MD4480C1 - Virus ARN oncolitic stabil genetic, metodă de producere şi de utilizare a acestuia - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la enterovirusul modificat ECHO tip 7, care poate fi utilizat pentru tratamentul unor tumori maligne.Esenţa invenţiei constă în producerea enterovirusului modificat ECHO tip 7 prin modificarea virusului nativ ECHO 7 izolat printr-o metodă cunoscută din fecale umane şi identificat în baza secvenţei genomului, unde modificarea se realizează iniţial prin adaptarea virusului în celulele canceroase atenuate cu preparatul antitumoral dacarbazină, apoi virusul modificat este trecut în cultură de fibroblaşti embrionari umani cu reproducerea ulterioară în celule de melanom uman şi pasajul ulterior în cultură de fibroblaşti embrionari umani tratată cu ribavirină, izolarea şi purificarea printr-o metodă cunoscută.Secvenţe: 55

Description

Prezenta invenţie se referă la elaborarea unui nou preparat medicamentos anticanceros, produs printr-o metodă biotehnologică, şi anume la un virus ARN oncolitic stabil genetic, la o metodă de producere şi de utilizare a acestuia.

Abilitatea virusurilor de a distruge celulele canceroase este cunoscută de mai bine de un secol, iar în terapia cancerului experimental s-au produs numeroase rezultate pozitive de perspectivă cu diverse virusuri, cu toate acestea utilizarea lor în practica clinică este îngreuiată de dificultatea de a prevedea interacţiunea dintre tumoare şi gazda acesteia, precum şi dintre virus şi răspunsul sistemului imunitar uman la anticorpii împotriva virusului (Kelly E., Russell S.J. History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering. Mol. Ther., 2007, nr.15, p. 651-659).

Deşi investigaţiile clinice privind utilizarea virusurilor în terapia cancerului au început în urmă cu mai mult de 50 de ani, în prezent doar două virusuri sunt aprobate pentru utilizare clinică în tratamentul cancerului. Ele reprezintă adenovirusul cu gena E1B 55K eliminată [1] şi enterovirusul nemodificat pasivizat din familia Picornaviridae de tip Echo [2] în calitate de imunostimulatoare antitumorale.

Astfel, elaborarea unor nouă virusuri oncolitice eficiente este încă o problemă de actualitate (Han Hsi Wong, Nicholas R. Lemoine, Yaohe Wang. Viruses, 2010, nr. 2, p. 78-106)

În scopul de a spori potenţialul virusului în ceea ce priveşte selectivitatea infectării celulelor canceroase şi intensificarea activităţii oncolitice, a fost dezvăluit un număr de virusuri modificate. Ele sunt caracterizate prin deleţia unor gene concrete, astfel prevenind propagarea lor în celulele normale, sau prin integrarea unor gene suplimentare pentru îmbunătăţirea proprietăţilor oncolitice.

Cu toate acestea, cunoştinţele limitate în ceea ce priveşte modificările genetice care asigură selectivitatea şi eficienţa împotriva celulelor tumorale, conduce la aceea că virusurile modificate posedă o activitate citolitică mai redusă, comparativ cu virusul nativ, sau un răspuns antiviral mai puternic al sistemului imunitar uman (Han Hsi Wong, Nicholas R. Lemoine, Yaohe Wang. Viruses, 2010, nr. 2, p. 78-106), (Meerani S., Yang Yao. Oncolytic viruses in cancer therapy. European Journal of Scientific Research, vol. 40, no.1, 2010, p.156-171).

Deşi virusurile sunt instrumente uzuale pentru transportul vectorilor în celule, utilizarea lor este limitată de imunogenitatea înaltă a virusurilor (Peng Z. Current status of gendicine in China: recombinant human Ad-p53 agent for treatment of cancers. Hum. Gene. Ther., 2005, no. 16, p. 1016-1027).

Una dintre proprietăţile adverse cele mai grave ale virusurilor nemodificate de tip ECHO, inclusiv ECHO 7, este capacitatea lor de a provoca infecţii, care pot avea un rezultat fatal (Wreghitt T.G., Gandy G.M., King A., Sutehall G. Fatal neonatal ECHO 7 virus infection, The Lancet, vol. 324, 1984, p. 465). Aceste virusuri sunt cunoscute a fi responsabile pentru bolile mâinilor, picioarelor şi cavităţii bucale în Malaezia (Hand, foot and mouth disease in Malaysia. 25 October 2000, http://www.vadscorner.com/echovirus7.html), pentru miocardită la copiii cu leucemie (Midula M., Marzetti G., Borra G., Sabatino G. Myocarditis associated with ECHO 7 type infection in leukemic child. Acta Paediatrica, Vol. 65, Issue 4, 1976, p. 649-651), meningită aseptică, boli paralitice şi febră (http://viroloqv-online.com/viruses/Enteroviruses8.htm). De aceea patogenitatea este una dintre cele mai importante limitări, care urmează a fi depăşită în utilizarea virusurilor de tip ECHO 7 în tratarea pacienţilor cu cancer.

Astfel, problema pe care o rezolvă prezenta invenţie este elaborarea unui virus oncolitic selectiv, foarte eficient, fără patogenitate în celulele normale şi cu un răspuns imunologic redus, având o stabilitate genetică înaltă. Este bine ştiut şi cunoscut că virusurile ARN pot evolua foarte uşor la trecerea în culturi de celule, ceea ce poate modifica fenotipul, conducând la creşterea patogenităţii. Astfel, pentru obţinerea unui medicament pe bază de virus oncolitic, folosind o tulpină de virus nepatogen ECHO 7 de tip sălbatic în calitate de materie primă, este extrem de important să se găsească o procedură care ar permite să genereze o modificare oncolitică a acestui virus, care ar păstra caracterul nepatogen al virusului nativ şi i-ar asigura o stabilitate genetică.

Această problemă a fost rezolvată în mod surprinzător printr-o modificare direcţionată a virusului cu ARN monofilar prin elaborarea unei metode, în care s-a utilizat potenţialul înalt de mutaţie al virusului cu ARN monofilar în combinaţie cu o selecţie direcţionată a mutanţilor, care asigură separarea rapidă din ansamblu a tipurilor mutante cu activitate oncolitică înaltă şi selectivă. Multe celule canceroase sunt rezistente la virus (virusul nu poate intra în celulă şi supravieţui acolo). Printr-o selectare atentă a unor linii celulare, în care virusul este modificat, şi o pretratare adecvată a celulelor canceroase, este posibilă crearea unui virus nepatogen stabil genetic pentru tratamentul cancerului. Virusul, conform prezentei invenţii, este în esenţă prima dezvăluire a unui virus oncolitic stabil genetic pe bază de virus de tip ECHO-7, totodată, virusul stabil genetic menţionat asigură aplicabilitate pentru o producere pe termen lung (o reproducere multiplă) în calitate de medicament.

A fost elaborată o modificare a virusului ECHO 7 nativ, identificat prin secvenţa genomului Seq No 2, metoda cuprinzând iniţial efectuarea adaptării virusului în celulele canceroase, atenuate cu un agent anticanceros, cum ar fi dacarbazina, pasajul virusului modificat în cultură de fibroblaste embrionare umane, reproducerea în celulele melanomului uman şi pasajul în cultură de fibroblaste embrionare umane, opţional tratate cu ribavirină, izolarea virusului şi purificarea virusului. Virusul poate fi izolat şi purificat prin metode cunoscute. Utilizarea unui agent anticanceros, cum ar fi dacarbazina în concentraţii subtoxice pentru modificarea celulelor canceroase şi utilizarea acestor celule canceroase tratate în calitate de celule gazdă pentru replicarea virusului a condus la crearea unui virus mutant cu genom stabil, potrivit pentru aplicare în calitate de medicament foarte eficient pentru tratarea cancerului.

În procesul realizării adaptării virusului pot fi utilizate mai mult de un tip de linii celulare.

Invenţia se explică prin desenele din fig. 1- 2, care reprezintă:

- fig. 1, o comparaţie a genomurilor (Seq ID No 1) virusului şi virusului nemodificat (nativ) (Seq ID No 2) şi

- fig. 2, o comparaţie a secvenţelor de aminoacizi ale virusului modificat (Seq ID No 4) şi ale virusului nemodificat (nativ) (Seq ID No 5).

LISTA SECVENŢELOR forma desfăşurată

Seq ID No 1: Virus modificat;

SEQ ID No 2: Virus nemodificat (nativ);

Seq ID No 3: Virus modificat după reproducere timp de 12 luni;

Seq ID No 4: Secvenţa de aminoacizi a virusului modificat;

Seq ID No 5: Secvenţa de aminoacizi a virusului nemodificat;

Seq ID No 6: Primer Eo7-1 F; SEQ ID No 7: Primer Eo7-1 R;

SEQ ID No 8: Primer Eo7-2F; SEQ ID No 9: Primer Eo7-2R;

SEQ ID No 10: Primer Eo7-3F; Seq ID No 11: Primer Eo7-3R;

SEQ ID No 12: Primer Eo7-4F; SEQ ID No 13: Primer Eo7-4R;

SEQ ID No 14: Primer Eo7-5F; SEQ ID No 15: Primer Eo7-5R;

SEQ ID No 16: Primer Eo7-6F; SEQ ID No 17: Primer Eo7-6R;

SEQ ID No 18: Primer Eo7-7F; SEQ ID No 19: Primer Eo7-7R;

SEQ ID NO 20: Primer Eo7-8F; SEQ ID NO 21: Primer Eo7-8R;

SEQ ID NO 22: Primer Eo7-9F; SEQ ID No 23: Primer Eo7-10F;

SEQ ID NO 24: Primer Eo7-9R; SEQ ID No 25: Primer Eo7-11F;

SEQ ID NO 26: Primer Eo7-11R; SEQ ID No 27: Primer Eo7-12F;

SEQ ID NO 28: Primer Eo7-12R; SEQ ID No 29: Primer Eo7-13F;

SEQ ID No 30: Primer Eo7-13R; SEQ ID NO 31: Primer Eo7-14F;

SEQ ID NO 32: Primer Eo7-14R; SEQ ID NO 33: Primer Eo7-15F;

SEQ ID No 34: Primer Eo7- 15R; SEQ ID No 35: Primer Eo7-16F;

SEQ ID No 36: Primer Eo7- 17F; SEQ ID NO 37: Primer Eo7-16R;

SEQ ID No 38: Primer Eo7- 18F; SEQ ID NO 39: Primer Eo7-18R;

SEQ ID No 40: Primer Eo7- 19F; SEQ ID No 41: Primer Eo7-19R;

SEQ ID No 42: Primer Eo7- 20F; SEQ ID No 43: Primer Eo7-20R;

SEQ ID No 44: Primer Eo7- 21F; SEQ ID NO 45: Primer Eo7-21R;

SEQ ID No 46: Primer Eo7- 22F; SEQ ID No 47: Primer Eo7-22R;

SEQ ID No 48: Primer Eo7- 23F; SEQ ID NO 49: Primer Eo7-23R;

SEQ ID No 50: Primer Eo7- 24F; SEQ ID NO 51: Primer Eo7-24R;

SEQ ID No 52: Primer Eo7- 25F; SEQ ID NO 53: Primer Eo7-25R;

SEQ ID No 54: Primer Eo7- 26F; SEQ ID NO 55: Primer Eo7-26R.

A fost descoperit în mod neaşteptat utilitatea pentru acest scop a unui enterovirus cunoscut din familia Picornaviridae de tip Echo 7, izolat din intestinul uman. S-a constatat că secvenţa nucleotidică iniţială, determinată printr-o metodă standard, este similară cu cea a Picornaviridae enterovirus de tip Wallace.

Verificarea activităţii oncolitice a enterovirusurilor native izolate în ţesut de angiosarcom a demonstrat că nici virusurile aparte şi nici combinaţiile acestora în doză de 3x105 TCID50/0,03 ml nu posedă activitate oncolitică substanţială, cu excepţia tipului ECHO 7, care a demonstrat o activitate mai promiţătoare (tab. 1).

Tabelul 1

Influenţa virusurilor asupra culturii tisulare de angiosarcom

Virusul Numărul de animale Numărul de tumori cu regresie în a 4-a zi după infectare Virusul izolat (care a supravieţuit) Titrul virusului în ziua a 4-a, TCD50/0,1 ml ECHO 4 6 0 ECHO 4 106-107 ECHO 7 6 0 ECHO 7 105-106 Coxsackie B-5 6 0 Coxsackie B-5 107-108 ECHO 4 + ECHO 7 6 2 ECHO 7 109 ECHO 4 + Coxsackie B-5 6 1 ECHO 4, Coxsackie B-5 103 108 ECHO 7 + Coxsackie B-5 6 0 ECHO 7 104 Control 6 0 108

Instabilitatea genomului virusurilor cu ARN monofilar este un fapt bine cunoscut, de aceea, astfel de virusuri, de regulă, nu sunt selectate pentru construirea agenţilor virali oncolitici.

Modificarea virusului nativ izolat a fost realizată în mai multe etape consecutive.

În prima etapă s-a folosit potenţialul înalt de mutaţie al virusurilor ARN (în medie o mutaţie la fiecare act de replicare) pentru a elabora un mutant citopatic prin replicarea virusului în monostrat de cultură tripsinizată de fibroblaste embrionare umane în prezenţa serului de viţel.

Celulele au fost incubate timp de 10 zile, pasajul se realiza de fiecare dată la degenerarea celulelor din cultură până la 50%.

La testarea virusului selectat în culturi de celule RD, un efect citopatic pronunţat a fost observat deja peste 24 ore după infectare. Titrul virusului elaborat, determinat prin metoda de diluţii finale, a constituit TCID50 = 1x10-8.

Această tulpină a fost reprodusă, izolată şi depozitată la -70°C pentru utilizare ulterioară în producerea unei tulpini oncolitice selective şi stabile genetic.

Virusul astfel obţinut a fost modificat, utilizând o metodă special elaborată, care cuprinde trei etape.

Prima etapă de modificare în prima linie de celule canceroase.

În prima etapă de modificare virusul a fost reprodus în linii celulare tumorale, atenuate cu un agent anticanceros. În această etapă a fost utilizată o linie celulară de adenocarcinom mamar uman (MCF-7).

Un monostrat de aceste celule s-a tratat cu dacarbazină DTIC în doză subtoxică (20 µM). După tratarea cu dacarbazină, celulele au fost transferate pe mediu de cultură proaspăt şi puse în contact cu virusul, reproducerea fiind continuată fără a adăuga ser. Peste 24 ore de contact cu virusul, din mediu au fost îndepărtate celulele şi a fost izolat virusul.

Virusul a fost reprodus în mod repetat (pasaj) în cultură celulară de fibroblaste embrionare umane şi utilizat din nou pentru infectarea liniei celulare MCF-7. Această procedură se repetă de 10 ori. Astfel, această etapă de modificare cuprinde reproducerea alternativă a virusului în celule de adenocarcinom mamar uman şi fibroblaste embrionare umane.

A doua etapă de modificare într-o a doua linie de celule tumorale.

În etapa următoare de modificare, virusul, conform descrierii de mai sus, a fost pus în contact cu cultură celulară de adenocarcinom gastric. Un monostrat de aceste celule s-a tratat cu dacarbazină DTIC în doză subtoxică (20 µM).

Monostratul de aceste celule a fost infectat cu virusul, izolat după modificarea în prima etapă, şi s-a continuat reproducerea într-un mediu de cultură fără ser.

Peste 24 ore de contact cu virusul, din mediu au fost îndepărtate celulele şi a fost izolat virusul. Virusul a fost reprodus în mod repetat (pasaj) în cultură celulară de fibroblaste embrionare umane şi utilizat din nou pentru infectarea liniei celulare de adenocarcinom gastric. Această procedură se repetă de 10 ori. Astfel, această a doua etapă de modificare cuprinde reproducerea alternativă a virusului în celule de adenocarcinom gastric şi fibroblaste embrionare umane.

În prima etapă de modificare şi în a doua etapă de modificare procedura de reproducere totdeauna se finaliza cu ultima reproducere în cultură de fibroblaste embrionare umane.

A treia etapă de modificare în celule de melanom uman.

Virusul, produs în a doua etapă, a fost utilizat pentru infectarea tumorilor umane, obţinute după extirpare chirurgicală.

Ţesuturile canceroase de melanom au fost prelevate în cadrul operaţiilor de la 23 de pacienţi care au administrat anterior chimioterapie.

Ţesuturile au fost infectate cu virusul modificat şi incubate la 37°C în absenţa dioxidului de carbon. Înainte de folosire pentru infectarea unui nou material tisular (ţesut proaspăt de melanom de la un alt pacient), virusul modificat a fost reprodus în mod repetat în cultură de fibroblaste embrionare umane până la o concentraţie de 7 Ig TCID50/1 ml.

Virusul modificat a fost reprodus în culturi celulare de fibroblaste embrionare umane, tratate cu 5 mM ribavirină timp de 7 ore înainte de infectare şi cultivate timp de 24 de ore. Virusul a fost izolat din cultură, procedura de reproducere a virusului în cultură de fibroblaste a fost repetată de 10 ori.

În cele din urmă virusul a fost izolat, purificat şi reprodus în cultură de fibroblaste embrionare umane fără adaos de ribavirină.

Virusul reprodus s-a utilizat pentru determinarea secvenţei. Genomul virusului modificat diferă de cel al virusului nativ nemodificat congelat (tip Echo 7, tulpina Wallace din baza de date NCBI) aproximativ cu 10%, o parte din proteina membranei externe a virusului - aproximativ cu 12%.

S-a constatat că virusul modificat prin metoda descrisă s-a dovedit a fi surprinzător de stabil. Genomul lui a fost modificat doar cu 0,7% după pasajul continuu timp de 12 luni (reproducere timp de 12 luni în cultură de celule embrionare pulmonare umane MRC 5). Deosebit de important este faptul că virusul modificat (în continuare VM) se caracterizează prin efect citopatic deosebit de înalt pe celulele maligne, citotoxicitate redusă pe linii celulare normale, precum şi prin absenţa toxicităţii la şoareci in vivo.

În experimente cu linii celulare s-a constatat că VM s-a dovedit a fi citotoxic pentru linii celulare de melanom FM9, FM55, FM94 şi SK-Mel26, celule de carcinom gastric, celule de carcinom cu celule scuamoase al cavităţii bucale SCC25, linia de celule umane epiteliale derivate dintr-un carcinom pulmonar (A549), celule de leucemie monocitară acută THP-1, celule de rabdomiosarcom RD, celule de adenocarcinom pancreatic uman HPAF-II, celule de adenocarcinom mamar uman (MCF-7), precum şi pentru culturi celulare primare de adenocarcinom gastric GC1 şi linia celulară de cancer tiroidian HA007.

În experimente pe animale VM provoca regresia sarcomului murin M-1, fibrosarcomului murin MX-17, precum şi a tumorilor transplantabile - sarcomului Moloney (SM) şi sarcomului KRS-321.

Într-un studiu clinic experimental la un grup din 46 de pacienţi cu melanom stadiul I, la 43 pacienţi care administrau tratament cu VM timp de 50 de luni nu s-a înregistrat progresarea melanomului. În grupul de control, melanomul a progresat la 10 din 31 de pacienţi, care au administrat terapie standard.

Peste 50 de luni examenul realizat la 44 de pacienţi cu melanom stadiul II a relevat că progresul melanomului a fost stopat la 38 de pacienţi, comparativ cu grupul de control din 36 de pacienţi, care au administrat terapie standard, totodată melanomul nu a progresat la 15 pacienţi, dar a progresat la 21 de pacienţi. La pacienţii trataţi cu VM nu au fost observate efecte adverse grave.

A fost elaborată o nouă tulpină de virus (VM) cu secvenţa iniţială a genomului stabilă în ceea ce priveşte driftul genetic, care posedă activitate citopatică împotriva diferitor tipuri de tumori, caracterizată printr-o incidenţă redusă a efectelor adverse şi toxicitate mică, care poate fi utilizată în mod avantajos în viroterapia cancerului. Astfel, a fost lichidat în mod neaşteptat principalul obstacol în utilizarea mai largă a virusurilor ARN în medicină - a fost obţinută o tulpină genetic stabilă, care poate fi utilizată în producerea continuă standardizată a preparatului viral oncolitic. Preparatul viral poate fi utilizat în terapia antitumorală împotriva unei varietăţi de celule canceroase.

EXEMPLE

Prezenta invenţie este descrisă mai detaliat în exemple. Cu toate acestea, prezenta invenţie nu urmează a fi interpretată ca fiind limitată de exemple.

Virusul

Virusul, modificat în conformitate cu prezenta invenţie, este virusul ECHO-7 (familia Picornaviridae, genul Enterovirus, ECHO (virusul enteric citopatic “orfan” uman) de tip 7, grupa IV, un virus cu ARN monofilar cu polaritate pozitivă). Virusul nativ poate fi identificat prin secvenţa genomului Seq ID No 2.

Exemplul 1. Izolarea şi caracterizarea tulpinii de virus iniţial.

S-a folosit o metodă cunoscută de izolare (Rentz A.C., Libbey J.E., Fujinami R.S., Whitby F.G. and Byington C.L. Investigation of Treatment Failure in Neonatal Echovirus 7 Infection. The Pediatric Infectious Disease Journal, Vol. 25, Number 3, March 2006, p. 259) şi de reproducere în linia celulară BS-C-1 (CCL 26; ATCC) (Libbey J.E., McCright I.J., Tsunoda I. et al. Peripheral nerve protein, P0, as a potential receptor for Theiler's murine encephalomyelitis virus. J Neurovirol., 2001, no. 7, p. 97-104),( Pevear D.C., Tull T.M., Seipel M.E. et al. Activity of pleconaril against enteroviruses. Antimicrob Agents Chemother, 1999, no. 43, p. 2109-2115). Reproducerea virusului şi determinarea titrului s-a realizat printr-o metodă cunoscută (Zurbriggen A., Fujinami R.S. A neutralization-resistant Theiler's virus variant produces an altered disease pattern in the mouse central nervous system. J. Virol., 1989, no. 63, p. 1505- 1513).

Exemplul 2. Modificarea virusului.

În prima etapă de modificare virusul a fost reprodus în linii de celule tumorale, atenuate cu un agent anticancerigen. Iniţial, pentru reproducere s-a utilizat cultură celulară de adenocarcinom mamar uman (MCF-7), cultivată în mediu DME (Sigma-Aldrich) cu 10% ser (Gibco) şi antibiotice (100 UI/ml de penicilină, 100 UI/ml de streptomicină) la 37°C într-o atmosferă conţinând 5% CO2 până la apariţia monostratului.

Monostratul obţinut din aceste celule s-a tratat cu dacarbazină DTIC în doză subtoxică (20 µM). După tratarea cu dacarbazină celulele au fost transferate pe mediu de cultură proaspăt fără ser, celulele interacţionau cu virusul şi reproducerea continua.

Peste 24 ore de contact cu virusul, din mediu au fost îndepărtate celulele şi s-a izolat virusul. Virusul a fost reprodus în mod repetat în culturi celulare de fibroblaste embrionare umane şi utilizat din nou pentru infectarea liniei celulare MCF-7. Acest procedeu s-a repetat de 10 ori.

În următoarea, a doua etapă, virusul, conform descrierii de mai sus, a fost pus în contact cu culturi celulare de adenocarcinom gastric. Cultura celulară pentru reproducere a fost cultivată în mediu DME (Sigma-Aldrich) cu 10% ser (Gibco) şi antibiotice (100 UI/ml de penicilină, 100 UI/ml de streptomicină) la 37°C într-o atmosferă conţinând 5% CO2, până la apariţia monostratului.

Monostratul obţinut din aceste celule s-a tratat cu dacarbazină DTIC în doză subtoxică (20 µM). După tratarea cu dacarbazină celulele au fost transferate pe mediu de cultură proaspăt fără ser, celulele interacţionau cu virusul şi reproducerea se continua.

Peste 24 de ore de contact cu virusul, din mediu au fost îndepărtate celulele şi s-a izolat virusul. Virusul a fost reprodus în mod repetat în culturi celulare de fibroblaste embrionare umane şi utilizat din nou pentru infectarea liniei celulare de adenocarcinom gastric. Acest procedeu s-a repetat de 10 ori.

În a treia etapă virusul, produs în a doua etapă, a fost utilizat pentru infectarea tumorii umane, obţinute după operaţie. Ţesuturile canceroase de melanom au fost prelevate în cadrul intervenţiilor chirurgicale de la 23 de pacienţi, care anterior au administrat chimioterapie.

Celulele tumorale au fost separate de celulele adipoase, ţesutul necrotic şi sânge, au fost menţinute la 0°C timp de 24 ore, apoi mărunţite, iar bucăţile de ţesut cu dimensiuni de aproximativ 0,1 cm3 au fost cufundate în mediul Eagle (4 ml de mediu pentru 10 mg de ţesut), infectate cu virusul preparat şi incubate în absenţa dioxidului de carbon la 37°C.

Mediul era înlocuit cu o porţie proaspătă în fiecare zi până la distrugerea tumorii, fapt determinat morfologic şi vizual după nivelul de oxidare a mediului.

Titrul virusului s-a determinat în fiecare zi în ţesutul tumoral, în proba fără mediu. Rata de reproducere a virusului s-a determinat din titrul virusului la finalizarea experimentului, comparativ cu titrul în ziua 0. Asemenea modificări ale virusului s-au realizat în ţesuturile obţinute de la 23 de pacienţi. Înainte de a fi folosit pentru infectarea unui nou material tisular, virusul modificat era de fiecare dată reprodus în mod repetat în cultura de fibroblaste embrionare umane până la titrul de 7 lg TCID50/1 ml.

Virusul modificat era reprodus în culturi celulare de fibroblaste embrionare umane, tratate cu 5 mM ribavirină cu 7 ore înainte de infectare şi cultivate timp de 24 de ore. Virusul a fost izolat din mediul de cultură, iar procedura repetată de 10 ori.

În final virusul era izolat, purificat şi reprodus în cultură celulară de fibroblaste embrionare umane fără adaos de ribavirină.

Mostra cu virus reprodus s-a utilizat pentru determinarea secvenţei genomului, activităţii antitumorale şi stabilităţii replicative după pasajul acestuia timp de 12 luni în cultură celulară de fibroblaste embrionare umane cu determinarea repetată a secvenţei genomului (Seq ID No 1).

Exemplul 3. Determinarea secvenţei genomului virusului.

Izolarea, amplificarea şi secvenţierea genomului virusului izolat, modificat şi cultivat au fost realizate în conformitate cu o metodă cunoscută (Chua B.H., McMinn P.C., Lam S.K., Chua K.B. Comparison of the complete nucleotide sequences of echovirus 7 strains UMMC and the prototype (Wallace) strain demonstrates significant genetic drift over time. J. Gen. Virol., 2001 Nov, no. 82(Pt 11), p. 2629-2639).

În acest scop, 96 de enterovirusuri cu secvenţa completă a genomului au fost selectate din biblioteca NCBI Gene. Secvenţele complete ale genomilor acestor virusuri au fost încărcate şi comparate cu programul Vector NTI. Pe baza rezultatelor comparaţiei au fost determinate cele mai conservatoare regiuni ale genomilor virali şi selectate 13 perechi de oligonucleotide degenerate în aceste regiuni, care acoperă lungimea genomului enteroviral potenţial. După sinteza primelor 13 fragmente, s-au obţinut alte 13 perechi de nucleotide. Aceste perechi de oligonucleotide erau specifice pentru virus şi au fost proiectate astfel, încât să producă fragmente suprapuse. După construirea secvenţei complete a genomului, genomul virusului a fost secvenţiat în mod repetat cu primerii specifici virusurilor.

Exemplul 3.1. Secvenţa genomului virusului nemodificat (nativ).

Secvenţa virusului nativ a fost obţinută din 26 fragmente PCR de suprapunere separate, sintetizate din primerii enumeraţi în tab 2.

Tabelul 2

Primerii utilizaţi pentru secvenţierea genomului complet al virusurilor.

Primerul Secvenţa (5'- 3') Lungimea (b.p.) Poziţia Regiunea ţintită Eo7-1F TTAAAACAGCCTGTGGGTTG 20 1-20 5' UTR Eo7-1R GAAACACGGACACCCAAAGTAG 22 545-566 5' UTR Eo7-2F CCATGGGACGCTTCAATACT 20 391-410 5' UTR Eo7-2R GC AC CAGTCTTTTGTGTCGA 20 758-777 VP4 Eo7-3F CGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC 25 542-566 5' UTR Eo7-3R TCDGGRAAYTTCCACCACCACCC 23 1178-1200 VP2 Eo7-4F CGACAGGGTGAGATCCCTAA 20 979-998 VP2 Eo7-4R TTTCACCCTTCGTGAGGTTC 20 1381-1400 VP2 Eo7-5F GCATCYAARTTYCAYCARGG 20 1289-1308 VP2 Eo7-5R CACATKGGKGCAATSGTGAC 20 1676-1695 VP2 Eo7-6F GTGGATCAACTTGCGCACTA 20 1513-1532 VP2 Eo7-6R AAATTGTGGCATAGCCGAAG 20 1797-1816 VP3 Eo7-7F GTCACSATTGCMCCMATGTG 20 1676-1695 VP2 Eo7-7R CTTNATRCTYCCTGACCAGTGTG 23 2055-2077 VP3 Eo7-8F AAGCATGGACGCATATCACA 20 1921-1940 VP3 Eo7-8R GATATGGGTTCCCACATTGC 20 2174-2194 VP3 Eo7-9F CACACTGGTCAGGRAGYATNAAG 23 2055-2077 VP3 Eo7-10F CAAGTGTGTCGTCCTGTGCT 20 2350-2369 VP3 Eo7-9R CCTATTGGCGCTGTCTTGAT 20 2694-2713 VP1 Eo7-11F ACCAAAGATCAAGACAGCGC 20 2687-2706 VP1 Eo7-11R TTGGCACCCACACTCTGATA 20 3178-3197 VP1 Eo7-12F ACCAGTCCGGTGCTGTTTAC 20 3336-3355 VP1-2A Eo7-12R TCCCAYACACARTTYTGCCAGTC 23 3401-3423 2A Eo7-13F CARAAYTGTGTGTGGGAAGACTA 23 3407-3429 2A Eo7-13R CCCTGYTCCATKGCTTCATCYTCYARC 27 3748-3774 2A-2B Eo7-14F TTACCCAGTCACCTTCGAGG 20 3535-3554 2A Eo7-14R TGTTTTTCCTTCACTTCCGG 20 4181-4200 2C Eo7-15F GTTRGARGATGATGCNATGGARCARGG 27 3748-3774 2A-2B Eo7-15R TCAATACGGYRTTTGSWCTTGAA 23 4409-4431 2C Eo7-16F CCTYTRTAYGCVGCYGARGC 20 4343-4362 2C Eo7-17F TTCAAGWSCAAAYRCCGTATTGA 23 4409-4431 2C Eo7-16R AAYTGAATGGCCTTHCCACACAC 23 4922-4944 2C Eo7-18F CTDGTGTGTGGRAAGGCYATNCA 23 4919-4941 2C Eo7-18R TATGCTCCYTGRAARCCTGCAAA 23 5309-5330 3A-3B Eo7-19F CAAGCCCTAACCACGTTTGT 20 5252-5271 3A Eo7-19R ACCCGTAGTCAGTCACCTGG 20 5740-5759 3C Eo7-20F TTTGCAGGMTTYCARGGWGCATA 23 5309-5330 3A-3B Eo7-20R GC Y CTW GTGGGRAAGTTRT AC AT 23 5723-5745 3C Eo7-21F GTGTTGGATGCCAAGGAACT 20 5555-5574 3C Eo7-21R ATGGGCTCCGATCTGATGTC 20 6203-6222 3D Eo7-22F TTCCCCACWAGRGCAGGCCARTGYGG 26 5907-5832 3C Eo7-22R CTCCAAAABASRTCYGGGTCRCA 23 6572-6594 3D Eo7-23F TGAAGGAATGCATGGACAAA 20 6360-6379 3D Eo7-23R ATGGGTATTGCTCATCTGCC 20 7078-7097 3D Eo7-24F TGYGACCCRGAYSTVTTTTGGAG 23 6572-6594 3D Eo7-24R TCRTGDATDTCYTTCATGGGCA 22 7116-7137 3D Eo7-25F CCTGGACGAATGTGACCTTT 20 7041-7060 3D Eo7-25R CCCTACCGCACTTTTATCCA 20 7384-7403 3'UTR Eo7-26F ATCCAYGARTCHATYAGRTGGAC 23 7130-7152 3D Eo7-26R CCGCACCGAATGCGGAGAATTTAC 24 7404-7427 3'UTR

UTR - regiunea netranslată.

S-a obţinut secvenţa 5' - terminală şi secvenţa 3' - terminală, folosind metodele 5'-RACE şi 3'-RACE, respectiv.

În final, s-a constatat că secvenţa completă a genomului virusului nemodificat constă din 7434 nucleotide, cu excepţia secvenţei poli-A (Seq ID No 2).

Secvenţa 5'- terminală netranslată (5'NTR) conţine 742 de nucleotide, urmate de partea codificatoare, care se începe cu codonul de start (AUG) în poziţia 743, conţinând codonii pentru 2196 de aminoacizi şi terminându-se cu codonul de stopare (UAA) în poziţia 7331 (SEQ ID nr.2). Secvenţa 3'- terminală netranslată (3'NTR) a acestei tulpini conţine 100 de nucleotide, urmate de secvenţa poli-A.

Exemplul 3.2. Secvenţa virusului modificat (VM).

Secvenţa virusului iniţial a fost obţinută din 26 fragmente PCR de suprapunere separate, sintetizate utilizând primerii prezentaţi în tabelul 2.

S-a obţinut secvenţa 5' - terminală şi secvenţa 3' - terminală, folosind metodele 5'-RACE şi 3'-RACE, respectiv.

În final, s-a constatat că secvenţa completă a genomului virusului nemodificat constă din 7427 nucleotide, cu excepţia secvenţei poli-A (Seq ID No 1).

Secvenţa 5'-terminală netranslată (5'NTR) conţine 742 de nucleotide, urmate de partea codificatoare. Partea codificatoare, care conţine informaţia cu privire la poliproteina virală, începând cu codonul de start (AUG) în poziţia 743, conţine codonii pentru 2194 de aminoacizi şi capetele cu codonii de stopare (UAA) în poziţia 7325 (SEQ ID nr.1). Secvenţa 3'-terminală netranslată (3'NTR) a acestei tulpini conţine 100 de nucleotide, urmate de secvenţa poli-A.

Exemplul 3.3. Secvenţa genomului virusului modificat după reproducere timp de 12 luni.

Secvenţa virusului modificat a fost obţinută din 26 fragmente PCR de suprapunere separate, sintetizate din primerii prezentaţi în tabelul 2.

S-a obţinut secvenţa 5' - terminală şi secvenţa 3' - terminală, folosind metodele 5'-RACE şi 3'-RACE, respectiv.

În final, s-a constatat că secvenţa completă a genomului virusului nemodificat constă din 7427 nucleotide, cu excepţia secvenţei poli-A (Seq ID No 3).

Secvenţa 5'-terminală netranslată (5'NTR) conţine 742 de nucleotide, urmate de partea codificatoare, care se începe cu codonul de start (AUG) în poziţia 743, conţinând codonii pentru 2194 de aminoacizi şi terminându-se cu codonul de stopare (UAA) în poziţia 7325 (SEQ ID nr.3). Secvenţa 3'- terminală netranslată (3'NTR) a acestei tulpini conţine 100 de nucleotide, urmate de secvenţa poli-A.

Exemplul 3.4. Compararea genomurilor virusului modificat (VM) şi tulpinii native.

Compararea genomurilor virusului modificat (VM) şi tulpinii iniţiale este prezentată în fig. 1.

Diferenţa secvenţelor de nucleotide, calculată cu programul Vector NTI, era semnificativă, de 10% pentru genomul complet şi de 12% pentru partea care codifică proteinele virale ale membranei. Secvenţele de aminoacizi pentru tulpina modificată şi tulpina iniţială sunt prezentate în fig. 2.

Exemplul 3.5. Secvenţa genomului virusului modificat după reproducere timp de 12 luni.

Modificările în secvenţa genomului virusului modificat (VM) după pasaje continue timp de 12 luni nu au depăşit 0,7% din secvenţa iniţială.

Toate modificările constatate au fost substituiri de nucleotidă solitare, parţial mutaţii “mute” (fără schimbarea aminoacidului). Dacă aminoacidul era modificat, poziţia lui era parte polimorfă în genom, probabil, fără influenţă relevantă asupra activităţii virusului.

Exemplul 4. Pasajul virusului.

Pasajul virusului VM s-a realizat prin metode cunoscute şi s-a reprodus timp de 12 luni în cultură de celule pulmonare embrionare umane MRC 5 (Instituto Zooprofilaticco Sperimentale della Lombardia e dell Emilia, Brescia - Laboratorio Centra Substrati Cellulari, Catalog Nr. BS CL 68 (originea: American Type Culture centre Collection, Rockville, Maryland, SUA) fără bacterii, virusuri, fungi sau micoplasme, iar ulterior depozitată congelată la -70°C.

Exemplul 5. Determinarea activităţii antitumorale a virusului modificat (VM).

În experimentele cu linii celulare s-a dovedit că VM este citotoxic pentru liniile celulare de melanom FM9, FM55, FM94 şi SK-Mel26, celulele de carcinom gastric, celulele de carcinom cu celule scuamoase ale cavităţii bucale umane SCC25, linia de celule epiteliale umane, derivate din carcinom pulmonar (A549), celulele de leucemie monocitară acută THP-1, celulele de rabdomiosarcom RD, celulele de adenocarcinom pancreatic uman HPAF-II, celulele de adenocarcinom mamar uman (MCF-7), precum şi pentru culturile celulare primare de adenocarcinom gastric GC1 şi linia de cancer tiroidian HA007.

Astfel, de exemplu, injecţiile cu VM timp de 3 zile au provocat reducerea masei sarcomului M-1 la 55% (la 11 din 22) din animale, comparativ cu 6% (la 1 din 18) de regresie spontană în grupul de control.

Transplantul sarcomului KRS-321 s-a executat în ziua 5 după injectare cu VM în doză de 15x106 TCID50 la şobolanii de linie Wistar, totodată, regresia tumorii s-a observat la 44% din animale (11/25), în timp ce în grupul de control nu au existat cazuri de regresie.

În cadrul testării activităţii antitumorale a mostrei de virus, peste 12 luni de pasaj pe aceleaşi linii celulare de cancer şi tumori transplantate, nu a fost înregistrată diferenţă statistic concludentă cu VM iniţial.

Nici VM, nici virusul supus pasajului timp de 12 luni nu au cauzat oarecare reacţii toxice la şoarecii intacţi.

Exemplul 6. Activitatea antitumorală a virusului modificat la pacienţii trataţi.

Tratamentul pacienţilor cu melanom cu virusul modificat (VM) s-a realizat conform schemei următoare: terapia s-a început peste 2…3 săptămâni după excizia tumorii prin administrarea intramusculară a 2 ml de soluţie cu titrul de 2x106 TCID50/ml - 2x108 TCID50/ml timp de 3 zile consecutiv cu susţinere prin administrarea injecţiilor la intervale de o lună, conform aceleiaşi scheme de 3 zile. Peste patru luni, preparatul viral s-a administrat o dată pe lună timp de următoarele 8 luni. În următorii 2 ani s-a continuat terapia de susţinere în aceleaşi doze, treptat mărind intervalul între administrări până la 6, 8 şi 12 săptămâni.

Într-un studiu clinic pilot pe un grup din 46 de pacienţi cu melanom stadiul I nu s-a observat nici un progres al melanomului timp de 50 de luni la 43 de pacienţi, trataţi cu VM. În grupul de control melanomul avansa la 10 din 31 de pacienţi, care au administrat terapie standard.

Într-un studiu timp de 50 de luni la 44 de pacienţi cu melanom stadiul II, progresul melanomului timp de 50 de luni nu s-a constatat la 38 de pacienţi, în comparaţie cu grupul de control din 36 de pacienţi, care au administrat terapie standard, totodată melanomul nu a progresat la 15 pacienţi, dar a progresat la 21 de pacienţi.

Eficienţa tratamentului se caracterizează prin următoarele exemple:

Cazul 1. Femeie, 76 ani, Melanoma cutis dorsi.

Intervenţie chirurgicală: 11.09.2009. Excisio tu cutis dorsi.

pT4bN0M0.

Biopsie SN nu s-a efectuat.

Ex consilio: urmărire ulterioară.

Intervenţie chirurgicală: 04.07.2010. LAE axillaris sin.

Mts l/n axillaris sin.

Ex consilio: Roferon.

Roferon 6 milioane de 3 ori pe săptămână de la 24.06.2010 până la 30.08.2010.

Tratamentul a fost întrerupt din cauza efectelor adverse.

Din octombrie 2010 s-a început terapia cu preparat viral în doza de 2 ml cu titrul de 2x106 TCID50/ml - 2x108 TCID50/ml. Toleranţa tratamentului bună, progresul bolii nu a fost documentat până la 01.02.2012.

Cazul 2. Femeie, 42 de ani, Melanoma cutis dorsi.

Intervenţie chirurgicală: 25.05.2008. Excisio tu cutis dorsi.

pT4aN0M0, ClarkV, Breslow 9 mm.

Biopsie SN nu s-a efectuat.

Preparatul viral (2 ml cu titrul 2x106 TCID50/ml - 2x108 TCID50/ml) s-a administrat de la 27.06.2008 până la 27.06.2011.

21.01.2011. Examenul US: manifestare repetată în cicatrice.

Op. 02.02.2011. Excisio. Examenul histologic: granulom.

Administrarea preparatului viral (2 ml cu titrul 2x106 TCID50/ml - 2x108 TCID50/ml) a fost continuată până la 27.06.2011.

În perioada de observaţie (până în decembrie 2011) nu a fost documentată nici o dovadă de evoluţie a bolii.

Cazul 3. Femeie, 57 de ani, Melanoma cutis dorsi.

Intervenţie chirurgicală: 19.08.2007. Excisio tu cutis dorsi.

pT3bN0M0.

Biopsie SN nu s-a efectuat.

Recomandări: urmărire ulterioară.

Intervenţie chirurgicală: 10.12.2009. LAE colli dx.

Examenul histologic: mts l/n colli dx.

Progresia bolii - examenul US pe 22.02.2010: mts l/n colli.

22.02.2010. Ex consilio: intervenţie chirurgicală nu a fost recomandată din cauza afectării masive în limfogranolumatoză.

Preparatul viral (2 ml, cu titrul 2x106 TCID50/ml - 2x108 TCID50/ml) s-a administrat din 22.02.2010 şi încă mai este administrat.

Ultima vizita în clinică: 22.11 .2011 - boala s-a stabilizat.

Cazul 4. Femeie, 58 de ani, Melanoma cutis dorsi.

Operaţie: Aprilie 2004. Excisio tu cutis dorsi, LAE axillaris sin.

pT4bN2cM0 (Breslow 15 mm).

Reexcisio ianuarie 2006, septembrie 2006 (recidivă locală).

Terapie cu IFN din octombrie 2006 pana în mai 2007.

Reexcisio cum dermoplasticum: februarie 2007, mai 2007, septembrie 2007.

Preparatul viral (2 ml cu titrul 2x106 TCID50/ml - 2x108 TCID50/ml) a fost administrat din februarie 2008 pana în aprilie 2011.

Metastaze viscerale în februarie 2011.

Exitus letalis: în octombrie 2011.

Forma de dozare şi de administrare.

Preparatul viral pentru efect terapeutic poate fi sub forma unei soluţii apoase injectabile cu conţinut de virus modificat, care are secvenţa genomului stabilă, cum s-a explicat mai sus, de exemplu, cu titrul de 2x106 TCID50/ml - 2x108 TCID50/ml. Soluţia cu conţinut de virus poate fi orice soluţie sterilă fiziologic admisibilă, în special soluţie de clorură de sodiu. Preparatul este depozitat şi transportat în stare congelată şi se decongelează la temperatura camerei înainte de utilizare. Preparatul poate fi în fiole sau în alte unităţi de containere în cantităţi care corespund unei singure doze, injectate la o singură administrare pacientului.

Preparatul poate fi administrat prin injectare intramusculară (i/m) pacientului după excizia tumorii respective, după vindecarea plăgii. Doza poate constitui 2 ml de soluţie menţionată mai sus la o singură administrare. Administrarea intramusculară prin injectare se repetă, conform schemei de terapie planificate.

Descrierea se publică în redacţia solicitantului.

1. Garber K. China approves world,s first oncolytic virus therapy for cancer treatment. J. Natl. cancer Inst. 2006, nr. 98, p. 298-300

2. EA007839 (B1) 2007-02-27

Claims (12)

1. Enterovirus modificat ECHO tip 7, caracterizat printr-o secvenţă stabilă a genomului, care în cel puţin aproximativ 85%, de preferinţă cel puţin aproximativ 95%, mai preferabil cel puţin aproximativ 99% din secvenţă este identică cu Seq ID No 1, şi în care modificările în secvenţa genomului enterovirusului modificat constituie cel mult 0,7%, după reproducerea continuă a enterovirusului modificat în culturi celulare timp de 12 luni.

2. Enterovirus modificat ECHO tip 7, caracterizat printr-o secvenţă stabilă a genomului Seq ID No1.

3. Metodă de producere a unui enterovirus modificat ECHO tip 7, care constă în modificarea virusului nativ ECHO 7, identificat în baza secvenţei genomului Seq ID No 2, în care modificarea prevede adaptarea virusului în celulele canceroase, atenuate cu un agent anticancerigen, cu pasajul ulterior al virusului modificat în cultură de fibroblaste embrionare umane, reproducerea virusului modificat în celule de melanom uman şi pasajul ulterior al virusului modificat în cultură de fibroblaste embrionare umane, opţional tratate cu ribavirină, cu izolarea şi purificarea virusului.

4. Metodă conform revendicării 3, în care procedura de reproducere a virusului în celulele canceroase şi pasajul ulterior al virusului modificat în cultura de fibroblaste embrionare umane se repetă de câteva ori.

5. Metodă conform revendicării 3 sau 4, în care procedura de reproducere a virusului modificat în celulele melanomului uman şi pasajul ulterior al virusului modificat în cultura de fibroblaste embrionare umane se repetă de câteva ori.

6. Metodă conform revendicării 3, 4 sau 5, în care adaptarea virusului se realizează în celulele canceroase de cel puţin două tipuri diferite de cancer, cum ar fi celule de adenocarcinom mamar uman şi celule de adenocarcinom gastric.

7. Metodă conform oricăreia dintre revendicările 3-6, în care prin modificare se obţine un enterovirus modificat ECHO tip 7, care se caracterizează printr-o secvenţă stabilă a genomului, care în cel puţin aproximativ 85%, de preferinţă cel puţin aproximativ 95%, mai preferabil cel puţin aproximativ 99% din secvenţă este identică cu Seq ID No 1, şi în care modificările în secvenţa genomului enterovirusului modificat constituie cel mult 0,7%, după reproducerea continuă a enterovirusului modificat în culturi celulare timp de 12 luni.

8. Metodă conform revendicării 7, în care prin modificare se obţine un enterovirus modificat ECHO tip 7, care se caracterizează printr-o secvenţă stabilă a genomului Seq ID No 1.

9. Metodă conform revendicării 7 sau 8, în care modificările reprezintă substituiri ale unei nucleotide, care constau parţial din mutaţii „mute” fără modificarea aminoacidului corespunzător.

10. Utilizare a virusului definit în revendicarea 1 sau 2 pentru tratamentul bolilor oncologice.

11. Utilizare, conform revendicării 10, în care boala oncologică este selectată din grupul constând din: melanom, cancer gastric, cancer intestinal, cancer de sân uman, cancer de prostată, cancer pancreatic, cancer pulmonar, cancer renal, cancer de vezică urinară, limfosarcom, cancer uterin, angiosarcom, rabdomiosarcom.

12. Utilizare, conform revendicării 10, în care boala oncologică este melanomul.