CN105393914B

CN105393914B - 大叶藻离体花序愈伤组织的诱导方法

Info

Publication number: CN105393914B
Application number: CN201410463124.3A
Authority: CN
Inventors: 郑凤英; 张飞; 刘雪芹; 金艳梅; 张伟; 韩晓弟
Original assignee: Shandong University Weihai
Current assignee: Shandong University Weihai
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2034-09-12
Also published as: CN105393914A

Abstract

本发明涉及一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，是以大叶藻花序为外植体，将经过表面消毒的花序切成3‑5mm长接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，每半月转接一次，培养近1个月后花序轴两侧膨大，逐渐形成愈伤组织；所述愈伤组织培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加2,4‑D、水解酪蛋白、蔗糖、琼脂和海盐。本发明采用改良的MS培养基，可有效地促进大叶藻愈伤组织的诱导，为大叶藻组培再生苗的产生和快速繁殖的实现提供重要的技术支撑。

Description

大叶藻离体花序愈伤组织的诱导方法

技术领域

本发明所属植物组织培养研究领域，本发明涉及一种大叶藻离体花序愈伤组织的诱导方法。

背景技术

愈伤组织的诱导是植物组织培养技术中最为重要的中间环节，多数植物的无菌苗再生需经历愈伤组织的诱导这一中间环节，因此，愈伤组织的成功诱导是植物无菌苗再生的重要技术支撑，同时，培养愈伤组织也可成为植物次生代谢物快速生产的一条途径。

大叶藻(Zostera marina L.)隶属于大叶藻科(Zosteraceae)大叶藻属(Zostera)，广布于北半球温带的浅水海域如海湾、泻湖和河流入海口，在我国辽宁、河北和山东近海广为分布。但近一个世纪里，其种群在全球范围内大面积衰退。因此，种群恢复研究成为大叶藻科学研究中的重点，其中，不断有学者试图通过植物组织培养手段来获得大叶藻无菌再生苗，以推进大叶藻种群恢复中种苗移栽的研究进程。虽对其的组织培养研究已有一段时间，研究进展却并不大，日本学者2001年以其茎尖为外植体，历经180d的培养获得了少量的愈伤组织；中国海洋大学2011年8月公开了“一种大叶藻属愈伤组织的诱导方法”专利，采用无菌实生苗的胚根、胚轴、子叶为外植体诱导出了愈伤组织。

本发明以大叶藻花序为外植体，短时间内诱导出愈伤组织，目前采用该技术方案的相关专利和文献未见报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种大叶藻离体花序愈伤组织的诱导方法，采用花序为外植体，可有效地获得愈伤组织，为大叶藻的快速繁殖和无菌组培苗再生提供重要的技术支撑。

本发明所采用的技术方案为：

本发明的一种大叶藻离体花序愈伤组织的诱导方法，是以大叶藻的花序为诱导愈伤组织的外植体。

本发明的具体步骤如下：

1）外植体的选取：采集大叶藻花枝，取其健康佛焰苞花序，经表面除杂、清洗后在超净工作台内进行消毒处理，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

2）愈伤组织的诱导培养：在无菌条件下将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于诱导培养基中，于15-25℃、黑暗条件下进行培养。其中，所述诱导培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加水解酪蛋白0-100mg/L、蔗糖或葡萄糖30-80g/L、2,4-D 2-20mg/L、琼脂5-7g/L、海盐20-30g/L。培养30-40d后可见到花序两侧组织膨大，产生愈伤组织。

本发明中，所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的情况下调整其中的硝酸钾为0-3800mg/L、硝酸铵为0-3300mg/L、磷酸二氢钾为0-340mg/L、七水硫酸镁0-740mg/L、二水氯化钙0-880mg/L。

本发明中，诱导培养基中添加的水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D、琼脂、海盐分别优选为100mg/L、30 g/L、2mg/L、5g/L、20g/L。

本发明的优点在于：大叶藻花期可持续3个月之久，因此外植体供体可获取时间较长；以其花序为外植体，表面消毒效果大大提升；采用改良培养基，愈伤组织获得时间较短。本发明为大叶藻无菌组培菌再生提供了重要的技术支撑，也为海草组织培养的成功奠定了基础。

具体实施方式

以下实施例仅用于发明本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

实施例1：一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，其实施步骤包括：

1）外植体的选取：采集大叶藻花枝，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后转入超净工作台内，用10%的过氧化氢溶液浸泡15-20min，灭菌海水冲洗3次后，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

2）愈伤组织的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于诱导培养基中，在20℃、黑暗条件下进行培养，每半月转接一次。28d后可陆续见到花序两侧组织萌动、开始膨大，逐渐形成愈伤组织，诱导率高达34%；

3）所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的情况下调整其中的为硝酸钾为0-3800 mg/L、硝酸铵为0-3300 mg/L、磷酸二氢钾为0-340 mg/L、七水硫酸镁为0-740 mg/L、二水氯化钙为0-880 mg/L，诱导培养基中添加的水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D、琼脂、海盐分别为100mg/L、30 g/L、2mg/L、5g/L、20g/L。

实施例2：一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，其实施步骤为：

1）外植体的选取：取大叶藻花枝上健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后转入超净工作台内，用10%的过氧化氢溶液浸泡15-20min，灭菌海水冲洗3次后，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

2）愈伤组织的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于诱导培养基中，在20℃、黑暗条件下进行培养，每半月转瓶一次。40d后可陆续见到花序两侧组织萌动、开始膨大，逐渐形成愈伤组织，诱导率为26%；

3）所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的情况下调整其中的为硝酸钾为0-3800 mg/L、硝酸铵为0-3300 mg/L、磷酸二氢钾为0-340 mg/L、七水硫酸镁为0-740 mg/L、二水氯化钙为0-880 mg/L，诱导培养基中添加的水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D、琼脂、海盐分别为100mg/L、30 g/L、10mg/L、5g/L、20g/L。

实施例3：一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其实施步骤为：

2）愈伤组织的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于诱导培养基中，在20℃、黑暗条件下进行培养，每半月转接一次。40d后可陆续见到花序两侧组织萌动、开始膨大，逐渐形成愈伤组织，诱导率为7%；

3）所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的情况下调整其中的为硝酸钾为0-3800 mg/L、硝酸铵为0-3300 mg/L、磷酸二氢钾为0-340 mg/L、七水硫酸镁为0-740 mg/L、二水氯化钙为0-880 mg/L，诱导培养基中添加的水解酪蛋白、蔗糖、2,4-D、琼脂、海盐分别为100mg/L、30 g/L、20mg/L、5g/L、20g/L。

Claims

1.一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，其特征在于，是以大叶藻的花序为诱导愈伤组织的外植体；

由以下步骤组成：

1)外植体的选取：采集大叶藻花枝，取其健康佛焰苞花序，经表面除杂、清洗后在超净工作台内进行消毒处理，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

2)愈伤组织的诱导培养：在无菌条件下将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于诱导培养基中，于15-25℃、黑暗条件下进行培养；其中，所述诱导培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加水解酪蛋白100mg/L、蔗糖30g/L、2,4-D 2mg/L、琼脂5g/L、海盐20g/L；培养30-40d后可见到花序两侧组织膨大，产生愈伤组织；

所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的情况下调整其中的硝酸钾为0-3800mg/L、硝酸铵为0-3300mg/L、磷酸二氢钾为0-340mg/L、七水硫酸镁0-740mg/L、二水氯化钙0-880mg/L。