATGACCTAATATTGTCAGTGGAGTGTTAAATC

Примеры

Следующие ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Они предназначены для помощи в понимании изобретения, и их не следует истолковывать в качестве ограничения объема изобретения.

Пример 1: идентификация CLuTV

Образцы рыбы были отобраны с места выращивания пинагора (Cyclopterus lumpus), где наблюдалась высокая смертность рыбы (60-80%). Образцы анализировали с использованием стандартной ОТ-ПЦР в режиме реального времени и гистологии. С помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени не было выявлено известных патогенов. Гистологический анализ показал признаки повреждения тканей кишечника у пораженных рыб, но не было обнаружено ни потенциально патогенных бактерий, ни микропаразитов.

Общую фракцию РНК экстрагировали из умирающей рыбы в соответствии с протоколом экстракции смесью фенол/хлороформ (набор для высокопроизводительного выделения РНК из тканей Qiagen RNeasy® 96), и данную РНК использовали в качестве матрицы в анализе секвенирования нового поколения (NGS). NGS-анализ проводили в компании BaseClear (https://www.baseclear.com/), и он дал приблизительно 98 миллионов считываний последовательностей, большинство из которых были получены из транскриптома хозяина. В GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI) было обнаружено, что приблизительно 28600 считываний из анализа NGS не имеют значимого нуклеотидного совпадения. На основании этих считываний изобретателями была идентифицирована и охарактеризована новая вирусная последовательность, названная здесь Cyclopterus lumpus Totivirus или CLuTV. Последовательности ДНК, полученные в результате анализа NGS, представлены на фиг. 2-5 (см. также SEQ ID NO: 1-6). Однако следует понимать, что соответствующие последовательности РНК присутствуют в вирусе CLuTV.

Последовательность CLuTV, идентифицированная здесь, имеет длину 6353 нуклеотида и содержит пять возможных открытых рамок считывания (ORF). Схема приведена на фиг. 1. Связь между CLuTV и другими известными вирусами можно определить только сравнением транслированных аминокислотных последовательностей. Длина и организация генома вместе с последующим анализом последовательности показали, что это новый вирус в семействе Totiviridae, ближайшим представителем которого является вирус атлантического лосося PMCV.

Предварительные результаты показывают, что по меньшей мере в Норвегии, CLuTV широко распространен среди выращиваемых на фермах пинагоров.

Патология, связанная с CLuTV у пинагора, показана на фиг. 9-12. Срезы тканей пинагора окрашивали с использованием гистологического красителя гематоксилина и эозина (H&E). На фиг. 9 представлен полный срез пораженного пинагора, показывающий скопление жидкости в желудке (стрелка). На фиг. 10 представлен срез кишечника пинагора, показывающий скопление слизи и клеточные выделения (стрелки). На фиг. 11 представлен срез кишечника пинагора, показывающий скопление слизи (стрелка) и клеточные выделения. На фиг. 12 представлен срез кишечника пинагора, показывающий скопление слизи (стрелка).

Пример 2: анализ нуклеотидной последовательности CLuTV

Нуклеотидная последовательность CLuTV по данным анализа NGS была подтверждена стандартным секвенированием по Сэнгеру продуктов ОТ-ПЦР, полученных из общей фракции РНК, экстрагированной из умирающих рыб.

При выполнении стандартного поиска нуклеотидов BLAST с использованием последовательности CLuTV совпадений в NCBI GeneBank обнаружено не было. Если параметры поиска изменяли для включения в поиск более непохожих последовательностей, то были идентифицированы некоторые участки последовательностей других известных вирусов. Процент идентичности нуклеотидных последовательностей («Seq. Id.») между этими областями CLuTV и областями других известных вирусов показан в таблице 4.

Таблица 4
Наилучшее совпадение нуклеотидов, обнаруженное между CLuTV и известными вирусами в NCBI GeneBank

PMCV, ближайший представитель для CLuTV, содержит в своем геноме три ORF. ORF3 из PMCV находится в той же области, что и ORFX-Y в CLuTV.

Пример 3: анализ аминокислотной последовательности CLuTV

Трансляция ORF CLuTV дает в общей сложности пять потенциальных белков. Аминокислотная идентичность ORF CLuTV и других известных белков из других вирусов показана в таблице 5. Приведено только наилучшее совпадение для каждой ORF.

Таблица 5
Наилучшее совпадение аминокислотной последовательности, обнаруженное между CLuTV и известными вирусами в NCBI GeneBank

Пример 4: оценка присутствия CLuTV в выращиваемых популяциях пинагора

Были разработаны три отдельных анализа ОТ-ПЦР в режиме реального времени (CLP01, CLP02 и CLP03) с использованием праймеров согласно SEQ ID NO: 12-14, 15-17 и 18-20 соответственно. CLP01 нацелен на ORF-1, CLP02 нацелен на ORF-2 и CLP03 нацелен на ORF-Y. Исходный материал образца рыбы был подтвержден как положительный на CLuTV с использованием всех данных трех анализов.

Для более обширного исследования был выбран анализ CLP01 для оценки присутствия CLuTV в имеющихся популяциях пинагора. Результаты скрининга различных популяций пинагора в Норвегии приведены в таблице 6.

Таблица 6
Результаты тестирования материала NGS и полевого материала

Как следует из данных таблицы, в некоторых популяциях пинагора, в частности в округах Finnmark и Rogaland, распространенность CLuTV превышает 90%.

Принимая во внимание раскрытие, представленное здесь, следует понимать, что настоящее изобретение также включает следующие пункты:

1. Нуклеиновая кислота, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты включает:

(а) по меньшей мере, последовательность одной открытой рамки считывания (ORF), выбранной из группы, состоящей из ORF-1, ORF-2, ORF-X, ORF-Y и ORF-Z, или

(b) последовательность, комплементарную ей;

где:

2. Нуклеиновая кислота по п.1, где:

3. Нуклеиновая кислота по пп.1 или 2, где:

4. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-3, где:

5. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-4, где:

6. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-5, где:

7. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-6, где:

ORF-1 на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1,

ORF-2 на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2,

ORF-X на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3,

ORF-Y на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4, и

ORF-Z на 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5.

8. Нуклеиновая кислота, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80% идентична соответствующей последовательности, присутствующей в SEQ ID NO: 6, предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична и особенно предпочтительно на 100% идентична.

9. Нуклеиновая кислота, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80% идентична соответствующей последовательности, присутствующей в последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 6, предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере 99% идентична и особенно предпочтительно на 100% идентична.

10. Нуклеиновая кислота по пп.8 или 9, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты содержит 200 нуклеотидов или менее.

11. Нуклеиновая кислота по любому из пп.8-10, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере 60 нуклеотидов.

12. Нуклеиновая кислота по п.11, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере 100 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 150 нуклеотидов.

13. Нуклеиновая кислота по п.8 или 9, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере 200 нуклеотидов.

14. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13:

(а) в качестве гибридизационного зонда;

(b) для обнаружения вируса, раскрытого здесь, в биологическом образце рыбы, в частности, рыбы пинагор;

(c) в способе обнаружения вируса, который инфицирует и способен приводить к гибели рыбы, в частности, рыбы пинагор;

(d) в способе обнаружения вируса, который инфицирует и способен приводить к гибели рыбы, в частности рыбы пинагор, согласно любому из соответствующих способов, раскрытых здесь;

(e) для приготовления вакцины для защиты рыб, в частности, рыбы пинагор, от болезней, вызванных инфекцией Totivirus; или

(f) для приготовления вакцины для защиты рыб, в частности рыбы пинагор, от болезни, вызванной вирусом, раскрытым здесь, например, вирусом по пп.18-25 ниже.

15. Нуклеиновая кислота по п.1, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере ORF-1 и ORF-2, как определено в любом из пп.1-7, или последовательность, комплементарную им.

16. Нуклеиновая кислота по п.1, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80% идентична геному вируса согласно SEQ ID NO: 6, предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична, но все же более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере 99% идентична и особенно предпочтительно на 100% идентична.

17. Нуклеиновая кислота по п.1, где последовательность указанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80% идентична последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 6, предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична, но более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична и особенно предпочтительно на 100% идентична.

18. Вирус, в частности вирус, который инфицирует и способен приводить к гибели рыбы пинагор (например, Cyclopterus lumpus), где геном вируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13 и 15-17, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты, содержащаяся в геноме вируса, содержит основание урацил (U) вместо основания тимин (T).

19. Вирус по п.18, где инфицирование этим вирусом рыбы пинагор вызывает у рыб следующие симптомы:

(i) повреждение тканей кишечника и/или

(ii) диарею; или

(iii) кардиомиопатию.

20. Вирус, который содержит одну или более, предпочтительно две или более, более предпочтительно три или более, более предпочтительно четыре или более, еще более предпочтительно пять из ORF 1, 2, X, Y и Z, где указанные ORF 1, 2 , X, Y, Z кодируют вирусные полипептиды согласно SEQ ID NO: 7-11 соответственно или вирусные полипептиды, которые по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 7-11 соответственно.

21. Вирус по п.20, где указанные ORF 1, 2, X, Y и Z кодируют вирусные полипептиды согласно SEQ ID NO: 7-11 соответственно или вирусные полипептиды, которые по меньшей мере на 90% идентичны SEQ ID NO: 7-11 соответственно.

22. Вирус по п.20, где указанные ORF 1, 2, X, Y и Z кодируют вирусные полипептиды согласно SEQ ID NO: 7-11 соответственно или вирусные полипептиды, которые по меньшей мере на 95% идентичны SEQ ID NO: 7-11 соответственно.

23. Вирус по любому из пп.20-22, где указанные ORF 1, 2, X, Y и Z кодируют вирусные полипептиды, которые являются консервативно замещенными вариантами SEQ ID NO: 7-11 соответственно.

24. Вирус по любому из пп.18-23, где вирус является вирусом без оболочки.

25. Вирус по любому из пп.18-24, где вирус представляет собой Totivirus.

26. Олигонуклеотидный праймер, который содержит последовательность по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и особенно предпочтительно по меньшей мере 18 последовательных нуклеотидов, где указанная последовательность содержится в геноме вируса по любому из пп.18-25, предпочтительно при условии, что указанный праймер не содержит SEQ ID NO: 41-49.

27. Олигонуклеотидный праймер, который содержит последовательность по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов и особенно предпочтительно по меньшей мере 18 последовательных нуклеотидов, где указанная последовательность комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в геноме вируса по любому из пп.18-25, предпочтительно при условии, что указанный праймер не содержит SEQ ID NO: 41-49.

28. Олигонуклеотидный праймер, который содержит последовательность по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов и особенно предпочтительно по меньшей мере 18 последовательных нуклеотидов, где указанная последовательность по меньшей мере на 80% идентична последовательности, содержащейся в SEQ ID NO: 6, предпочтительно при условии, что указанный праймер не содержит SEQ ID NO: 41-49.

29. Олигонуклеотидный праймер, который содержит последовательность по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и особенно предпочтительно по меньшей мере 18 последовательных нуклеотидов, где указанная последовательность по меньшей мере на 80% идентична последовательности, содержащейся в последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 6, предпочтительно при условии, что указанный праймер не содержит SEQ ID NO: 41-49.

30. Олигонуклеотидный праймер по п.28 или 29, где указанная процентная идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, еще более предпочтительно по меньшей мере, 99% и особенно предпочтительно 100%.

31. Олигонуклеотидный праймер по любому из пп.22-26, где указанный олигонуклеотидный праймер имеет от 9 до 60 нуклеотидов в длину, предпочтительно от 12 до 40 нуклеотидов в длину, более предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов в длину, особенно предпочтительно от 18 до 25 нуклеотидов в длину.

32. Олигонуклеотидный праймер по любому из пп.22-24, где указанная последовательность, содержащаяся в нем, представляет собой или комплементарна фрагменту референсной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.

33. Олигонуклеотидный праймер, который содержит по меньшей мере 9 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и особенно предпочтительно по меньшей мере 18 последовательных нуклеотидов, последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, которая представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 40, или комплементарной ей, предпочтительно при условии, что указанный праймер не содержит SEQ ID NO: 41-49.

34. Применение по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера в способе обнаружения вируса по любому из пп.18-25, где по меньшей мере один праймер содержит последовательность по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и особенно предпочтительно по меньшей мере 18 последовательных нуклеотидов, и где указанная последовательность комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме указанного вируса, предпочтительно при условии, что указанный праймер не содержит SEQ ID NO: 41-49.

35. Применение по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13 или 15-17, или по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера по любому из пп.26-34 в способе обнаружения вируса рыб, где необязательно вирус инфицирует и приводит к гибели рыбы пинагор.

36. Применение по п.35, где указанная нуклеиновая кислота или указанный олигонуклеотидный праймер используются в способе обнаружения вируса по любому из пп.18-25.

37. Способ обнаружения вируса, который инфицирует и может привести к гибели рыбы, в частности, рыбы пинагор, включающий следующие стадии:

(а) контактирование нуклеиновой кислоты, экстрагированной из биологического образца рыбы по меньшей мере с одним олигонуклеотидным праймером с образованием смеси, где по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер комплементарен последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса по любому из пп.18-25,

38. Способ по п.37, где олигонуклеотидный праймер представляет собой олигонуклеотидный праймер по любому из пп. 26-34.

39. Способ по п.37 или 38, где нуклеиновую кислоту на стадии (а) способа, например РНК, экстрагируют из биологических образцов с использованием твердофазной экстракции, например, очистки на колонке с использованием твердой фазы из силикагелевой мембраны.

40. Способ по любому из пп.37, 38, где нуклеиновую кислоту на стадии (а) способа, например РНК, экстрагируют из биологических образцов с использованием экстракции смесью фенол/хлороформ.

41. Способ обнаружения вируса, который инфицирует рыбу и способен приводит к гибели рыбы, в частности, рыбу пинагор, включающий следующие стадии:

(b) сравнение полученной последовательности нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая представляет собой или комплементарна референсной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, где по меньшей мере 80% идентичность последовательности между двумя последовательностями указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

42. Способ по п.41, где процент идентичности последовательности между двумя последовательностями, который указывает на присутствие вируса в биологическом образце, составляет по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, еще более предпочтительно по меньшей мере 99% и особенно предпочтительно 100%.

43. Вирусный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11.

44. Вирусный полипептид по п.43, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11.

45. Вирусный полипептид по п.43 или 44, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична любой из SEQ ID NO: 7-11.

46. Вирусный полипептид по любому из пп.43-45, содержащий аминокислотную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO: 7-11 или ее консервативно замещенный вариант.

47. Вирусный полипептид по любому из пп.43-45, содержащий аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 7-11.

48. Антитело, которое связывается с полипептидом, где полипептид кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса по любому из пп.18-25, или представляет собой вирусный полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по любому из пп.1-13 и 15-17.

49. Антитело, которое связывается с полипептидом, выбранным из группы, состоящей из:

(i) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична или представляет собой SEQ ID NO: 7;

(ii) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, особенно предпочтительно, по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична или представляет собой SEQ ID NO: 8;

(iv) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 98%, особенно предпочтительно, по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична или представляет собой SEQ ID NO: 10; и

50. Набор для обнаружения вируса в биологическом образце рыбы, где набор включает нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-13 или 15-17, олигонуклеотидный праймер по любому из пп.26-34 и/или антитело по п.48 или 49.

51. Набор по п.50, где набор подходит для проведения или предназначен для применения в проведении анализа ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

52. Антитело по п.48 или 49 для применения в лечении рыбы, инфицированной вирусом, в частности рыбы пинагор.

53. Антитело по п.52, где вирус представляет собой вирус по любому из пп.18-25.

54. Применение вируса по любому из пп.18-21 для получения вакцины.

55. Вакцина, содержащая:

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме вируса по любому из пп.18-25;

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13 или 15-17;

(iii) вирусный полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащейся в геноме вируса по любому из пп.18-25;

(iv) вирусный полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13 или 15-17;

(v) вирусный полипептид по любому из пп.43-47, или

(vi) вирус по любому из пп.18-25.

56. Вакцина по п.55, где последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в любом из пп.1-13 или 17, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит основание урацил (U) вместо основания тимин (Т).

57. Молекула интерферирующей РНК (iРНК) для применения в лечении рыб, инфицированных вирусом, в частности, рыбы пинагор, где молекула iРНК содержит по меньшей мере 12 (предпочтительно смежных) нуклеотидов или комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в геноме вируса по любому из пп.18-25.

58. Молекула интерферирующей РНК (iРНК) для применения в лечении рыб, инфицированных вирусом, в частности рыбы пинагор, где молекула iРНК содержит по меньшей мере 12 (предпочтительно смежных) нуклеотидов или комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно на 98%, особенно предпочтительно на 99% или даже на 100% идентична последовательности вирусного генома согласно SEQ ID NO: 6 (CLuTV).

59. Интерферирующая РНК по п.57 или 58, где указанная молекула iРНК содержит по меньшей мере 15, и более предпочтительно по меньшей мере 18 указанных (предпочтительно смежных) нуклеотидов.

Специалисты в данной области понимают или смогут определить, используя не более чем рутинные эксперименты и/или общеизвестные общие знания, многочисленные эквиваленты конкретных аспектов, элементов и вариантов осуществления, раскрытых здесь как в примерах, так и в основной части полного описания патента. Такие эквиваленты считаются входящими в объем данного изобретения и предназначены для охвата следующей формулой изобретения или любой формулой изобретения, которая может быть реализована на основе настоящего раскрытия.

--->

Список последовательностей

<110> Pharmaq Analytiq

<120> Новый Totivirus рыб

<130> ZOE20234PCT

<160> 49

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 2484

<212> ДНК

<213> Вирусы

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность ORF-1

<400> 1

atggacgcaa acaaagaaac acaaataaca gaggagaaag taggagagga ggttacctta 60

caggtggaag taagggagga agatacggga ttactccaag acccaacgag taaagaagcc 120

ctgacaaaac tgatcaccga cctagccaaa aaacaaaggg aggtggtctc tgatgcaacc 180

gatttcgggt tggacatcgc aacaactcta cagtcaagac agtcaaacag tcagttccac 240

gtgttgagag aaggaaatgt agataccagg atagcatcgg agagaggatc aacaacacac 300

acaagaaggc ttgccactat tggtaacgtg gagccatgct ggttcagaac agcaccgggt 360

gttagggggg ggatattgat tgaaccctca aacgctgttc tggctctgaa acctctcttc 420

cagggtgcag accccggacc tctttcaagt agtgcccgtt tggatattaa caactattca 480

tcccagacgg cccttggctt catgaacagc attggagcag acatcgaaag taacagggtt 540

tcattttctg agccgttgat tcgcgccttc atcttctcaa ttgatgatca tataagaggt 600

gaatcacccc tctcgtggtt ggggaacaga acgacgcttt tgccgcgccc acttggtaca 660

ttacctagtg gggattactt tccagcatct gtaagatcag ctggatgggt ggcgggagac 720

acacaggcta tgattgtgaa cgctgaagac tttgcaaggg aggcaagggg cgaggagagg 780

ttcaatgacg gttggggggc aacagtatgg aatgtaccag gagtagaagg tgtggcagtt 840

gttcccatta aactcgcaga ccaaggagat ccagcaatca attctatctg gatgctcatg 900

cacatggaaa atccaatccg tacaaggttt gttgaggttg atgaggttga catgttgctg 960

gatgatcctc aggtgggttc agaatggaca aatctttcaa catctgttgt tccgggaccg 1020

tcaaagaagg ttctcttcgt gatcactgac atgaacaaca accagagtgg ggacatactc 1080

ctggacgatt tcaacggtgc tgttgacaac atcgaccaag cagccaacgt cataggagga 1140

gtgccggtcg acatcggagc actaatacct gcctggatgg ggttggatcc tgatcgtcgg 1200

tcagagttgg ggattgctgg agtgaggaga tggacaaggt actatgggaa cacacaggac 1260

tgggaggctt cactagccat cgtgagtgag atgctcgtca ctttccctgg acaggtacag 1320

aggtcaggaa gaacaggtgc tgagaatcac tatgctgatg caggaggagg gattgcccaa 1380

tacccactga atggtattga tgtggtgttg tatgatgggt tgacggctgc agagaagtta 1440

gcattagctg gaagagagtc tgacatcatg actacaccag cttcgggcta caggcagcga 1500

tcaaacaatc caaacacttc gcctccaatg ctcctatact gtcggttttc ctcagaagca 1560

gccgtggctg taagtgctct actctataag cccaggttca caatgaccat cggaaatgag 1620

ttgagacctg ccatcctggc tgataacatc tacaggagag gaaagagaac agcagtcatg 1680

gtggacatca tcgcaggcca gataggtgca gtttctagga tgaccaacac cccagggaac 1740

tcagaacaac cagcagtggc tcaagccatt gttcgtcaac tagcaggctg tgccacacgt 1800

ctacatcagg aaacttgtgc tggtgagcta gtgaacatca ctgtctctgg gtggaataac 1860

caacaaggtc agattgcatg gagaaacctt tacacggatg gccgtgacag aacactgagc 1920

tgcagggtac cacggatgga gtacaactcg ctgggatttg atggaaggat ggaaatcgat 1980

gacctctaca acttcaaaac agagggattc gacgcacttg acattgatgg gcagcagtgg 2040

gatcacatga attggaaaac tccacatcaa aaggaagacg gacaggtcac cgcacgaagg 2100

ctgacttcag cagcaggatg gacaagggct cttgttccac ttgacaacat cggtcttgta 2160

agggctaacg gagcagagtt cgcaccactc ggagtacatg tcctaaaccc aacagttgga 2220

agaggaaagg aagtaagata ttccaactat ggatttgtac cactcgcaag cgagatccga 2280

gagttgccac tggtcacaca ggtaccttca cagaacgatg ccaatcacat cattcaccct 2340

gcagttcgcg gtggaaggcc tctggtgtta ggaaacatgg gaatgttcaa tccaatcttc 2400

atggacagaa ctccgggaca aagagcatcc cagaatccca caaccgacac acagaccgtg 2460

aacaacgcca ccgtcctgga tttc 2484

<210> 2

<211> 1941

<212> ДНК

<213> Вирусы

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность ORF-2

<400> 2

atgacaattt taatcaattt tattagagaa aacaaacttg acccatcaaa ggtgttcaaa 60

aatttaacaa acaaggtaaa gttggctggt gagggattca gtagtgactg gaggtattat 120

gtgaactggg aattacttgg tggataccag gatctcgagg aacacgacat gattgaggaa 180

gtaagggctt ttacaacgca ggaagcaaag tcggcagagt tcggagggcc ggttgttaaa 240

gcattggaag aacttcttgc ccctttatca ggagtggtac gttcaaagag aactttggag 300

gagttcctac tggacagaga tgcatgggcg aagaatacat caggttttgt tacaagtaac 360

atcaagaaag gaaagaacaa gattgaggtt gcagagaaca tggacatcaa agagctactg 420

gagatagttt accttggaga atatcaaaac aggccattta taaaacaaga accaggaaaa 480

gccaggccgg tagttaattc aaacttaccg ccctaccttt tcatgagttg ggttttcgaa 540

caaatcgagc ccattttgag gaaaaacttt tcatcaaaaa ctaccatctt cgattcagca 600

tggacaaaga gtgagttgtg gcatcaaatg acagacgacg tcaggtataa gaaaggaatt 660

ttcgttccgc ttgactattc gagattcgat tcaacaatta gtaaagaact agctgtaaca 720

gcattcaata tgctagttga catactcgtc gacatcccct ctgatctgcg aaggtcagcc 780

aaatacaggt tcaggaatca agtgattctg acgggtgagg aaagttggac gtggaacaat 840

gccgttcttt cgggatggcg ttggactgct ctgattacat cattagtcaa tctcgcaatc 900

ctagaagctg cagaggttac cagaacaggg acgggaatta gagtacaagg ggacgacgtg 960

cgtgttttct ttcaaaagaa aggagatgca gaaattgcaa ttgcgaaaat caactcattc 1020

ggtttcgaaa tcaatccaac aaaagtcttt tgctcgaaaa ggagagatga gtatctaaga 1080

atggtagcaa cggatgaatt acgtggttac ccaattaggt cactcccaaa aatattgttt 1140

gtgggaccaa ctgaaacact taccgacaga tcagaagaca gagtaaatgg aatagtcaac 1200

aaatggacaa cactggtgtc aagaggagga aatgagagta ggtgctggaa gatgcttgtt 1260

accgatattg cgggtttaac ccaatggtca cgtgataaca tcaagaagtg gcttcaaaca 1320

ccttcagcac tgggtggtgc aggactgttc cagaacacaa cgtcacaagg aattagactc 1380

aaaatcaaaa cagagattaa ggaggatttg ggaacttaca agctggcgag tgattacccg 1440

ggagacttgg gaaatttatg ggccagaggt aggaactcaa aatccaagct attgtctgca 1500

caattagaag aaatccacat tccacagcca ttaggagttt ggccaaacgc tttcatcttt 1560

acaaagaaga agaagcccac agttaggttc aaagaagaag cattaggatc cacaaaacgt 1620

gacgccttga ttagggataa ggattgggat gcacttgaag atttggttga gaataagtct 1680

gaggtattgt tttggaagag agtgctcccc agatttttct atcgtatgtt gcttgtcgaa 1740

ggaggttttt caactcctat tccaaaaaca ctcgtgaata atgaaatagt tgctacggtc 1800

tcagctttcg tagcgtggta tacttttgaa aagatcatga agtataatgg aatattgagt 1860

ggtgaaaagc tccagagact tcaacttggg gcagagtact attcaagatt cttactggac 1920

tcattcaaac gctttggtaa a 1941

<210> 3

<211> 270

<212> ДНК

<213> Вирусы

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность ORF-X

<400> 3

atggaaaatg aaaagaacgt aagagtaggt agttgttaca gtgtaagtgc tgtgtttgga 60

tctacaatct gtacagcaca agacaacact gcaggtggag atttggaggc taagcagagc 120

tgggattcac cagttgtgac ggcgatgata gtgatcggag tcgtggcatt cattctgatg 180

gtggtgtgga tgttgagagg agcctgcaag ggctacaccg ttgtgaagag accgcatggg 240

aacgaagagg ctctccaact tcaggacgta 270

<210> 4

<211> 354

<212> ДНК

<213> Вирусы

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность ORF-Y

<400> 4

atgtcagtga tgtgggataa cgaatggata aggttgagta gggttagcag gagttctgtt 60

gccgtgaaaa gaaatatata cggtgaacgg gttgaacgct tactactcag ctttggatca 120

gaggcttctg tcttcgaatg gtttggagta gaggaagaag attaccacag gatacgtctg 180

gcattcagag ttattgccca ctgggttatt cactctgaac ttttggaagt aggaggaggg 240

tatacagtct ggagaaatga agatgaccct cgtgaccggg atgcggagtg ggagttctgt 300

tacaccttaa gagttcatgg gagaatggct aactcttcag gcagaagatc agga 354

<210> 5

<211> 336

<212> ДНК

<213> Вирусы

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность ORF-Z

<400> 5

atgatagttt actctttcaa aaaccacaac cagttgacct ttgcactgga agagcagggt 60

gtggctaatg tcatagttca actagatgac aagtggaagg aggtaacatt tcaacaccat 120

gagaggaaag agttggttca gtttctactc actctcggta aatatgtcga taaagaatta 180

tgtacaacag tactcgactt ggaaattacc gaagaagatg atcttgagta tgaaaaggaa 240

taccaggtga atggtgaaat cttgaccttt tggtctgcag aggttgaagg gaaagaagtc 300

attaatgcaa tgacaatgga gatggaatgt ctcaat 336

<210> 6

<211> 6353

<212> ДНК

<213> Вирусы

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность генома

<400> 6

gttagatttg ttttccagtg aggttggttg acggcgcctc accgtaacac tccgtcgggt 60

tcacacgccg ccacgtgtgt cccacccacc actccctccg gtagagtgga ccggttttcg 120

ctggccagat tgagccctgg tcggtagtcg ggtaacatcg cttaaagggt actgtaggcg 180

tctgaaagca cggattcgac actgtgccgt atggcggtcc tgtccacggt actctactta 240

acttcgcccc cttggaggac cgtacaggtc tgacgtgagg aacttctctg aagtgaccac 300

aagcgtcgca gtaattgcta gagggaaaga gctgacgggt tgttgagtat tcagtttcta 360

atataccatg gacgcaaaca aagaaacaca aataacagag gagaaagtag gagaggaggt 420

taccttacag gtggaagtaa gggaggaaga tacgggatta ctccaagacc caacgagtaa 480

agaagccctg acaaaactga tcaccgacct agccaaaaaa caaagggagg tggtctctga 540

tgcaaccgat ttcgggttgg acatcgcaac aactctacag tcaagacagt caaacagtca 600

gttccacgtg ttgagagaag gaaatgtaga taccaggata gcatcggaga gaggatcaac 660

aacacacaca agaaggcttg ccactattgg taacgtggag ccatgctggt tcagaacagc 720

accgggtgtt agggggggga tattgattga accctcaaac gctgttctgg ctctgaaacc 780

tctcttccag ggtgcagacc ccggacctct ttcaagtagt gcccgtttgg atattaacaa 840

ctattcatcc cagacggccc ttggcttcat gaacagcatt ggagcagaca tcgaaagtaa 900

cagggtttca ttttctgagc cgttgattcg cgccttcatc ttctcaattg atgatcatat 960

aagaggtgaa tcacccctct cgtggttggg gaacagaacg acgcttttgc cgcgcccact 1020

tggtacatta cctagtgggg attactttcc agcatctgta agatcagctg gatgggtggc 1080

gggagacaca caggctatga ttgtgaacgc tgaagacttt gcaagggagg caaggggcga 1140

ggagaggttc aatgacggtt ggggggcaac agtatggaat gtaccaggag tagaaggtgt 1200

ggcagttgtt cccattaaac tcgcagacca aggagatcca gcaatcaatt ctatctggat 1260

gctcatgcac atggaaaatc caatccgtac aaggtttgtt gaggttgatg aggttgacat 1320

gttgctggat gatcctcagg tgggttcaga atggacaaat ctttcaacat ctgttgttcc 1380

gggaccgtca aagaaggttc tcttcgtgat cactgacatg aacaacaacc agagtgggga 1440

catactcctg gacgatttca acggtgctgt tgacaacatc gaccaagcag ccaacgtcat 1500

aggaggagtg ccggtcgaca tcggagcact aatacctgcc tggatggggt tggatcctga 1560

tcgtcggtca gagttgggga ttgctggagt gaggagatgg acaaggtact atgggaacac 1620

acaggactgg gaggcttcac tagccatcgt gagtgagatg ctcgtcactt tccctggaca 1680

ggtacagagg tcaggaagaa caggtgctga gaatcactat gctgatgcag gaggagggat 1740

tgcccaatac ccactgaatg gtattgatgt ggtgttgtat gatgggttga cggctgcaga 1800

gaagttagca ttagctggaa gagagtctga catcatgact acaccagctt cgggctacag 1860

gcagcgatca aacaatccaa acacttcgcc tccaatgctc ctatactgtc ggttttcctc 1920

agaagcagcc gtggctgtaa gtgctctact ctataagccc aggttcacaa tgaccatcgg 1980

aaatgagttg agacctgcca tcctggctga taacatctac aggagaggaa agagaacagc 2040

agtcatggtg gacatcatcg caggccagat aggtgcagtt tctaggatga ccaacacccc 2100

agggaactca gaacaaccag cagtggctca agccattgtt cgtcaactag caggctgtgc 2160

cacacgtcta catcaggaaa cttgtgctgg tgagctagtg aacatcactg tctctgggtg 2220

gaataaccaa caaggtcaga ttgcatggag aaacctttac acggatggcc gtgacagaac 2280

actgagctgc agggtaccac ggatggagta caactcgctg ggatttgatg gaaggatgga 2340

aatcgatgac ctctacaact tcaaaacaga gggattcgac gcacttgaca ttgatgggca 2400

gcagtgggat cacatgaatt ggaaaactcc acatcaaaag gaagacggac aggtcaccgc 2460

acgaaggctg acttcagcag caggatggac aagggctctt gttccacttg acaacatcgg 2520

tcttgtaagg gctaacggag cagagttcgc accactcgga gtacatgtcc taaacccaac 2580

agttggaaga ggaaaggaag taagatattc caactatgga tttgtaccac tcgcaagcga 2640

gatccgagag ttgccactgg tcacacaggt accttcacag aacgatgcca atcacatcat 2700

tcaccctgca gttcgcggtg gaaggcctct ggtgttagga aacatgggaa tgttcaatcc 2760

aatcttcatg gacagaactc cgggacaaag agcatcccag aatcccacaa ccgacacaca 2820

gaccgtgaac aacgccaccg tcctggattt ctagtaaggg ggagcacgct tcctccttac 2880

cgcgtggacc tacgattcga cccattcttc aaaaattgac aaagaatttc taaaaagaac 2940

aattaggtac taaaatcgac aattgggaag ataacataac atttggaaca acggagaaat 3000

ttaagagtag tggagaacta cctggttggg gaaaaagtgg gtggagaaga ggactgtggt 3060

tggcgttaca agttgttccc cgtgaagtaa aaaatgagat gacaatttta atcaatttta 3120

ttagagaaaa caaacttgac ccatcaaagg tgttcaaaaa tttaacaaac aaggtaaagt 3180

tggctggtga gggattcagt agtgactgga ggtattatgt gaactgggaa ttacttggtg 3240

gataccagga tctcgaggaa cacgacatga ttgaggaagt aagggctttt acaacgcagg 3300

aagcaaagtc ggcagagttc ggagggccgg ttgttaaagc attggaagaa cttcttgccc 3360

ctttatcagg agtggtacgt tcaaagagaa ctttggagga gttcctactg gacagagatg 3420

catgggcgaa gaatacatca ggttttgtta caagtaacat caagaaagga aagaacaaga 3480

ttgaggttgc agagaacatg gacatcaaag agctactgga gatagtttac cttggagaat 3540

atcaaaacag gccatttata aaacaagaac caggaaaagc caggccggta gttaattcaa 3600

acttaccgcc ctaccttttc atgagttggg ttttcgaaca aatcgagccc attttgagga 3660

aaaacttttc atcaaaaact accatcttcg attcagcatg gacaaagagt gagttgtggc 3720

atcaaatgac agacgacgtc aggtataaga aaggaatttt cgttccgctt gactattcga 3780

gattcgattc aacaattagt aaagaactag ctgtaacagc attcaatatg ctagttgaca 3840

tactcgtcga catcccctct gatctgcgaa ggtcagccaa atacaggttc aggaatcaag 3900

tgattctgac gggtgaggaa agttggacgt ggaacaatgc cgttctttcg ggatggcgtt 3960

ggactgctct gattacatca ttagtcaatc tcgcaatcct agaagctgca gaggttacca 4020

gaacagggac gggaattaga gtacaagggg acgacgtgcg tgttttcttt caaaagaaag 4080

gagatgcaga aattgcaatt gcgaaaatca actcattcgg tttcgaaatc aatccaacaa 4140

aagtcttttg ctcgaaaagg agagatgagt atctaagaat ggtagcaacg gatgaattac 4200

gtggttaccc aattaggtca ctcccaaaaa tattgtttgt gggaccaact gaaacactta 4260

ccgacagatc agaagacaga gtaaatggaa tagtcaacaa atggacaaca ctggtgtcaa 4320

gaggaggaaa tgagagtagg tgctggaaga tgcttgttac cgatattgcg ggtttaaccc 4380

aatggtcacg tgataacatc aagaagtggc ttcaaacacc ttcagcactg ggtggtgcag 4440

gactgttcca gaacacaacg tcacaaggaa ttagactcaa aatcaaaaca gagattaagg 4500

aggatttggg aacttacaag ctggcgagtg attacccggg agacttggga aatttatggg 4560

ccagaggtag gaactcaaaa tccaagctat tgtctgcaca attagaagaa atccacattc 4620

cacagccatt aggagtttgg ccaaacgctt tcatctttac aaagaagaag aagcccacag 4680

ttaggttcaa agaagaagca ttaggatcca caaaacgtga cgccttgatt agggataagg 4740

attgggatgc acttgaagat ttggttgaga ataagtctga ggtattgttt tggaagagag 4800

tgctccccag atttttctat cgtatgttgc ttgtcgaagg aggtttttca actcctattc 4860

caaaaacact cgtgaataat gaaatagttg ctacggtctc agctttcgta gcgtggtata 4920

cttttgaaaa gatcatgaag tataatggaa tattgagtgg tgaaaagctc cagagacttc 4980

aacttggggc agagtactat tcaagattct tactggactc attcaaacgc tttggtaaat 5040

aatgcaatgt acgggagtcg gtcaggaccg tacagtatca acacgaatgt agatttgttc 5100

tacgacggtg ggcaaatagt tgctaaacgg taagtccatc cgaggcggct tacctgtagt 5160

taccctggag acaaagggaa taaacacgaa gtgtgaccct cctagtaagg cccaggaacg 5220

tgccgcgtaa ctatgggtat cggcaataca tgacaaaatg gaaaatgaaa agaacgtaag 5280

agtaggtagt tgttacagtg taagtgctgt gtttggatct acaatctgta cagcacaaga 5340

caacactgca ggtggagatt tggaggctaa gcagagctgg gattcaccag ttgtgacggc 5400

gatgatagtg atcggagtcg tggcattcat tctgatggtg gtgtggatgt tgagaggagc 5460

ctgcaagggc tacaccgttg tgaagagacc gcatgggaac gaagaggctc tccaacttca 5520

ggacgtataa tgtcagtgat gtgggataac gaatggataa ggttgagtag ggttagcagg 5580

agttctgttg ccgtgaaaag aaatatatac ggtgaacggg ttgaacgctt actactcagc 5640

tttggatcag aggcttctgt cttcgaatgg tttggagtag aggaagaaga ttaccacagg 5700

atacgtctgg cattcagagt tattgcccac tgggttattc actctgaact tttggaagta 5760

ggaggagggt atacagtctg gagaaatgaa gatgaccctc gtgaccggga tgcggagtgg 5820

gagttctgtt acaccttaag agttcatggg agaatggcta actcttcagg cagaagatca 5880

ggatgatagt ttactctttc aaaaaccaca accagttgac ctttgcactg gaagagcagg 5940

gtgtggctaa tgtcatagtt caactagatg acaagtggaa ggaggtaaca tttcaacacc 6000

atgagaggaa agagttggtt cagtttctac tcactctcgg taaatatgtc gataaagaat 6060

tatgtacaac agtactcgac ttggaaatta ccgaagaaga tgatcttgag tatgaaaagg 6120

aataccaggt gaatggtgaa atcttgacct tttggtctgc agaggttgaa gggaaagaag 6180

tcattaatgc aatgacaatg gagatggaat gtctcaatta attctctctt atagagaggc 6240

acagcatcac acaacacaca ctcacacaca ccaacgcaca cactaggctg gcgggcctat 6300

aggagtaccc ctgactccga atataaatct aatgggggcc tgtagttaag cac 6353

<210> 7

<211> 828

<212> БЕЛОК

<213> Вирусы

<220>

<223> Аминокислотная последовательность ORF-1

<400> 7

Met Asp Ala Asn Lys Glu Thr Gln Ile Thr Glu Glu Lys Val Gly Glu

1 5 10 15

Glu Val Thr Leu Gln Val Glu Val Arg Glu Glu Asp Thr Gly Leu Leu

20 25 30

Gln Asp Pro Thr Ser Lys Glu Ala Leu Thr Lys Leu Ile Thr Asp Leu

35 40 45

Ala Lys Lys Gln Arg Glu Val Val Ser Asp Ala Thr Asp Phe Gly Leu

50 55 60

Asp Ile Ala Thr Thr Leu Gln Ser Arg Gln Ser Asn Ser Gln Phe His

65 70 75 80

Val Leu Arg Glu Gly Asn Val Asp Thr Arg Ile Ala Ser Glu Arg Gly

85 90 95

Ser Thr Thr His Thr Arg Arg Leu Ala Thr Ile Gly Asn Val Glu Pro

100 105 110

Cys Trp Phe Arg Thr Ala Pro Gly Val Arg Gly Gly Ile Leu Ile Glu

115 120 125

Pro Ser Asn Ala Val Leu Ala Leu Lys Pro Leu Phe Gln Gly Ala Asp

130 135 140

Pro Gly Pro Leu Ser Ser Ser Ala Arg Leu Asp Ile Asn Asn Tyr Ser

145 150 155 160

Ser Gln Thr Ala Leu Gly Phe Met Asn Ser Ile Gly Ala Asp Ile Glu

165 170 175

Ser Asn Arg Val Ser Phe Ser Glu Pro Leu Ile Arg Ala Phe Ile Phe

180 185 190

Ser Ile Asp Asp His Ile Arg Gly Glu Ser Pro Leu Ser Trp Leu Gly

195 200 205

Asn Arg Thr Thr Leu Leu Pro Arg Pro Leu Gly Thr Leu Pro Ser Gly

210 215 220

Asp Tyr Phe Pro Ala Ser Val Arg Ser Ala Gly Trp Val Ala Gly Asp

225 230 235 240

Thr Gln Ala Met Ile Val Asn Ala Glu Asp Phe Ala Arg Glu Ala Arg

245 250 255

Gly Glu Glu Arg Phe Asn Asp Gly Trp Gly Ala Thr Val Trp Asn Val

260 265 270

Pro Gly Val Glu Gly Val Ala Val Val Pro Ile Lys Leu Ala Asp Gln

275 280 285

Gly Asp Pro Ala Ile Asn Ser Ile Trp Met Leu Met His Met Glu Asn

290 295 300

Pro Ile Arg Thr Arg Phe Val Glu Val Asp Glu Val Asp Met Leu Leu

305 310 315 320

Asp Asp Pro Gln Val Gly Ser Glu Trp Thr Asn Leu Ser Thr Ser Val

325 330 335

Val Pro Gly Pro Ser Lys Lys Val Leu Phe Val Ile Thr Asp Met Asn

340 345 350

Asn Asn Gln Ser Gly Asp Ile Leu Leu Asp Asp Phe Asn Gly Ala Val

355 360 365

Asp Asn Ile Asp Gln Ala Ala Asn Val Ile Gly Gly Val Pro Val Asp

370 375 380

Ile Gly Ala Leu Ile Pro Ala Trp Met Gly Leu Asp Pro Asp Arg Arg

385 390 395 400

Ser Glu Leu Gly Ile Ala Gly Val Arg Arg Trp Thr Arg Tyr Tyr Gly

405 410 415

Asn Thr Gln Asp Trp Glu Ala Ser Leu Ala Ile Val Ser Glu Met Leu

420 425 430

Val Thr Phe Pro Gly Gln Val Gln Arg Ser Gly Arg Thr Gly Ala Glu

435 440 445

Asn His Tyr Ala Asp Ala Gly Gly Gly Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Asn

450 455 460

Gly Ile Asp Val Val Leu Tyr Asp Gly Leu Thr Ala Ala Glu Lys Leu

465 470 475 480

Ala Leu Ala Gly Arg Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Pro Ala Ser Gly

485 490 495

Tyr Arg Gln Arg Ser Asn Asn Pro Asn Thr Ser Pro Pro Met Leu Leu

500 505 510

Tyr Cys Arg Phe Ser Ser Glu Ala Ala Val Ala Val Ser Ala Leu Leu

515 520 525

Tyr Lys Pro Arg Phe Thr Met Thr Ile Gly Asn Glu Leu Arg Pro Ala

530 535 540

Ile Leu Ala Asp Asn Ile Tyr Arg Arg Gly Lys Arg Thr Ala Val Met

545 550 555 560

Val Asp Ile Ile Ala Gly Gln Ile Gly Ala Val Ser Arg Met Thr Asn

565 570 575

Thr Pro Gly Asn Ser Glu Gln Pro Ala Val Ala Gln Ala Ile Val Arg

580 585 590

Gln Leu Ala Gly Cys Ala Thr Arg Leu His Gln Glu Thr Cys Ala Gly

595 600 605

Glu Leu Val Asn Ile Thr Val Ser Gly Trp Asn Asn Gln Gln Gly Gln

610 615 620

Ile Ala Trp Arg Asn Leu Tyr Thr Asp Gly Arg Asp Arg Thr Leu Ser

625 630 635 640

Cys Arg Val Pro Arg Met Glu Tyr Asn Ser Leu Gly Phe Asp Gly Arg

645 650 655

Met Glu Ile Asp Asp Leu Tyr Asn Phe Lys Thr Glu Gly Phe Asp Ala

660 665 670

Leu Asp Ile Asp Gly Gln Gln Trp Asp His Met Asn Trp Lys Thr Pro

675 680 685

His Gln Lys Glu Asp Gly Gln Val Thr Ala Arg Arg Leu Thr Ser Ala

690 695 700

Ala Gly Trp Thr Arg Ala Leu Val Pro Leu Asp Asn Ile Gly Leu Val

705 710 715 720

Arg Ala Asn Gly Ala Glu Phe Ala Pro Leu Gly Val His Val Leu Asn

725 730 735

Pro Thr Val Gly Arg Gly Lys Glu Val Arg Tyr Ser Asn Tyr Gly Phe

740 745 750

Val Pro Leu Ala Ser Glu Ile Arg Glu Leu Pro Leu Val Thr Gln Val

755 760 765

Pro Ser Gln Asn Asp Ala Asn His Ile Ile His Pro Ala Val Arg Gly

770 775 780

Gly Arg Pro Leu Val Leu Gly Asn Met Gly Met Phe Asn Pro Ile Phe

785 790 795 800

Met Asp Arg Thr Pro Gly Gln Arg Ala Ser Gln Asn Pro Thr Thr Asp

805 810 815

Thr Gln Thr Val Asn Asn Ala Thr Val Leu Asp Phe

820 825

<210> 8

<211> 647

<212> БЕЛОК

<213> Вирусы

<220>

<223> Аминокислотная последовательность ORF-2

<400> 8

Met Thr Ile Leu Ile Asn Phe Ile Arg Glu Asn Lys Leu Asp Pro Ser

1 5 10 15

Lys Val Phe Lys Asn Leu Thr Asn Lys Val Lys Leu Ala Gly Glu Gly

20 25 30

Phe Ser Ser Asp Trp Arg Tyr Tyr Val Asn Trp Glu Leu Leu Gly Gly

35 40 45

Tyr Gln Asp Leu Glu Glu His Asp Met Ile Glu Glu Val Arg Ala Phe

50 55 60

Thr Thr Gln Glu Ala Lys Ser Ala Glu Phe Gly Gly Pro Val Val Lys

65 70 75 80

Ala Leu Glu Glu Leu Leu Ala Pro Leu Ser Gly Val Val Arg Ser Lys

85 90 95

Arg Thr Leu Glu Glu Phe Leu Leu Asp Arg Asp Ala Trp Ala Lys Asn

100 105 110

Thr Ser Gly Phe Val Thr Ser Asn Ile Lys Lys Gly Lys Asn Lys Ile

115 120 125

Glu Val Ala Glu Asn Met Asp Ile Lys Glu Leu Leu Glu Ile Val Tyr

130 135 140

Leu Gly Glu Tyr Gln Asn Arg Pro Phe Ile Lys Gln Glu Pro Gly Lys

145 150 155 160

Ala Arg Pro Val Val Asn Ser Asn Leu Pro Pro Tyr Leu Phe Met Ser

165 170 175

Trp Val Phe Glu Gln Ile Glu Pro Ile Leu Arg Lys Asn Phe Ser Ser

180 185 190

Lys Thr Thr Ile Phe Asp Ser Ala Trp Thr Lys Ser Glu Leu Trp His

195 200 205

Gln Met Thr Asp Asp Val Arg Tyr Lys Lys Gly Ile Phe Val Pro Leu

210 215 220

Asp Tyr Ser Arg Phe Asp Ser Thr Ile Ser Lys Glu Leu Ala Val Thr

225 230 235 240

Ala Phe Asn Met Leu Val Asp Ile Leu Val Asp Ile Pro Ser Asp Leu

245 250 255

Arg Arg Ser Ala Lys Tyr Arg Phe Arg Asn Gln Val Ile Leu Thr Gly

260 265 270

Glu Glu Ser Trp Thr Trp Asn Asn Ala Val Leu Ser Gly Trp Arg Trp

275 280 285

Thr Ala Leu Ile Thr Ser Leu Val Asn Leu Ala Ile Leu Glu Ala Ala

290 295 300

Glu Val Thr Arg Thr Gly Thr Gly Ile Arg Val Gln Gly Asp Asp Val

305 310 315 320

Arg Val Phe Phe Gln Lys Lys Gly Asp Ala Glu Ile Ala Ile Ala Lys

325 330 335

Ile Asn Ser Phe Gly Phe Glu Ile Asn Pro Thr Lys Val Phe Cys Ser

340 345 350

Lys Arg Arg Asp Glu Tyr Leu Arg Met Val Ala Thr Asp Glu Leu Arg

355 360 365

Gly Tyr Pro Ile Arg Ser Leu Pro Lys Ile Leu Phe Val Gly Pro Thr

370 375 380

Glu Thr Leu Thr Asp Arg Ser Glu Asp Arg Val Asn Gly Ile Val Asn

385 390 395 400

Lys Trp Thr Thr Leu Val Ser Arg Gly Gly Asn Glu Ser Arg Cys Trp

405 410 415

Lys Met Leu Val Thr Asp Ile Ala Gly Leu Thr Gln Trp Ser Arg Asp

420 425 430

Asn Ile Lys Lys Trp Leu Gln Thr Pro Ser Ala Leu Gly Gly Ala Gly

435 440 445

Leu Phe Gln Asn Thr Thr Ser Gln Gly Ile Arg Leu Lys Ile Lys Thr

450 455 460

Glu Ile Lys Glu Asp Leu Gly Thr Tyr Lys Leu Ala Ser Asp Tyr Pro

465 470 475 480

Gly Asp Leu Gly Asn Leu Trp Ala Arg Gly Arg Asn Ser Lys Ser Lys

485 490 495

Leu Leu Ser Ala Gln Leu Glu Glu Ile His Ile Pro Gln Pro Leu Gly

500 505 510

Val Trp Pro Asn Ala Phe Ile Phe Thr Lys Lys Lys Lys Pro Thr Val

515 520 525

Arg Phe Lys Glu Glu Ala Leu Gly Ser Thr Lys Arg Asp Ala Leu Ile

530 535 540

Arg Asp Lys Asp Trp Asp Ala Leu Glu Asp Leu Val Glu Asn Lys Ser

545 550 555 560

Glu Val Leu Phe Trp Lys Arg Val Leu Pro Arg Phe Phe Tyr Arg Met

565 570 575

Leu Leu Val Glu Gly Gly Phe Ser Thr Pro Ile Pro Lys Thr Leu Val

580 585 590

Asn Asn Glu Ile Val Ala Thr Val Ser Ala Phe Val Ala Trp Tyr Thr

595 600 605

Phe Glu Lys Ile Met Lys Tyr Asn Gly Ile Leu Ser Gly Glu Lys Leu

610 615 620

Gln Arg Leu Gln Leu Gly Ala Glu Tyr Tyr Ser Arg Phe Leu Leu Asp

625 630 635 640

Ser Phe Lys Arg Phe Gly Lys

645

<210> 9

<211> 90

<212> БЕЛОК

<213> Вирусы

<220>

<223> Аминокислотная последовательность ORF-X

<400> 9

Met Glu Asn Glu Lys Asn Val Arg Val Gly Ser Cys Tyr Ser Val Ser

1 5 10 15

Ala Val Phe Gly Ser Thr Ile Cys Thr Ala Gln Asp Asn Thr Ala Gly

20 25 30

Gly Asp Leu Glu Ala Lys Gln Ser Trp Asp Ser Pro Val Val Thr Ala

35 40 45

Met Ile Val Ile Gly Val Val Ala Phe Ile Leu Met Val Val Trp Met

50 55 60

Leu Arg Gly Ala Cys Lys Gly Tyr Thr Val Val Lys Arg Pro His Gly

65 70 75 80

Asn Glu Glu Ala Leu Gln Leu Gln Asp Val

85 90

<210> 10

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Вирусы

<220>

<223> Аминокислотная последовательность ORF-Y

<400> 10

Met Ser Val Met Trp Asp Asn Glu Trp Ile Arg Leu Ser Arg Val Ser

1 5 10 15

Arg Ser Ser Val Ala Val Lys Arg Asn Ile Tyr Gly Glu Arg Val Glu

20 25 30

Arg Leu Leu Leu Ser Phe Gly Ser Glu Ala Ser Val Phe Glu Trp Phe

35 40 45

Gly Val Glu Glu Glu Asp Tyr His Arg Ile Arg Leu Ala Phe Arg Val

50 55 60

Ile Ala His Trp Val Ile His Ser Glu Leu Leu Glu Val Gly Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Thr Val Trp Arg Asn Glu Asp Asp Pro Arg Asp Arg Asp Ala Glu

85 90 95

Trp Glu Phe Cys Tyr Thr Leu Arg Val His Gly Arg Met Ala Asn Ser

100 105 110

Ser Gly Arg Arg Ser Gly

115

<210> 11

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Вирусы

<220>

<223> Аминокислотная последовательность ORF-Z

<400> 11

Met Ile Val Tyr Ser Phe Lys Asn His Asn Gln Leu Thr Phe Ala Leu

1 5 10 15

Glu Glu Gln Gly Val Ala Asn Val Ile Val Gln Leu Asp Asp Lys Trp

20 25 30

Lys Glu Val Thr Phe Gln His His Glu Arg Lys Glu Leu Val Gln Phe

35 40 45

Leu Leu Thr Leu Gly Lys Tyr Val Asp Lys Glu Leu Cys Thr Thr Val

50 55 60

Leu Asp Leu Glu Ile Thr Glu Glu Asp Asp Leu Glu Tyr Glu Lys Glu

65 70 75 80

Tyr Gln Val Asn Gly Glu Ile Leu Thr Phe Trp Ser Ala Glu Val Glu

85 90 95

Gly Lys Glu Val Ile Asn Ala Met Thr Met Glu Met Glu Cys Leu Asn

100 105 110

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер CLP01

<400> 12

ctgtggctgt aagtgctcta c 21

<210> 13

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд CLP01 Taqman

<400> 13

tttccgatgg tcattgtgaa cctgg 25

<210> 14

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер CLP01

<400> 14

gctgttctct ttcctctcct g 21

<210> 15

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер CLP02

<400> 15

tcagccaaat acaggttcag g 21

<210> 16

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд CLP02 Taqman

<400> 16

ccaactttcc tcacccgtca gaat 24

<210> 17

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер CLP02

<400> 17

tgtaatcaga gcagtccaac g 21

<210> 18

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер CLP03

<400> 18

agtgatgtgg gataacgaat gg 22

<210> 19

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд CLP03 Taqman

<400> 19

aggttgagta gggttagcag gagt 24

<210> 20

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер CLP03

<400> 20

cctctgatcc aaagctgagt ag 22

<210> 21

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F1

<400> 21

atggacgcaa acaaagaaac a 21

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R1

<400> 22

ccaatgctgt tcatgaaacc 20

<210> 23

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F2

<400> 23

ccggacctct ttcaagtagt g 21

<210> 24

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R2

<400> 24

gcatctcact cacgatggct 20

<210> 25

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F3

<400> 25

tgggaacaca caggactggg 20

<210> 26

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R3

<400> 26

ctccatgcaa tctgaccttg 20

<210> 27

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F4

<400> 27

acttgtgctg gtgagctagt ga 22

<210> 28

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R4

<400> 28

atccaggacg gtggcgt 17

<210> 29

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F5

<400> 29

ttagagaaaa caaacttgac ccatc 25

<210> 30

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R5

<400> 30

cgacgagtat gtcaactagc atatt 25

<210> 31

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F6

<400> 31

caaatgacag acgacgtcag g 21

<210> 32

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R6

<400> 32

ccagtgctga aggtgtttga 20

<210> 33

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F7

<400> 33

ccgatattgc gggtttaacc ca 22

<210> 34

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R7

<400> 34

cgctacgaaa gctgagaccg 20

<210> 35

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F8

<400> 35

gttgttacag tgtaagtgct gtgtt 25

<210> 36

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R8

<400> 36

ttaccgagag tgagtagaaa ctgaa 25

<210> 37

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F9

<400> 37

acgccaccgt cctggat 17

<210> 38

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R9

<400> 38

cctgacgtcg tctgtcattt g 21

<210> 39

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_F10

<400> 39

cggtctcagc tttcgtagcg 20

<210> 40

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCL_R10

<400> 40

aacacagcac ttacactgta acaac 25

<210> 41

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Seq_41

<400> 41

cctacactta cagccacaga gtgcc 25

<210> 42

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Seq_42

<400> 42

tggtggcggc gctagctgtc aggagaggaa agagaag 37

<210> 43

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Seq_43

<400> 43

actcaacata aagttatact catggctaaa atttattaca ctacaggaac agcaggaaaa 60

cgatgggtgt aggtgaaggc tagagaagcc aaatacaggt tttcttatct tccttttgtg 120

gg 122

<210> 44

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Seq_44

<400> 44

tgcaggtatt tcctcacccg tcagc 25

<210> 45

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Seq_45

<400> 45

agtacatcat acaatacatg atcaactgct ctgattacat tattaattga aatt 54

<210> 46

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Seq_46

<400> 46

caggttcaca atgaccacct cat 23

<210> 47

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Seq_47

<400> 47

cgatgtggga taacgaaccg ggtaa 25

<210> 48

<211> 121

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Seq_48

<400> 48

ttacagggtt cctgcctaaa tgaatcatca tccaaggatt tacaaaaaat tatagccttg 60

kcaccccaac cattatagct atcataaccc tactcaacct gtactcttac atacacctca 120

t 121

<210> 49

<211> 97

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Seq_49

<400> 49

tatcacatcc acttgatcca aagctgagtt gaggttctga atacctttgt taattttctg 60

tctcaatgac ctaatattgt cagtggagtg ttaaatc 97

<---

Claims

1. Применение по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера в способе обнаружения вируса в биологическом образце рыбы, где геном указанного вируса содержит SEQ ID NO: 6 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80% идентичную ей, или по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 1-5 или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична ей, причем геном указанного вируса содержит основание урацила (U) вместо основания тимина (T), причем по меньшей мере один праймер содержит последовательность из по меньшей мере 12-40 последовательных нуклеотидов, и причем указанная последовательность комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержится в геноме указанного вируса.

2. Способ обнаружения вируса, в котором геном указанного вируса содержит SEQ ID NO: 6 или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80% идентичную ей, или по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 1-5, или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична ей, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит основание урацила (U) вместо основания тимина (T), причем способ включает стадии:

(a) контактирования нуклеиновой кислоты, выделенной из биологического образца рыбы, с по меньшей мере одним олигонуклеотидным праймером с образованием смеси, где по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер комплементарен последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в геноме вируса, и

(b) определения того, присутствует ли при амплификации смеси a) продукт амплификации, где присутствие продукта амплификации указывает на присутствие РНК, связанной с вирусом, и следовательно, на присутствие вируса в биологическом образце,

причем олигонуклеотидный праймер представляет собой олигонуклеотидный праймер указанный в п.1.

3. Способ обнаружения вируса, включающий стадии:

(a) секвенирования нуклеиновой кислоты, выделенной из биологического образца рыбы, и

(b) сравнения полученной последовательности нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая представляет собой или комплементарна референсной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, где по меньшей мере 80% идентичности последовательности между двумя последовательностями указывает на присутствие вируса в биологическом образце.

4. Набор для обнаружения вируса в биологическом образце рыбы, содержащий олигонуклеотидный праймер по п.1.

5. Применение по п.1, или способ по п.2, или набор по п.4, где указанный олигонуклеотидный праймер содержит по меньшей мере 9 последовательных нуклеотидов последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, которая представляет собой или комплементарна последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:12 - SEQ ID NO:40;

при условии, что указанный олигонуклеотидный праймер не содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:41 - SEQ ID NO:49.

6. Набор по п.4, где указанный набор представляет собой тест ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

7. Применение по п.1, или способ по п.2, или набор по п.4, где указанный олигонуклеотидный праймер имеет длину 18-25 нуклеотидов.