CN116286820A - 一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法和制药用途 - Google Patents

一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法和制药用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116286820A
CN116286820A CN202310137487.7A CN202310137487A CN116286820A CN 116286820 A CN116286820 A CN 116286820A CN 202310137487 A CN202310137487 A CN 202310137487A CN 116286820 A CN116286820 A CN 116286820A
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression vector
shrna
seq
group
heart failure
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310137487.7A
Other languages
English (en)
Inventor
汪道文
李华萍
陈琛
谢融
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Original Assignee
Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology filed Critical Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Priority to CN202310137487.7A priority Critical patent/CN116286820A/zh
Publication of CN116286820A publication Critical patent/CN116286820A/zh
Priority to US18/426,681 priority patent/US20240279662A1/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法和制药用途，属于生物医药领域。本发明提供一种shRNA，其对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。本发明还提供基于所述shRNA的重组表达载体、转化体、抗心衰药物及其制药用途，并提供该抗心衰药物的制备方法。经动物试验证实本发明提供的抗心衰药物可显著改善心衰动物的心脏功能，起到有效的抗心衰作用。

Description

一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法 和制药用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法和制药用途。
背景技术
心力衰竭是不同的心血管疾病发展到终末阶段的临床综合征。虽然近年来有一些新药被应用于临床，但仍有约50％的心衰患者在确诊后5年内死亡。心力衰竭预后不良，死亡率高，是威胁人类健康和导致医疗负担增加的最主要病因之一。
目前多采用腺病毒和慢病毒作为基因治疗的表达载体，但慢病毒多由白血病病毒或HIV改造而来，而腺病毒载体表达时间短、对机体有免疫原性，均不适合将来的临床应用。而重组腺相关病毒载体(rAAV)克服了其他基因表达载体所难以克服的缺点，无免疫源性，能驱动目的基因在体内长期表达，从而成为基因治疗最有前途的载体。
小核酸药物是指能利用siRNA、miRNA及反义核酸ASO等核酸小分子特异性地沉默疾病基因的表达，以治愈特定疾病的药物。其中siRNA是指双链RNA或发卡结构RNA(shRNA)经核酸内切酶剪切后形成siRNA，在解旋酶作用下生成正义链和反义链，并形成RNA诱导沉默复合体将靶基因切割降解，从而抑制靶基因的表达。目前已有多款新型小RNA药物上市(例如siRNA药物Inclisiran治疗高脂血症、ASO药物casimersen治疗杜氏肌营养不良等)，具有巨大的临床应用前景。但临床上治疗心衰的小RNA药物却仍处于空白。
本发明中，申请人设计开发了一款rAAV递送短发夹RNA(shRNA)的小RNA药物，能够显著改善心功能，具有治疗心力衰竭的潜能。
发明内容
发明人根据本领域客观存在的上述问题和不足，开发出一种rAAV递送短发夹RNA(shRNA)的小RNA药物rAAV-shRNA-AHF(AHF，anti-heart-failure)，同时进行动物实验验证其效果，发现rAAV-AHF能显著改善小鼠心脏功能，治疗心力衰竭。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种shRNA，其特征在于，其对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5组成的组。
上述shRNA均能起到负调控心肌肥厚标志物ANP的作用，具有制备抗心衰药物的前景和价值，其中SEQ ID NO.1的shRNA经动物实验验证具有抗心衰效果。所述对应的DNA序列指shRNA中的U碱基对应为T碱基，其他碱基均与shRNA一致的DNA序列。
一种重组表达载体，其特征在于，为连接有shRNA的表达载体；所述shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
一种转化体，其特征在于，为转化有重组表达载体的宿主；所述重组表达载体为连接有shRNA的表达载体；所述shRNA对应的DNA序列选自由SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5组成的组。
所述宿主选自：病毒、和/或，细胞；
优选地，所述病毒选自腺相关病毒；
优选地，所述细胞选自293细胞；
优选地，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
一种抗心衰药物，包括药效活性成分，其特征在于，所述药效活性成分包括：其对应的DNA序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5的shRNA。
所述药效活性成分选自：由shRNA、重组表达载体、转化体组成的组；
所述shRNA具有SEQ ID NO.1所示序列；转化体为含有重组表达载体的宿主；重组表达载体为连接有SEQ ID NO.1所示序列的shRNA的表达载体；
优选地，所述的一种抗心衰药物还包括：药用辅料；
优选地，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
一种抗心衰药物的制备方法，其特征在于，制备shRNA；与shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
所述制备选自：由合成、扩增、表达、克隆、分泌、富集、扩繁组成的组；
优选地，所述合成指全基因合成技术；
优选地，所述克隆指，将shRNA连接至表达载体上；
优选地，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
shRNA在制备抗心衰药物方面的用途，其特征在于，与shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
本发明提供一种shRNA在制备治疗心衰的药物方面的用途。
优选地，所述表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)；
优选地，所述表达载体启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述连接了shRNA-AHF表达载体选自：连接了shRNA-AHF序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-shRNA-AHF；或，依次连接了心肌特异性启动子tnt、shRNA-AHF序列的的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-shRNA-AHF；
优选地，所述转化体的宿主细胞选自：293细胞；
优选地，所述转化shRNA-AHF表达载体的转化体选自：转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-shRNA-AHF的重组腺相关病毒rAAV-shRNA-AHF；或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-shRNA-AHF的重组腺相关病毒rAAV-tnt-shRNA-AHF；
优选地，所述shRNA-AHF序列如SEQ ID NO.1所示；
一种具有治疗心衰效果的重组表达载体，其特征在于，为连接了所述的一种具有治疗心衰效果的基因的序列的表达载体。
所述表达载体选自：为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)；
优选地，所述一种具有治疗心衰效果的重组表达载体选自：连接了shRNA-AHF基因序列的重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-shRNA-AHF。
一种具有治疗心衰效果的转化体，其特征在于，为转化有所述的一种具有治疗心衰效果的重组表达载体的宿主细胞。
所述宿主细胞选自：293细胞；
优选地，所述一种具有治疗心衰效果的转化体选自：转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-shRNA-AHF1的重组腺相关病毒rAAV-shRNA-AHF。或，转化有重组腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)-tnt-shRNA-AHF的重组腺相关病毒rAAV-tnt-shRNA-AHF；
进一步的，所述药物还包括药学上可接受的辅料，和/或，用于缓冲、合成、和/或纯化所述序列片段的试剂。本领域技术人员可根据客观需求，将本发明的抗心衰药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料，制成各类剂型，便于销售或推广。
在进一步的实施例中，所述制备方法包括：将shRNA-AHF序列片段插入表达载体，从而制备得到可稳定表达shRNA-AHF的重组质粒。
在具体的实施例中，所述包含shRNA-AHF序列片段的表达载体为腺相关病毒表达载体pAAV-D(+)。
为了实现心力衰竭的基因治疗目的，本发明将shRNA-AHF序列片段与重组腺相关病毒载体重组构建，并经检测获得满足治疗要求的高滴度，在动物实验中证实了其可以有效改善心力衰竭小鼠的心功能。因此，本发明基于上述发现和结果，提供一种以shRNA-AHF为代表的小RNA药物的用于临床心力衰竭的治疗。
本发明涉及一种用于治疗心力衰竭的药物。所述抗心衰药物涉及shRNA-AHF的重组腺相关病毒重组体(rAAV-shRNA-AHF)的构建和制备方法，且通过高表达所述rAAV-shRNA-AHF起到所述治疗心力衰竭的药效。本发明利用化学合成法构建pAAV-D(+)-shRNA-AHF表达质粒，利用三种质粒磷酸钙共转染法包装制备含目的片段的重组腺相关病毒并纯化。经动物试验证实本发明提供的抗心衰药物可显著改善心衰动物的心脏功能，起到有效的抗心衰作用。
本发明设计并合成了shRNA-AHF的序列，并成功插入真核表达载体pAAV-D(+)中构成重组质粒pAAV-D(+)-shRNA-AHF。之后，将以下三种质粒：1)pXX9质粒、2)phelper质粒、3)pAAV-D(+)-shRNA-AHF质粒，用钙磷共转染法分别转入293细胞包装制备能表达shRNA-AHF的重组腺相关病毒(rAAV9)，经纯化后，real-time PCR法测定滴度。下一步将包装制备的同一血清型的重组腺相关病毒(rAAV-shRNA-AHF)经尾静脉注射至主动脉结扎术(TAC)导致的心力衰竭模型小鼠中。超声及导管结果表明重组腺相关病毒介导的shRNA-AHF能明显改善TAC小鼠的心功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1涉及筛选的shRNA序列对心肌肥厚标志物ANP的调控作用。
图2是本发明实验例1制备的pAAV-D(+)-shRNA-AHF的质粒的结构示意图；其中，tnt启动子代表心肌细胞特异性启动子。
图3是本发明实验例2的心脏超声及导管监测rAAV-shRNA-AHF治疗对TAC小鼠心脏功能的影响，其中A为射血分数的柱形图，B为缩短分数的柱形图，C为等容收缩期左心室压力最大上升速率的柱形图，D为等容收缩期左心室压力最小上升速率的柱形图；结果显示rAAV-shRNA-AHF可明显增加TAC小鼠的心脏收缩功能及舒张功能。
图中各标记含义列示如下：rAAV-shNC代表注射了特异性靶向心肌细胞的的表达对照shRNA的重组腺相关病毒载体的TAC小鼠，rAAV-shRNA-AHF代表注射了特异性靶向心肌细胞shRNA-AHF的重组腺相关病毒载体的TAC小鼠；sham代表假手术对照小鼠，TAC代表TAC导致的心力衰竭模型小鼠。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例或实验例涉及到的仪器设备、试剂与耗材及生物材料的来源如下：
1)仪器设备
Figure SMS_1
ND-1000核酸分析仪、ABI 9700PCR仪、ABI 7900HT荧光实时定量PCR仪、Beckman X-15R低温高速离心机；
2)试剂与耗材
RNasey Mini Kit试剂盒(购自Qiagen)、TRIZOL(购自Invitrogen公司)、TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自TaKaRa公司)、
Figure SMS_2
Endo-Free Plasmid Maxi Kit(质粒提取试剂盒，购自OMEGA公司)、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(质粒提取试剂盒，购自北京全式金公司)；真核表达载体pAAV-D(+)由合作的肖啸教授构建并赠予，shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4和shRNA-5的核心序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。pAAV-shRNA-AHF序列片段由武汉科锐斯特生物有限公司合成。
生物材料的来源
C57小鼠购自北京华阜康公司；
293T细胞来自美国ATCC公司。
第1组实施例、本发明shRNA
本组实施例提供一种shRNA。本组所有的实施例都具备如下共同特征：shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
在一些实施例中，所述shRNA为shRNA-AHF，其对应的DNA序列为SEQ ID NO.1。
在一些实施例中，所述shRNA为shRNA-3，其对应的DNA序列为SEQ IDNO.3。
在另一些实施例中，所述shRNA为shRNA-5，其对应的DNA序列为SEQ IDNO.5。
上述shRNA-AHF(shRNA-1)、shRNA-3和shRNA-5能够降低心肌肥厚标志物ANP的表达(shRNA-1作用最为明显)。其中shRNA-3和shRNA-5是靶向人源序列，无法做小鼠实验；同时因时间有限，短期内无法开展人的临床实验，因此只能提供心肌细胞实验的结果图(如图1)，证明它们具有保护心肌细胞功能。
上述shRNA均为本发明首次设计合成得到，任何扩增、合成、生产、制造、销售、许诺销售、使用、进口、出口、分泌、扩繁、富集、连接、转化、克隆、表达上述任一shRNA的行为，和/或，任何将上述任一shRNA用于制药或做为药物成分的行为，和/或，任何将上述任一shRNA用于治疗的行为均落入本发明的保护范围。
第2组实施例、本发明的重组表达载体
本组实施例提供一种重组表达载体。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述重组表达载体为连接有shRNA的表达载体；所述shRNA对应的DNA序列选自由SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
在具体的实施例中，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
上述重组表达载体均为本发明首次制备得到，任何扩增、合成、生产、制造、销售、许诺销售、使用、进口、出口、分泌、扩繁、富集、连接、转化、克隆、表达上述重组表达载体的行为，和/或，任何将上述重组表达载体用于制药或做为药物成分的行为，和/或，任何将上述重组表达载体用于治疗的行为均落入本发明的保护范围。
第3组实施例、本发明的转化体
本组实施例提供一种转化体。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述转化体为转化有重组表达载体的宿主；所述重组表达载体为连接有shRNA的表达载体；所述shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
在一些实施例中，所述宿主选自：病毒、和/或，细胞；
优选地，所述病毒选自腺相关病毒；
优选地，所述细胞选自293细胞；
优选地，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
上述转化体均为本发明首次制备得到，任何扩增、合成、生产、制造、销售、许诺销售、使用、进口、出口、分泌、扩繁、富集、连接、转化、克隆、表达上述转化体的行为，和/或，任何将上述转化体用于制药或做为药物成分的行为，和/或，任何将上述转化体用于治疗的行为均落入本发明的保护范围。
第4组实施例、本发明的抗心衰药物
本组实施例提供一种抗心衰药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述抗心衰药物包括药效活性成分，所述药效活性成分包括：其对应的DNA序列选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5的shRNA。
在一些实施例中，所述药效活性成分选自：由shRNA、重组表达载体、转化体组成的组；
所述shRNA具有SEQ ID NO.1所示序列；转化体为含有重组表达载体的宿主；重组表达载体为连接有SEQ ID NO.1所示序列的shRNA的表达载体；
优选地，所述的一种抗心衰药物还包括：药用辅料；和/或，用于扩增、合成、生产、制造、销售、许诺销售、使用、进口、出口、分泌、扩繁、富集、连接、转化、克隆、表达第1组实施例任一项所述的shRNA，和/或，第2组实施例任一项所述的重组表达载体，和/或，第3组实施例任一项所述的转化体的试剂；
本领域技术人员基于本发明的教导，根据生产需要和实践要求，将本发明的抗心衰药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料，制成各类剂型，便于销售或推广。
在具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
优选地，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
第5组实施例、本发明的抗心衰药物的制备方法
本组实施例提供一种抗心衰药物的制备方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：制备shRNA；与shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
在具体的实施例中，所述制备选自：由合成、扩增、表达、克隆、分泌、富集、扩繁组成的组；
优选地，所述合成指全基因合成技术；
优选地，所述克隆指，将shRNA连接至表达载体上；
优选地，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
在进一步的实施例中，所述制备方法还包括：将药效活性成分与药用辅料组配或混合。
本领域技术人员基于本发明的教导，根据生产需要和实践要求，将本发明的抗心衰药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料，制成各类剂型，便于销售或推广。
在具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
第5组实施例、本发明shRNA的制药用途
本组实施例提供shRNA在制备抗心衰药物方面的用途。本组所有的实施例都具备如下共同特征：与shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
在一些实施例中，所述抗心衰药物以shRNA或重组表达载体或转化体作为药效活性成分；
在进一步的实施例中，所述抗心衰药物还包括药用辅料；
在具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
在具体的实施例中，转化体为含有重组表达载体的宿主；重组表达载体为连接有SEQ ID NO.1所示序列的shRNA的表达载体，能够起到治疗心衰的作用；
在优选的实施例中，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
优选地，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)；
优选地，所述宿主选自：病毒、和/或，细胞；
优选地，所述病毒选自腺相关病毒；
优选地，所述细胞选自293细胞。
下面及实施例对本发明作进一步描述：
实验例1、重组腺相关病毒的构建
1.shRNA-AHF序列筛选
前期筛选过程中，申请人设计出数条具有潜在抗心力衰竭作用的shRNA，如SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.5所示，shRNA的核心序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。经过细胞实验筛选，发现含SEQ ID NO.1序列的shRNA-1(即shRNA-AHF)降低肥厚标志物ANP的效果最为明显(shRNA-3和shRNA-5也能够降低ANP)(图1)。申请人于是进一步挑选SEQ IDNO.1进行动物实验作为实施例的代表。下面描述中的构建仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些上述这些shRNA序列获得类似的实施例结果。
2.pAAV-D(+)载体构建
采取全基因合成技术合成rAAV-shRNA-AHF双链核苷酸并克隆在pAAV-D(+)载体上(图2)，双链核苷酸由武汉科锐斯特生物有限公司合成。shRNA-AHF序列SEQ ID NO.1所示。
3.质粒转化
将pAAV-D(+)-shRNA-AHF质粒加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30min；42℃加热45sec后，再在冰中放置1min；加入500μl无抗生素LB培养基，37℃100rpm振荡培养60min；在Amp+的LB平板培养基上培养，挑选白色单克隆菌落鉴定。
4.质粒小提
挑取单克隆菌落，加入到3ml Amp+的LB液体培养基中，37℃280rpm振荡培养过夜。使用北京全式金公司EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取质粒，具体操作步骤如下：1.取1.5ml过夜培养的细菌10,000g离心1min，尽量吸尽上清；2.加入250μl无色溶液RB(含RNaseA)，震荡悬浮细菌沉淀；3.加入250μl蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液；4.加入350μl黄色溶液NB，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min；5.15,000g离心5min，小心吸取上清加入吸附柱中；6.15,000g离心1min，弃流出液；7.加入650μl溶液WB，15,000g离心1min，弃流出液；8.15,000g离心2min，彻底去除残留的WB；9.将吸附柱置于新Ep管中，在柱中央加入20μl 70℃预热的EB，室温静置1min；10.10,000g离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃保存。
5.质粒大提
准备1L的无菌锥形瓶，加入300ml无菌LB培养基，加氨苄青霉素溶液至终浓度为100μg/ml。分别加入50μl所需质粒(pXX9、phelper、pAAV-D(+)-shNC、pAAV-D(+)-shRNA-AHF)，280rpm，37℃过夜培养。按照OMEGA公司Endo-Free Plasmid Maxi Kit说明书操作，提取质粒，具体步骤如下：1.室温下5000g离心10min收集细菌；2.弃培养基，加入10mlSolution I/RNase A混合液，漩涡震荡完全重悬；3.重悬混合液中加入10ml Solution II，轻轻颠倒混匀10-15次后，室温放置
6.rAAV介导的病毒包装
293T细胞生长至90％，钙磷转染前1-2hr，每个培养皿换新鲜培养基(含血清)12-15ml，在50ml离心管内先加入氯化钙(CaCl2)，再加入质粒，形成Ca-DNA混合液，充分混匀，向Ca-DNA混合液中缓慢滴加2XHEBS BUFFER，形成Ca-DNA-P混合液，一边加2X HEBS一边振荡离心管，充分混匀形成钙磷颗粒。8-12hr后，换18-20ml无血清培养基，72hr后，吸弃培养基，用PBS洗3遍，每个培养皿中加入Tris+NaCl(pH 8.5)1ml，用刮匙刮取细胞，收集于干净离心管，-80℃冻存。
7.病毒纯化
将冻存于-80℃的细胞取出，在37℃解冻溶解，反复冻融4次，8,000g离心15min，将上清放至干净离心管，弃细胞沉淀。用-20℃预冷的无水乙醇与rAAV以3∶1的体积比充分混匀，-20℃冰箱放置2hr后，4℃，13,000rpm离心15min，弃上清；乙醇挥发后，加入相应体积Tris+NaCl(pH 8.5)溶解沉淀。用Millipore小滤器(0.22μm)过滤。
8.病毒滴度测定
样品处理：
rAAV病毒液40μl
蛋白酶K(20mg/ml)5μl
55℃，反应1hr；
酚：氯仿：异戊醇45μl
4℃，12,000g离心5min回收水相；
氯仿45μl
4℃，12,000g离心5min回收水相。
Real-time PCR：
Primer 1(10μm)0.4μl
Primer 2(10μm)0.4μl
SYBR Green I Mix 10μl
ddH2O 8.2μl
Template 1μl
95℃30sec---(95℃5sec---60℃5sec---72℃20sec)×40个循环---MeltingCurve实验例2、以rAAV9型表达shRNA-AHF的重组腺相关病毒为例检测其对心力衰竭的治疗作用
采用8周龄的C57小鼠，通过尾静脉分别注射rAAV-tnt-shRNA-AHF和对照rAAV-tnt-shNC病毒，病毒滴度1×1011PFU/每只，2周后行TAC手术：胸主动脉结扎术(TransverseAortic Constriction，TAC)，至实验终点(4周后)时行小鼠心功能检测，方法如下：使用仪器为配有30MHz高频探头的超声仪。在使用异氟烷麻醉小鼠后，将小鼠仰卧放置于检测平台，沿小鼠胸骨旁左室乳头肌水平短轴和长轴切面采集左室二维图像，同时在二维图像引导下分别获取5个以上连续心动周期M型超声影像，根据采集的影像使用软件分析结果，得到心脏超声检测心脏血流动力学指标，经相关软件分析后计算出下列指标：包括心率(Heart rate,HR)、左室舒张期内径(Left Ventricular Internal Dimension，diastole，LVIDd)、左室收缩期内径(Left Ventricular Internal Dimension，systole，LVIDs)、左室后壁舒张期厚度(Left Ventricular Posterior Wall，diastole，LVPWd)、左室后壁收缩期厚度(Left Ventricular Posterior Wall，systole，LVPWs)、室间隔舒张期厚度(Interventricular septal thickness，diastole，IVSd)、室间隔收缩期厚度(Interventricular septal thickness，systole，IVSs)、射血分数(Ejection Fraction，EF)以及缩短分数(Fractional Shortening，FS)等。结果显示：rAAV-shRNA-AHF处理可明显改善TAC小鼠的心脏功能(图3)。

Claims (10)

1.一种shRNA，其特征在于，其对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5组成的组。
2.一种重组表达载体，其特征在于，为连接有shRNA的表达载体；所述shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
3.根据权利要求2所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
和/或，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
4.一种转化体，其特征在于，为转化有重组表达载体的宿主；所述重组表达载体为连接有shRNA的表达载体；所述shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5组成的组。
5.根据权利要求4所述的一种转化体，其特征在于，所述宿主选自：病毒、和/或，细胞；
和/或，所述病毒选自腺相关病毒；
和/或，所述细胞选自293细胞；
和/或，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
和/或，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
6.一种抗心衰药物，包括药效活性成分，其特征在于，所述药效活性成分包括：其对应的DNA序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5的shRNA。
7.根据权利要求6所述的一种抗心衰药物，其特征在于，所述药效活性成分选自：由shRNA、重组表达载体、转化体组成的组；
所述shRNA具有SEQ ID NO.1所示序列；转化体为含有重组表达载体的宿主；重组表达载体为连接有SEQ ID NO.1所示序列的shRNA的表达载体；
和/或，所述的一种抗心衰药物还包括：药用辅料；
和/或，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
和/或，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
8.一种抗心衰药物的制备方法，其特征在于，制备shRNA；与shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
9.根据权利要求8所述的一种抗心衰药物的制备方法，其特征在于，所述制备选自：由合成、扩增、表达、克隆、分泌、富集、扩繁组成的组；
和/或，所述合成指全基因合成技术；
和/或，所述克隆指，将shRNA连接至表达载体上；
和/或，所述表达载体的启动子选自：心肌细胞特异性启动子tnt、α-MHC、MLC-2v、Desmin，或非特异性启动子H1、U6、CMV；
和/或，所述表达载体选自腺相关病毒表达载体pAAV D(+)。
10.shRNA在制备抗心衰药物方面的用途，其特征在于，与shRNA对应的DNA序列选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5组成的组。
CN202310137487.7A 2023-02-17 2023-02-17 一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法和制药用途 Pending CN116286820A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310137487.7A CN116286820A (zh) 2023-02-17 2023-02-17 一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法和制药用途
US18/426,681 US20240279662A1 (en) 2023-02-17 2024-01-30 A shRNA, its recombinant expression vector, transformant, anti-heart failure drug, preparation method, and use as drug thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310137487.7A CN116286820A (zh) 2023-02-17 2023-02-17 一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法和制药用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116286820A true CN116286820A (zh) 2023-06-23

Family

ID=86812391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310137487.7A Pending CN116286820A (zh) 2023-02-17 2023-02-17 一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法和制药用途

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20240279662A1 (zh)
CN (1) CN116286820A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101970051A (zh) * 2007-12-31 2011-02-09 纳诺科尔治疗公司 用于治疗心力衰竭的rna干扰
CN106555002A (zh) * 2016-11-16 2017-04-05 武汉大学 乳脂肪球表皮生长因子8在心脏重构和心力衰竭的诊断及治疗中的应用
CN107252491A (zh) * 2017-06-09 2017-10-17 汪道文 用于治疗心力衰竭的药物及其筛选方法和制备方法
US20190022250A1 (en) * 2015-11-06 2019-01-24 National University Corporation Kumamoto University Pharmaceutical composition for preventing or treating heart failure
CN111549028A (zh) * 2020-05-08 2020-08-18 中国农业大学 一种shRNA及其应用
CN112251421A (zh) * 2020-10-29 2021-01-22 武汉大学 一种ezh2可变剪切体及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101970051A (zh) * 2007-12-31 2011-02-09 纳诺科尔治疗公司 用于治疗心力衰竭的rna干扰
US20190022250A1 (en) * 2015-11-06 2019-01-24 National University Corporation Kumamoto University Pharmaceutical composition for preventing or treating heart failure
US20200345866A1 (en) * 2015-11-06 2020-11-05 National University Corporation Kumamoto University Pharmaceutical composition for preventing or treating heart failure
CN106555002A (zh) * 2016-11-16 2017-04-05 武汉大学 乳脂肪球表皮生长因子8在心脏重构和心力衰竭的诊断及治疗中的应用
CN107252491A (zh) * 2017-06-09 2017-10-17 汪道文 用于治疗心力衰竭的药物及其筛选方法和制备方法
CN111549028A (zh) * 2020-05-08 2020-08-18 中国农业大学 一种shRNA及其应用
CN112251421A (zh) * 2020-10-29 2021-01-22 武汉大学 一种ezh2可变剪切体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨广;李小鹰;鲁晓春;: "利用RNA干扰技术治疗慢性心衰大鼠的研究", 中国分子心脏病学杂志, no. 02, 15 April 2007 (2007-04-15), pages 99 - 103 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20240279662A1 (en) 2024-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230355743A1 (en) Multi-proline-substituted coronavirus spike protein vaccines
US11351242B1 (en) HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
US20240100145A1 (en) Vlp enteroviral vaccines
WO2021154763A1 (en) Coronavirus rna vaccines
WO2019148101A1 (en) Rsv rna vaccines
CN109641064A (zh) 非整合病毒递送系统及其相关方法
WO2022221336A1 (en) Respiratory syncytial virus mrna vaccines
EP4322997A1 (en) Epstein-barr virus mrna vaccines
JPH04504125A (ja) 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現
WO2023283651A1 (en) Pan-human coronavirus vaccines
JP2016529886A (ja) 遺伝的に安定な腫瘍溶解性ｒｎａウイルス、その製造方法およびその使用
CN107252491B (zh) 用于治疗心力衰竭的药物及其筛选方法和制备方法
CN116019935A (zh) Ago2在制备治疗心衰或糖尿病性心肌病的药物方面的用途及其蛋白、基因、转化体
CN105754999B (zh) 一种抑制hsa-miR-221-3p的寡核苷酸序列、重组腺病毒及其制备方法和应用
CN116286820A (zh) 一种shRNA、其重组表达载体、转化体、抗心衰药物及制备方法和制药用途
CN110684805B (zh) 神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用
CN114432332A (zh) circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物
CN109266684B (zh) 一种构建病原感染敏感性动物模型的方法
JP2023518734A (ja) インビトロトランスクリプトｍｒｎａ及びこれを含有する薬学組成物
CN113583977A (zh) 可受微小rna调控的分离的重组溶瘤痘病毒及其应用
CN115838725B (zh) 在哺乳动物心脏中特异性启动基因的启动子序列及其应用
CN114292847B (zh) 一种长链非编码rna及其在制备治疗骨质疏松药物中的应用
CN117243967B (zh) Met-tRNAiMet或tRNAiMet在制备治疗心肌肥大及心衰药物方面的应用
CN118001427A (zh) miR-320抑制剂在制备治疗非酒精性脂肪性肝病或高脂血症药物中的应用
CN113817733B (zh) 一种MYB基因上游34kb区域转录的lncRNA、表达载体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination