CN102138530A - 一种大叶藻属愈伤组织的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，其特征在于，是用大叶藻的无菌实生苗作为诱导愈伤组织的外植体，具体诱导方式是在无菌条件下将大叶藻无菌苗的胚根、胚轴、子叶的切段选取任一种或几种接种于培养基中，在无菌、培养温度为18～30℃的黑暗条件下培养完成愈伤组织的诱导，其中培养基为盐度20～35‰，且添加了碳源、生长素和细胞分裂素的MS固体培养基、N6固体培养基、PESI固体培养基或VSE固体培养基中的任一种。本发明的方法可以在短时间内诱导出大叶藻愈伤组织，为人工条件下实现大叶藻规模化组织培养快繁体系做基础技术参考，为海草场的恢复奠定基础。适用于沼生目大叶藻科大叶藻属的多年生草本植物种类。
Description
技术领域
本发明属于海草愈伤组织的诱导方法，具体涉及一种大叶藻愈伤组织的诱导方法。
背景技术
海草是一种生活在温带和热带海域浅水中的单子叶植物，是一种只适应于海洋环境生活的水生种子植物。主要由海草构成的海草场是遍布世界浅海水域最显著和广泛的群落之一，是一类具有极高生产力的浅海生态系统。
大叶藻(Zostera marina L.)是一种多年生草本单子叶海草植物，隶属于沼生目、大叶藻科、大叶藻属。由于其特殊的生活环境和自身结构特点，既具有水生植物的生长特性，也具有陆生植物的生长特性。不但可以为附生藻类和附着动物提供固着基，也可为动物提供食物来源，还具有稳定沉积物改善海水透明度的作用，生态效益显著。但近年来，由于自然条件的改变和人为因素的干扰，导致大叶藻资源大量减少，其种群分布范围日益缩小。
植物组织培养技术不受季节和地域限制、繁殖速度快、植物材料单一、遗传背景一致、具有良好的遗传重复性；通过组织培养技术能在短时间内繁殖大量藻体，对灰复、保护和合理开发利用大叶藻具有重要的现实意义，为海水养殖提供健康环境，为海洋生态系统的恢复提供基础，达到海水养殖和生态恢复的双赢。
目前高等植物的愈伤组织诱导技术已经相当成熟。高等植物一般以成熟或发育完全的植株器官作为外植体进行愈伤组织诱导实验，不可避免消毒剂对幼嫩组织的直接伤害，消毒剂种类选择和消毒时间掌控对实验的成功至关重要；而大叶藻生活在海水环境中，海洋中的微生物种类和数量较多，而海藻的细胞壁又很薄，消毒剂对细胞的直接伤害比陆生高等植物严重很多，消毒后很难保证既可以获得很高无菌性又可以获得很高成活率的外植体；以通过无菌人工培育的无菌实生苗为外植体既可以保证外植体的无菌性，也可以保证外植体的成活率。此外，高等植物大多以MS培养基或N6培养基为基本培养基；MS培养基和N6培养基含有大量的无机盐，营养极为丰富，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的需要，具有加速愈伤组织和培养物生长的作用；然而大叶藻虽然具有陆生植物的生长特性，但其毕竟生活在海洋环境中，没有陆生植物高级，呈酸性的MS和N6培养基是否适宜其生长还不明确，将酸性MS和N6培养基pH调到海水pH后发生一些化学变化，对大叶藻愈伤组织诱导的作用也不明确。
大叶藻既是一种海洋藻类，又具有高等陆生植物的生长特性，因此，高等植物的愈伤组织诱导技术用来培育大叶藻愈伤组织并不能获得很好的效果，所以，急需从培养基筛选等方面入手来建立有效的大叶藻愈伤组织的诱导方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，即选用合适的培养基和诱导条件来建立大叶藻科愈伤组织的诱导方法，以弥补现有技术的不足。
考虑到大叶藻是水生植物，生长在自然环境中的藻体携带的杂藻和细菌的种类和数量较多，消毒剂浓度低时达不到消毒作用，而过高则会使藻体死亡，所以外植体和消毒剂的选择至关重要。为了达到外植体较高的无菌性和成活率，以其自然成熟植株的种子培育出的无菌苗为外植体，既可以保证拥有相对无菌的外植体，又可以避免消毒剂对外植体的直接伤害。
本发明的技术方案如下：
本发明的一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，是用大叶藻的无菌苗作为诱导愈伤组织的外植体。
本发明的诱导方法，是在无菌条件下将大叶藻无菌苗的胚根、胚轴、子叶的切段选取任一种或几种接种于培养基中，在无菌条件下，15～30℃下黑暗条件下培养完成愈伤组织的诱导，其中培养基是盐度为20～35‰，且添加了碳源、生长素和细胞分裂素的MS固体培养基、N6固体培养基、PESI固体培养基或VSE固体培养基中的任一种。
培养基中添加的碳源可以是蔗糖、葡萄糖等培养基常用的碳源，添加浓度为30g/L；
培养基中添加的生长素可以选用2，4-D，浓度为2mg/L；
培养基中添加的细胞分裂素为6-BA，浓度为1mg/L。
培养基的盐度优选为30‰。
诱导培养时的温度优选为18℃。
本发明的诱导方法，是在黑暗条件下培养15～30天完成诱导。
其中胚根的诱导培养基优选为PESI培养基或VSE培养基；胚轴的诱导培养基优选为PESI培养基或VSE培养基；子叶的诱导培养基优选为VSE培养基。
本发明的方法可以在短时间内诱导出大叶藻愈伤组织，为人工条件下实现大叶藻规模化组织培养快繁体系做基础技术参考，为海草场的恢复奠定基础。适用于沼生目大叶藻科大叶藻属的多年生草本植物种类。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
一、大叶藻无菌苗的培育
首先在大叶藻的成熟季节6-7月份，从海水中用筛绢收集大叶藻种子，4℃保存送至无菌室，且在4℃低温条件下保存一个月以低温刺激打破种子休眠状态；在超净工作台内，用灭菌海水将低温保存的大叶藻种子清洗干净，挑取结实饱满的种子，用75％乙醇消毒30s，再用10％次氯酸钠消毒10min，用灭菌海水冲洗干净后接种于装有盐度为10‰的液体培养基的锥形瓶中；将锥形瓶放在光照培养箱中培养，培养条件为：温度14℃，光照强度500Lx，光周期：12:12 L:D。
盐度为10‰的液体培养基，由过滤海水和自来水配制而成，pH调为8.0；液体培养基和海水高温(120℃)高压(103kPa)灭菌20min，冷却至20℃左右后用于接种和清洗；每1天换一次培养基。
白色胚根突破种皮1cm左右后将其转移到温度18℃；光照强度2000Lx；光周期：12:12 L:D的光照培养箱中，逐渐将其盐度调为30‰。培养至发育成具胚根、胚轴和子叶的苗种，将其称为无菌苗，作为诱导愈伤组织的外植体。
二、愈伤组织的诱导
实施例1以MS固体培养基诱导大叶藻愈伤组织
在无菌室的超净台内，分离出无菌苗的胚根、胚轴和子叶，分别将胚根、胚轴和子叶切成2-4mm左右的切段。将胚根、胚轴和子叶的切段接种于装有MS固体培养基的锥形瓶内，将锥形瓶置于光照控温培养箱中，在18℃下，黑暗条件下培养。其中MS固体培养基是在MS基本培养基中添加凝固用的7g/L琼脂，所添加的碳源为30g/L蔗糖，并添加生长素2mg/L的2，4-D和细胞分裂素1mg/L的6-BA，将pH调为8.0后高温(120℃)高压(103kPa)灭菌20min，冷却至固体状态后就制成了MS固体培养基。
培养15-30天，只有胚根可以在MS固体培养基上形成正常愈伤组织，愈伤组织颜色为白色，形状为半球形，结构紧密粘稠，愈伤组织诱导率为23％；但胚轴和子叶只能形成褐化的愈伤组织，颜色为黄褐色，质地粘稠或坚硬。
实施例2以N6固体培养基诱导大叶藻愈伤组织
本实例2的大叶藻愈伤组织诱导方法与实例1相同，只是培养基为N6固体培养基。其中N6固体培养基是在N6基本培养基中添加凝固用的7g/L琼脂，所添加的碳源为30g/L蔗糖，并添加生长素2mg/L的2，4-D和细胞分裂素1mg/L的6-BA，将pH调为8.0后高温(120℃)高压(103kPa)灭菌20min，冷却至固体状态后就制成N6固体培养基。
按照实施例的诱导方法培养15-30天，只有胚根和子叶可以在N6固体培养基上形成正常白色愈伤组织，胚根形成的愈伤组织形状为半球形或不规则形，子叶形成的愈伤组织形状为不规则形；子叶也可以形成褐化的不规则形愈伤组织，颜色为黄褐色，质地粘稠或坚硬；愈伤组织诱导率为胚根(25％)＞子叶(5.9％)；培养至实验结束，胚轴未产生任何愈伤组织。
其中培养基中的碳源、生长素和细胞分裂素等都可以用现有的成分来替代，在诱导效果上同上述的N6固体培养基效果类似。
实施例3PESI固体培养基诱导大叶藻愈伤组织
本实例3的大叶藻愈伤组织诱导方法与实例1相同，只是培养基为PESI固体培养基。其中PESI固体培养基是在PESI基本培养基中添加凝固用的7g/L琼脂，所添加的碳源为30g/L蔗糖，并添加生长素2mg/L的2，4-D和细胞分裂素1mg/L的6-BA，将pH调为8.0后高温(120℃)高压(103kPa)灭菌20min，冷却至固体状态后就制成PESI固体培养基。
培养5天左右，胚根和胚轴均可以在PESI培养基上形成半球形和不规则形的正常白色愈伤组织；胚根形成的愈伤组织颜色为白色，质地略为稀薄；胚轴形成的愈伤组织颜色为半透明色，质地比较稀薄；培养21天后，愈伤组织数量变动较小，愈伤组织诱导率为胚根(70％)＞胚轴(50％)；培养至实验结束，子叶未产生任何愈伤组织。
实施例4 VSE固体培养基诱导大叶藻愈伤组织
本实例4的大叶藻愈伤组织诱导方法与实例1相同只是培养基为VSE固体培养基。其中VSE固体培养基是在VSE基本培养基中添加凝固用的7g/L琼脂，所添加的碳源为30g/L蔗糖，并添加生长素2mg/L的2，4-D和细胞分裂素1mg/L的6-BA，将pH调为8.0后高温(120℃)高压(103kPa)灭菌20min，冷却至固体状态后制成VSE固体培养基。
培养5天左右，胚根和胚轴均可以在VSE培养基上形成半球形和不规则形正常白色愈伤组织；胚根形成的愈伤组织颜色为白色，质地略为稀薄；胚轴形成的愈伤组织颜色为半透明色，质地比较稀薄。子叶只可以在VSE培养基上形成不规则形愈伤组织，愈伤组织颜色为半透明色，质地比较稀薄。培养21天后，愈伤组织数量变动较小，愈伤组织诱导率为胚轴(80％)＞胚根(75％)＞子叶(15％)。
结果表明，不同的培养基对于大叶藻无菌苗不同部位的愈伤组织诱导效果差别非常大，本发明发现其中胚根的诱导培养基优选为PESI固体培养基或VSE固体培养基；胚轴的诱导培养基优选为PESI固体培养基或VSE固体培养基；子叶的诱导培养基优选为VSE固体培养基。
本发明方法诱导产生的愈伤组织一方面可研究大叶藻的生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对大叶藻遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于原生质体培养中的原生质体来源等。
Claims (9)
1.一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，其特征在于，是用大叶藻的无菌实生苗作为诱导愈伤组织的外植体。
2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，是在无菌条件下将大叶藻无菌苗的胚根、胚轴、子叶的切段选取任一种或几种接种于培养基中，在无菌、培养温度为15～30℃的黑暗条件下培养完成愈伤组织的诱导，其中培养基为盐度20～35‰，且添加了碳源、生长素和细胞分裂素的MS固体培养基、N6固体培养基、PESI固体培养基或VSE固体培养基中的任一种。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于上述的四种培养基中添加的碳源是蔗糖，浓度为30g/L的；生长素为2，4-D，添加浓度为2mg/L；细胞分裂素为6-BA，添加浓度为1mg/L的。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于上述的四种培养基的pH值为8.0。
5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于上述的四种培养基的盐度为30‰。
6.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于上述的培养温度为18℃。
7.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于上述的胚根的诱导培养基为PESI固体培养基或VSE固体培养基。
8.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于上述的胚轴的诱导培养基为PESI固体培养基或VSE固体培养基。
9.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于上述的子叶的诱导培养基为VSE固体培养基。
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