CN105412838A

CN105412838A - 用于治疗糖尿病肾病的中药药物

Info

Publication number: CN105412838A
Application number: CN201510975558.6A
Authority: CN
Inventors: 赵玉妹
Original assignee: Qingdao Huaren Technology Incubator Co Ltd
Current assignee: Qingdao Huaren Technology Incubator Co Ltd
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2015-12-23
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明提供了一种用于治疗糖尿病肾病的中药药物，其原料药包括黄芪、生地黄、熟地黄、丹参、川芎、黄精、地龙、水蛭、全蝎、茜草、郁金、牛膝、姜黄、延胡索、山药、白术、沙参、百合、龟甲、鳖甲、枸杞子、炙甘草。本发明具有益气养阴化瘀通络的效果，补益中气固护脾胃，化瘀通络疏肝养血，滋养阴精补肾填髓。通过临床资料总结回顾，实验研究相结合，证实了本发明制剂具有治疗糖尿病肾病的临床效果。

Description

用于治疗糖尿病肾病的中药药物

技术领域

本发明涉及中医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗糖尿病肾病的中药药物。

背景技术

随着经济发展、人民生活水平提高及人口的老龄化，慢性肾脏病的疾病谱也在不断变化，近代一些由不良生活方式导致的高发病如糖尿病引起的慢性肾脏病在日益增多。在发达国家，糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)在慢性肾脏病中己占第一位(约占25％～40％)。我国是发展中国家，终末期肾病(end-stagerenaldisease，ESRD)患者中原发性肾小球肾炎仍占第一位，但是糖尿病肾病近年己在迅速增加。据统计，全球约有1.71亿糖尿病患者，到2030年患者总数可能翻倍，而我国20岁以上人群的糖尿病发病率达9.7％，推算患者总数为9240万人，约有20％～30％的糖尿病患者进展为DN。若末能对DN进行有效治疗，最终将进入到ESRD，而必须依赖肾脏替代治疗，即血液透析、腹膜透析或肾脏移植来维持生命。但在发展中国家，极多的ESRD患者无力接受透析或肾脏移植治疗。所以如何减少DN的发生以及如何有效减缓DN的进展将是函待解决的艰巨任务。

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者最主要的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病(ESRD)的首位病因。DN的主要病理表现为肾小球肥大，细胞外基质增生，肾小球系膜区增宽及毛细血管基底膜增厚，最后进展至肾小球硬化。其发病机制涉及遗传、糖代谢紊乱、血流动力学改变、细胞因子、炎症介质等多种因素环节。DN的防治至今尚无有效手段。虽然血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)被作为治疗DN的首选药物，但当肾衰竭患者血清肌配大于265μmol/L时，即不能应用。因为此时残存肾单位己很少，必须依赖出球小动脉高度收缩来维持球内“三高”代偿排毒，如果给予ACEI或ARB，出球小动脉扩张，代偿机制破坏，SCr即可能异常升高，还可能导致高钾血症的发生。因此，寻找防治DN安全有效的新药迫在眉睫。近年来中医药在DN的防治中日益发挥重要作用，尤其对早期DN持续的微量白蛋白尿，干预治疗甚能逆转，进而阻止或延缓肾脏病进展。本发明制剂是经过治疗DN多年临床实践的总结，前期的研究均表明本发明制剂对肾脏具有很好的保护作用。

本发明具有益气养阴化瘀通络的效果，补益中气固护脾胃，化瘀通络疏肝养血，滋养阴精补肾填髓。通过临床观察，证实其治疗糖尿病肾病的临床疗效，有效的减少复发率，结合现代研究进展，通过动物实验研究，进一步探讨中医药治疗糖尿病肾病的相关机制，从而发挥中医药治疗的优势，最终为糖尿病肾病的临床治疗提供强有力的数据支持。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于治疗糖尿病肾病的中药药物，具有益气养阴化瘀通络的效果，补益中气固护脾胃，化瘀通络疏肝养血，滋养阴精补肾填髓。通过临床资料总结回顾，实验研究相结合，证实了本发明制剂具有治疗糖尿病肾病的临床效果，有效的减少复发率。

本发明提供了一种用于治疗糖尿病肾病的中药药物，其原料药包括生黄芪、生地黄、熟地黄、丹参、川芎、黄精、地龙、水蛭、路路通、全蝎、茜草、郁金、怀牛膝、片姜黄、延胡索、炒山药、生白术、北沙参、百合、制龟板、枸杞子和炙甘草。

其中，所述中药药物中各原料药的重量分别为生黄芪30g～40g、生地黄15g～25g、熟地黄20g～30g、丹参20g～30g、川芎15g～25g、黄精30g～40g、地龙10g～15g、水蛭10g～15g、路路通5g～15g、全蝎10g～15g、茜草20g～30g、郁金25g～35g、怀牛膝20g～30g、片姜黄15g～25g、延胡索20g～30g、炒山药20g～30g、生白术15g～25g、北沙参25g～35g、百合10g～20g、制龟板20g～30g、枸杞子15g～25g和炙甘草20g～30g。

其中，所述中药药物中各原料药的重量分别为生黄芪35g～40g、生地黄15g～20g、熟地黄25g～30g、丹参25g～30g、川芎15g～20、黄精35g～40g、地龙10g～15g、水蛭10g～15g、路路通10g～15g、全蝎10g～15g、茜草25g～30g、郁金25g～30g、怀牛膝25g～30g、片姜黄15g～20g、延胡索25g～30g、炒山药25g～30g、生白术15g～20g、北沙参25g～30g、百合15g～20g、制龟板25g～30g、枸杞子15g～20g和炙甘草25g～30g。

其中，所述中药药物中各原料药的重量分别为生黄芪35g、生地黄20g、熟地黄25g、丹参25g、川芎20g、黄精35gg、地龙10g、水蛭10g、路路通10g、全蝎10g、茜草25g、郁金30g、怀牛膝25g、片姜黄20g、延胡索25g、炒山药25g、生白术20g、北沙参30g、百合15g、制龟板25g、枸杞子20g和炙甘草25g。

其中，本发明提供的中药药物还包括药学上可接受的载体和辅料。

其中，所述中药药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂或粉剂。

本发明还提供了上述中药药物的制备方法，其包括：

第一步，取生黄芪、丹参、黄精、地龙、水蛭、全蝎、怀牛膝、片姜黄、北沙参、龟板、枸杞子和炙甘草，按上述重量配比，采用乙醇渗漉，收集渗漉液，纯化，浓缩，干燥，粉碎，获得第一粉末；

第二步，将佘下原料药组分按上述重量配比，采用水提法提取，提取液经大孔吸附树脂纯化，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，获得第二粉末；

第三步，将第一粉末和第二粉末混合，添加辅料和载体，制备需要的剂型。

其中，所述第一步进一步具体为取生黄芪、丹参、黄精、地龙、水蛭、全蝎、怀牛膝、片姜黄、北沙参、制龟板、枸杞子和炙甘草分别粉碎成粉末，按上述重量配比，混合在一起，获得混合物，用相对于混合物质量5～8倍醇浓度为80～90％乙醇渗漉，静置24-36小时后，以2～4ml/min的速度收集渗漉液，调节pH为7，静置24小时，抽滤，回收乙醇并浓缩，干燥，粉碎，获得第一粉末。

其中，所述第二步进一步具体为将佘下原料药组分分别粉碎，按上述重量配比混合，获得混合物，用相对于混合物质量3～5倍的水提取两次，将提取液合并，离心，取上清液，将所得上清液大孔吸附树脂柱，用2～4倍柱床体积纯水洗脱杂质，再用3～6倍柱床体积的醇浓度为40％～80％乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2～4倍柱床体积/小时，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，获得第二粉末。

其中，当制备成口服液时，所述第三步进一步具体为将所述第一粉末和第二粉末混合，进一步碎成200目～400目的粉末，加相对于获得的粉末质量3～5倍量的蒸馏水，0.2～0.4倍的蔗糖，0.03～0.05倍的苯甲酸钠，搅拌，煮沸，冷却，过滤，分装，灭菌即获得口服液。

有益的技术效果

本发明提供的用于治疗糖尿病肾病的中药药物，具有益气养阴化瘀通络的效果，补益中气固护脾胃，化瘀通络疏肝养血，滋养阴精补肾填髓。通过临床资料总结回顾，实验研究相结合，证实了本发明制剂具有治疗糖尿病肾病的临床效果，有效的减少复发率。

具体实施方式

本发明提供了一种用于治疗糖尿病肾病的中药药物，其特征在于原料药包括生黄芪、生地黄、熟地黄、丹参、川芎、黄精、地龙、水蛭、路路通、全蝎、茜草、郁金、怀牛膝、片姜黄、延胡索、炒山药、生白术、北沙参、百合、制龟板、枸杞子和炙甘草。

进一步优选，所述中药药物仅由上述原料药制备而成。

本病的治疗要点在于益气养阴化瘀通络，本发明制剂使用药物组方思路如下：

1、益气

以黄芪、炒山药、生白术、炙甘草四味中药，起到健脾益气功效，其中炒山药亦有平补肝肾功效，诸药合用，肝脾肾同补。

2、养阴

本病迁延日久，以气阴不足为主要临床表现，益气药使用同时，容易耗上阴津，故方中益气药用量较少，而养阴药用量较大，如大剂量的生地黄、熟地黄、黄精、北沙参、百合等，滋补肝肾之阴，养阴润肺，使全身气津得充。

3.化瘀通络

久病入络，现代中医学研究，糖尿病日久，可导致糖络不通，血络不通，经脉不通，因此本发明制剂使用一定剂量的虫类药，如水蛭、全蝎、地龙活血化瘀通络，使用路路通、丹参、川芎、郁金、茜草、片姜黄、延胡索活血行气，通络止痛。

4.攻补兼施

在使用虫类化瘀通络攻邪的同时，需要注意顾护根本，本发明制剂加入怀牛膝、炒山药、生白术、北沙参、制龟板、枸杞子，调补肝、肺、肾、脾四脏。

用药思路清晰，组方配伍得当，药量使用精简，全方攻补兼施，标本兼顾，以通为主，切中糖尿病肾病的病机演变规律，共奏益气养阴化瘀通络之效。

各原料药药理如下：

生黄芪：拉丁名astragaliradix，味甘，性温，入脾、肺经，有补益脾肺，升举阳气、固表止汗，托疮生肌等功效，主要用于脾肺气虚所致之乏力食少便溏，心悸气短，中气下陷之脏器下垂，气不摄血之崩漏便血，久泻脱肛；表虚不固之自汗盗汗，气血不足等证。

生地黄：拉丁名RehmanniaeRadix，味甘、苦，性寒，归心、肝、肾经，具有清热凉血、去瘀生新，养阴生津的功效，主治热如营分之身热口渴等真阴被劫之证；或热病后期低热不退；慢性疾病证属阴虚内热者；肺胃蕴热之口渴引饮，消渴心烦，胃阴受伤之口渴少津；血热妄行之便血、崩漏下血；血热毒盛之发斑紫黑等证。

熟地黄：又名熟地，味甘，性微温，入肝、肾经，具有补血滋阴，益精填髓的作用，用于血虚萎黄；眩晕，心悸，失眠，月经不调，崩不止；肝肾阴亏，盗汗，足膝疼痛，腰膝酸软，耳鸣耳聋，头目昏花；遗精阳痿；不育不孕；月经不调；崩漏下血；须发早白；消渴；便秘；肾虚喘促等证。

丹参：味苦，性微寒，归心、肝经，具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神的功效，主治月经不调，经闭痛经，症瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠；肝脾肿大，心绞痛等证。

川芎：味辛，性温，归肝、胆、心包经，具有活血行气，祛风止痛的功效，主治月经不调；经闭痛经；产后瘀滞腥痛；症瘕肿块；胸胁疼痛；头痛眩晕；风寒湿痹；跌打损伤；痈疽疮疡等证。

黄精：味甘，性平，入肺、脾、肾经，具有滋肾润肺，补脾益气的作用，用于阴虚肺燥，干咳痰少，消渴多饮，脾胃虚弱，脾气虚或脾阴不足，肾虚精亏，腰膝酸软，须发早白等证。

地龙：味成，性寒，归肝、脾、膀胱经，具有清热定惊，通络平喘，利尿的功效，主治高热神昏、关节痹痛，肢体麻木，半身不遂，肺热咳喘，水肿尿少的功效。

水蛭：味成、苦，性平，入肝经，具有破血逐瘀的功效，用于血淤闭经，症瘕腹痛、蓄血、损伤瘀血作痛、痈肿丹毒等症的治疗。

路路通：味苦，性平，归肝，肾经，具有祛风活络，利水通经的功效，用于关节痹痛，麻木拘挛，水肿胀满，乳少经闭等证。

全蝎：味辛，性平，归肝经，具有息风镇痉，攻毒散结，通络止痛的功效，主治小儿惊风，抽搐痉挛，中风口歪，半身不遂，破伤风，风湿顽痹，偏正头痛，疮疡，瘰疬等证。

茜草：性寒，味苦，归肝经，功效：凉血止血；活血化瘀，主治血热咯血、吐血、衄血、尿血、便血、崩漏、经闭、产后瘀阻腹痛、跌打损伤、风湿痹痛、黄疸、疮痈、痔肿等证。

郁金：味辛、苦，性寒，归肝、心、肺经，具有行气化瘀，清心解郁，利胆退黄的功效，主治经闭痛经，胸腹胀痛、刺痛，热病神昏，癫痫发狂，黄疸尿赤等证。

怀牛膝：

片姜黄：拉丁名RhizomaWenyujinConcisum，味辛、苦，性温，归肝、脾经，具有破血行气，通经止痛的功效。用于血滞经闭，行经腹痛，胸胁剌痛，风湿痹痛，肩臂疼痛，跌扑损伤等证。

延胡索：又名玄胡索、元胡索、元胡，味辛、苦，性温，入肝、脾经，具有活血散瘀，行气止痛的作用，用于气滞血瘀引起的各种痛证，尤为心腹疼痛所常用，如肝郁化热，肝胃不和之胃脘腹胀，具有镇痛的作用。

炒山药：拉丁名dioscoreaerhizoma，味甘，性平，入肺、脾、肾经，具有健脾补肺、益胃补肾、固肾益精、聪耳明目、助五脏、强筋骨、长志安神、延年益寿的功效，主治脾胃虚弱、倦怠无力、食欲不振、久泄久痢、肺气虚燥、痰喘咳嗽、肾气亏耗、腰膝酸软、下肢痿弱、消渴尿频、遗精早泄、带下白浊、皮肤赤肿、肥胖等证。

生白术：拉丁名atractylodismacrocephalaerhizoma，味苦、甘，性温，入脾、胃经，具有健脾益气，燥湿利水，固表止汗，安胎的作用，用于脾胃虚弱，食少胀满，倦怠乏力，泄泻，水湿停留、痰饮、水肿，表虚自汗等证。

北沙参：性微寒，味甘、微苦，具有养阴清肺，益胃生津的功效，主治肺热燥咳、劳嗽痰血、热病津伤口渴等证。

百合：味甘，性微寒，入心、肺经，具有养阴润肺，清心安神的功效，主治阴虚久咳，痰中带血，虚烦惊悸，失眠多梦，精神恍惚等证。

制龟板：味成、甘，性微寒，入肾、心、肝经，有滋阴潜阳，益肾添精，固冲止崩的作用。主要用于肝肾阴虚、肝阳上亢之头目晕眩；阴虚内热之骨蒸劳嗽，盗汗遗精，瘦弱少气；心阴不足，痰火上扰之心悸怔忡；精血不足之腰酸脚软，小儿行迟；阴虚血热、冲任损伤之崩漏，行经不止；阴虚湿热下注之赤白带下等症状，龟板具有补血、解热镇痛的作用，能降低动物体内的甲状腺素水平。

枸杞子：拉丁名lyciifructus，味甘、性平，入肝、肾经，有补益肝肾、养血补血、益精明目、润肺止咳的作用，主要用于肝肾两虚、精血不足之腰膝酸软、头晕耳鸣、遗精耳鸣、自汗乏力；肾阳不足之阳痿、不育；阴精亏损、肝血不足之眼目昏花以及阴虚劳嗽等证。

炙甘草：味甘，性平，入十二经，调和药性，祛痰止咳的作用，并能健脾和中，缓急止痛，主要用于补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。

所述中药药物中各原料药的重量分别为生黄芪30g～40g、生地黄15g～25g、熟地黄20g～30g、丹参20g～30g、川芎15g～25g、黄精30g～40g、地龙10g～15g、水蛭10g～15g、路路通5g～15g、全蝎10g～15g、茜草20g～30g、郁金25g～35g、怀牛膝20g～30g、片姜黄15g～25g、延胡索20g～30g、炒山药20g～30g、生白术15g～25g、北沙参25g～35g、百合10g～20g、制龟板20g～30g、枸杞子15g～25g和炙甘草20g～30g。

进一步优选，所述中药药物中各原料药的重量分别为生黄芪35g～40g、生地黄15g～20g、熟地黄25g～30g、丹参25g～30g、川芎15g～20、黄精35g～40g、地龙10g～15g、水蛭10g～15g、路路通10g～15g、全蝎10g～15g、茜草25g～30g、郁金25g～30g、怀牛膝25g～30g、片姜黄15g～20g、延胡索25g～30g、炒山药25g～30g、生白术15g～20g、北沙参25g～30g、百合15g～20g、制龟板25g～30g、枸杞子15g～20g和炙甘草25g～30g。

最优选，所述中药药物中各原料药的重量分别为生黄芪35g、生地黄20g、熟地黄25g、丹参25g、川芎20g、黄精35g、地龙10g、水蛭10g、路路通10g、全蝎10g、茜草25g、郁金30g、怀牛膝25g、片姜黄20g、延胡索25g、炒山药25g、生白术20g、北沙参30g、百合15g、制龟板25g、枸杞子20g和炙甘草25g。

本发明提供的中药药物还包括药学上可接受的载体和辅料，可以采用常规的制备方法，添加常规的载体和辅料制备成所需要的各种剂型，优选剂型为片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂或粉剂，优选为口服液。

本发明还提供了上述药物的制备方法，其包括：

所述第一步进一步具体为取生黄芪、丹参、黄精、地龙、水蛭、全蝎、怀牛膝、片姜黄、北沙参、制龟板、枸杞子和炙甘草分别粉碎成粉末，按上述重量配比，混合在一起，获得混合物，用相对于混合物质量5～8倍醇浓度为80～90％乙醇渗漉，静置24-36小时后，以2～4ml/min的速度收集渗漉液，调节pH为7，静置24小时，抽滤，回收乙醇并浓缩，干燥，粉碎，获得第一粉末。

所述第二步进一步具体为将佘下原料药组分分别粉碎，按上述重量配比混合，获得混合物，用相对于混合物质量3～5倍的水提取两次，将提取液合并，离心，取上清液，将所得上清液大孔吸附树脂柱，用2～4倍柱床体积纯水洗脱杂质，再用3～6倍柱床体积的醇浓度为40％～80％乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2～4倍柱床体积/小时，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，获得第二粉末。

当制备成口服液时，所述第三步进一步具体为将所述第一粉末和第二粉末混合，进一步碎成200目～400目的粉末，加相对于获得的粉末质量3～5倍量的蒸馏水，0.2～0.4倍的蔗糖，0.03～0.05倍的苯甲酸钠，搅拌，煮沸，冷却，过滤，分装，灭菌即获得口服液。

以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1口服液1

取生黄芪35g、丹参25g、黄精35g、地龙10g、水蛭10g、全蝎10g、怀牛膝25g、片姜黄20g、北沙参30g、制龟板25g、枸杞子20g和炙甘草25g分别粉碎成粉末，混合在一起，获得混合物，用1.8kg醇浓度为90％乙醇渗漉，静置36小时后，以3ml/min的速度收集渗漉液，调节pH为7，静置24小时，抽滤，回收乙醇并浓缩，干燥，粉碎，获得第一粉末，将生地黄20g、熟地黄25g、川芎20g、路路通10g、茜草25g、郁金30g、延胡索25g、炒山药25g、生白术20g、百合15g分别粉碎，混合，获得混合物，用900g的水提取两次，将提取液合并，离心，取上清液，将所得上清液大孔吸附树脂柱，用3倍柱床体积纯水洗脱杂质，再用5倍柱床体积的醇浓度为60％乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2倍柱床体积/小时，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，获得第二粉末，将所述第一粉末和第二粉末混合，进一步碎成300目的粉末，加相对于获得的粉末质量4倍量的蒸馏水，0.2倍的蔗糖，0.03倍的苯甲酸钠，搅拌，煮沸，冷却，过滤，分装，灭菌即获得口服液1。

实施例2口服液2

取生黄芪35g、丹参25g、黄精35g、地龙10g、水蛭10g、全蝎10g、怀牛膝25g、片姜黄15g、北沙参25g、制龟板25g、枸杞子15g和炙甘草25g分别粉碎成粉末，混合在一起，获得混合物，用1.8kg醇浓度为90％乙醇渗漉，静置36小时后，以3ml/min的速度收集渗漉液，调节pH为7，静置24小时，抽滤，回收乙醇并浓缩，干燥，粉碎，获得第一粉末，将生地黄15g、熟地黄25g、川芎15g、路路通10g、茜草25g、郁金25g、延胡索25g、炒山药25g、生白术15g、百合15g分别粉碎，混合，获得混合物，用900g的水提取两次，将提取液合并，离心，取上清液，将所得上清液大孔吸附树脂柱，用3倍柱床体积纯水洗脱杂质，再用5倍柱床体积的醇浓度为60％乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2倍柱床体积/小时，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，获得第二粉末，将所述第一粉末和第二粉末混合，进一步碎成300目的粉末，加相对于获得的粉末质量4倍量的蒸馏水，0.2倍的蔗糖，0.03倍的苯甲酸钠，搅拌，煮沸，冷却，过滤，分装，灭菌即获得口服液2。

实施例3口服液3

取生黄芪40g、丹参30g、黄精40g、地龙15g、水蛭15g、全蝎15g、怀牛膝30g、片姜黄20g、北沙参30g、制龟板30g、枸杞子20g和炙甘草30g分别粉碎成粉末，混合在一起，获得混合物，用2kg醇浓度为90％乙醇渗漉，静置36小时后，以3ml/min的速度收集渗漉液，调节pH为7，静置24小时，抽滤，回收乙醇并浓缩，干燥，粉碎，获得第一粉末，将生地黄20g、熟地黄30g、川芎20g、路路通15g、茜草30g、郁金30g、延胡索30g、炒山药30g、生白术20g、百合20g分别粉碎，混合，获得混合物，用1kg的水提取两次，将提取液合并，离心，取上清液，将所得上清液大孔吸附树脂柱，用3倍柱床体积纯水洗脱杂质，再用5倍柱床体积的醇浓度为60％乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2倍柱床体积/小时，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，获得第二粉末，将所述第一粉末和第二粉末混合，进一步碎成300目的粉末，加相对于获得的粉末质量4倍量的蒸馏水，0.2倍的蔗糖，0.03倍的苯甲酸钠，搅拌，煮沸，冷却，过滤，分装，灭菌即获得口服液3。

实施例4毒理学试验

急毒性试验

实验动物

ICR小鼠，体重18～22g，清洁级，雌雄各半，购自青岛大学医学院实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK(鲁)20141350。

受试样品

本发明实施例1制备的口服液1，为了便于实验动物灌胃给药，本实验中配置为折算为所含生药浓度，其剂量下述。

实验方法

取体重18～22g的小鼠60只，雌雄各半，按体重随机分为6组，分别为5个给药组和对照组。小鼠在实验前禁食16h，不禁水，各组按表1所列剂量一次性灌胃给药，灌胃体积为0.3ml/10g，对照组给以等体积蒸馏水。药物以蒸馏水稀释，剂间比为1∶0.8，各给药组剂量分别为171.43、137.14、109.71、87.77、70.22g生药/kg。给药后即刻观察动物的反应情况，包括动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等。对死亡动物及时大体解剖，其他动物在观察期结束后处死进行大体解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查。连续观察14天，同时每周称体重一次。

表1小鼠14天内死亡数

体重观察结果显示，给药2、3、4组小鼠于给药后一周的体重较对照组明显减轻，其中第3、4组小鼠在第二周时体重有所恢复，而第2组小鼠与对照组相比仍有明显差异。14天观察结束后颈推脱白处死小鼠，进行大体解剖，对主要脏器进行肉眼观察，结果各器官的体积、颜色、质地未发现异常改变。

以LD₅₀数据处理软件计算半数致死量，结果：半数致死量LD50＝119.26g(生药)/kg，LD₅₀95％的置信区间为73.94g/kg≤LD₅₀≤93.39g/kg。

拟定的人用剂量为30g/人/天，以人体重60kg计，相当于0.5g生药/kg。则其LD₅₀相当于人用临床刻量的119.26/0.5＝176倍。

最小致死量MLD(minimumlethaldose)计算：本发明中药制剂小鼠急性毒性试验中，给药第四组有动物死亡，而给药第5组未引起动物死亡，则其口服最小致死量为：87.77g生药/kg。最小致死量相当于人临床拟用刻量的87.77/0.5＝176倍。

长期毒性研究

实验动物

SD大鼠，120只，雌雄各半，体重70～110g，清洁级，购自青岛大学医学院实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK(鲁)20145207。

受试样品

实验方法

(一)药物的刻量和动物数设三个给药组和一个对照组，每组大鼠30只，雌雄各半。实验开始前进行适应性观察一周，然后按体重随机分为4组，雌雄分开飼养，每笼5只，每日灌胃给药一次，并进行一般观察，包括外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便及给药局部反应等，连续6个月，于给药3个月时每组处死大鼠10只，雌雄各半，进行系统尸解，并取脏器称重及做组织病理学检查，测定血常规及血液生化指标。给药结束时，于末次给药后24小时每组处死大氣14只，雌雄各半，同法进行检查及测定。剩余大鼠停药，继续饲养、观察二周后同法处死，取脏器称重，进行组织病理学解剖，并测血常规及血液生化指标。

1、高剂量组：药物剂量为25g生药/kg，相当于成人拟用临床剂量(30g生药/曰/人)的倍数为25/(30/60)＝50倍。

2、中剂量组：药物剂量为12.5g生药/kg，相当于成人拟用临床剂量(30g/日/人)的倍数为12.5/0.5＝25倍。

3、低剂量组：药物别量为6.25g生药/kg，相当于成人拟用临床剂量(30g/曰人)的倍数为6.25/0.5＝12.5倍。

4、对照组：给予等体积蒸馏水。

(二)给药方法和周期：

1、给药方法：本实验采用灌胃法给药。

2、给药体积：10ml/kg体重，每周根据体重情况调整一次给药体积。

3、给药周期：每日给药一次，每天给药时间相同为上午8：30～9：30，每周给药6天，周日不给药，连续6个月，停药后继续饲养2周作为恢复期观察。

(三)检测项目：

1、一般观察

每天观察外观体征和行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状、给药局部反应等，每周称一次体重和进食量。

2、血液学指标

血小板数、红细胞数、白细胞总数及白细胞分类、血红蛋白、红细胞容积、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、网织红细胞计数、凝血晦原时间。

3、血液生化指标

丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(Crea)、减性填酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、总胆固醇(T-CHO)、总胆红素(T-BIL)、肌酸破酸激酶(CK)、甘油三醋(TG)、纳离子浓度(Na⁺)、钟离子浓度(K⁺)、氯离子浓度(Cr)。

4、脏器系数及组织病理学检查

心、肝、脾、肺、皆、脑、胃、十二指肠、回肠、空肠、结肠、直肠、脑垂体、脊髓、胸骨(骨和骨髓)、肠系膜淋巴结、膀胱、视神经、坐骨神经、睾丸(含附睾)、子宫、卵巢、胸腺、肾上腺、甲状腺、唾液腺、前列腺、姨腺等脏器，先作肉眼观察，对心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、附睾、子宫、卯巢、胸腺、肾上腺等脏器称湿重，计算脏器系数，并将所有10脏器保存于10％福尔马林溶液中，作组织病理学检查。病理检查先对高剂量组和对照组的上述脏器进行，如发现异常则再检查中剂量组和低剂量组，如无异常则不再检查其他组别的脏器。

(四)检测指标的时间

一般性观测每天一次，每周记录各组饲料消耗及体重一次。中期血象及血液生化于给药3个月时进行，每组取10只大鼠，雌雄各半，取血进行测定。末期检测在最后一次给药后24h，每组取14只大鼠进行，雌雄各半。检测指标前禁食14h，不禁水。

(五)可逆性观察

佘下动物停药，继续观察二周，以了解毒性反应的可逆性程度和可能出现的退缓性毒性反应，观察结束时全部处死，同上法测定心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、附睾、子官、卯巢、胸腺、肾上腺等的脏器系数，并做血象及血液生化检测。

实验结果

本发明实施例1制备的口服液1以25g生药/kg、12.5g生药/kg、6.25g生药/kg(以人体重60kg计算，相当于拟用临床别量的50、25、12.5倍)三个剂量连续灌胃给药6个月，对照组给予等体积蒸馏水，对大鼠的外观体征、行为活动、腺体分秘、呼吸、粪便、进食量等均无不良影响。高、中、低剂量给药组雄性大鼠的体重低于雄性对照组并且有统计学意义(经t检验，P＜0.05)，这可能与给药量大影响动物进食有关，也可能与黄连降糖片的降脂作用有关，但无毒理学意义。血液学、血液生化指标检测结果表明，给药组与对照组均未见有统计学意义的差异，也末见有生物学意义的异常数据。组织病理学检查显示，各组大鼠的主要脏器均无明显病变发生。

实施例5临床资料

1.1病例来源及分组

选取2013年1月-2013年7月在青岛大学医学院附属医院住院的早期DN患者178例。将符合纳入标准的患者，根据就诊时间顺序按随机数字表法随机分为两组，益气养阴化瘀通络方治疗组(治疗组)和厄贝沙坦治疗组(对照组)。治疗组99例，其中男41例，女58例；年龄36-68岁，平均(55.9±13.5)岁；病程1.5-30年，平均(12.3±6.7)年。对照组79例，其中男39例，女40例；年龄34-70岁，平均(58.5±15.9)岁；病程2-30年，平均(10.1±8.9)年。两组在性别、年龄、病程方面比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

诊断标准

西医诊断标准

参照世界卫生组织《糖尿病诊断标准》，且根据国际通用的MogensenDN分期诊断标准，分为五期：

I期：肾小球高滤过期。肾脏体积增大，肾小球滤过率(GFR)升高，GFR增加30％-40％，可高达150ml/min。病理：肾小球肥大，基底膜(GBM)和系膜正常。此期肾脏结构正常。

II期：正常白蛋白尿期。GFR增高或正常；尿白蛋白排泄率(UAER)多数在正常范围，应激后可升高，体息后可恢复。病理：肾小球毛细血管基底膜(GBM)增厚和系膜扩张。

III期：早期糖尿病肾病期。UAER持续在20-200μg/min(或30-300mg/24h)，GFR大致正常。病理：GBM增厚和系膜扩张明显，出现肾小球结带型和弥漫型病变以及小动脉玻璃样变，并开始出现肾小球荒废。

IV期：临床糖尿病肾病期。出现大量白蛋白尿，UAER＞200μg/min，或持续尿蛋白＞0.5g/24h，GFR下降，可伴有浮肿、高血压、‘肾功能减退。病理：GBM明显增厚，系膜区扩张，荒废的肾小球增加(平均占36％)，残余肾小球代偿性肥大。

V期：肾功能衰竭期。多数肾单位闭锁，GFR进行性下降，尿蛋白量增多或可因肾小球荒废而减少，血肌配、尿素氮升高；伴严重高血压、低蛋白血症、水肿以及尿毒症症状。病理：肾小球广泛硬化、荒废，肾小管萎缩及肾间质纤维化。

将I、II、III期统称为早期糖尿病肾病，第IV期称为临床期糖尿病肾病(中期糖尿病肾病)，第V期称为晚期糖尿病肾病。

中医辨证标准及中医证候评分标准

参照中华人民共和国卫生部制定的《中医证候规范》，辨证为脾肾不足，气阴两虚之证，并伴瘀血、湿浊之象，证见神疲乏力，少气懒言，自汗畏风，面色黛黑或晦暗，腰脊酸痛，口粘欲饮，五心烦热，口干咽燥，舌淡苔白或舌红少苔或舌质紫暗，舌苔厚腻等症。证候评分标准参照《中药新药临床研究指导原则》(试行)，采取症状积分法，按轻重分4个等级，无症状0分，轻度1分，中度2分，重度3分。具体评分标准如下：

(1)神疲乏力无症状0分；精力减退，耐力减退，不影响日常生活1分；精神倦怠，一般活动即感乏力2分；精神疲惫，即使体息也感无力3分。

(2)少气懒言无症状0分；活动后气短，平素懒于多言1分；安静时也时有气短，懒于言语2分；安静时持续气短，语声低微，言语无力3分。

(3)自汗畏风无症状0分；安静时略有汗出，动则汗出增多1分；安静时即有明显汗出，动则多汗2分；安静时即汗出，活动则大汗欲脱3分。

(4)面色黛黑或晦暗无症状0分；面部淡黛黑(晦暗)色1分；面色黛黑(晦暗)2分；面色呈深黛黑(晦暗)色3分。

(5)腰脊酸痛无症状0分；腰脊酸痛偶见，劳累后出现，工作活动仍正常1分；腰脊酸痛隐隐，体息缓解，可一般工作2分；腰脊酸痛明显，不能多站多行，体息时亦有，影响行动3分。

(6)口粘欲饮无症状0分；口中略感粘腻1分；口中粘腻不舒，偶有异味2分；口有尿臭，口中粘腻难受，时时漱口3分。

(7)五心烦热无症状0分；偶有手足心发热，或兼有心烦1分；时时手足心发热，兼有心烦2分；持续手足心热，欲持冷物，或兼烦躁不安3分。

(8)口干咽燥无症状0分；咽喉微干，稍饮水即可缓解1分；咽喉干燥，饮水缓解2分；口干咽燥难忍，饮水也难缓解3分。

选择病例标准

纳入标准

(1)符合上述西医诊断标准和中医辨证标准；

(2)性别不限，年龄18-70岁；

(3)III期糖尿病患者，3个月内尿检连续2次尿白蛋白排泄率(UAER)20～200μg/min(30～300mg/24h)；

(4)签署知情同意书者。

排除标准

(1)难治性水肿；

(2)24h尿蛋白定量＞10g/24h，血清白蛋白＜25g/L；

(3)肾血管性高血压；

(4)6个月内危急重症病史者，如恶性高血压、脑血管意外、心肌梗死、糖尿病酮症酸中毒等；

(5)有充血性心力衰竭者；

(6)癌症、妊娠期及哺乳期妇女及对本方中药物过敏或不能按规定服用药物者。

病例的剔除和脱落

(1)纳入后发现不符合纳入标准者，符合纳入标准而纳入后末曾用药者，需予剔除；

(2)纳入后，患者依从性差，不能坚持治疗者、观察中发生过敏反应或严重不良反应者、病情恶化，必须采取紧急措施者、提出退出观察者等无论何时何因退出者，均为脱落病例。

(3)剔除和脱落率＜15％。

所有剔出病例，疗程己完成1/2者，计入疗效统计。

终止观察标准

(1)在观察过程中出现过敏反应或严重不良反应者；

(2)患者依从性差，不能坚持治疗者；

(3)在观察过程中出现病情恶化，必须采取紧急措施者；

所有终止观察病例，如发生不良反应者，应按不良反应统计，如其他情况终止观察的病例，疗程己完成1/2者，计入疗效统计。

治疗方法

基础治疗

两组均采用调整生活方式、饮食控制、降糖、降压、降脂等基础治疗，具体如下：

(1)调整生活方式：对患者进行糖尿病知识教育，调整其生活方式，包括减肥、禁烟和适当运动。

(2)饮食控制：宜给予低盐低脂优质低蛋白饮食。蛋白摄入量宜限制在0。8g/(kg·d)以下，富含优质蛋白的食品如鱼、海产品、瘦肉和蛋，限制植物蛋白和动物内脏等。

(3)降糖：严格控制血糖，治疗可予格列哇酮、α糖什酶抑制剂或胰岛素，使糖化血红蛋白控制在7.0％以下。

(4)降压：可选用钙离子拮抗剂或利尿剂等，避免使用血管紧张素转化酶

抑制剂(ACEI)及血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)类降压药物，使血压控制在130/80mmHg以下。

(5)降脂：积极纠正血脂紊乱，经饮食、运动、控制血糖等治疗血脂仍不达标者，可选择他汀类、贝特类或其他降脂药。

(6)随症处理：纠正电解质紊乱和酸碱失衡。

分组治疗

治疗组

采用调整生活方式、饮食控制、降糖、降压、降脂等基础治疗加本发明实施例1制备的口服液1，每日200ml，分早、晚2次服用。

对照组

采用调整生活方式、饮食控制、降糖、降压、降脂等基础治疗加厄贝沙坦片(商品名：安博维，150mg/片，杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司生产，150mg/片，批准文号：国药准字J20030113)，每日1片，早饭前口服。

疗程

所有病例治疗1年后检测各项指标，评价疗效，每3个月为一访视点。

观察指标

疗效性指标

观察终点事件发生率(终点事件：糖尿病肾病患者由III期进入IV期，UAER＞300mg/24h或尿蛋白定量＞0.5g/24h)、两组治疗前后临床症状、尿白蛋白排泄率(UAER)及生化指标包括血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、血脂(TC、TG)。

采用免疫比浊法测定UAER，试剂购自美国RANDOX公司。SCr和血脂采用酶测定法，BUN采用紫外一谷氨酸脱氢酶法测定，各项生化指标均采用美国贝克曼公司BECKMANCX7型全自动生化分析仪检测，试剂购自日本协和生物有限公司。

安全性指标

观察血、尿、便常规加隐血检查、肝功能、心电图检查、肝胆脾胰B超，观察前和观察期满各检查1次；记录观察期间出现的不良反应及处理措施等情况。

疗效评价

疗效判定标准

参照《中药新药临床研究指导原则》(试行)中有关治疗慢性肾炎和治疗消渴病(糖尿病)的有关内容，制定糖尿病肾病疗效判定标准。显效：临床症状基本消失，证候积分减少＞90％，UAER正常或下降50％以上，血糖、血脂下降30％或恢复正常。有效：临床症状较前好转，证候积分减少＞30％，UAER、血糖、血脂有所改善，但不足显效标准。无效：临床症状无改善或加重，实验室指标无变化或升高。

安全性评价

1级是安全，无任何不良反应。

2级是比较安全，如有不良反应，不需要做任何处理可继续给药。

3级是有安全性问题，有中等程度的不良反应，做处理后可继续给药。

4级是因不良反应中止观察。

统计学方法

计数资料两样本率的比较采用卡方检验，各计量资料均以均数士标准差表示，两两比较采用t检验，以P＜0.05为有统计学差异。所有数据采用SPSS13.0统计软件进行处理。

结果

两组总体疗效比较

在观察期间2例患者依从性差，末按规定服用药物，另1例患者服用了影响疗效判定的药物，故予以排除，其余175例患者均完成相关治疗，其中治疗组98例，对照组77例。

表2总体疗效比较(％)

组别	n	痊愈	有效	无效	显愈率(％)
						治疗组	98	31	57	10	89.80
对照组	77	10	48	19	75.32

经卡方分析，治疗组与对照组有显著统计学差异，P＜0.05，通过分析可知，治疗组疗效优于对照组。

中医证候积分比较

两组治疗前比较无统计学差异(P＞0.05)，提示具有可比性；治疗组治疗前后比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；对照组治疗前后神疲乏力、腰脊酸痛症状改善明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余症状无明显改善P＞0.05；两组治疗后比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示治疗组症状改善较对照组明显。

表3中医症候积分比较

与治疗前比较：^*P＜0.05，；与对照组比较：^οP＜0.05

表4中医症候积分比较(续)

与治疗前相比：^*P＜0.05；与对照组相比：^οP＜0.05

表5中医症候积分比较(续)

与治疗前相比：^*P＜0.05与对照组相比：^οP＜0.05

治疗前后尿白蛋白排泄率、血肌配、尿素氮、血脂比较

两组治疗前比较无统计学差异(P＞0.05)；两组治疗后尿白蛋白排泄率、血肌配、尿素氮、血脂均较治疗前显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；两组各项治疗后比较，治疗组血脂较对照组明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，而尿白蛋白排泄率、血肌配、尿素氮两组之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表6UAER、SCr、BUN比较

与治疗前相比：^*P＜0.05与对照组相比：^οP＜0.05

表7TC、TG比较

与治疗前相比：^*P＜0.05与对照组相比：^οP＜0.05

终点事件发生率比较

治疗前所有病例UAER均在20～200μg/min(30～300mg/24h)，治疗组与对照组比较无统计学差异；1年后治疗组有2名患者进入临床糖尿病肾病，终点事件发生率为5.4％，对照组有4例病人进入临床糖尿病肾病，终点事件发生率为10.5％，两者相比较，治疗组要低于对照组，但两者无统计学差异(P＞0.05)。

安全性分析

在完成观察的175例患者中，安全性指标末见明显异常。

从该临床资料可以看出，本发明制剂能明显改善早期DN患者的症状、体征，并且总体疗效和中医证候疗效均优于厄贝沙坦；本发明制剂能明显调节脂代谢紊乱；本发明制剂能明显降低早期DN患者尿白蛋白排泄率、血肌配、尿素氮，保护肾功能，从而延缓DN的进展。

实施例6动物实验

实验材料

140只健康SD大鼠，雄性，清洁级。体重为120-150g由青岛大学医学院实验动物中心提供，动物合格证编号：1008095。普通饲料：青岛大学医学院实验动物中心提供，高脂饲料：含蛋白质18.6％、脂类22.3、糖44.4％、水10％，其余为矿物质和维生素等。

实验药物

受试药物：本发明实施例1制备的口服液1，制备成含生药浓度为1g/ml液体，4摄氏度保存备用。

实验试剂

链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司；

柠檬酸，天津市百世化工有限公司；

柠檬酸三钠，天津市博迪化工有限公司；

血糖试纸，德国；

目测尿糖、尿蛋白试纸，广州高尔宝生物技术有限公司；

0.9％生理盐水，石家庄四药有限公司；

多聚赖氨酸，河北博海生物工程有限公司；

兔抗大鼠工以M-1多克隆抗体，河北博海生物工程开发有限公司；

兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗体，河北博海生物工程开发有限公司。

实验仪器

Accu-ChekActive快速血糖仪，德国BECKMANCX7全自动生化分析仪，美国贝克曼公司LD4-2A低速离心机，北京医用离心机厂PHSJ-4A型

实验室pH计，上海雷磁仪器厂MDF-382E型超低温

冰箱，日本三洋公司HM340E型石蜡切片机

德国ZEISS公司DT2000型电子天平，常熟双杰测试仪器厂

精密电子天平，北京赛多利斯天平有限公司

DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司

手提式压力蒸汽灭菌器，上海华线医用核子仪器有限公司

Olympus光学显微镜，日本OLYMPUS公司

UCT超薄切片机，德国LEICA公司

日立H7500型透射电镜，日本HITACHI公司

HPIAS-1000型全自动彩色病理图象分析系统，武汉千屏影像技术公司

超纯水机，美国Thermo公司

实验方法

试剂配制

1％STZ：(1)枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制：O.1M枸橼酸母液：称2.1g枸橼酸(分子量210.14)溶于100ml双蒸水；0.1M枸橼酸三钠母液：称2.94g枸橼酸三钠(分子量294.10)溶于100ml双蒸水；O.1M枸橼酸缓冲液(PH4.5)：由枸橼酸和枸橼酸三钠按1∶1.32配制(用PH计测定PH值)。

(2)STZ按30mg分装于Eppendorf管内，-20℃保存，使用时用pH4.5的0.1M枸橼酸缓冲液配成1％的浓度，0.22微孔滤膜过滤除菌，现配现用。10％中性甲醛固定液：37％～40％甲醛液100ml、双蒸水900ml，混匀，加入足量碳酸钙。

动物模型制备及分组

选用健康雄性SD大鼠40只，体重120-150g，给予普通饲料适应性喂养一周，分别检测血糖、尿糖和尿蛋白均为阴性者用于实验。按体重随机分为正常组10只，给予普通饲料。高脂饲料组30只，给予高脂饲料。12周后，高脂饲料组大鼠禁食不禁水按30mg/kg，一次性腹腔注射STZ。

正常组注射相应体积的枸橼酸缓冲液。72h后尾静脉取血测血糖，血糖多16.7mmol/L为DM造模成功。将成模大鼠按体重随机分为模型组10只，益气养阴化瘀通络中药组10只，益气养阴通络中药组10只，实验过程中两治疗组大鼠各死亡一只，模型组1只因血糖缓解予以剔除。

给药方法

DM模型成模后开始给药，正常组和模型组灌服相应量生理盐水。本发明实施例制备的口服液1制剂组大鼠按10ml/kg给药，生药浓度为1g/ml液体；益气养阴组大鼠按10ml/kg给药(溶液含生药量为0.77g/ml，由黄芪、地黄、黄精、地龙、水蛭、全蝎等组成)。各组灌胃，日1次，给药量按体表面积折算，连续给药32周。实验期间，不给予胰岛素及其他干预，不定期检测尾静脉血糖，血糖缓解者予以剔除。

标本留取

标本留取，于给药32周末，分别于处死前1天用代谢笼收集24小时尿液，并记录尿量。腹腔注射水合氯醛麻醉后，股动脉取血，分离血清，用于血生化指标测定；杀死大鼠(杀死大鼠前12小时禁食不禁水)。切取肾脏，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重；将部分肾组织，迅速置于4℃预冷的4％戊二醛电镜固定液中，切成小块，用玻璃吸管转移至标本瓶内，留做电镜观察；部分用4％多聚甲醛固定，留做常规病理学观察及免疫组织化学观察。

观察指标及方法

体重、相对肾重

于治疗第32周末，称大鼠体重。大鼠处死后，取出左肾，切取左肾剥离被膜精确称重后，按下式计算相对肾重((kidneyweight/bodyweight，KW/BW)。

KW/BW＝肾脏重量/体重(g)

二十四小时尿蛋白定量

于治疗第32周末，收集大鼠24小时尿液(将各组大鼠单只置于代谢笼中，禁食自由饮水)，采用双缩脉法测定大鼠24小时尿蛋白定量。

血生化指标测定

于治疗第32周末，大鼠股动脉取血，分离血清，检测血清肌配、尿素氮。

光镜样品制备

肾组织在4％多聚甲醛中固定24小时，用75％，85％，95％，100％乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋。常规病理切片，分别行HE，PAS，MASSON染色，光镜下观察肾小球基底膜、系膜基质的病理变化。

透射电镜样品制备

取肾上极1mm³，迅速置入4℃预冷的4％戊二醛固定1小时，4摄氏度1％饿酸固定2小时，乙醇梯度脱水，100％丙酮脱水，丙酮与树脂混合液浸透15min，纯树脂浸透30min，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸油、柠檬酸铅双重电子染色，用电子显微镜进行观察和拍照。

免疫组化染色法检测肾组织ICAM-1，VCAM-1的表达

免疫组化步骤：

(1)取材：取实验组和对照组动物组织尽可能新鲜，PBS(磷酸盐缓冲液)洗，取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块。

(2)固定和包埋：用4％多聚甲醛(0.1MPBS，PH7.0～7.6，含0.1％DEPC)进行固定，经70％乙醇30分钟、80％乙醇30分钟、90％乙醇30分钟两次、95％乙醇30分钟两次、100％乙醇30分钟两次、二甲苯透明30分钟两次、55℃石蜡中30分钟两次、用铜制模具包埋组织块。

(3)切片：将厚度5μm的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜。

(4)脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100％乙醇5分钟两次、95％乙醇5分钟两次、90％乙醇5分钟两次、85％乙醇5分钟两次、75％乙醇5分钟两次、自来水冲洗、PBS洗两次。

(5)1％甲醇双氧水，室温10分钟，蒸馏水洗1次，0.1MPBS洗3次×5分钟。

(6)切片上滴加抗原修复液，室温10分钟，0.1MPBS洗3次×5分钟。

(7)切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。

(8)切片上滴加第一抗体，4℃过夜，0.1MPBS洗3次×5分钟。

(9)切片上滴加生物素化第二抗体((IgG)}370C20分钟，0.1MPBS洗3次×5分钟。

(10)切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液((S-A/HRP)，37摄氏度20分钟，O.1MPBS洗3次×5分钟。

(11)DAB显色：使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A，B，C各一滴，混匀，加至标本上，显色6分钟，充分水洗。

(12)苏木素复染细胞核1分钟，充分水洗、1％盐酸酒精分化、1％胺水反蓝、充分水洗、经70％乙醇5分钟、80％乙醇5分钟、90％乙醇5分钟两次、95％乙醇5分钟两次、100％乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片。镜下观察结果。阳性部位为棕黄色。

统计学分析

所有结果均采用SPSS13.0统计软件进行统计，所有资料数据以均数士标准差表示，用单因素方差分析，两两组间比较用LSD法对统计结果进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

每组大鼠体重，肥大指数(肾重/体重)

模型组，两中药治疗组的大鼠与正常组大鼠相比，体重显著下降(P＜0.01)；模型组，两中药组大鼠体重之间无统计学意义(P＞0.05)；模型组，两中药治疗组大鼠肥大指数比正常组显著增加(P＞0.05)，模型组大鼠，ZY1与ZY2之间大鼠之间肥大指数无统计学意义(P＞0.05)。

表8每组大鼠体重、肥大指数比较

组别	n	体重/g	肥大指数
				正常组	10	491.4±63.8	3.2±0.5
模型组	9	385.0±43.6	4.4±0.7
				益气养阴组	9	464.1±44.5^*	3.6±1.0^*
本发明制剂组	9	455.2±32.3^*#	3.4±0.7^*#

与模型组比较^*P＜0.01，与对照组比较，^#P＜0.05

每组大鼠24小时尿蛋白定量

与正常组大鼠相比，模型组，对照治疗组大鼠24小时尿蛋白定量均明显增高(P＜0.01)，本发明制剂组有升高，但统计学分析无统计学差异，P＞0.05；与模型组相比，两中药治疗组24小时尿蛋白定量均明显下降(P＜0.05)；本发明制剂组与对照组相比显著下降(P＜0.05)。

表94小时尿蛋白定量

组别	n	尿蛋白(mg/24h)
			正常组	10	7.13±1.81
模型组	9	58.60±6.97
			益气养阴组	9	27.23±4.33^*
本发明制剂组	9	13.47±3.23^*#

与模型组比较^*P＜0.05，与对照组比较，^#P＜0.05

每组大鼠BUN，Scr的比较

与正常组相比，模型组大鼠，两中药治疗组大鼠血清肌配水平比正常组明显增高(P＜0.05)，与模型组大鼠相比，两中药治疗组大鼠血清肌配水平显著下降(P＜0.05)；两中药治疗组之间Scr水平无显著差异(P＞0.05)；与正常组大鼠相比，模型组大鼠，两中药治疗组大鼠BUN水平均明显上升(P＜0.05)，与模型组相比，两中药治疗组大鼠BUN水平明显下降(P＜0.05)，本发明制剂组与对照组之间BUN水平无显著差异(P＞0.05)。

表10大鼠BUN，Scr的比较

组别	n	BUN	Cr
				正常组	10	5.15±0.56	65.43±4.51
模型组	9	9.37±1.51	83.72±5.25
				益气养阴组	9	8.35±1.61^*	70.85±4.46^*
本发明制剂组	9	7.24±0.79^*#	69.42±5.26^*

与模型组比较^*P＜0.05，与对照组比较，^#P＜0.05

肾脏病理形态学观察

光镜观察

正常组大鼠肾小球结构完整，末见肾小球肥大，肾小球毛细血管基底膜，系膜细胞系及其基质无明显改变；模型组大鼠可见肾小球明显肥大，肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜区变宽；两中药治疗组肾小球均有不同程度的病理改变。同模型组相比较，为肾小球肥大减轻，系膜细胞及基质少量增多，两中药治疗组间无明显区别。

电镜观察

正常组肾小球基底膜均匀无增厚，足突均匀分布，模型组大鼠肾小球毛细血管基底膜增厚明显，部分增生，足突广泛融合。两中药组大鼠肾小球毛细血管基底膜较正常，呈匀质样增厚，足细胞局部融合。

免疫组化染色法检测肾组织ICAM-1，VCAM-1表达

ICAM-1：正常组：肾小球内皮细胞、系膜细胞，包曼氏囊壁少许染色，肾小球系膜区，基底膜均少量表达；模型组：r肾球内皮细胞、系膜细胞可见强阳性棕黄色沉积，并有肾小球与囊壁粘连，粘连处呈阳性，可见肾小管变性坏死；两治疗组与模型组相比ICAM-1的表达范围和程度均减轻。

VCAM-1：正常组：可见肾小球内皮细胞和系膜细胞，肾小管上皮细胞少量着色；模型组；可见大部分肾小球内皮上呈阳性的棕黄色沉积，肾小管同小血管内皮也有阳性的棕黄着色；两治疗组与模型组相比VCAM-1的表达范围和程度均减轻。

从该实验可以看出，两治疗组中药可降低DN大鼠Scr，BUN，减少UPro的排泄，改善糖尿病肾病大鼠肾脏病理损害，延缓DN的进展，且本发明制剂组中药降尿蛋白疗效优于益气养阴组，两治疗组中药能够降低ICAM-1，VCAM-1表达，延缓DN进展从而达到对DN大鼠肾脏保护作用。

所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种用于治疗糖尿病肾病的中药药物，其特征在于：原料药包括生黄芪、生地黄、熟地黄、丹参、川芎、黄精、地龙、水蛭、路路通、全蝎、茜草、郁金、怀牛膝、片姜黄、延胡索、炒山药、生白术、北沙参、百合、制龟板、枸杞子和炙甘草。

2.如权利要求1所述的用于治疗糖尿病肾病的中药药物，其特征在于：各原料药的重量分别为生黄芪30g～40g、生地黄15g～25g、熟地黄20g～30g、丹参20g～30g、川芎15g～25g、黄精30g～40g、地龙10g～15g、水蛭10g～15g、路路通5g～15g、全蝎10g～15g、茜草20g～30g、郁金25g～35g、怀牛膝20g～30g、片姜黄15g～25g、延胡索20g～30g、炒山药20g～30g、生白术15g～25g、北沙参25g～35g、百合10g～20g、制龟板20g～30g、枸杞子15g～25g和炙甘草20g～30g。

3.如权利要求1或2所述的用于治疗糖尿病肾病的中药药物，其特征在于：各原料药的重量分别为生黄芪35g～40g、生地黄15g～20g、熟地黄25g～30g、丹参25g～30g、川芎15g～20、黄精35g～40g、地龙10g～15g、水蛭10g～15g、路路通10g～15g、全蝎10g～15g、茜草25g～30g、郁金25g～30g、怀牛膝25g～30g、片姜黄15g～20g、延胡索25g～30g、炒山药25g～30g、生白术15g～20g、北沙参25g～30g、百合15g～20g、制龟板25g～30g、枸杞子15g～20g和炙甘草25g～30g。

4.如权利要求1至3所述的用于治疗糖尿病肾病的中药药物，其特征在于：各原料药的重量分别为生黄芪35g、生地黄20g、熟地黄25g、丹参25g、川芎20g、黄精35gg、地龙10g、水蛭10g、路路通10g、全蝎10g、茜草25g、郁金30g、怀牛膝25g、片姜黄20g、延胡索25g、炒山药25g、生白术20g、北沙参30g、百合15g、制龟板25g、枸杞子20g和炙甘草25g。

5.如权利要求1至4所述的用于治疗糖尿病肾病的中药药物，其特征在于：所述中药药物还包括药学上可接受的载体和辅料。

6.如权利要求1至5所述的用于治疗糖尿病肾病的中药药物，其特征在于：所述中药药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂或粉剂。

7.权利要求1至6所述中药药物的制备方法，其特征在于，包括：

8.权利要求7所述中药药物的制备方法，其特征在于：所述第一步进一步具体为取生黄芪、丹参、黄精、地龙、水蛭、全蝎、怀牛膝、片姜黄、北沙参、制龟板、枸杞子和炙甘草分别粉碎成粉末，按上述重量配比，混合在一起，获得混合物，用相对于混合物质量5～8倍醇浓度为80～90％乙醇渗漉，静置24-36小时后，以2～4ml/min的速度收集渗漉液，调节pH为7，静置24小时，抽滤，回收乙醇并浓缩，干燥，粉碎，获得第一粉末。

9.权利要求7或8所述中药药物的制备方法，其特征在于：所述第二步进一步具体为将佘下原料药组分分别粉碎，按上述重量配比混合，获得混合物，用相对于混合物质量3～5倍的水提取两次，将提取液合并，离心，取上清液，将所得上清液大孔吸附树脂柱，用2～4倍柱床体积纯水洗脱杂质，再用3～6倍柱床体积的醇浓度为40％～80％乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2～4倍柱床体积/小时，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，获得第二粉末。

10.权利要求7至9所述中药药物的制备方法，其特征在于：当制备成口服液时，所述第三步进一步具体为将所述第一粉末和第二粉末混合，进一步碎成200目～400目的粉末，加相对于获得的粉末质量3～5倍量的蒸馏水，0.2～0.4倍的蔗糖，0.03～0.05倍的苯甲酸钠，搅拌，煮沸，冷却，过滤，分装，灭菌即获得口服液。