CN102577699A - 一种培育大叶藻无菌苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种培育大叶藻无菌苗的方法，其步骤是：选取形态饱满完整的大叶藻种子，用灭菌天然海水涮洗2次；用浓度为75％乙醇溶液浸泡10分钟，再用灭菌天然海水涮洗2次；将大叶藻种子移至浓度为1.5％的碘化钾溶液中浸泡20分钟，再用灭菌海水涮洗2次；接种到盐度为5‰的灭菌海水中，并放入恒温光照培养箱内，培养7～14天；转接到正常盐度的灭菌海水中，在温度保持15℃，湿度60％，光照强度40μmol·m^-2·s^-1，L∶D＝12∶12条件下再培养7～14天。本发明使大叶藻种子无菌苗培育迅速而简便，而且成本低，不需用额外的培养基和生长调节剂，节约成本，操作简便。

Description

一种培育大叶藻无菌苗的方法

技术领域

本发明涉及大叶藻的培育方法，尤其涉及大叶藻无菌苗的培育方法。

现有技术

大叶藻(Zostera marina L.)是一种营沉水生活的海洋高等植物，俗称海带草，属于被子植物门(Angiospermae)，单子叶植物纲(Monocotyledoneae，或称百合纲Liliopsida)，泽泻目(Alismales)，眼子菜科(Potamogetonaceae)，大叶藻属(Zostera L.)，多年生草本，广泛分布在近海生态系统中，在海洋生态环境保护中起着重要的作用。近年来对大叶藻的生物特性，种子萌发等各方面的研究也逐渐成为热点之一。若能快速地培养大叶藻无菌苗，可为后期进行大叶藻的组织培养等深入研究工作奠定基础。因为大叶藻的种子在不适的生活环境中会发生休眠，而且休眠时间有的可长达一年，使得种子的萌发时间不一致。目前的技术主要是通过低温保存种子，打破种子的休眠状态，再进行无菌处理，然后用专门的培养基进行无菌苗的培养。因低温处理种子需要一个月或更长的时间，过程缓慢，而且要频繁地更换培养基，增加成本的同时也增加了工作量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种快速高效和低成本的培育大叶藻无菌苗的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种培育大叶藻无菌苗的方法，其步骤是：

(1)选取形态饱满完整的大叶藻种子，用灭菌天然海水涮洗2次，用吸水纸吸干，移至无菌室超净工作台上；

(2)在无菌室超净工作台上用浓度为75％乙醇溶液浸泡10分钟，再用灭菌天然海水涮洗2次，用吸水纸吸干；

(3)再将大叶藻种子移至浓度为1.5％的碘化钾溶液中浸泡20分钟，再用灭菌海水涮洗2次，用吸水纸吸干；

(4)将步骤(3)消毒处理好的大叶藻种子接种到盐度为5‰的灭菌海水中，并放入恒温光照培养箱内，在温度15℃，湿度60％，光照强度40μmol·m^-2·s^-1，L∶D＝12∶12条件下培养7～14天，其中L∶D＝12∶12为光照时间比黑暗时间，即光照12小时，黑暗12小时，模拟昼夜切换；

(5)萌发后的大叶藻种子转接到正常盐度的灭菌海水中，在温度保持15℃，湿度60％，光照强度40μmol·m^-2·s^-1，L∶D＝12∶12条件下再培养7～14天。

在上述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)和步骤(5)所述灭菌天然海水为先将天然海水煮沸5分钟，然后冷却到室温后再使用过滤器进行抽滤。

在上述步骤(2)中，所述浓度为75％乙醇溶液是无水乙醇和纯水配制而成。

在上述步骤(3)所述浓度为1.5％的碘化钾溶液是用天然海水和碘化钾配置而成，并抽滤除菌。

在上述步骤(4)中，在所述盐度为5‰的灭菌海水是用人工海水素和纯水配制而成，并抽滤除菌。

本发明的技术效果是：本发明是先将大叶藻种子进行消毒处理后，用低盐度灭菌海水促大叶藻种子萌发，然后再用正常盐度的灭菌海水来培养萌发的大叶藻种子，使大叶藻种子无菌苗培育迅速而简便，而且成本低。本发明能够快速地打破大叶藻种子的休眠，使大叶藻种子快速进入萌发生长阶段，低盐度灭菌海水促大叶藻种子萌发耗时短，效率高，后期培养过程只需用正常盐度的灭菌海水即可，不需用额外的培养基和生长调节剂，节约成本，操作简便。经实验对比，本发明大叶藻种子在盐度为5‰的海水促萌发效果最好。本发明是在无菌环境下促进大叶藻萌发成长为苗，此处长成的大叶藻苗为无菌苗，可直接用于后续的原生质体分离和组织培养，能够满足实验室中要求的无菌组织培养、原生质体制备和遗传转化等实验。

附图说明

图1为消毒后的大叶藻种子的照片。

图2为大叶藻种子接种在5‰盐度海水中培养3天的照片。

图3为大叶藻种子接种在5‰盐度海水中培养10天的照片。

图4为大叶藻种子接种在正常盐度天然海水中培养14天的照片。

图5为大叶藻种子一直在正常盐度天然海水中培养30天仍未萌发的照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

本发明对大叶藻种子无菌苗的培养分为无菌消毒处理，低盐度灭菌海水促种子萌发，正常盐度灭菌海水培养三步骤进行，具体步骤如下：

(1)选取形态饱满完整的大叶藻种子，一般选择形状完整，质地坚硬，颗粒饱满，成熟并具有活力的大叶藻种子，用灭菌天然海水涮洗2次，即将大叶藻种子放入装有灭菌天然海水的培养皿中，用镊子夹住种子，在灭菌天然海水中涮洗，依次涮洗2次，直到没有明显的附着物和杂质即可，灭菌天然海水的水温一般保持常温即可。涮洗后的大叶藻种子用吸水纸吸干，并移至无菌室的无菌操作台上。

本实施例灭菌天然海水为无菌抽滤海水：在抽滤前，先将天然海水煮沸5分钟，然后冷却到室温后再使用过滤器进行抽滤。本实施例过滤器采用上海领德仪器有限公司生产的1升规格的不锈钢圆筒式正压过滤器，抽滤前将过滤器出水口和正压口用牛皮纸包扎好，并准备4个250毫升规格的蓝盖血清瓶，每个蓝盖血清瓶瓶口拧上瓶盖，但瓶盖不要拧紧，留一圈瓶盖螺纹丝扣有益于灭菌和防止在消毒时瓶内空气压力增大而导致血清瓶炸裂。然后将血清瓶和过滤器放入布袋并扎好布袋口，放入高压锅进行灭菌，本实施例高压锅采用上海博讯实业有限公司医疗设备厂的YXQ-LS-50 S11型高压锅，在温度为121℃、相对压力(高出空气大气压力)103kPa～115kPa条件下灭菌25分钟。取出布袋放入无菌缓冲间的干燥箱中烘干1个小时，本实施例干燥箱采用龙口市先科仪器公司生产的DGL-2003型电热鼓风干燥箱。然后布袋放入无菌操作台用紫外光灯通过紫外线常规灭菌30分钟，再打开布袋，取出过滤器和血清瓶，取出前在布袋中将血清瓶瓶盖拧紧，将拧好瓶盖的血清瓶放在无菌操作台上备用。将过滤器支架用紫外光通过紫外线常规照射消毒30分钟，再用浓度75％乙醇溶液擦拭过滤器支架一遍，在酒精灯火焰的外焰烧过滤器支架30秒，然后过滤器支架连接在过滤器上，去掉过滤器正压口的牛皮纸，接上真空泵，本实施例真空泵采用天津奥特赛恩斯仪器有限公司生产的型号为AP-01P真空泵，把煮沸5分钟的1升天然海水从过滤器进口倒入过滤器中，拧好过滤器进口滤器盖，拿掉过滤器出水口牛皮纸，用酒精灯火焰的外焰烧过滤器出水口1分钟，将250毫升的蓝盖血清瓶的瓶口接近过滤器出水口接灭菌天然海水，单手操作，接水时，拧开血清瓶盖，并掀起血清瓶盖一端，血清瓶盖另一端不能离开血清瓶的瓶口，以避免空气中的杂质进入，接好灭菌天然海水的4瓶血清瓶放入恒温培养箱备用。

打开无菌室和无菌操作台上的紫外光灯，通过紫外线提前常规消毒30分钟，并间隔一段时间(关闭紫外线灯15分钟后)，等到无菌室内的臭氧味散尽了人员再进入无菌室操作。在进无菌室之前，先进入缓冲间换拖鞋和实验服，进入无菌室前要对操作人员胳膊和手用浸有浓度为75％乙醇溶液的棉球擦拭消毒，再进入无菌室并在无菌操作台操作。

(2)涮洗后的大叶藻种子用浓度为75％的乙醇溶液浸泡10分钟，再用灭菌天然海水涮洗2次，并用吸水纸吸干。这里灭菌天然海水同步骤(1)用的灭菌天然海水制备方法一致。

本实施例浓度为75％的乙醇溶液采用75毫升无水乙醇加入25毫升的纯水配制成浓度为75％乙醇溶液100毫升，本实施例纯水由青岛紫泉仪器有限公司生产的FMN1001-RO型纯水机用自来水在实验室制备，本实施例无水乙醇采用天津市瑞金特化学品有限公司生产的规格为500毫升的无水乙醇。

(3)将大叶藻种子移至浓度为1.5％的碘化钾溶液中浸泡20分钟，再用灭菌天然海水涮洗2次，用吸水纸吸干。这里灭菌天然海水同步骤(1)用的灭菌天然海水制备方法一致。图1为消毒后的大叶藻种子的照片。

本实施例1.5％的碘化钾溶液是用天然海水和碘化钾配置而成，并在无菌台上抽滤除菌。所用天然海水需要经过人工煮沸5分钟并冷却到室温，本实施例1.5％的碘化钾溶液配置过程是：先称取1.5克碘化钾溶解到100毫升煮沸过的天然海水中，完全溶解后再用一次性的0.22μm针头滤器抽滤备用。本实施例0.22μm针头滤器由美国密理博公司生产；碘化钾采用国药集团化学试剂有限公司出品的碘化钾，规格为每瓶500克。

(4)将上述消毒处理好的大叶藻种子接种到盐度为5‰的灭菌海水中，然后将盛有大叶藻种子盐度为5‰的灭菌海水的容器放入恒温光照培养箱内，在温度15℃，湿度60％，光照强度40μmol·m^-2·s^-1，L∶D＝12∶12条件下培养7天，大叶藻种子一般在5‰的灭菌海水中培养3～5天即可实现完全萌发。图2为在5‰盐度海水中培养3天大叶藻种子的照片，图3为大叶藻种子接种在5‰盐度海水中培养10天的照片。

本实施例恒温光照培养箱采用上海一恒科学仪器有限公司生产的MGC-300H型恒温光照培养箱，该恒温光照培养箱能够模拟自然光照条件，在一定光照和温度情况下，能昼夜自动切换。

本实施例盐度为5‰的灭菌海水是用人工海水素和纯水配制而成，即在1000毫升纯水中加入5.025克人工海水素，本实施例人工海水素采用昌邑市海瑞海水素有限公司生产的海水素，规格500克/袋。盐度为5‰的灭菌海水在无菌台上需抽滤除菌，抽滤过程和使用设备同本实施例步骤(1)无菌天然海水的抽滤过程一致。

(5)大叶藻种子萌发7天后，即大叶藻种子在5‰盐度海水中培养10天转接到正常盐度的灭菌天然海水中，然后将盛有已萌发大叶藻种子的正常盐度的灭菌天然海水容器放入恒温光照培养箱内，在温度15℃，湿度60％，光照强度40μmol·m^-2·s^-1，L∶D＝12∶12条件下培养7～14天。其中L∶D＝12∶12为光照时间比黑暗时间，即光照12小时，黑暗12小时，模拟昼夜切换。培养7～14天后萌发的大叶藻种子的子叶长度可长至2～3厘米。图4为大叶藻种子接种在正常盐度天然海水中培养14天的照片。

正常盐度天然海水的盐度一般为32‰，灭菌天然海水由天然海水经煮沸后再抽滤，本实施例天然海水煮沸是将天然海水放在5000ml三角瓶中在煤气灶上煮沸5分钟，抽滤同本实施例步骤(1)用的灭菌天然海水抽滤方法一致。

Claims (5)

1.一种培育大叶藻无菌苗的方法，其步骤是：

(1)选取形态饱满完整的大叶藻种子，用灭菌天然海水涮洗2次，用吸水纸吸干，移至无菌室超净工作台上；

(2)在无菌室超净工作台上用浓度为75％乙醇溶液浸泡10分钟，再用灭菌天然海水涮洗2次，用吸水纸吸干；

(3)再将种子移至浓度为1.5％的碘化钾溶液中浸泡20分钟，再用灭菌天然海水涮洗2次，用吸水纸吸干；

(4)将步骤(3)消毒处理好的大叶藻种子接种到盐度为5‰的灭菌海水中，并放入恒温光照培养箱内，在温度15℃，湿度60％，光照强度40μmol·m^-2·s^-1，L∶D＝12∶12条件下培养7～14天，L∶D＝12∶12为光照时间比黑暗时间，即光照12小时，黑暗12小时，模拟昼夜切换；

(5)萌发后的大叶藻种子转接到正常盐度的灭菌天然海水中，在温度15℃，湿度60％，光照强度40μmol·m^-2·s^-1，L∶D＝12∶12条件下再培养7～14天。

2.根据权利要求1所述一种培育大叶藻无菌苗的方法，其特征在于：步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)和步骤(5)所述灭菌天然海水为先将天然海水煮沸5分钟，然后冷却到室温后再使用过滤器进行抽滤。

3.根据权利要求1所述一种培育大叶藻无菌苗的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述浓度为75％乙醇溶液是无水乙醇和纯水配制而成。

4.根据权利要求1所述一种培育大叶藻无菌苗的方法，其特征在于：在步骤(3)所述浓度为1.5％的碘化钾溶液是用天然海水和碘化钾配置而成，并抽滤除菌。

5.根据权利要求1所述一种培育大叶藻无菌苗的方法，其特征在于：在步骤(4)中，在所述盐度为5‰的灭菌海水是用人工海水素和纯水配制而成，并抽滤除菌。

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