JP6293882B2 - 遺伝的に安定な腫瘍溶解性ｒｎａウイルス、その製造方法およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、バイオテクノロジーによって生産された新規の抗癌製剤の開発、すなわち、遺伝的に安定な腫瘍溶解性ＲＮＡウイルス、腫瘍溶解性ウイルスを製造するための方法、およびその使用に関する。
癌細胞を死滅させるウイルスの能力は、一世紀以上にわたって知られており［Ｋｅｌｌｙ，Ｅ．；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ：ｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００７，１５，ｐ．６５１−６５９］、さまざまなウイルスを用いる実験的な癌療法において、多数の有望な成果があったが、それでも、臨床診療におけるそれらの使用は、腫瘍とその宿主の間の相互作用、ならびにウイルスとウイルス抗体に対するヒトの免疫系の反応との間の相互作用を予見することの難しさが障害となっている。
癌療法におけるウイルスの使用に関する臨床的検討は５０年以上前に始まったが、現在は２種類のウイルスのみ癌療法での臨床使用が承認されている。これらは、抗腫瘍性免疫賦活剤として作用する、Ｅ１Ｂ ５５Ｋ遺伝子が欠失したアデノウイルス（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ． Ｃｈｉｎａ ａｐｐｒｏｖｅｓ ｗｏｒｌｄ’ｓ ｆｉｒｓｔ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００６，９８，ｐ．２９８−３００）およびＥｃｈｏ型の非修飾受動態化Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓである（ユーラシア特許第００７８３９号；欧州特許出願第０３７３３６０７号）。
したがって、新規の効率的な腫瘍溶解性ウイルスの開発は、依然として話題となっている問題である（Ｈａｎ Ｈｓｉ Ｗｏｎｇ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｒ． Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｙａｏｈｅ Ｗａｎｇ，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１０，２，ｐ．７８−１０６）。
癌細胞に選択的に感染し、腫瘍溶解活性を向上するウイルスの可能性を高めるために、いくつかの修飾ウイルスが開示されている。これらは、特定の遺伝子が欠失し、したがって、正常細胞内での増殖は妨げられることによって特徴付けられ、または、腫瘍溶解性を改善するための別の遺伝子の組込みによって特徴付けられる。
しかし、腫瘍細胞に対する選択性および効率をもたらす遺伝子組換えに関する知識が限られているため、源と比べて細胞溶解性の低い修飾ウイルスが生じたり、ヒトの免疫系の抗ウイルス反応が高くなったりする結果となる（Ｓ．Ｍｅｅｒａｎｉ，Ｙａｎｇ Ｙａｏ，Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４０ ｎｏ．１（２０１０），ｐ．１５６−１７１；Ｈａｎ Ｈｓｉ Ｗｏｎｇ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｒ． Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｙａｏｈｅ Ｗａｎｇ，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１０，２，７８−１０６）。
ウイルスは、ベクターを細胞内に運ぶ十分に確立された手段であるが、ウイルスの免疫原性が高いため、これらの使用は制限される（Ｐｅｎｇ，Ｚ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｇｅｎｄｉｃｉｎｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ａｄ−ｐ５３ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒｓ． Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２００５，１６，１０１６−１０２７）。
ＥＣＨＯ７を含む非修飾Ｅｃｈｏ型ウイルスの最も重大な不都合な性質の１つは、致命的な結果をもたらす恐れのある感染を引き起こすその能力である（Ｗｒｅｇｈｉｔｔ Ｔ．Ｇ．，Ｇａｎｄｙ Ｇ．Ｍ．，Ｋｉｎｇ Ａ．，Ｓｕｔｅｈａｌｌ Ｇ．，Ｆａｔａｌ ｎｅｏｎａｔａｌ ＥＣＨＯ ７ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，ｖｏｌ．３２４，ｐ．４６５，１９８４）。これらのウイルスは、マレーシアでは手、足および口の疾患（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｄｓｃｏｒｎｅｒ．ｃｏｍ／ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ７．ｈｔｍｌ）、白血病の子供の心筋炎（Ｍｉｄｕｌａ Ｍ．，Ｍａｒｚｅｔｔｉ Ｇ．，Ｂｏｒｒａ Ｇ．，Ｓａｂａｔｉｎｏ Ｇ．，Ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥＣＨＯ ７ ｔｙｐｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｈｉｌｄ，Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ Ｖｏｌｕｍｅ ６５，Ｉｓｓｕｅ ４，ｐ．６４９−６５１，Ｊｕｌｙ １９７６）、無菌性髄膜炎、麻痺性疾患および発熱（ｈｔｔｐ：／／ｖｉｒｏｌｏｇｙ−ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ／ｖｉｒｕｓｅｓ／Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ６．ｈｔｍ）の原因となることが知られている。したがって、癌患者の治療におけるＥＣＨＯ７型ウイルスの使用において、病原性が克服しなければならない主要な制約の１つである。
Ｋｅｌｌｙ，Ｅ．；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ：ｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００７，１５，ｐ．６５１−６５９
Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ． Ｃｈｉｎａ ａｐｐｒｏｖｅｓ ｗｏｒｌｄ’ｓ ｆｉｒｓｔ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００６，９８，ｐ．２９８−３００
Ｈａｎ Ｈｓｉ Ｗｏｎｇ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｒ． Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｙａｏｈｅ Ｗａｎｇ，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１０，２，ｐ．７８−１０６
Ｓ．Ｍｅｅｒａｎｉ，Ｙａｎｇ Ｙａｏ，Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４０ ｎｏ．１（２０１０），ｐ．１５６−１７１
Ｈａｎ Ｈｓｉ Ｗｏｎｇ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｒ． Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｙａｏｈｅ Ｗａｎｇ，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１０，２，７８−１０６
Ｐｅｎｇ，Ｚ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｇｅｎｄｉｃｉｎｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ａｄ−ｐ５３ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒｓ． Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２００５，１６，１０１６−１０２７
Ｗｒｅｇｈｉｔｔ Ｔ．Ｇ．，Ｇａｎｄｙ Ｇ．Ｍ．，Ｋｉｎｇ Ａ．，Ｓｕｔｅｈａｌｌ Ｇ．，Ｆａｔａｌ ｎｅｏｎａｔａｌ ＥＣＨＯ ７ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，ｖｏｌ．３２４，ｐ．４６５，１９８４
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｄｓｃｏｒｎｅｒ．ｃｏｍ／ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ７．ｈｔｍｌ
Ｍｉｄｕｌａ Ｍ．，Ｍａｒｚｅｔｔｉ Ｇ．，Ｂｏｒｒａ Ｇ．，Ｓａｂａｔｉｎｏ Ｇ．，Ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥＣＨＯ ７ ｔｙｐｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｈｉｌｄ，Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ Ｖｏｌｕｍｅ ６５，Ｉｓｓｕｅ ４，ｐ．６４９−６５１，Ｊｕｌｙ １９７６
ｈｔｔｐ：／／ｖｉｒｏｌｏｇｙ−ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ／ｖｉｒｕｓｅｓ／Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ６．ｈｔｍ
したがって、解決すべき課題は、正常細胞において病原性がなく、低免疫反応で、高い遺伝的安定性を持つ高効率の選択的な腫瘍溶解性ウイルスの開発であった。ＲＮＡウイルスが細胞培養液における継代により非常に容易に変異することはよく知られ、認識されているが、この変異により表現型が変わり、病原性が高くなる可能性がある。したがって、出発物質として天然の非病原性ＥＣＨＯ７ウイルス株を用いる腫瘍溶解性ウイルスに基づく医薬品の調製については、元のウイルスの非病原性を保持し、遺伝的に安定になるこのウイルスの腫瘍溶解に関する修飾を可能にする手順を見出すことが極めて重要である。
驚いたことに、この課題は、変異の特異的に標的とする選択と組み合わせた一本鎖ＲＮＡウイルスの高い変異可能性を利用した方法を開発し、選択的で高い腫瘍溶解活性を持つ変異種のプールから速く分離することにより、一本鎖ＲＮＡウイルスに目標とする修飾を行うことで解決した。多くの癌細胞は、ウイルスに対して耐性がある（ウイルスは細胞に入ることも、細胞内で生存することもできない）。ウイルスが修飾されている細胞株を注意深く選択し、癌細胞を適切に前処理することにより、癌治療のための遺伝的に安定な非病原性のウイルスを作製することが可能である。本発明により提供されるウイルスは、実際、ＥＣＨＯ−７型ウイルスに基づいた遺伝的に安定な腫瘍溶解性ウイルスの初めての開示であり、上記遺伝的に安定なウイルスは、医薬品として長期の製造（複数の複製）に使用可能になる。
我々は、ゲノム配列ＳｅｑＮｏ２により同定される天然ＥＣＨＯ７ウイルスを修飾するための方法を開発し、その方法は、ダカルバジンなどの抗癌剤により弱毒化した癌細胞においてウイルス適応を初めに行う工程と、ヒト胚性線維芽細胞培養液において修飾ウイルスを継代する工程と、ヒトメラノーマ細胞における増殖と、および任意選択でリバビリンにより処理されたヒト胚性線維芽細胞培養液において継代する工程と、ウイルスの単離と、およびウイルスの精製とを含む。ウイルスは、既知の方法により単離および精製することができる。癌細胞の修飾のために準毒性濃度のダカルバジンなどの抗癌剤を使用し、ウイルス複製のための宿主細胞として処理されたこれらの癌細胞を使用することで、癌の治療のための非常に効果的な医薬品として適用できる安定なゲノムを持つ変異ウイルスを作製することができた。
ウイルス適応を行う間、１つのタイプを超える細胞株を用いることができる。
配列表フリーテキスト
配列ＩＤ番号１：修飾ウイルス；
配列ＩＤ番号２：非修飾（天然）ウイルス；
配列ＩＤ番号３：１２カ月間増殖後の修飾ウイルス；
配列ＩＤ番号４：修飾ウイルスのアミノ酸配列；
配列ＩＤ番号５：非修飾ウイルスのアミノ酸配列；
配列ＩＤ番号６：プライマーＥｏ７−１Ｆ；配列ＩＤ番号７：プライマーＥｏ７−１Ｒ；
配列ＩＤ番号８：プライマーＥｏ７−２Ｆ；配列ＩＤ番号９：プライマーＥｏ７−２Ｒ；
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配列ＩＤ番号２４：プライマーＥｏ７−９Ｒ；配列ＩＤ番号２５：プライマーＥｏ７−１１Ｆ；
配列ＩＤ番号２６：プライマーＥｏ７−１１Ｒ；配列ＩＤ番号２７：プライマーＥｏ７−１２Ｆ；
配列ＩＤ番号２８：プライマーＥｏ７−１２Ｒ；配列ＩＤ番号２９：プライマーＥｏ７−１３Ｆ；
配列ＩＤ番号３０：プライマーＥｏ７−１３Ｒ；配列ＩＤ番号３１：プライマーＥｏ７−１４Ｆ；
配列ＩＤ番号３２：プライマーＥｏ７−１４Ｒ；配列ＩＤ番号３３：プライマーＥｏ７−１５Ｆ；
配列ＩＤ番号３４：プライマーＥｏ７−１５Ｒ；配列ＩＤ番号３５：プライマーＥｏ７−１６Ｆ；
配列ＩＤ番号３６：プライマーＥｏ７−１７Ｆ；配列ＩＤ番号３７：プライマーＥｏ７−１６Ｒ；
配列ＩＤ番号３８：プライマーＥｏ７−１８Ｆ；配列ＩＤ番号３９：プライマーＥｏ７−１８Ｒ；
配列ＩＤ番号４０：プライマーＥｏ７−１９Ｆ；配列ＩＤ番号４１：プライマーＥｏ７−１９Ｒ；
配列ＩＤ番号４２：プライマーＥｏ７−２０Ｆ；配列ＩＤ番号４３：プライマーＥｏ７−２０Ｒ；
配列ＩＤ番号４４：プライマーＥｏ７−２１Ｆ；配列ＩＤ番号４５：プライマーＥｏ７−２１Ｒ；
配列ＩＤ番号４６：プライマーＥｏ７−２２Ｆ；配列ＩＤ番号４７：プライマーＥｏ７−２２Ｒ；
配列ＩＤ番号４８：プライマーＥｏ７−２３Ｆ；配列ＩＤ番号４９：プライマーＥｏ７−２３Ｒ；
配列ＩＤ番号５０：プライマーＥｏ７−２４Ｆ；配列ＩＤ番号５１：プライマーＥｏ７−２４Ｒ；
配列ＩＤ番号５２：プライマーＥｏ７−２５Ｆ；配列ＩＤ番号５３：プライマーＥｏ７−２５Ｒ；
配列ＩＤ番号５４：プライマーＥｏ７−２６Ｆ；配列ＩＤ番号５５：プライマーＥｏ７−２６Ｒ。
配列ＩＤ番号１：修飾ウイルス；
配列ＩＤ番号２：非修飾（天然）ウイルス；
配列ＩＤ番号３：１２カ月間増殖後の修飾ウイルス；
配列ＩＤ番号４：修飾ウイルスのアミノ酸配列；
配列ＩＤ番号５：非修飾ウイルスのアミノ酸配列；
配列ＩＤ番号６：プライマーＥｏ７−１Ｆ；配列ＩＤ番号７：プライマーＥｏ７−１Ｒ；
配列ＩＤ番号８：プライマーＥｏ７−２Ｆ；配列ＩＤ番号９：プライマーＥｏ７−２Ｒ；
配列ＩＤ番号１０：プライマーＥｏ７−３Ｆ；配列ＩＤ番号１１：プライマーＥｏ７−３Ｒ；
配列ＩＤ番号１２：プライマーＥｏ７−４Ｆ；配列ＩＤ番号１３：プライマーＥｏ７−４Ｒ；
配列ＩＤ番号１４：プライマーＥｏ７−５Ｆ；配列ＩＤ番号１５：プライマーＥｏ７−５Ｒ；
配列ＩＤ番号１６：プライマーＥｏ７−６Ｆ；配列ＩＤ番号１７：プライマーＥｏ７−６Ｒ；
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配列ＩＤ番号４０：プライマーＥｏ７−１９Ｆ；配列ＩＤ番号４１：プライマーＥｏ７−１９Ｒ；
配列ＩＤ番号４２：プライマーＥｏ７−２０Ｆ；配列ＩＤ番号４３：プライマーＥｏ７−２０Ｒ；
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配列ＩＤ番号５０：プライマーＥｏ７−２４Ｆ；配列ＩＤ番号５１：プライマーＥｏ７−２４Ｒ；
配列ＩＤ番号５２：プライマーＥｏ７−２５Ｆ；配列ＩＤ番号５３：プライマーＥｏ７−２５Ｒ；
配列ＩＤ番号５４：プライマーＥｏ７−２６Ｆ；配列ＩＤ番号５５：プライマーＥｏ７−２６Ｒ。
我々は、ヒトの腸から単離された既知のＥｃｈｏ ７型Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓがこの目的に適合していることを意外にも見出した。標準的な方法で決定した元のヌクレオチド配列は、Ｗａｌｌａｃｅ型Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓの配列にかなり似ていることが判明した。
血管肉腫の組織から単離した天然エンテロウイルスの腫瘍溶解活性を確認すると、個々のウイルスも、それらの組み合わせも、３×１０５ ＴＣＩＤ５０／０．０３ｍｌの用量では、より有望な活性を示したＥＣＨＯ７型を除いて実質的に腫瘍溶解活性を持たないことが示された（表１）。
ＲＮＡ一本鎖ウイルスのゲノムの不安定性はよく知られた事実である；したがって、このようなウイルスは、通常、腫瘍溶解性ウイルス剤を構成するために選択されない。
単離した天然ウイルスの修飾は、いくつかの連続するステップにおいて実現された。
単離した天然ウイルスの修飾は、いくつかの連続するステップにおいて実現された。
第１のステップは、ＲＮＡウイルスの高い変異可能性（各複製につき平均で１つの変異）を利用して、ウシ胎児血清の存在下、ヒト胚性線維芽細胞培養液のトリプシン処理した単層にてウイルスを複製することにより、細胞変性変異を発生させる。
培養液中の細胞が５０％変性する毎に継代を行いながら、細胞を１０日間インキュベートした。
選択したウイルスをＲＤ細胞培養において試験すると、感染後２４時間で既に顕著な細胞変性効果が観察された。最後の希釈法により決定した、発生したウイルスの力価はＴＣＩＤ５０＝１×１０−８であった。
この株を増殖、単離し、選択的かつ遺伝的に安定な腫瘍溶解性株の作製にさらに使用するために−７０℃で保管した。
このように得られたウイルスを、３つのステップを含む特別に開発した方法を用いて修飾した。
第１の腫瘍細胞株における第１の修飾ステップ
第１の修飾ステップにおいて、抗癌剤により弱毒化した腫瘍細胞株内でウイルスを増殖した。このステップで、ヒト乳腺癌細胞株（ＭＣＦ−７）を用いた。
これらの細胞の単層を中毒量以下（２０μＭ）のダカルバジンＤＴＩＣで処理した。ダカルバジンで処理後、細胞を新鮮な培地に移してウイルスに接触させ、血清を加えずに増殖を続けた。ウイルスに接触させてから２４時間後、細胞を取り出し、ウイルスを培地から単離した。
ウイルスをヒト胚性線維芽細胞培養液において繰り返し増殖（継代）し、再びＭＣＦ−７細胞株の感染に用いた。この手順を１０回繰り返した。したがって、この修飾ステップは、ヒト乳腺癌細胞内およびヒト胚性線維芽細胞内でウイルスを交互に増殖する工程を含む。
第２の腫瘍細胞株における第２の修飾ステップ
次の修飾ステップにおいて、上述のウイルスを胃腺癌細胞培養液に接触させた。これらの細胞の単層を中毒量以下（２０μＭ）のダカルバジンＤＴＩＣで処理した。
次の修飾ステップにおいて、上述のウイルスを胃腺癌細胞培養液に接触させた。これらの細胞の単層を中毒量以下（２０μＭ）のダカルバジンＤＴＩＣで処理した。
これらの細胞の単層を、第１のステップにおいて修飾した後に単離したウイルスに感染させ、血清のない培地内で増殖を続けた。
ウイルスに接触させてから２４時間後、細胞を取り出し、ウイルスを培地から単離した。ウイルスをヒト胚性線維芽細胞培養液において繰り返し増殖（継代）し、その後再び胃腺癌細胞株の感染に用いた。この手順を１０回繰り返した。したがって、この第２の修飾ステップは、胃腺癌細胞内およびヒト胚性線維芽細胞内でウイルスを交互に増殖する工程を含む。
第１の修飾ステップおよび第２の修飾ステップにおいて、増殖手順は、常に、ヒト胚性線維芽細胞培養液において最後にウイルスを増殖して完了した。
ヒトメラノーマ細胞における第３の修飾ステップ
第２のステップにおいて作製したウイルスを、外科手術で得られたヒト腫瘍の感染に用いた。
メラノーマ癌組織は、化学療法によりあらかじめ治療された２３人の患者から外科手術で得た。
組織を修飾ウイルスに感染させ、二酸化炭素がない状態で３７℃でインキュベートした。新しい組織材料（別の患者からの新鮮なメラノーマ組織）の感染に用いる前に、修飾ウイルスをヒト胚性線維芽細胞培養液において力価７ Ｉｇ ＴＣＩＤ５０／１ｍｌまで繰り返し増殖した。
修飾ウイルスを、感染前に、５ｍＭ リバビリンで７時間処理したヒト胚性線維芽細胞培養液において増殖し、２４時間培養した。ウイルスを培養液から単離し、線維芽細胞培養液においてウイルスを増殖する手順を１０回繰り返した。
最後に、ウイルスを単離、精製し、ヒト胚性線維芽細胞培養液においてリバビリンを加えずに増殖した。
増殖したウイルスを配列決定に用いた。修飾ウイルスのゲノムは、凍結した非修飾天然ウイルス（ＮＣＢＩデータベースからのＥｃｈｏ ７型Ｗａｌｌａｃｅ株）のゲノムとは約１０％異なり、外被部では約１２％異なる。
記載した方法により修飾したウイルスは驚くほど安定であることが判明した。そのゲノムは、１２カ月間の連続的な継代（ヒト胚性肺培養液ＭＲＣ ５における１２カ月間の増殖）の後、０．７％のみ変化した。特に重要なのは、修飾ウイルス（以下、ＭＶ）は、悪性細胞に対して細胞変性効果が例外的に高く、正常細胞株に対して細胞毒性が低く、ならびにマウスにおいてインビボで毒性がないことによって特徴付けられることである。
細胞株を用いた実験において、ＭＶは、メラノーマ細胞株ＦＭ９、ＦＭ５５、ＦＭ９４およびＳＫ−Ｍｅｌ２６、胃癌細胞、ヒト口腔扁平上皮細胞癌ＳＣＣ２５細胞、肺癌由来のヒト上皮細胞株（Ａ５４９）、急性単球性白血病ＴＨＰ−１細胞、横紋筋肉腫ＲＤ細胞、ヒト膵臓腺癌ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞、ヒト乳腺癌細胞（ＭＣＦ−７）に対して、ならびに胃腺癌ＧＣ１および甲状腺癌株ＨＡ００７の初代細胞培養に対して細胞傷害性があることが判明した。
動物実験において、ＭＶは、マウス肉腫Ｍ−１、マウス線維肉腫ＭＸ−１７ならびに移植可能な腫瘍−モロニー肉腫（ＳＭ）およびＫＲＳ−３２１肉腫を縮小させた。
臨床予備試験、４６人のメラノーマのステージＩの患者の群において、メラノーマの進行は、ＭＶで治療された４３人の患者において５０カ月間観察されなかった。対照群において、メラノーマは、標準的な療法を受けた３１人の患者のうち１０人で進行した。
メラノーマが１５人の患者で進行しなかったが、２１人の患者で進行した標準的な療法を受けた３６人の患者の対照群と比べて、４４人のステージＩＩのメラノーマ患者の５０カ月の試験において、メラノーマの進行は３８人の患者で止まった。重篤な有害作用は、ＭＶで治療された患者には観察されなかった。
我々は、元のゲノム配列を持ち、遺伝的浮動に対して安定で、さまざまなタイプの腫瘍に対して細胞変性活性を持ち、癌ウイルス療法において有利に用いることができる低頻度の有害作用および低毒性によって特徴付けられる新規のウイルス株（ＭＶ）を開発した。したがって、我々は意外にも、医薬品におけるＲＮＡウイルスのより幅広い使用における主な障害を解決した−腫瘍溶解性ウイルス製剤の標準化された連続製造において用いることができる遺伝的に安定な株を得た。ウイルス製剤は、さまざまな腫瘍細胞に対する抗癌療法において用いることができる。
実施例において本発明をさらに詳細に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定されるものと解釈されない。
ウイルス
本発明により修飾されるウイルスは、ＥＣＨＯ−７ウイルス（ピコルナウイルス科、エンテロウイルス属、ＥＣＨＯ（Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｏｒｐｈａｎ）７型、ＩＶ群、プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス）である。天然ウイルスは、配列ＩＤ番号２のゲノム配列により同定することができる。
実施例１．元のウイルス株の単離および特徴付け
単離（Ａ．Ｃ． Ｒｅｎｔｚ，Ｊ．Ｅ． Ｌｉｂｂｅｙ，Ｒ．Ｓ． Ｆｕｊｉｎａｍｉ，Ｆ．Ｇ． Ｗｈｉｔｂｙ，ａｎｄ Ｃ．Ｌ． Ｂｙｉｎｇｔｏｎ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ ７ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ２５，Ｎｕｍｂｅｒ ３，Ｍａｒｃｈ ２００６，２５９）およびＢＳ−Ｃ−１細胞株（ＣＣＬ２６；ＡＴＣＣ）における増殖のための既知の方法を用いた（Ｌｉｂｂｅｙ ＪＥ，ＭｃＣｒｉｇｈｔ ＩＪ，Ｔｓｕｎｏｄａ Ｉ，ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐ０，ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ ｍｕｒｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ． ２００１；７：９７−１０４． Ｐｅｖｅａｒ ＤＣ，Ｔｕｌｌ ＴＭ，Ｓｅｉｐｅｌ ＭＥ，ｅｔ ａｌ． Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｌｅｃｏｎａｒｉｌ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． １９９９；４３：２１０９−２１１５）。ウイルス増殖および力価の測定は、発表されている方法にしたがって行った（Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ Ａ，Ｆｕｊｉｎａｍｉ ＲＳ． Ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９８９；６３：１５０５−１５１３）。
単離（Ａ．Ｃ． Ｒｅｎｔｚ，Ｊ．Ｅ． Ｌｉｂｂｅｙ，Ｒ．Ｓ． Ｆｕｊｉｎａｍｉ，Ｆ．Ｇ． Ｗｈｉｔｂｙ，ａｎｄ Ｃ．Ｌ． Ｂｙｉｎｇｔｏｎ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ ７ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ２５，Ｎｕｍｂｅｒ ３，Ｍａｒｃｈ ２００６，２５９）およびＢＳ−Ｃ−１細胞株（ＣＣＬ２６；ＡＴＣＣ）における増殖のための既知の方法を用いた（Ｌｉｂｂｅｙ ＪＥ，ＭｃＣｒｉｇｈｔ ＩＪ，Ｔｓｕｎｏｄａ Ｉ，ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐ０，ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ ｍｕｒｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ． ２００１；７：９７−１０４． Ｐｅｖｅａｒ ＤＣ，Ｔｕｌｌ ＴＭ，Ｓｅｉｐｅｌ ＭＥ，ｅｔ ａｌ． Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｌｅｃｏｎａｒｉｌ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． １９９９；４３：２１０９−２１１５）。ウイルス増殖および力価の測定は、発表されている方法にしたがって行った（Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ Ａ，Ｆｕｊｉｎａｍｉ ＲＳ． Ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９８９；６３：１５０５−１５１３）。
実施例２．ウイルスの修飾
第１の修飾ステップにおいて、抗癌剤により弱毒化した腫瘍細胞株内でウイルスを増殖した。初めに、増殖のために、５％ ＣＯ２を含み、３７℃、大気下で１０％血清（Ｇｉｂｃｏ）および抗生物質（１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００ＩＵ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）内で、単層を形成するまで培養したヒト乳腺癌細胞培養液（ＭＣＦ−７）を用いた。
第１の修飾ステップにおいて、抗癌剤により弱毒化した腫瘍細胞株内でウイルスを増殖した。初めに、増殖のために、５％ ＣＯ２を含み、３７℃、大気下で１０％血清（Ｇｉｂｃｏ）および抗生物質（１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００ＩＵ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）内で、単層を形成するまで培養したヒト乳腺癌細胞培養液（ＭＣＦ−７）を用いた。
これらの細胞の得られた単層を中毒量以下（２０μＭ）のダカルバジンＤＴＩＣで処理した。ダカルバジンで処理後、血清を加えずに細胞を新鮮な培地に移し、細胞をウイルスに接触させ、増殖を続けた。
ウイルスに接触させてから２４時間後、細胞を取り出し、ウイルスを培地から単離した。ウイルスをヒト胚性線維芽細胞培養液において繰り返し増殖し、再びＭＣＦ−７細胞株の感染に用いた。この手順を１０回繰り返した。
次の第２のステップにおいて、上述のウイルスを胃腺癌細胞培養液に接触させた。増殖のための細胞培養液は、５％ ＣＯ２を含み、３７℃、大気下で１０％血清（Ｇｉｂｃｏ）および抗生物質（１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００ＩＵ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）内で、単層を形成するまで培養した。
これらの細胞の得られた単層を中毒量以下（２０μＭ）のダカルバジンＤＴＩＣで処理した。ダカルバジンで処理後、血清を加えずに細胞を新鮮な培地に移し、細胞をウイルスに接触させ、増殖を続けた。
ウイルスに接触させてから２４時間後、細胞を取り出し、ウイルスを培地から単離した。ウイルスをヒト胚性線維芽細胞培養液において繰り返し増殖し、再び胃腺癌細胞株の感染に用いた。この手順を１０回繰り返した。
第３のステップにおいて、第２のステップにおいて作製したウイルスを、外科手術で得られたヒト腫瘍の感染に用いた。メラノーマ癌組織は、化学療法によりあらかじめ治療された２３人の患者から外科手術で得た。
第３のステップにおいて、第２のステップにおいて作製したウイルスを、外科手術で得られたヒト腫瘍の感染に用いた。メラノーマ癌組織は、化学療法によりあらかじめ治療された２３人の患者から外科手術で得た。
腫瘍細胞を脂肪細胞、壊死組織および血液から分離し、０℃で２４時間保ち、断片化して、約０．１ｃｍ３大の組織片としてイーグル培地（１０ｍｇの組織に対して４ｍｌの培地）に浸漬し、調製したウイルスに感染させ、二酸化炭素がない状態で３７℃でインキュベートした。
腫瘍が破壊されるまで、培地を新鮮なもので毎日置き換え、培地の酸化レベルにより形態学的および視覚的に調べた。
腫瘍組織ｆｅｅ培地サンプルにおいて、ウイルス価を毎日測定した。実験の終了時、０日目の増殖率と比較したウイルスの増殖率をウイルス価から求めた。ウイルスのこのような修飾を、２３人の患者から得られた組織において実施した。
新しい組織材料の感染に用いる前に、修飾ウイルスをヒト胚性線維芽細胞培養液において力価７ Ｉｇ ＴＣＩＤ５０／１ｍｌまで毎回繰り返し増殖した。
修飾ウイルスを、感染前に、５ｍＭ リバビリンで７時間処理したヒト胚性線維芽細胞培養液において増殖し、２４時間培養した。ウイルスを培地から単離し、手順を１０回繰り返した。
最後に、ウイルスを単離、精製し、ヒト胚性線維芽細胞培養液においてリバビリンを加えずに増殖した。
増殖したウイルスのサンプルを用いて、ゲノム配列（配列ＩＤ番号１）を繰り返し決定しながら、増殖したウイルスのサンプルをヒト胚性線維芽細胞培養液において１２カ月間継代することにより、ゲノム配列、抗癌活性および複製安定性を決定した。
実施例３．ウイルスのゲノム配列の決定
単離、修飾および培養したウイルスゲノムの単離、増幅および配列決定は、既知の方法にしたがって実施した［Ｃｈｕａ ＢＨ，ＭｃＭｉｎｎ ＰＣ，Ｌａｍ ＳＫ，Ｃｈｕａ ＫＢ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ ７ ｓｔｒａｉｎｓ ＵＭＭＣ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ （Ｗａｌｌａｃｅ） ｓｔｒａｉｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｒｉｆｔ ｏｖｅｒ ｔｉｍｅ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ２００１ Ｎｏｖ；８２（Ｐｔ １１）：２６２９−３９］。
単離、修飾および培養したウイルスゲノムの単離、増幅および配列決定は、既知の方法にしたがって実施した［Ｃｈｕａ ＢＨ，ＭｃＭｉｎｎ ＰＣ，Ｌａｍ ＳＫ，Ｃｈｕａ ＫＢ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ ７ ｓｔｒａｉｎｓ ＵＭＭＣ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ （Ｗａｌｌａｃｅ） ｓｔｒａｉｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｒｉｆｔ ｏｖｅｒ ｔｉｍｅ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ２００１ Ｎｏｖ；８２（Ｐｔ １１）：２６２９−３９］。
この目的のために、完全なゲノム配列を持つ９６のエンテロウイルスをＮＣＢＩ遺伝子バンクから選択した。これらのウイルスの完全なゲノム配列をダウンロードして、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムにより比較した。ウイルスの最も保存的な領域を比較した結果に基づいてゲノムを決定し、これらの領域において、可能性のあるエンテロウイルスゲノムの長さを網羅しながら、１３の変性したオリゴヌクレオチド対を選択した。最初の１３の断片の合成後、別の１３のヌクレオチド対を作製した。これらのオリゴヌクレオチド対はウイルス特異的であり、付加断片を産生するように設計された。全ゲノム配列の構築後、ウイルス特異的なプライマーを用いて繰り返しウイルスゲノムの配列を決定した。
実施例３．１．非修飾（天然）ウイルスのゲノム配列
表２に一覧にしたプライマーから合成した、２６の別々のオーバーラップＰＣＲ断片から天然ウイルスの配列を作成した。
表２に一覧にしたプライマーから合成した、２６の別々のオーバーラップＰＣＲ断片から天然ウイルスの配列を作成した。
５’末端配列および３’末端配列は、それに対応して５’レース法および３’レース法を用いて得た。
その結果、非修飾ウイルスの全ゲノム配列は、ポリＡ配列を除いて、７４３４のヌクレオチドからなることが判明した（配列ＩＤ番号２）。翻訳不可能な５’末端（５’ＮＴＲ）は、７４２のヌクレオチドを含み、その後、７４３位の開始コドン（ＡＵＧ）で始まり、２１９６のアミノ酸のコドンを含み、７３３１位の終止コドン（ＵＡＡ）で終わるコーディング部が続く（配列ＩＤ番号２）。この株の翻訳不可能な３’末端（３’ＮＴＲ）は、１００のヌクレオチドを含み、その後、ポリＡ配列が続く。
実施例３．２．修飾ウイルス（ＭＶ）の配列
表２に一覧にしたプライマーを用いて合成した、２６の別々のオーバーラップＰＣＲ断片から出発ウイルスの配列を作成した。
表２に一覧にしたプライマーを用いて合成した、２６の別々のオーバーラップＰＣＲ断片から出発ウイルスの配列を作成した。
５’末端配列および３’末端配列は、それに対応して５’レース法および３’レース法を用いて得た。
その結果、修飾ウイルスの全ゲノム配列は、ポリＡ配列を除いて、７４２７のヌクレオチドからなることが判明した（配列ＩＤ番号１）。
この株の翻訳不可能な５’末端（５’ＮＴＲ）は、７４２のヌクレオチドを含み、その後、コード配列が続く。ウイルスのポリタンパク質に関する情報を含むコーディング部は、７４３位の開始コドン（ＡＵＧ）で始まり、２１９４のアミノ酸のコドンを含み、７３２５位の終止コドン（ＵＡＡ）で終わる（配列ＩＤ番号１）。この株の翻訳不可能な３’末端（３’ＮＴＲ）は、１００のヌクレオチドを含み、その後、ポリＡ配列が続く。
実施例３．３．１２カ月間増殖後の修飾ウイルスのゲノム配列
修飾ウイルスの配列を、２６の別々のオーバーラップＰＣＲ断片から作成した，ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｌｉｓｔｅｄ ｉｎ Ｔａｂｌｅ ２。
修飾ウイルスの配列を、２６の別々のオーバーラップＰＣＲ断片から作成した，ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｌｉｓｔｅｄ ｉｎ Ｔａｂｌｅ ２。
この株の５’末端配列および３’末端配列は、それに対応して５’レース法および３’レース法を用いて得た。
その結果、修飾ウイルスの全ゲノム配列は、ポリａ配列を除いて、７４２７のヌクレオチドからなることが判明した（配列ＩＤ番号３）。
翻訳不可能な５’末端（５’ＮＴＲ）は、７４２のヌクレオチドを含み、その後、７４３位の開始コドン（ＡＵＧ）で始まり、２１９４のアミノ酸のコドンを含み、７３２５位の終止コドン（ＵＡＡ）で終わるコーディング部が続く（配列ＩＤ番号３）。この株の翻訳不可能な３’末端（３’ＮＴＲ）は、１００のヌクレオチドを含み、その後、ポリＡ配列が続く。
実施例３．４．修飾ウイルス（ＭＶ）および天然株のゲノムの比較
修飾ウイルス（ＭＶ）および出発株のゲノムの比較を図１に示す。
修飾ウイルス（ＭＶ）および出発株のゲノムの比較を図１に示す。
プログラムＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩにより計算したヌクレオチド配列の違いは大きく、全ゲノムで１０％、ウイルス外被タンパク質をコードしている部品で１２％である。修飾株および出発株のアミノ酸配列を図２に一覧にした。
実施例３．５．１２カ月間増殖後の修飾ウイルスのゲノム配列
１２カ月間の連続的な継代の後、修飾ウイルス（ＭＶ）ゲノムの配列の変化は、初期の配列の０．７％を超えなかった。
１２カ月間の連続的な継代の後、修飾ウイルス（ＭＶ）ゲノムの配列の変化は、初期の配列の０．７％を超えなかった。
判明したすべての変化は、部分的にミュート変異の１つのヌクレオチド交換であった（アミノ酸の変化を伴わず）。アミノ酸が変化した場合、その位置はゲノムの多型部分にあり、明らかにウイルス活性に対して関連する影響はない。
実施例４．ウイルスの継代
ウイルスＭＶを既知の方法により継代し、細菌、ウイルス、菌類またはマイコプラズマのないヒト胚性肺培養液ＭＲＣ ５（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ ｄｅｌｌａ Ｌｏｍｂａｒｄｉａ ｅ ｄｅｌｌ Ｅｍｉｌｉａ，Ｂｒｅｓｃｉａ − Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ Ｃｅｎｔｒｏ Ｓｕｂｓｔｒａｔｉ Ｃｅｌｌｕｌａｒｉ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｏ． ＢＳ ＣＬ ６８（出所：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｅｎｔｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国メリーランド州ロックビル）において１２カ月間増殖して、後に−７０℃で凍結保管した。
ウイルスＭＶを既知の方法により継代し、細菌、ウイルス、菌類またはマイコプラズマのないヒト胚性肺培養液ＭＲＣ ５（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ ｄｅｌｌａ Ｌｏｍｂａｒｄｉａ ｅ ｄｅｌｌ Ｅｍｉｌｉａ，Ｂｒｅｓｃｉａ − Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ Ｃｅｎｔｒｏ Ｓｕｂｓｔｒａｔｉ Ｃｅｌｌｕｌａｒｉ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｏ． ＢＳ ＣＬ ６８（出所：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｅｎｔｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国メリーランド州ロックビル）において１２カ月間増殖して、後に−７０℃で凍結保管した。
実施例５．修飾ウイルス（ＭＶ）の抗癌活性の決定
細胞株を用いた実験において、ＭＶは、メラノーマ細胞株ＦＭ９、ＦＭ５５、ＦＭ９４およびＳＫ−Ｍｅｌ２６、胃癌細胞、ヒト口腔扁平上皮細胞癌ＳＣＣ２５細胞、肺癌由来のヒト上皮細胞株（Ａ５４９）、急性単球性白血病ＴＨＰ−１細胞、横紋筋肉腫ＲＤ細胞、ヒト膵臓腺癌ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞、ヒト乳腺癌細胞（ＭＣＦ−７）に対して、ならびに胃腺癌ＧＣ１および甲状腺癌株ＨＡ００７の初代細胞培養に対して細胞傷害性があることが判明した。
細胞株を用いた実験において、ＭＶは、メラノーマ細胞株ＦＭ９、ＦＭ５５、ＦＭ９４およびＳＫ−Ｍｅｌ２６、胃癌細胞、ヒト口腔扁平上皮細胞癌ＳＣＣ２５細胞、肺癌由来のヒト上皮細胞株（Ａ５４９）、急性単球性白血病ＴＨＰ−１細胞、横紋筋肉腫ＲＤ細胞、ヒト膵臓腺癌ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞、ヒト乳腺癌細胞（ＭＣＦ−７）に対して、ならびに胃腺癌ＧＣ１および甲状腺癌株ＨＡ００７の初代細胞培養に対して細胞傷害性があることが判明した。
したがって、例えば、３日間のＭＶ注入により、対照群の６％（１８個体中１個体）の自然退行と比較して、肉腫Ｍ−１の質量が５５％（２２個体中１１個体）の動物で低減した。
１５×１０６ ＴＣＩＤ５０の用量でＭＶをウィスターラットに注射した後、５日目に肉腫ＫＲＳ−３２１を移植し、４４％の動物（１１／２５）において、腫瘍の退行が観察されたが、対照群では、退行したケースはなかった。
同じ癌細胞株および移植した腫瘍を１２カ月継代した後にウイルスのサンプルの抗癌活性を試験したが、元のＭＶとの統計的に有意な差は観察されなかった。
ＭＶも１２カ月間継代したウイルスも、無処置のマウスにおいてどのような中毒反応も引き起こさなかった。
実施例６．患者の治療における修飾ウイルスの抗癌活性
修飾ウイルス（ＭＶ）によるメラノーマ患者の治療を以下のスキームにしたがって行った：腫瘍を切除して２〜３週間後に、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの溶液２ｍｌを３日間連続して筋内投与することにより療法を始め、同じ３日のスケジュールにしたがって毎月１回補助注射を行った。４カ月目の後、次の８カ月間、毎月１回ウイルス製剤を投与した。次の２年において、６週、８週および１２週に投与間隔を徐々に広げながら、同じ用量で補助療法を続けた。
修飾ウイルス（ＭＶ）によるメラノーマ患者の治療を以下のスキームにしたがって行った：腫瘍を切除して２〜３週間後に、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの溶液２ｍｌを３日間連続して筋内投与することにより療法を始め、同じ３日のスケジュールにしたがって毎月１回補助注射を行った。４カ月目の後、次の８カ月間、毎月１回ウイルス製剤を投与した。次の２年において、６週、８週および１２週に投与間隔を徐々に広げながら、同じ用量で補助療法を続けた。
臨床予備試験、４６人のメラノーマのステージＩの患者の群において、メラノーマの進行は、ＭＶで治療された４３人の患者において５０カ月間観察されなかった。対照群において、メラノーマは、標準的な療法を受けた３１人の患者のうち１０人で進行した。
メラノーマが１５人の患者で進行しなかったが、２１人の患者で進行した標準的な療法を受けた３６人の患者の対照群と比べて、４４人のステージＩＩのメラノーマ患者の５０カ月の試験において、メラノーマの進行は３８人の患者で止まった。
治療の効率は、以下の例によって特徴付けられる：
ケース１．女性、年齢７６歳、背部皮膚メラノーマ
２００９年０９月１１日手術、Ｅｘｃｉｓｉｏ ｔｕ ｃｕｔｉｓ ｄｏｒｓｉ
ｐＴ４ｂ Ｎ０ Ｍ０
ＳＮ生検は実施しなかった
Ｅｘ ｃｏｎｓｉｌｉｏ：経過観察
２０１０年０４月０７日手術、ＬＡＥ ａｘｉｌｌａｒｉｓ ｓｉｎ．
Ｍｔｓ ｌ／ｎ ａｘｉｌｌａｒｉｓ ｓｉｎ
Ｅｘ ｃｏｎｓｉｌｉｏ：ロフェロン
ロフェロン、６ｍｉｌ、週３回、２０１０年０６月２４日から２０１０年０８月３０日まで。
治療は副作用により中断した。
２０１０年１０月から、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの２ｍｌの用量のウイルス製剤で療法を始めた。治療は良好な耐容性を示し、疾患の進行は２０１２年０２月０１日まで記述されていない。
ケース１．女性、年齢７６歳、背部皮膚メラノーマ
２００９年０９月１１日手術、Ｅｘｃｉｓｉｏ ｔｕ ｃｕｔｉｓ ｄｏｒｓｉ
ｐＴ４ｂ Ｎ０ Ｍ０
ＳＮ生検は実施しなかった
Ｅｘ ｃｏｎｓｉｌｉｏ：経過観察
２０１０年０４月０７日手術、ＬＡＥ ａｘｉｌｌａｒｉｓ ｓｉｎ．
Ｍｔｓ ｌ／ｎ ａｘｉｌｌａｒｉｓ ｓｉｎ
Ｅｘ ｃｏｎｓｉｌｉｏ：ロフェロン
ロフェロン、６ｍｉｌ、週３回、２０１０年０６月２４日から２０１０年０８月３０日まで。
治療は副作用により中断した。
２０１０年１０月から、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの２ｍｌの用量のウイルス製剤で療法を始めた。治療は良好な耐容性を示し、疾患の進行は２０１２年０２月０１日まで記述されていない。
ケース２．女性、年齢４２歳、背部皮膚メラノーマ
２００８年０５月２５日手術、Ｅｘｃｉｓｉｏ ｔｕ ｃｕｔｉｓ ｄｏｒｓｉ
ｐＴ４ａ Ｎ０ Ｍ０，Ｃｌａｒｋ Ｖ，Ｂｒｅｓｌｏｗ ９ ｍｍ
ＳＮ生検は実施しなかった
ウイルス製剤（２ｍｌ、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを２００８年０６月２７日から２０１１年０６月２７日まで投与した。
２０１１年０１月２１日超音波検査：瘢痕にて再発
２０１１年０２月０２日手術、切除、組織学的検査：肉芽腫。
ウイルス製剤（２ｍｌ、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを２０１１年０６月２７日まで続けた。
観察期間中（２０１１年１２月まで）、疾患進行の証拠は記述されていない。
２００８年０５月２５日手術、Ｅｘｃｉｓｉｏ ｔｕ ｃｕｔｉｓ ｄｏｒｓｉ
ｐＴ４ａ Ｎ０ Ｍ０，Ｃｌａｒｋ Ｖ，Ｂｒｅｓｌｏｗ ９ ｍｍ
ＳＮ生検は実施しなかった
ウイルス製剤（２ｍｌ、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを２００８年０６月２７日から２０１１年０６月２７日まで投与した。
２０１１年０１月２１日超音波検査：瘢痕にて再発
２０１１年０２月０２日手術、切除、組織学的検査：肉芽腫。
ウイルス製剤（２ｍｌ、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを２０１１年０６月２７日まで続けた。
観察期間中（２０１１年１２月まで）、疾患進行の証拠は記述されていない。
ケース３．女性、年齢５７歳、背部皮膚メラノーマ
２００７年０８月１９日手術、Ｅｘｃｉｓｉｏ ｔｕ ｃｕｔｉｓ ｄｏｒｓｉ
Ｐ Ｔ３ｂ Ｎ０ Ｍ０
ＳＮ生検は実施しなかった
推奨事項：経過観察
２００９年１２月１０日手術、ＬＡＥ ｃｏｌｌｉ ｄｘ．組織学的検査：ｍｔｓ ｌ／ｎ ｃｏｌｌｉ ｄｘ
疾患の進行−超音波検査（２０１０年０２月２２日）：ｍｔｓ ｌ／ｎ ｃｏｌｌｉ（２０１０年０２月２２日）。Ｅｘ ｃｏｎｓｉｌｉｏ：巨大病変により外科手術は推奨されず
ウイルス製剤（２ｍｌ、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを２０１０年０２月２２日から投与し、依然として進行中。
診療所への最後の訪問は２０１１年１１月２２日−疾患は安定化した。
２００７年０８月１９日手術、Ｅｘｃｉｓｉｏ ｔｕ ｃｕｔｉｓ ｄｏｒｓｉ
Ｐ Ｔ３ｂ Ｎ０ Ｍ０
ＳＮ生検は実施しなかった
推奨事項：経過観察
２００９年１２月１０日手術、ＬＡＥ ｃｏｌｌｉ ｄｘ．組織学的検査：ｍｔｓ ｌ／ｎ ｃｏｌｌｉ ｄｘ
疾患の進行−超音波検査（２０１０年０２月２２日）：ｍｔｓ ｌ／ｎ ｃｏｌｌｉ（２０１０年０２月２２日）。Ｅｘ ｃｏｎｓｉｌｉｏ：巨大病変により外科手術は推奨されず
ウイルス製剤（２ｍｌ、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを２０１０年０２月２２日から投与し、依然として進行中。
診療所への最後の訪問は２０１１年１１月２２日−疾患は安定化した。
ケース４．女性、年齢５８歳、背部皮膚メラノーマ
手術２００４年４月。Ｅｘｃｉｓｉｏ ｔｕ ｃｕｔｉｓ ｄｏｒｓｉ， ＬＡＥ ａｘｉｌｌａｒｉｓ ｓｉｎ．
ｐＴ４ｂ，Ｎ２ｃ，Ｍ０（Ｂｒｅｓｌｏｗ １５ｍｍ）
Ｒｅｅｘｃｉｓｉｏ、２００６年１月、２００６年９月（局所再発）
インターフェロンを用いた療法（２００６年１０月から２００７年５月まで）。
Ｒｅｅｘｃｉｓｉｏ ｃｕｍ ｄｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃｕｍ、２００７年２月、２００７年５月、２００７年９月。
ウイルス製剤（２ｍｌ、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを２００８年２月から２０１１年４月まで投与した。
内臓転移（２０１１年２月）。
Ｅｘｉｔｕｓ ｌｅｔａｌｉｓ（２０１１年１０月）。
手術２００４年４月。Ｅｘｃｉｓｉｏ ｔｕ ｃｕｔｉｓ ｄｏｒｓｉ， ＬＡＥ ａｘｉｌｌａｒｉｓ ｓｉｎ．
ｐＴ４ｂ，Ｎ２ｃ，Ｍ０（Ｂｒｅｓｌｏｗ １５ｍｍ）
Ｒｅｅｘｃｉｓｉｏ、２００６年１月、２００６年９月（局所再発）
インターフェロンを用いた療法（２００６年１０月から２００７年５月まで）。
Ｒｅｅｘｃｉｓｉｏ ｃｕｍ ｄｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃｕｍ、２００７年２月、２００７年５月、２００７年９月。
ウイルス製剤（２ｍｌ、力価２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを２００８年２月から２０１１年４月まで投与した。
内臓転移（２０１１年２月）。
Ｅｘｉｔｕｓ ｌｅｔａｌｉｓ（２０１１年１０月）。
投与形態および投与
療法治療のためのウイルス製剤は、上で説明した安定なゲノム配列を有する修飾ウイルスを、例えば、２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で含む注射可能な水溶液の形態が可能である。ウイルスを運ぶ溶液は、任意の生理学的に許容される無菌溶液、特に塩化ナトリウム溶液が可能である。製剤は凍結状態で保管および運搬され、使用前に室温で解凍される。製剤は、患者に一度に注入される単一用量に対応する容積のバイアルまたは他の容器ユニットに入れることができる。
療法治療のためのウイルス製剤は、上で説明した安定なゲノム配列を有する修飾ウイルスを、例えば、２×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で含む注射可能な水溶液の形態が可能である。ウイルスを運ぶ溶液は、任意の生理学的に許容される無菌溶液、特に塩化ナトリウム溶液が可能である。製剤は凍結状態で保管および運搬され、使用前に室温で解凍される。製剤は、患者に一度に注入される単一用量に対応する容積のバイアルまたは他の容器ユニットに入れることができる。
製剤は、問題になっている腫瘍を切除した後、ｗｏｕｋｎｄが治癒したときに、患者の筋肉内（ｉ．ｍ．）に注射することにより投与することができる。投与は一度に２ｍｌの前述の溶液にすることができる。注射による筋内投与は、計画された療法スケジュールにしたがって繰り返される。
Claims (12)
- 配列ＩＤ番号１と少なくとも９５％同一の配列を有する、１２カ月間の細胞培養液における前記修飾エンテロウイルスの連続的な増殖の後、前記修飾エンテロウイルスの前記ゲノムの前記配列における変化が、０．７％より大きくない、安定なゲノム配列を有することを特徴とするＥＣＨＯ７型の修飾エンテロウイルス。
- 配列ＩＤ番号１の安定なゲノム配列を有することを特徴とするＥＣＨＯ７型の修飾エンテロウイルス。
- 天然ＥＣＨＯ７ウイルスの修飾によるＥＣＨＯ７型の修飾エンテロウイルスの製造方法であって、前記修飾が、抗癌剤により弱毒化した癌細胞においてウイルス適応を行う工程と、続いてヒト胚性線維芽細胞培養液において前記修飾エンテロウイルスを継代する工程と、ヒトメラノーマ細胞において前記修飾エンテロウイルスを増殖する工程と、続いて任意選択でリバビリンにより処理されたヒト胚性線維芽細胞培養液において前記修飾エンテロウイルスを継代する工程と、前記修飾エンテロウイルスの単離および精製とを含む、製造方法。
- 癌細胞において前記修飾エンテロウイルスを増殖し、続いてヒト胚性線維芽細胞培養液において前記修飾エンテロウイルスを継代する手順が数回繰り返される、請求項３に記載の方法。
- ヒトメラノーマ細胞において前記修飾エンテロウイルスを増殖し、続いてヒト胚性線維芽細胞培養液において前記修飾エンテロウイルスを継代する手順が数回繰り返される、請求項３または４に記載の方法。
- 前記ウイルス適応が、ヒト乳腺癌細胞および胃腺癌細胞などの少なくとも２つの異なる癌の癌細胞において行われる、請求項３、４、または５に記載の方法。
- 前記修飾が、配列ＩＤ番号１と少なくとも９５％同一の配列を有する、１２カ月間の細胞培養液における前記修飾エンテロウイルスの連続的な増殖の後、前記修飾エンテロウイルスの前記ゲノムの前記配列における変化が、０．７％より大きくない、安定なゲノム配列を有することを特徴とするＥＣＨＯ７型の修飾エンテロウイルスを与える、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾が、配列ＩＤ番号１の安定なゲノム配列を有することを特徴とするＥＣＨＯ７型の修飾エンテロウイルスを与える、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変化が、部分的に、対応するアミノ酸の変化を伴わないミュート変異からなる１つのヌクレオチド交換である、請求項８に記載の方法。
- 腫瘍性疾患の治療における使用のための、請求項１、又は２に記載のウイルス。
- 前記腫瘍性疾患が、メラノーマ、胃癌、腸癌、ヒト乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、膀胱癌、リンパ肉腫、子宮癌、血管肉腫、横紋筋肉腫からなる群から選択される、請求項１０に記載のウイルス。
- 前記腫瘍性疾患がメラノーマである、請求項１０に記載のウイルス。
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