CN1244583A - 本土性猪水泡病病毒与其变异株的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明是揭示本土性猪水泡病病毒(swine vesicular disease virus,简称SVDV)基因与其基因变异株、其表达质粒和该变异株的制备方法,含该变异株的疫苗组合物及做为猪水泡病疫苗的用途。

Description

本土性猪水泡病病毒与其变异株的制备方法及用途

本发明涉及本土性猪水泡病病毒之基因及其基因变异株、其表达质粒、其制法及用途。本发明还涉及含该变异株之疫苗组合物。

猪水泡病是一种经接触感染之病毒性疾病，其解剖及组织上的水疱病变基本上与口蹄疫相似，剖检时除了水疱病变外无其它病变，一般水疱在冠状带、蹄趾间、鼻、口腔黏膜及舌发生，其临床症状与口蹄疫相似。虽然罹病猪不会死亡，但感染猪会有疼痛、跛行、生长发育迟缓等现象。此外因为其临床症状与恶性传染病口蹄疫极为相似，容易造成检疫上的错误而影响到口蹄疫的防治(口蹄疫是感染于家畜及野生偶蹄类动物的高度急性传染性疾病，会严重打击畜牧生产业，因此畜牧业发达的国家都将此疾病列为首要防治对象)。为了有效控制口蹄疫，先进国家也将猪水泡病列为恶性传染病并进行清场政策，即扑杀感染猪水泡病的猪，同时严格管制进口猪肉及防止感染过猪水泡病的猪进入国内。

猪水泡病的致病原为猪水泡病病毒，属小型核糖核苷酸病毒的肠道病毒群，其具有正极性的多腺嘌呤核苷酸之单股RNA病毒，基因长约7400个碱基，由P-1，P-2和P-3区域所组成，整个病毒基因只有一个开放读码，可合成一个大的多蛋白(polyprotein)，经由病毒特异性蛋白酶切割为成熟的病毒蛋白，在P-l区域的多蛋白，包括4个外鞘蛋白，即VP1、VP2、VP3和VP4(J.general Virology70，919-934(1989))。其抗原决定区主要在VP1之87、88、272、275，VP2之70、154、163、233及VP3之60、73、76等氨基酸区域(J.general Virology 76，3099-3106(1995))。P-2区域的多蛋白包含3个蛋白质：2A、2B、2C，其中2A为蛋白切割酶。P-3区域的多蛋白，包括4个蛋白质3A、3B、3C、3D，其中3C为蛋白切割酶，3D为RNA聚合酶。

如上所述整个猪水泡病病毒的基因只有7400个碱基，共编码11个蛋白质，每个蛋白质对病毒存活都很重要，截至目前没有任何报告指出可删除病毒蛋白的任何片段而不影响到病毒的存活。

已知文献资料已揭示下列猪水泡病病毒株H/3’76(J.generalVirology 70，919-934(1989))，J1’73(Nucleic Acids Research 21，3896(1993))及UKG/27/72(Virus Research16，255-274(1990))的全部cDNA序列，彼此间相似性大于98％。

另外克沙奇病毒B5与猪水泡病毒之病毒外鞘蛋白相似性很高(92-96％)，但其2A蛋白相似性较低(86.7-88％)。口蹄疫虽临床症状与猪水泡病很像但其基因相似性很低约25％。早期诊断或区分此等病毒主要是依据血清检验，但最近因DNA聚合酶链反应技术突飞猛进及其较血清方法简单、快速、而且因为是侦测检体的DNA序列，可经由适当的引物设计而区分基因序列很相似的检体。所以也陆续有人报告利用聚合酶链反应方法来诊断区分此等临床症状很像或是外鞘蛋白很相似的病毒(Journal of Virological Method 53(1995)，189-199及(1995)，155-167和Archives of Virology(1996)141，331-344)。随着PCR技术的进展，尤其是定量PCR技术之改进，用PCR技术检验猪水泡病、克沙奇病、口蹄疫病等病毒的方法将会越来越普遍。

于1981年Baltimore将属于小RNA病毒的小儿麻痹病毒全病毒的cDNA克隆到含有SV40启动子的哺乳动物细胞表达载体上，将其转化HeLa细胞后会产生具感染性的小儿麻痹病毒(Science 214，916-919(1981))。使人们可以经由改变表达质粒上RNA病毒的cDNA序列，再经转化适当宿主细胞而产生突变的RNA病毒，因此整个DNA病毒的基因重组工作可在DNA水平上操作既简单，快速成功率又高，故后来不但创造了许多抗原决定区变异株的小儿麻痹病毒(Journal of Virology 63，5251-5257)，也发展成多价的疫苗载体(Science 265(1994)，1448-1451；Virology 21861-70(1996))。此外Toru Inoue于1990年也将同属小RNA病毒的猪水疱病毒(日本之H/3’76株)的cDNA克隆到pSVL表达质粒上，含有SV40启动子的哺乳动物细胞表达载体，经转化IBRS-2细胞后也可产生猪水泡病病毒(Journal of General Virology(1990)，71，1835-1838)，但其所制备的病毒感染IBRS-2细胞所形成的病毒较母株(H/3’76)小，可能是在繁杂的表达质粒克隆(约经10次的克隆步骤)中产生突变。

目前畜牧界尚未有很好免疫力且可与野生株病毒区分的疫苗用来防治猪感染猪水泡病，因此迫切需求可跟野生株病毒区分的疫苗变异株对猪免疫以减少经济损失而提升产业利用性。

本发明的目的是提供猪水泡病病毒台湾玉里株全长cDNA序列。

本发明的另一目的是提供猪水泡病病毒变异株之基因及其变异株与其表达质粒。

本发明进一步的目的是提供一种制备猪水泡病病毒变异株的方法。

本发明的又一目的是提供用于防治猪水泡病的疫苗组合物。

本发明的再一目的是提供用以防治及扑灭猪水泡病的方法。

本发明的再一目的是提供用以区分克沙奇病毒及口蹄疫病毒的方法。

图1示出经由RT-PCR所制备的猪水泡病病毒全长cDNA。

图2示出pKS/CMV-SVDV-T表达质粒的构建。

图3示出pKS/CMV-SVDV-T表达质粒之限制性酶切图谱。

图4示出pCI/SVDV-T表达质粒的构建。

图5示出pCI/SVDV-T表达质粒之限制性酶切图谱。

图6示出pCI/SVDV-T转染MVPK细胞后，产生猪水泡病病毒斑。(a)24小时，(b)48小时。

图7示出猪水泡病病毒台湾玉里株全长cDNA的核苷酸序列。

图8示出pCI(ΔEag I)/SVDV-T质粒的构建。

图9示出pCI(ΔEag I)/SVDV-T质粒的限制性酶切图谱。

图10示出pCI(ΔEag I)/SVDV-T(ΔSph I)质粒的构建。

图11示出pCI(ΔEag I)/SVDV-T(ΔSph I)质粒的限制性酶切图谱。

图12示出pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)质粒的构建。

图13示出pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)质粒的限制性酶切图谱。

图14示出pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/H21质粒的构建。

图15示出pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/H21质粒的限制性酶切图谱。

图16示出pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/S97质粒的构建。

图17示出pCI(ΔEag I，ΔHindIII)/SVDV-T(ΔSph I)/S97质粒限制性内切酶图谱。

图18示出pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/N3质粒构建。

图19示出pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/N3质粒限制性内切酶图谱。

图20示出H21，SP7，N3等变异株猪水泡病病毒的变异区核苷酶序列。

图21示出以反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)区分猪水泡病病毒变异株与野生株。

本发明首先是提供台湾玉里株猪水泡病病毒全长的cDNA序列。其是以猪水泡病病毒台湾玉里株RNA为模板，经反转录-聚合酶链反应制备出病毒全长cDNA，并克隆到含有启动子(如CMV启动子)的表达载体上，经转化适当宿主细胞后可产生具有感染性的猪水泡病病毒。

整个猪水泡病病毒的基因共编码11个蛋白质，每个蛋白质对病毒存活都很重要，尚未报告指出可删除病毒蛋白质的任何片段而不影响到病毒的存活。本发明另提供一些变异株猪水泡病病毒的基因以利与野生株有所区分。只是本发明在构建可与野生株区分的疫苗变异株时无法沿用传统上用删除病毒的蛋白抗原片段来达到区分的目的，例如在构建猪拟狂犬病可区分的疫苗变异株时，就以删除其gp1基因，使其病毒不再制备gp1蛋白且可存活，以达到与野生株区分的目的(Thomas Moliter et al.，“Pseudorabies Vaccines：Past，Present，and Future”，Comperdium Food Aninal，9卷12期，1987年12月，F412页)。本发明在不影响病毒存活的条件下以置换外鞘蛋白抗原决定区基因的方式，来达到与野生株区分的目的。

本发明亦提供一种H21变异株猪水泡病病毒的基因，其核酸序列如猪水泡病病毒台湾玉里株的基因序列，但2705至2710碱基位置被GAAAGC所取代。

本发明还提供了一种N3变异株猪水泡病病毒基因，其核酸序列如猪水泡病病毒台湾玉里株之基因序列，但2693至2710碱基位置被GACAACGGCGCTGAAAGC所取代。

本发明提供一种SP7变异株猪水泡病病毒基因，其核酸序列如猪水泡病病毒台湾玉里株之基因序列，但2705至2710碱基位置被下列序列GGCTCCACCACAAACAAGGATAAGAGC所取代。

为了避免在多次的克隆过程中产生突变，本发明揭示了以特长PCR技术(Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 91，pp.2216-2220)由台湾玉里株猪水泡病病毒的RNA为模板经反转录成单股DNA后，以特长PCR技术制备出全长7.4kb的cDNA，再将此cDNA克隆到含有启动子(如CMV启动子)的表达载体上而构建成具有感染性的表达质粒，即此表达质粒转化适当宿主细胞后可产生具有感染性之病毒，由此方法所制备的猪水泡病病毒其效价、病毒斑大小，以及被抗猪水泡病病毒血清中和能力皆与母株一样。

经由改变表达质粒上猪水泡病病毒的cDNA序列，可产生猪水泡病病毒变异株，其不但比野生株有较佳的诱导小白鼠产生中和抗体的能力，因其可与野生株区分，更可在推行扑灭猪水泡病政策时使用。

因此，本发明还提供了猪水泡病病毒N3、N21、SP7变异株。

本发明还提供了一种猪水泡病病毒的表达质粒，其含有猪水泡病病毒或其变异株的全长cDNA。

本发明进一步提供了含猪水泡病病毒台湾玉里株的表达质粒。

本发明进一步提供了猪水泡病病毒衣壳蛋白1、2或3等区域突变的表达质粒。

特定言之，本发明提供了猪水泡病病毒中第84到88位氨基酸区域产生突变之表达质粒。

本发明进一步提供了猪水泡病病毒表达质粒，选自pCI/SVDV-T表达质粒(其已于1998年8月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 98013)、pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/H21(其已于1998年8月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 98011)、pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/SP7(其已于1998年8月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 98012)或pCI(ΔEag I，ΔHindIII)/SVDV-T(ΔSph I)/N3(其已于1998年8月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 98010)。

本发明也提供了一种制备猪水泡病病毒变异株的方法，其包括下列步骤

(1)构建含猪水泡病病毒全长cDNA的表达载体，

(2)在猪特定传统染病毒表达载体上改变其cDNA序列来构建猪水泡病病毒变异株表达载体，及

(3)将猪水泡病病毒变异株表达载体感染适当宿主细胞而产生具感染性之猪水泡病病毒变异株。

本发明所揭示的猪特定传染表达质粒，除了可用以重组猪水泡病病毒cDNA，而产生猪水泡病病毒之变异株外，也可连接外来基因当作表达外来基因的载体，例如多价疫苗的载体。此外本发明之疫苗可与野生株区分的猪水泡病有所区分。所以用来防治猪感染猪水泡病的疫苗不但可防治猪水泡病，更有助于口蹄疫的防治，尤其在进行清场政策时，可跟野生株病毒区分的变异株疫苗对猪免疫以减少经济损失而提升产业利用性。

所以，本发明提供了一种用于防治猪水泡病的疫苗组合物，其含有本发明的猪水泡病病毒变异株及疫苗用佐剂。该疫苗组合物是繁殖经本发明变异株感染的宿主细胞后添加适当佐剂而制得。

本发明也揭示了以PCR方法区分野生株及变异株的猪水泡病病毒，且设计的引物对5’端在VP1区域而3’端在2A蛋白酶区域(该引物对分别位于猪水泡病病毒cDNA第2692到2709位碱基及第3358到3375位碱基)，因此除了可区分不同株的猪水泡病病毒外也可有效区分克沙奇病毒及口蹄疫病毒。

所以本发明提供了一种以聚合酶链反应区分猪水泡病病毒野生株与N3、H21、SP7变异株的方法，其聚合酶链反应中所用的DNA引物位于猪水泡病病毒cDNA第2692到2709位碱基而另一引物位于第3358到3375位碱基。

本发明提供了一种以聚合酶链反应区分克沙奇病毒及口蹄疫病毒的方法，其聚合酶链反应中所用的DNA引物位于猪水泡病病毒cDNA第2692到2709位碱基而另一引物位于第3358到3375位碱基。

由于本发明的疫苗可经由聚合酶链反应或酶联免疫反应与野生株猪水泡病病毒区分，因此除了可防治猪水泡病外，也可同时扑杀感染野生株病毒的猪，以达扑灭猪水泡病病毒的目的。

是以本发明提供了一种用以防治及扑灭猪水泡病的方法，其包括下列步骤：

(1)以猪水泡病病毒变异株疫苗免疫猪，

(2)以聚合酶链反应或酶联免疫反应侦测被野生株病毒感染的猪，及

(3)扑杀感染野生株病毒之猪。

特定言之，本发明提供了用以防治及扑灭猪水泡病之方法，其中步骤(1)之变异株猪水泡病病毒系选自猪水泡病病毒N3、H21或SP7变异株，而步骤(2)之聚合酶链反应中所用的DNA引物位于猪水泡病病毒cDNA第2692到2709位碱基而另一引物位于第3358到3375位碱基。

本文所称“适当宿主细胞”是指常规用于基因重组技术之宿主细胞，包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞等；或指常规用于PR病毒培养技术之细胞株，例如猪肾细胞-MVPK、PK-2和PK-15、猪睾丸细胞(ST)、牛胚脾脏细胞、Madin-Darby牛肾细胞、猴肾细胞-vero、兔肾细胞-RK13、小仓鼠肾细胞(BHK)、鼠成纤维细胞-LM(TK^-)等。

本文所称之“适当载体”中指常规用于基因重组技术之载体，例如应用于大肠杆菌宿主的含有λPL、T5、T7、SP6、Ptac、lac、trp等启动子的载体；应用于酵母宿主的载体；应用于昆虫细胞宿主的杆状病毒载体；或应用于细胞宿主的病毒等载体系统。

为使本发明之目的、方法、原理、特征更清晰明确，兹以下文非限制性实施例进一步详细说明。

实施例1.猪水泡病病毒的培养及纯化

猪水泡病病毒台湾玉里株及猪肾细胞(MVPK)均由台湾大学兽医系赖秀穗博士提供。

采用猪肾细胞(MVPK)培养猪水泡病病毒，培养液为MEM含5％胎牛血清，MVPK细胞置于含5％CO₂，37℃恒温箱中培养，待细胞长成单层细胞后，吸掉培养液，每个T-175培养瓶接种约0.1MOI的玉里株猪水泡病病毒，置于37℃恒温箱中轻微振荡1小时后，再移入含有5％CO₂，37℃恒温箱中培养，当细胞病变(cytopathiceffect，CPE)达90％时，收集培养液，于4℃离心10分钟(3000转/分钟)，丢弃沉淀物，收取病毒溶胞液，此病毒溶胞液的效价为10⁹pfu/毫升，加入PEG 6000直到浓度达8％，于4℃搅拌6小时，离心(6000转/分钟)30分钟以原1/100体积的1×TEN缓冲液(0.01M Tris-HClpH7.5，0.1M NaCl，1mM EDTA)溶解沉淀物。然后以CsCl梯度离心(梯度由下而上为2毫升×1.45克/毫升，2毫升×1.39克/毫升，2毫升×1.35克/毫升，2毫升×1.25克/毫升)，纯化病毒。将2毫升病毒溶胞液放置于梯度离心柱最上层，于4℃离心(36000转/分钟)4小时，收集密度为1.34克/毫升层的病毒颗粒，再用1×TEN缓冲液透析含CsCl的病毒颗粒。以MVPK细胞测试纯化的猪水疱病毒其效价为10¹¹pfu/毫升。

实施例2.猪水泡病病毒全长cDNA的制备

(1)病毒RNA纯化

加0.75毫升TRIzol LS试剂(购自BRL)于0.25毫升病毒液中，震荡39秒、放置5分钟，再加入0.2毫升氯仿、震荡30秒，放置5分钟，于4℃，离心12000转/分、15分钟，收取上层液，加入0.5毫升异丙醇，静置于室温10分钟，然后于4℃离心(12000转/分钟)10分钟，丢掉上清液用1毫升75％酒精清洗沉淀物，最后以水溶RNA，并以UV 260毫微米测定RNA浓度，并以1％琼脂糖凝胶确定所纯化RNA长约为7.4kb。

(2)第一链cDNA有合成

10微升(5微克)RNA加1微升oligodT(33mer)，加热至95℃2分钟，置于冰上10分钟，加入1微升Rnasin(200U/微升，购自Giboco-BRL)，1微升反转录酶(200U/微升，Super Script TM GibcoBRL)，4微升5倍反转录酶反应液，0.4微升25mM dNTPs，2微升0.1MDTT，混合均匀，先于25℃反应10分钟，再于42℃反应1小时，最后于90℃反应10分钟，置于冰上冷却后加入1微升，2U/微升RNaseH(购自Gibco BRL)于37℃反应20分钟，最后以QIA quick SpinPlasmid kit(购自QIAGEN)纯化产物，并用50微升水冲提出第一链cDNA。

(3)聚合酶链反应合成cDNA

取5微升第一链cDNA，加入4微升2.5mM dNTPs，5微升10倍ExTag反应液(购自TaKaRa)，0.5微升，0.2微克/微升5’端引物，其序列如下：

GCTCTAGATTAAAACAGCCTGTGGGTTGTTCC，0.5微毫升0.2微克/微升3’端引物，其序列如下：CGGGATCC(T)₃₂，35微升水及0.25微升5U/微升ExTag(购自TaKaRa)，加50微升矿物油于上层。设定温度循环仪(RoboCycle，购自Stratagene)之反应参数为94℃，1分钟、1个循环及94℃、30秒，60℃、1分钟，72℃、7.5分钟为一循环、共反应30个循环，最后于72℃反应10分钟。以QIAquick Spin PCR纯化试剂盒(购自QIAGEN)纯化PCR产物，以100微升水冲提出产物，以0.8％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，确定已制备出全长猪水泡病病毒cDNA，长约7.4kb，如图1。

实施例3.猪水泡病病毒表达质粒的构建

(1)pKS/CMV-SVDV-T表达质粒构建

如图2所示构建pKS/CMV-SVDV-T表达质粒。

以EcoRV酶，切开pKS/CMV载体之EcoRV位置，再以碱性去磷酸酶(CIP，购自NEW CNGLAND Biolabs)去掉载体5’端磷酸根经纯化后置于4℃。以T4多核苷酸激酶(购自NEW ENGLANDBiolabs)磷酸化7.4kb之猪水泡病病毒cDNA，经纯化后与载体连接。用T4 DNA连接酶于16℃反应16小时后，经限制酶分析及利用Sanger’s方法并使用Sequence version 2.0 DNA测序套组(购自United States Biochemical)以T7启动序列(ATTAATACGACTCACTATAGG)为引物，测定DNA序列，确定所克隆到的7.4kb DNA片段为猪水泡病病毒的全长cDNA，其限制性酶切图谱如图3。

(2)pCI/SVDV-T表达质粒构建

如图4所示构建pCI/SVDV-T表达质粒。

以BamHI限制性酶由pKS/CMV-SVDV-T表达质粒切下全长猪水泡病病毒cDNA片段，以0.8％琼脂糖凝胶电泳分离DNA，切下约7.4kb的cDNA片段，经纯化后置于4℃冷藏。也以BamHI限制性内切酶切开pCI载体(购自Promega)，续以碱性去磷酸酶去掉载体两端的磷酸根防止载体自行连接，经纯化后与7.4kb的DNA片段连接，以T4 DNA连接酶于16℃反应16小时后转化DH5α菌株，经筛选得到比pCI大的质粒，经限制酶分析及DNA测序，证实已将猪水泡病病毒之cDNA接到pCI载体上，构建成pCI/SVDV-T表达质粒，其限制酶图谱如图5。

实施例4.由猪水泡病病毒表达质粒制备猪水泡病病毒

将1-2×10⁵MVPK细胞种于6孔细胞培养皿中，以3毫升含5％胎牛血清之MEM，在5％CO₂，37℃恒温箱中培养细胞。细胞约半满时，配制下列溶液，溶液A：将1微克pKS/CMV-SVDV-T或pCI/SVDV-T加到100微升OPTI-MEM(购自GIBCO BRL)中，溶液B：以100微升OPTI-MEM溶解20微升脂转染试剂(lipofectin，购自GIBCO BRL)。将A及B溶液混合后，静置于室温15分钟。以1×PBS洗半满MVPK细胞两次。然后每孔加入0.8毫升OPTI-MEM后再将已静置15分钟的A加B混合液加进来。转染的MVPK细胞置于培养箱中培养16小时，然后以1×PBS洗细胞，再加入3毫升含5％胎牛血清的MEM培养液，再放到培养箱中培养，隔24小时可观察到有明显的病毒斑形成，如图6(a)，再经24小时，可观察到MVPK细胞已完全被病毒分解如图6(b)，而对照组(只转染pKS/CMV或pCI载体者)的MVPK细胞则已长全满。取3毫升病毒溶胞液感染生长于3毫升含5％胎牛血清MEM中已长满的MVPK细胞，16小时后可看到明显的病毒斑。所以pKS/CMV-SVDV-T及pCI/SVDV-T等猪水泡病病毒表达质粒转染MVPK细胞后可产生具感染性的猪水泡病病毒。此病毒按照实施例1的方法培养，其病毒溶胞液的效价，纯化后效价及梯度离心后密度皆与原猪水泡病病毒一样。

实施例5.猪水泡病病毒变异株表达质粒的制备

(1)pCI(ΔEag I)/SVDV-T质粒构建

如图8所示构建pCI(ΔEag I)/SVDV-T表达质粒。

构建pCI(ΔEag I)/SVDV-T质粒的目的是为了删除pCI载体上的Eag I位点，以便猪水泡病病毒cDNA之1442bp位置的Eag I位点可用来构建变异株。首先将pCI/SVDV-T质粒用Not I及Xho I限制酶于37℃反应2小时，纯化后以15U/50微升的绿豆核酸分解酶(购自New England Biolabs)于25℃反应30分钟，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离DNA，切下约11.5kb DNA片段，纯化后以T4连接酶将两端连接，经转化DH5α菌株，抽取质粒后用Eag I限制性内切酶于37℃反应2小时，以0.8％琼脂糖凝胶分析挑选只被切一刀的线形质粒其大小为11.5kb，再经DNA测序，确定载体上Eag I位点已被删除，完成pCI(ΔEag I)/SVDV-T质粒构建，其限制性内切酶图谱如图9。

(2)pCI(ΔEag I)/SVDV-T(ΔSph I)质粒构建

如图10所示构建pCI(ΔEag I)/SVDV-T(ΔSph I)表达质粒。

构建pCI(ΔEag I)/SVDV-T(ΔSph I)质粒之目的是为了删除猪水泡病病毒cDNA之6772位置的Sph I限制性内切酶位点而使得2660bp位置的Sph I成为整个质粒中唯一的Sph I限制性内切酶位点，便于构建变异株时使用。预先以“重叠延伸”方法(Gene 7751-59(1989))，制备猪水泡病病毒5900到7300bp的cDNA片段，其6772bp的Sph I的DNA序列，经由引物的设计，改为GTGGC，仍维持原来的氨基酸编码，但Sph I限制性内切酶位点已被删除。再将所制备的cDNA片段用第6345bp处的NsiI及6928bp处的Cla I限制性内切酶位点与pCI(ΔEag I)/SVDV-T相对应片段互换而构建成pCI(ΔEagI)/SVDV-T(ΔSph I)。其详细步骤如下：先以pCI(ΔEag I)/SVDV-T为模板，SVDV5900(+)与SVDV6760-Sph I(-)为一对PCR引物，另一组PCR用SVDV6760-Sph I(+)与SVDV7300(-)为引物。PCR混合液为10微升10×Extag缓冲液，8微升2.5mM dNTP，引物各0.2微克，0.05微克模板，0.5微升Extag(购自TaKaRa)加至100微升。PCR反应条件为94℃、1分钟，1个循环，94℃、30秒钟，50℃、30秒钟，72℃、1分钟等3个步骤为一循环共反应30个循环，再72℃、3分钟。反应完成后用0.8％琼脂糖凝胶分析PCR产物，可清楚看到前组引物有约870bp DNA产物，而后组引物则有约530bp大小的DNA产物，切下这些DNA片段，经纯化后，再以0.05微克的870bp及530bp的DNA片段为模板，以0.2微克SVDV5900(+)及SVDV7300(-)为引物对，10微升10×Extag缓冲液，8微升2.5mMdNTP，0.5μl Extag加水至100微升。PCR反应条件为94℃、1分钟，1个循环，94℃、30秒钟，56℃、30秒钟，72℃、1.5分钟等三个步骤为一个循环共反应30个循环，再72℃、3分钟。反应完成后以0.8％琼脂糖凝胶分析PCR产物，可在1.5kb位置清楚看到DNA片段，切下1.5kb DNA片段，纯化后用Nsi I及Cal I限制性内切酶于37℃反应90分钟，以0.8％琼脂糖凝胶分离DNA，切下约0.5kb大小的DNA片段，纯化后冷藏于4℃。也用NsiI及Cal I限制性内切酶于37℃酶切pCI(ΔEag I)/SVDV-T质粒，处理2小时后，以0.8％琼脂糖凝胶分离DNA，切下约11kb大小的DNA片段，纯化后与0.5kb DNA片段于16℃用T4DNA连接酶连接，反应16小时后转化DH5α菌株，抽取质粒，用Sph I限制性内切酶筛选只剩一个Sph I限制性内切酶位点的质粒，并经DNA测序确定而完成pCI(ΔEag I)/SVDV-T(ΔSph I)质粒的构建，其限制性内切酶图谱如图11。

引物序列如下：

SVDV5900(+)：GAA ATG TTT AGG GAG TAC AAT CACAGA CAC AGC

SVDV6760-Sph I(-)：AGC ATC CTG ATG GCA TAC CGC CCCTCACAA

SVDV6760-Sph I(+)：TTG TGA GGG GCG GTA TGC CATCAG GAT GCT

SVDV7300(-)：TTA AAA GGA GTC CAA CCA CTT CCT

(3)pCI(ΔEag I，ΔHind III/SVDV-T(ΔSph I)质粒构建

如图12所示构建pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)表达质粒。

构建pCI(ΔEag I，ΔHind III/SVDV-T(ΔSph I)质粒目的是为了删除载体上Hind III位点，以方便猪水泡病病毒变异株构建。将pCI(ΔEag I)/SVDV-T(ΔSph I)质粒用Hind III限制性内切酶切开，再用klenow酶补平质粒两端，纯化后用T4DNA连接酶将两端连接，连接混合液转化DH5α菌株，抽取质粒，再以Hind III限制性内切酶于37℃反应2小时，以0.8％琼脂糖凝胶分析，选取不被切的质粒，再以DNA测序确定Hind III位点已被删除，而完成pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)质粒的构建，其限制性内切酶图谱如图13。

(4)猪水泡病病毒变异株表达质粒pCI(ΔEag I，ΔHindIII)/SVDV-T(ΔSph I)/H21的构建

如图14所示构建猪水泡病病毒变异株表达质粒pCI(ΔEagI，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/H21。

构建pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/H21质粒目的是为了在猪水泡病病毒2710碱基位置引入一个Hind III限制性内切酶位点，此位置可与2660碱基的Sph I限制性内切酶位点，构成一个基因置换卡夹，方便以卡夹置换的方式来改变猪水疱病毒cDNA第2660到2710碱基间DNA序列而且经由此Hind III限制性内切酶位点的引进，也将衣壳蛋白(VP1)第87及88位氨基酸由DN变成ES，产生猪水泡病病毒突变株。首先以PCR方法制备猪水泡病病毒2660到3750碱基的DNA片段，其在2710碱基位置经由引物设计(SVDV2660/Hind III-2710)而加入Hind III限制性内切酶序列。反应混合液为0.1μg SVDV2660/Hind III-2710及SVDV3750(-)引物对，10微升10×Extaq缓冲液，8微升2.5mM dNTPs，0.5微升Extaq，加水至100微升。反应条件为94℃、1分钟，1个循环，94℃、30秒，54℃、1分钟，72℃，75秒等三个步骤为一个循环，共反应30个循环，最后以72℃作用2分30秒，而结束PCR反应。用0.8％琼脂糖凝胶分离PCR产物并切下1.1kb DNA片段，经纯化后用BssH II限制性内切酶于50℃反应2小时，经纯化后再以Sph I限制性内切酶于37℃反应16小时，置于4℃冷藏。将pCI(ΔEag I，ΔHindIII)/SVDV-T(ΔSph I)质粒同上述反应条件用BssH II及Sph I限制性内切酶切掉猪水泡病病毒第3370到2660碱基的DNA片段。用0.8％琼脂糖凝胶分离BssH II及Sph I限制性内切酶处理过的PCR产物及质粒，由前者切下0.71kb DNA片段，而由后者切下约10kb DNA片段，经纯化后用T4 DNA连接酶于16℃将两者连接。连接混合液转化DH5α菌株，抽取各个菌落的质粒，并用Hind III限制性内切酶选取被切成线形DNA分子的质粒，再经DNA测序确定在2710碱基位置有Hind III限制性内切酶序列，而完成pCI(ΔEag I，ΔHindIII)/SVDV-T(ΔSph I)/H21表达质粒的构建，其限制性内切酶图谱如图15。将此表达质粒依照实施例4的方法可产生具感染性的猪水泡病病毒H21变异株。

引物DNA序列：

SVDV2660/Hind III(+)：GTG CAC ATC TGC ATG CGT CTT

                      CTA CAC CAC ATA CAA GAA CCA

                      TGG CTC CGA TGG CGA AAG CTT

                      CGC

SVDV3750(-)：         TCC TTGCTC CAT GGC GTC GTC

                      CTC CAG CCA CAA

(5)猪水泡病病毒变异株表达质粒pCI(ΔEag I，ΔHindIII)/SVDV-T(ΔSph I)/SP7的构建

如图16所示构建猪水泡病病毒变异株表达质粒pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/SP7。

构建此质粒目的是为了置换猪水泡病病毒VP1蛋白第85到88位氨基酸序列由DGDN改变成TTNKDKS，此区域为VP1之抗原决定区，故可以由此制备VP1抗原决定区变异的猪水泡病病毒变异株。

其构建方法如下：以Sph I及Hind III限制性内切酶于37℃反应2小时时，切下pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/H21质粒的2660到2710bp的DNA片段，以0.8％琼脂糖凝胶分离DNA，切下约10kb大小的DNA片段，经纯化，冷藏于4℃。将5微克的SP7(+)及SP7(-)多核苷酸溶于100微升pH6.8，2.5mM Tris.HCl水溶液中，以95℃加热5分钟，置于室温，30分钟回冷，使SP7(+)及SP(-)多核苷酸互相链合，经纯化1微克链合产物加2微升10×PNK缓冲液，1微升多核苷酸磷酸酶(PND购自NEB)，1微升2.5mM ATP于37℃反应30分钟，经纯化后与10kb DNA片段用T4DNA连接酶于16℃反应，连接的混合液转化DH5α菌株，抽取各菌落的质粒，并用Hind III限制性内切酶处理，经0.8％琼脂糖凝胶分析，选取不会被Hind III限制性内切酶切开的质粒，并经DNA测序确定置换区域的DNA序列正确，而完成pCI(ΔEag I，ΔHindIII)/SVDV-T(ΔSph I)/SP7表达质粒的构建，其限制性内切酶图谱如图17。将此质粒依照实施例4的方法转染MVPK细胞可产生具感染性的SP7变异株猪水泡病病毒。

DNA序列：

SP7(+)：TGT CTT CTA CAC CAC ATA CAA GAA CCA TGGCTC CAC CAC AAA CAA GGA TAAG

SP(-)： AGC TCT TAT CCT TGT TTG TGG TGG AGC CATGGT TCT TGT ATG TGG TGT AGA AGA CAC ATG

(6)猪水泡病病毒变异株表达质粒pCI(ΔEag I，ΔHindIII)/SVDV-T(ΔSph I)/N3的构建

如图16所示构建pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/猪水泡病病毒N3变异株表达质粒。

构建此质粒目的是为了置换猪水泡病病毒VP1第85到88位氨基酸序列由DGDN改变成GAES。其构建方法如实施例5(5)，只是以N3(±)多核苷酸取代SP7(±)多核苷酸而质粒筛选方法则是选取被Hind III限制性内切酶酶切而Sph I限制性内切酶不切的质粒并经DNA测序确定置换的DNA片段序列正确，而完成pCI(ΔEagI，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/N3表达质粒的构建，其限制性内切酶图谱如图19。再依照实施例4的方法转染MVPK细胞而产生具感染性的猪水泡病病毒N3变异株。

DNA序列：

N3(+)：TGT CTT CTA CAC CAC ATA CAA GAA CCA TGACAA CGG CGC TGA A

N3(-)：AGC TTT CAG CGC CGT TGT CAT GGT TCT TGTATG TGG TGT AGA AGA CAC ATG

实施例6：猪水泡病病毒变异株基因置换区域的DNA测序

为了确定在变异株上，抗原决定基因位置所置换的核苷酸确实无误，我们利用DNA测序的方法来确认。取1微升的变异株病毒cDNA(反转录聚合酶反应方法如上述)，加上5微升10倍的PCR缓冲液，0.25mM脱氧核苷三磷酸，一对猪水泡病寡核苷酸引物：SVD3296(-)AGT GGT TTT CAT GGT TGT TAT ATC及SVD 2500(+)GGA AGA GCC ATT GCC CGC GTC GCT GAT ACC ATT各0.1微克加水至总体积为50微升，然后加上1U的Klea Tag(购自LATechnology)，瞬间离心后，再加上矿物油然后置于94℃1分钟后，反覆30次的94℃、30秒，54℃、30秒，72℃、1分钟，最后再以72℃作用3分钟，54℃、30秒，72℃、1分钟，最后再以72℃作用3分钟，即得706碱基的双链cDNA片段。所得的DNA片段，再经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，纯化后，即可用来测序(DNA测序试剂购自TOYOBO Co.LTD)。取11微升已经纯化的DNA片段，加3微升的反应溶液，1微升/0.2微克的猪水泡病寡核苷酸引物SVD 2600(+)：AGA CAC GTG AAG AAT TAC CAT，0.75微升dΔTth聚合酶，10μci[α-³⁵S]dATP加水至总体积为17微升，瞬间离心后，分别取4微升的反应混合液，置于事先标示好A.G.C.T的小离心管中，然后分别加入2微升的ddA，ddG，ddC，和ddT溶液，滴上矿物油后，置于加热块95℃，5分钟后，立即置于冰上冷却2分钟，然后置于95℃、30秒，72℃、2分钟，反覆30次后，加4微升的终止反应液以中止反应。此测序反应溶液经加热90℃2分钟后，可于6％的测序胶上进行电泳分析，经X光压片后即可判读核苷酸的序列，其核苷酸序列如图20。

实施例7.以反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)区分猪水泡病病毒变异株与野生株

为了区分猪水泡病病毒变异株与野生株，我们利用反转录聚合酶链反应的技术，配合猪水泡病病毒抗原决定区基因置换区域内的核苷酸引物，来建立一可与野生株区别的鉴别方法。首先我们用TRIZOL试剂(购自Gibco BRL)分别抽取野生株及变异株病毒的RNA，然后以反转录聚合酶链反应制备猪水泡病病毒的cDNA；使用5微升抽取的病毒RNA，加50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT，12.5mM脱氧核苷三磷酸，0.2微克猪水泡病病毒引物SVDV 3376(-)，14U核酸分解抑制剂，100μMMLV反转录酶，加水至总反应体积为50微升，于37℃反应75分钟后，置于80℃处理5分钟，使酶丧失活性后，即得第一链cDNA，然后取1微升10倍稀释的第一链cDNA，加上5微升10倍PC2缓冲液500mMTris-HCl pH9.1，35mM MgCl₂，12.5mM脱氧核苷三磷酸，一对猪水泡病病毒寡核苷酸引物：SVDV3376(-)，SVDV2692(+)各0.1微克为实验组，或SVDV3376(-)，SVDV3000(+)各0.1微克做为对照组，加水至50微升然后加上1U的Klen Taq(购自LATechnology)，瞬间离心，再加上矿物油，然后置于94℃、1分钟后，反覆30次的94℃、30秒，54℃，30秒，72℃、1分钟，最后再以72℃作用3分钟之聚合酶链反应，即得不同大小的双链cDNA片段，如图21，1kb DNA标记物，右边PCR产物是经由SVDV3376(-)及SVDV3000(+)引物对所制备，因变异株(第8，9，10样品)在引物位置之序列并没改变，所以与野生株(第6，7样品)一样都有376碱基DNA片段，而1kb DNA标记物左边PCR产物是经由SVDV3376(-)，SVDV2692(+)引物对所制备，因为变异株(第3、4、5样品)在SVDV2692(+)引物位置之DNA序列被改变，所以没有PCR产物，而野生株(第1、2样品)则有684碱基的DNA片段，所以经由适当引物对的设计经由反转录-聚合酶链反应可以区分变异株与野生株之猪水泡病病毒。

引物序列如下：

SVDV3376(-)：TCC GCG CGC GTT GCG AGA

SVDV3000(+)：ATT GGC ATA GGC AAC GCA TAC

AVDV2692(+)：TGG CTC TGA TGG CGA CAA

实施例 8.猪水泡病病毒不活化疫苗诱导小白鼠产生中和抗体的能力

(1)猪水泡病病毒免疫小白鼠

依照实施例1的方法培养及纯化野生株，N3、SP7、H21等变异株猪水泡病病毒，其病毒浓度为每0.75毫升有25微克或50微克蛋白质量，加入2.4mM BEI溶液，在37℃恒温箱中搅拌，不活化24小时后加入2.4mM Na₂S₂O₃中和BEI毒性。然后加入等量的弗氏佐剂，推挤成牙膏状。分别以10微克猪水疱病毒不活化疫苗皮下注射6周龄小白鼠(BALB/C，购自台湾大学动物实验中心)各3只。每隔3周免疫一次共免疫3次，每次免疫注射前及第3次免疫后两周都抽血，将血液静置沉淀及离心，取出血清。0.1M BEI配制方法如下：600毫升H₂O加4.32克NaOH搅拌至完全溶解再加入1.23克2-溴乙胺HBr，搅拌至完全溶解后以0.2微米孔径无菌滤膜过滤，即完成0.1M BEI的配制。

(2)血清中和抗体之测定

先在96孔的微量滴定盘上，加入含有50万个MVPK细胞的细胞液，静置于37℃，5％CO₂培养箱中培养2小时，使MVPK细胞附着于微量滴定盘上，然后将细胞培养液抽弃。取小白鼠血清50微升在微试管内先10倍稀释后再做2倍系列等量稀释，每个稀释阶段做4个槽，再加等量2.5病毒/50微升的SVD病毒液，在37℃，5％CO₂培养箱中作用60分钟，然后将病毒与血清混合液移注于细胞已附着好的微量滴定盘中，继续置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养48至72小时，直至病毒液的细胞出现CPE时，即可判读。第三次注射后两周所采血清之血清中和抗体的结果如表1所示，对照组三只小白鼠的血清皆测不到中和抗体的效价，而野生株及H21，N3，SP7等变异株病毒免疫小白鼠后的血清都有中和抗体，其中变异株的效价最低值者较野生株高，而最高值除H21与野生株相当外，N3及SP7都较野生株高。故本发明所揭示之变异株病毒免疫小白鼠后不但可产生中和抗体且其效价也较野生株好。

表1.猪水泡病病毒免疫小白鼠产生中和抗体能力

猪水泡病病毒株	效价
		对照组	0
0
	0
野生株			40
	80
		160
	160
		640
	H21株		160
320
		320
640
		640
N3株			640
	640
		1280
	2560
		2560
	SP7株		80
320
		640
640
		1280

Claims (21)

1、一种猪水泡病病毒台湾玉里株基因及其简并序列，其核酸序列如下：1    TTAAAACAGC CTGTGGGTTG TTCCCACCCA CAGGGCCCAC TGGGCGCTAG51   CACACTGGTA TCACGGTACC TTTGTGCGCC TGTTTGACTT ACCCTCCCCA101  AACGCAACTT AGAAGCACAA CTTAAATGGT CAATAGACGG CTCAGTATGC151  CAACTGAGTC TCGATCAAGC ACTTCTGTTA CCCCGGACTG AGTACCAATA201  GGCTGCTCAC CCGGCTGAAG GGGAAACCGT TCGTTACCCG ACTAACTACT251  TCGAGAAACC TAGTACCACC ATGAAAGTTG CGCACGTTTC GTTCCGCACA301  ACCCCAGTGT AGATCAGGCC GATGAGTCAC CCCAAACCCC ACGGGCGACC351  GTGGCGGTGG CTGCGCTGGC GGCCTGCCCA TGGGGCAACT CATGGGATGC401  TTCAATACTG ACATGGTGCG AAGAGTCTAT TGAGCTAGTT GGTAGTCCTC451  CGGCCCCTGA ATGCGGCTAA TCCTAACTGC GGAGCAGATA CCCACGCACC501  AGTGGGCAGT CTGTCGTAAT GGGCAACTCT GCAGCGGAAC CGACTACTTT551  GGGTGTCCGT GTTTCCTTTT GTTCTTATAC TGGCTACTTA TGGTGACAAT601  TGAGAGATTG TAACCATATT GCTATTGGAT TGGCCACCTG GCGACGAATA651  GAACAGTTGC TTACCTGTTT GTTGGTCTCG TATCACTGAA CTACAAAGCC701  TTAAACACCC TTTAATTTCA TCATAACGCT CAATACGTTA AAATGGGAGC751  TCAAGTGTCA ACACAAAAGA CCGGTGCTCA TGAGACCAGC TTGAGTGCAG801  CGGGCAACTC AGTCATTCAT TACACAAACA TAAACTACTA CAAGGATGCT851  GCTTCAAATT CAGCAAATAG ACAAGACTTC ACACAGGACC CGGGGAAGTT901  CACCGAACCT GTGAAAGACA TCATGGTCAA ATCATCGCCT GCTCTCAATT951  CCCCATCAGC AGAGGAGTGT GGCTACAGTG ACAGGGTAAG ATCCATCACC1001 TTAGGGAATT CGACCATAAC AACTCAAGAA TGTGCAAACG TGGTAGTTGG1051 ATATGGGGTG TGGCCAACTT ACTTGAAGGA TGAAGAGGCA ACAGCAGAGG1101 ATCAACCCAC TCAACCAGAT GTGGCCACGT GCAGGTTTTA CACGCTCGAA1151 TCCGTGATGT GGCAACAGAG TTCACCAGGC TGGTGGTGGA AGTTCCCTGA1201 CGCGTTGTCC AACATGGGGC TATTTGGGCA AAATATGCAG TACCACTACC1251 TTGGGAGAGC CGGATACACG ATACACGTGC AGTGCAACGC GTCCAAATTT1301 CACCAAGGGT GTCTGCTGGT GGTATGTGTG CCAGAAGCAG AGATGGGGTG1351 TGCCACGTTG GCCAATAAGC CTGACCCAAA AAGCCTGAGT AAAGGGGAAA1401 TAGCCAACAT GTTTGAATCC CAAAGCTCCA CCGGGGAAAC GGCCGTGCAA1451 GCTAATGTGA TCAATGCAGG CATGGGTGTT GGTGTTGGTA ATCTAACTAT1501 CTTCCCCCAC CAGTGGATCA ACTTGCGCAC TAACAACAGC GCTACGATTG1551 TCATGCCATA TATAAACAGC GTGCCCATGG ACAACATGTT CAGACACAAC1601 AATTTTACAC TCATGGTCAT CCCGTTCGCC CCACTGAGCT ACAGCACAGG1651 GGCTACCACG TACGTACCAA TCACTGTGAC AGTGGCGCCA ATGTGCGCTG1701 AATATAATGG GCTGCGTCTG GCCGGCAAGC AAGGTTTACC AACGCTGTCG1751 ACACCCGGGA GCAACCAGTT TCTCACGTCC GATGACTTCC AGTCACCATC1801 AGCCATGCCA CAATTCGATG TCACTCCTGA GATGGATATT CCAGGACAAG1851 TCAACAACTT GATGGAGATT GCAGAAGTAG ATTCTGTAGT GCCTGTAAAC1901 AACACAGAAG GGAAAGTGAT GTCAATTGAG GCATACCAGA TACCTGTGCA1951 ATCGAATCCA ACCAACGGTT CTCAGGTTTT TGGGTTCCCA TTGACCCCAG2001 GGGCCAATAG TGTGTTAAAC AGGACTTTGC TGGGAGAAAT CTTAAACTAC2051 TATGCCCATT GGTCAGGCAG CATCAAACTA ACATTTATGT TTGTCGGGTC2101 AGCGATGGCT ACAGGAAAAT TCTTACTGGC ATACTCACCA CCGGGAGCTG2151 GGGCACCGAC CACACGCAAG GAGGCGATGC TAGGTACTCA CGTGATCTGG2201 GATGTGGGTC TACAATCGAG CTGCGTATTG TGTATACCAT GGATTAGTCA2251 AACGCACTAC AGGTATGTAG TAATGGATGA ATACACCGCT GGTGGATACA2301 TAACTTGCTG GTATCAAACA AATATTGTGG TGCCTGCAGA TGCACAGAGT2351 GACTGTAAGA TCTTGTGTTT TGTGTCGGCA TGTAACGATT TCTCAGTTAG2401 GATGCTCAAG GACACACCCT TTATAAAACA GGATAATTTC TTCCAAGGGC2451 CCCCAGGAGA GGTGATGGAA AGAGCCGTTG CCCGCGTCGC TGATACCATT2501 GGGAGCGGAC CAGTTAACTC GGAATCCATT CCAGCTCTAA CCGCCGCAGA2551 GACAGGGCAC ACGTCACAAG TTGTACCATC AGACACAATG CAAACTAGGC2601 ACGTGAAGAA TTATCATTCA AGGTCAGAGT CGACAGTGGA GAACTTCCTG2651 TGCAGATCTG CATGCGTCTT CTACACCACA TACAAGAACC ATGGCTCTGA2701 TGGCGACAAC TTCGCCTACT GGGTAATCAA CACACGGCAA GTTGCTCAAC2751 TGCGTCGGAA GCTCGAAATG TTCACGTACG CAAGATTTGA TCTGGAGTTG2801 ACCTTCGTGA TCACTAGCAC TCAGGAACAA CCCACCGTTA AAGGTCAAGA2851 TACACCAGTG CTCACCCACC AAATAATGTA TGTACCTCCA GGTGGTCCAG2901 TACCCACAAA GGTAAACAGC TACAGCTGGC AAACGTCCAC CAACCCAAGT2951 GTGTTCTGGA CGGAAGGGAG CGCACCGCCT CGAATGTCGA TACTATTCAT3001 TGGCATAGGC AACGCATACA GCATGTTCTA TGACGGGTGG GCCAGGTTTG3051 ACAAGCAAGG GACATACGGC GTCCAAGCAC TAAACAACAT GGGGACACTA3101 TATATGAGAC ATGTGAATGA TGGGGGTCCC GGTCCCATTG TGAGCACAGT3151 ACGAATTTAC TTCAAGCCAA AGCACGTCAA AACGTGGGTC CCAAGACCGC3201 CCAGACTATG TCAATACCAA AAGGCTGGCA ACGTGAATTT TGAACCCACT3251 GGTGTGACTG AGGGTAGGAC AGATATAACA ACCATGAAAA CCACTGGCGC3301 CTTCGGGCAG CAGTCTGGTG CCGTGTACGT TGGCAACTAT AGAGTGGTGA3351 ATAGACATCT CGCAACGCGC GCGGACTGGC AAAACTGTGT GTGGGAAGAC3401 TACAACAGAG ACCTTCTAGT GAGCACCACC ACTGCACATG GCTGCGACAC3451 CATTGCCAGG TGCGATTGCA CAGCAGGAGT GTACTTCTGC GCCTCCAGAA3501 ACAAGCACTA TCCAGTCACA TTTGAGGGGC CCGGTCTTGT GAAGGTTCAA3551 GAGAGTGAGT ATTACCCGAA AAAGTACCAA TCCCATGTAC TGCTCGCAGC3601 TGGATTTGCA GAGCCGGGTG ATTGTGGAGG GATTCTCAGA TGCCAACATG3651 GGGTGATTGG CATAGTTACC GTGGGGGGGG AAGGTGTTGT TGGTTTTGCC3701 GATGTAAGAG ACTTGTTGTG GCTGGAGGAC GATGCCATGG AGCAAGGAGT3751 TAGGGATTAT GTGGAACAAC TCGGCAACTG CTTCGGCTCA GGATTCACCA3801 ATCAAATTTG CGAACAGGTT ACCCTTCTAA AAGAGTCGTT AATTGGACAG3851 GATTCTATCC TTGAGAAGTC TCTCAAGGCC CTCGTCAAGA TAGTATCAGC3901 ACTCGTGATC GTGGTGAGAA ATCACGATGA CCTCATTACG GTCACCGCCA3951 CACTGGCGTT AATAGGATGT ACCACCTCAC CATGGCGCTG GCTCAAGCAG4001 AAAGTGTCTC AGTACTATGG CATCCCCATG GCTGAAAGGC AAAATAGTGG4051 CTGGTTAAAG AAGTTCACAG AGATGACCAA TGCCTGTAAG GGCATGGAGT4101 GGATAGCCAT CAAGATCCAA AAATTCATAG AGTGGTTGAA GGTTAAGATC4151 CTGCCAGAAG TCAAGGAAAA GCATGAGTTC CTCAACAGGC TTAAACAACT4201 ACCACTCTTG GAAAGTCAAA TAGCAACTAT TGAGCAGAGT GCACCATCTC4251 AAAGTGACCA GGAGCAACTA TTCTCTAATG TACAGTACTT TGCCCACTAC4301 TGTCGGAAGT ATGCACCATT GTACGCCGCT GAAGCAAAGA GAGTGTTCTC4351 ACTTGAAAAG AAGATGAGCA ATTACATACA GTTCAAGTCC AAATGCCGTA4411 TTGAACCCGT CTGTCTCTTG CTCCATGGCA GCCCAGGCGC TGGGAAGTCT4451 GTGGCAACGA ACTTGATTGG GCGCTCGCTC GCTGAGAAAC TCAACAGCTC4501 GGTGTACTCA CTACCACCAG ATCCAGACCA TTTCGATGGT TACAAACAGC4551 AAGCTGTTGT CATCATGGAC GACTTGTGCC AGAACCCGGA CGGTAAAGAT4601 GTGTCCTTGT TCTGTCAGAT GGTCTCCAGC GTTGACTTCG TGCCTCCCAT4651 GGCGGCGCTT GAGGAAAAAG GCATTCTATT CACCTCGCCG TTCGTTCTCG4701 CGTCCACCAA TGCAGGGTCA GTTAACGCCC CCACGGTCTC CGACAGTAGA4751 GCACTCGTAA GAAGGTTCCA TTTTGACATG AACATCGAGG TTATTTCCAT4801 GTATAGCCAG AACGGTAAGA TCAACATGCC TATGGCAGTT AAAACATGTG4851 ATGAGGAGTG TTGCCCGGTC AACTTCAAAA AGTGCTGCCC ACTAGTGTGT4901 GGCAAAGCTA TACAATTCAT AGACAGGAGG ACCCAAGTTA GGTATTCATT4951 GGACATGCTG GTTACCGAAA TGTTTAGGGA GTACAATCAC ACACACAGTC5001 TGGGGGCCAC CCTCGAGGCA TTGTTCCAAG GACCACCAGT TTATAGAGAG5051 ATCAAAATCA GTGTTGCCCC AGAAACTCCT CCACCACCAG CAGTTGCCGA3101 CTTACTAAAA TCAGTAGACA GTGAGGCTGT GAGGGAGTAC TGCAAGGAGA5151 AAGGGTGGCT TATACCAGAG GTCGATTCCA CCCTACAGAT AGAAAAGCAT5201 GTGAGCAGAG CGTTCATATG TTTGCAAGCT CTAACCACAT TTGTCTCGGT5251 TGCAGGCATA ATATACATCA TCTACAAATT GTTTGCAGGT TTCCAAGGCG5301 CATACACAGG GATGCCTAAT CAGAAGCCCA AGGTGCCCAC CCTGAGACAA5351 GCCAAAGTGC AGGGTCCAGC GTTTGAGTTC GCCGTGGCGA TGATGAAAAG5401 AAACGCCAGT ACAGTGAAAA CTGAGTATGG TGAATTCACC ATGCTTGGGA5451 TTTACGACAG GTGGGCGGTG TTGCCACGCC ATGCCAAACC TGGCCCCACC5501 ATCTTGATGA ACGACCAGGT AGTCGGAGTG TTGGACGCCA AGGAACTAGT5551 TGATAAAGAT GGGACCAACC TGGAATTGAC TCTCTTGAAG CTCAACCGCA5601 ACGAGAAGTT TAGAGACATC AGGGGATTCT TAGCACGAGA GGAGGTCGAA5651 GTGAACGAAG CTGTCCTAGC AATAAACACA AGTAAATTCC CGAATATGTA5701 CATACCCGTG GGCCGGGTAA CCGACTATGG GTTCTTAAAT CTGGGTGGAA5751 CCCCCACGAA GAGAATGCTC ATGTACAATT TCCCAACTAG GGCAGGCCAG5801 TGTGGGGGTG TCCTTATGTC AACAGGGAAA GTCCTGGGAA TACATGTAGG5851 AGGGAATGGA CACCAAGGGT TTTCAGCGGC ACTCCTCAGA CACTACTTCA5901 ATGAGGAGCA GGGTGAGATA GAATTCATTG AGAGCTCAAA GGACGCAGGA5951 TTTCCCGTGA TCAACACTCC CAGCCAAGAC AAATTGGAAC CAAGTGTGTT6001 TCACCACGTG TTCGAGGGCA ACAAGGAACC AGCGGTTCTC AGAAATGGGG6051 AGCCACGACT CAAGGCCAAC TTTGAGGAGG CAATCTTCTC CAAGTACATT6101 GGCAATGTTA ACACACATGT AGACGAGTAC ATGATGGAGG CTGTAGATCA6151 TTATGCAGGA CAACTAGCCA CACTGGACAT CAGCACGGAA CCCATGAAGC6201 TAGAAGATGC CGTGTATGGC ACTGAGGGGC TCGAAGCACT AGACCTGACC6251 ACCAGTGCAG GTTACCCTTA TGTGGCCCTG GGTATCAAGA AAAGAGACAT6301 CCTATCCAAG AAGACCAGAG ACCTTACCAA GCTAAAGGAA TGCATGGACA6351 AATATGGTCT AAACTTGCCA ATGGTAACCT ATGTCAAGGA CGAGTTGAGA6401 TCTGCCGACA AAGTGGCCAA GGGAAAATCC AGGCTCATCG AGGCTTCTAG6451 CCTCAACGAC TCAGTAGCAA TGAGGCAGAC ATTTGGAAAC CTATATAAGA6501 CTTTCCACCT CAACCCGGGC ATCGTTACGG GTAGCGCCGT TGGGTGTGAC6551 CCAGATGTCT TTTGGAGCAA GATCCCCGTT ATGCTCGATG GACATGTCAT6601 AGCGTTTGAC TATTCAGGCT ATGACGCCAG CCTCAGCCCA GTGTGGTTTA6651 CGTGCTTGAA ACTCCTCCTG GAGAAGCTAG GGTACACAAA CAAGGAAACG6701 AACTACATAG ACTACCTCTG TAATTCCCAC CACCTGTACA GGGACAAACA6751 CTACTTTGTG AGGGGCGGCA TGCCATCAGG ATGCTCAGGC ACTAGCATAT6801 TTAATTCCAT GATTAACAAC ATCATAATCA GAACCCTCAT GCTGAAGGTT6851 TATAAAGGCA TTGATTTGGA CCAATTCAGA ATGATTGCAT ATGGGGATGA6901 TGTGATAGCT TCATACCCGT GGCCCATCGA TGCCTCACTG CTAGCTGAAG6951 CAGGGAAGGA TTGTGGCTTG ATCATGACCC CAGCAGATAA AGGCGAGTGT7001 TTCAATGAGG TAACCTGGAC AAACATGACC TTCCTGAAAA GGTACTTCAG7051 GGCAGATGAA CAGTACCCAT TTTTGGTCCA TCCTGTCATG CCAATGAAGG7101 ATATACACGA ATCCATTAGG TGGACTAAAG ATCCTAAGAA CACACAGGAT7151 CACGTGCGCT CGCTGTGTTT ATTGGCTTGG CACAACGGGG AGCACGAATA7201 TGAGGAGTTT ATTCGTAAGA TCAGAAGCGT GCCCGTAGGG CGCTGCTTGT7251 CCCTCCCTGC GTTTTCAACG CTGCGCAGGA AGTGGTTGGA CTCCTTTTAA7301 AATTAGAGCA CAATTAGTCA ATCATAATTG GCTCAACCCT ACCGCATGAA7351 CCGAACTTGA TAAAAGTGCG GTAGGGGTAA ATTCTCCGTA TTCGGTGCGG

及其功能性片段或简并序列。

2、一种猪水泡病病毒H21变异株基因，其核酸序列如权利要求1的序列但2705至2710碱基位置被GAAAGC所取代，及其功能性片段或简并序列。

3、一种猪水泡病病毒N3变异株基因，其核酸序列如权利要求1的序列但2693至2710碱基位置被GACAACGGCGCTGAAAGC所取代，及其功能性片段或简并序列。

4、一种猪水泡病病毒变异株SP7基因，其核酸序列如权利要求1的序列但2705至2710碱基位置被下列序列GGCTCCACCACAAACAAGGATAAGAGC所取代，及其功能性片段或简并序列。

5.一种猪水泡病病毒变异株N3，其含有的核酸序列如权利要求1的序列但2693至2710碱基位置被GACAACGGCGCTGAAAGC所取代。

6、一种猪水泡病病毒变异株H21，其含有的核酸序列如权利要求1的序列但2705至2710碱基位置被GAAAGC所取代。

7、一种猪水泡病病毒变异株SP7，其含有的核酸序列如权利要求1的序列但2705至2710碱基位置被下列序列GGCTCCACCACAAACAAGGATAAGAGC所取代。

8、一种猪水泡病病毒之表达质粒，其含有猪水泡病病毒或其变异株之全长cDNA。

9、根据权利要求8所述的表达质粒，其中猪水泡病病毒是指猪水泡病病毒台湾玉里株。

10、根据权利要求8所述的表达质粒，其中变异株是指在猪水泡病病毒衣壳蛋白1、2或3区域产生突变的变异株。

11、根据权利要求8所述的表达质粒，其中变异株是指在猪水泡病病毒衣壳蛋白1区域产生突变的变异株。

12、根据权利要求8所述的表达质粒，其是指在第84到88位氨基酸区域产生突变。

13、根据权利要求8所述的表达质粒，其中猪水泡病病毒表达质粒系指pCI/SVDV-T表达质粒，保藏号为CCTCCM98013。

14、根据权利要求8所述的表达质粒，其中之变异株选自表达质粒pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSPh I)/H21，保藏号为CCTCC M 98011、pCI(ΔEag I，ΔHind III)/SVDV-T(ΔSph I)/SP7，保藏号为CCTCCM98012或pCI(ΔEag I，ΔHindIII)/SVDV-T(ΔSph I)/N3，保藏号为CCTCC M 98010。

15、一种制备猪水泡病病毒变异株的方法，其包括下列步骤

(1)构建含猪水泡病病毒全长cDNA的表现载体，

(2)在猪水泡病病毒表现载体上改变其cDNA序列来构建猪水泡病病毒变异株表现载体，及

(3)将猪水泡病病毒变异株表现载体转染适当宿主细胞而产生具感染性的猪水泡病病毒变异株。

16、一种用于防治猪水泡病的疫苗组合物，其含有权利要求5、6或7所述的变异株猪水泡病病毒及疫苗用佐剂。

17、一种以聚合酶链反应区分野生株与N3、H21、SP7变异株猪水泡病病毒的方法，其特征在于聚合酶链反应中所用的DNA引物位于猪水泡病病毒cDNA第2692到2709碱基位置而另一引物位于第3358到3375碱基位置。

18、一种以聚合酶链反应区分克沙奇病毒及口蹄疫病毒的方法，其特征在于聚合酶链反应中所用的DNA引物位于猪水泡病病毒cDNA第2692到2709碱基位置而另一引物位于第3358到3375碱基位置。

19、一种用以防治及扑灭猪水泡病的方法，其包括下列步骤：

(1)以猪水泡病病毒变异株的疫苗免疫猪，

(2)以聚合酶链反应或酶联免疫反应侦测被野生株病毒感染的猪，及

(3)扑杀感染野生株病毒的猪。

20、根据权利要求19所述的方法，其中步骤(1)的变异株猪水泡病病毒选自猪水泡病病毒变异株N3、H21或SP7。

21、根据权利要求19所述的方法，其中步骤(2)的聚合酶链反应是根据权利要求17的方法。

Images