CN105287653A

CN105287653A - 包含牛樟芝、桑黄菇及白鹤灵芝的中草药萃取物及其用于制备肝癌药物的用途

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Publication number: CN105287653A
Application number: CN201410299667.6A
Authority: CN
Inventors: 陈威丞; 赖美州; 刘崇喜; 刘怡旻
Original assignee: DSG Technology Inc
Current assignee: DST Technology Co Ltd; DSG Technology Inc
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2034-06-26
Also published as: CN105287653B

Abstract

本发明为包含牛樟芝、桑黄菇及白鹤灵芝的中草药萃取物及其用于制备肝癌药物的用途，公开了一种用以治疗肝癌的中草药萃取物，是包含由以下方法制备获得：混合以重量百分比计为33.4～60%的牛樟芝、20～33.4%的桑黄菇及20～33.4%的白鹤灵芝，并获得一混合物；以95%乙醇于50～80℃下萃取该混合物8～12小时，该混合物与95%乙醇的重量体积比为1：2，获得一中草药萃取液；及将该中草药萃取液进行浓缩，以获得该中草药萃取物。

Description

包含牛樟芝、桑黄菇及白鹤灵芝的中草药萃取物及其用于制备肝癌药物的用途

技术领域

本发明是关于一种中草药萃取物，特别是一种包含牛樟芝、桑黄菇及白鹤灵芝的中草药萃取物，本发明更关于该中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途。

背景技术

根据中国台湾国民健康局的统计分析显示，肝癌是中国台湾癌症死亡的第二大原因，每年约有7000名患者死于肝癌，主要是由于B型肝炎与C型肝炎盛行，使得慢性肝炎得以进一步发展成肝硬化或肝癌。肝癌的现有治疗方法以手术切除或原位肝脏移植为首选，然而若患者无法接受手术切除或者不具移植的资格时，则需选择替代的疗法，最常见的有射频灼烧术(Radiofrequencyablation)，但成本较高、易有并发症的产生且仅适用于肝肿瘤小于2公分的患者。

由于现有肝癌疗法所受限制较多、成本较高，又易引起并发症，因此除了现有肝癌疗法，选择中医疗法来辅助的患者亦逐渐增多，虽中医疗法的效果较为缓慢，但其对患者所产生的副作用亦随之降低。台湾特有珍贵中药材中，牛樟芝(Antrodiacinnamomea)是属于一种寄生于牛樟树中空树干内的真菌，富含有三萜类(Triterpenes)及超氧歧化酶等，具有保肝的效果。

然而根据中医理论，牛樟芝隶属于寒性药材，具有很强的抗自由基能力，可以有效消除自由基，减轻发炎症状，因此当长期服用牛樟芝单方可能会造成体内自由基浓度过低，而导致中医所谓的“体寒气虚”现象产生，使得人体免疫力下降。

白鹤灵芝(Rhinacanthusnasutus)又名仙鹤草，形状如展翅飞翔的白鹤，具有降肝火与消肿解毒等功效。而桑黄菇又简称桑黄，学名为鲍氏层孔菌(Phellinuslintenus)，主要的活性成分为多醣体，可以活化免疫系统，增强免疫力。

有鉴于此，基于“现有肝癌疗法使用上的限制”及“牛樟芝造成免疫力下降”的问题，因此急需提供一种改良牛樟芝配方制备为肝癌药物，以解决上述问题。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种中草药萃取物，作为对抗肝癌的药物，可以搭配现有肝癌疗法，以抑制肝肿瘤扩增。

本发明的再一目的是提供一种中草药萃取物，改良牛樟芝药性，相较于牛樟芝单方，可以强化体内免疫力，以解决牛樟芝所造成体寒问题。

本发明的又一目的是提供一种中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途，通过该中草药萃取物所富含的活性成分，防止肝肿瘤增大，以治疗肝癌。

为达到前述发明目的，本发明所运用的技术手段及借助该技术手段所能达到的功效包含有：

一种中草药萃取物，包含由以下方法制备获得：混合以重量百分比计为33.4～60％的牛樟芝、20～33.4％的桑黄菇及20～33.4％的白鹤灵芝，并获得一混合物；以95％乙醇于50～80℃下萃取该混合物8～12小时，该混合物与95％乙醇的重量体积比(千克：升)为1：2，获得一中草药萃取液；及将该中草药萃取液进行浓缩，以获得该中草药萃取物。

本发明的中草药萃取物，其中，该混合物较佳包含以重量百分比计为60％的牛樟芝、20％的桑黄菇及20％的白鹤灵芝。

本发明的中草药萃取物，其中，较佳是以隔水加热的方式萃取该混合物。

本发明的中草药萃取物，其中，萃取该混合物的时间较佳为10小时。

一种中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途，是将该中草药萃取物投予一所需个体，以抑制肝癌细胞生长。

本发明的中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途，其中该中草药萃取物较佳是以口服方式投予该所需个体。

本发明的中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途，其中该中草药萃取物的剂量较佳是每天每公斤的该所需个体重10～30毫克，且该中草药萃取物是持续施予该所需个体30天。

本发明的中草药萃取物具有三萜类及多醣体等活性成分，可以有效缩小肝肿瘤体积，广泛应用于各种肝癌患者，可以辅助现有肝癌疗法，达到治疗肝癌的功效。

本发明的中草药萃取物可以利用所富含的多醣体，弥补牛樟芝单方所造成的免疫力下降，强化免疫系统、活化巨噬细胞，达到减轻服用牛樟芝单方引起的副作用的功效。

本发明的一种中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途，借助萃取自牛樟芝、桑黄菇及白鹤灵芝所获得的活性成分毒杀肝癌细胞，促使肝肿瘤内部组织坏死，达到使肝肿瘤无法增生的功效。

附图说明

图1A是本试验第A1组中草药萃取物的三萜类六大指标分析图谱。

图1B是本试验第A2组中草药萃取物的三萜类六大指标分析图谱。

图1C是本试验第A3组中草药萃取物的三萜类六大指标分析图谱。

图2是本试验第E0～E3组肿瘤小鼠于30天后的肿瘤外观图(虚线圆圈处)。

图3A是本试验第E0组肿瘤小鼠于30天后的H&E染色结果图。

图3B是本试验第E1组肿瘤小鼠于30天后的H&E染色结果图。

图3C是本试验第E2组肿瘤小鼠于30天后的H&E染色结果图。

图3D是本试验第E3组肿瘤小鼠于30天后的H&E染色结果图。

具体实施方式

为让本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本发明的较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下：

本发明的中草药萃取物，是包含由以下方法制备获得：混合适量的牛樟芝、桑黄菇及白鹤灵芝，以获得一混合物，续以95％乙醇萃取该混合物，获得一中草药萃取液并浓缩该中草药萃取液，即可获得本发明的中草药萃取物。

详而言之，是取以重量百分比计为33.4～60％的牛樟芝、20～33.4％的桑黄菇及20～33.4％的白鹤灵芝，获得该混合物，以60％的牛樟芝、20％的桑黄菇及20％的白鹤灵芝的混合比例为佳；且混合牛樟芝、桑黄菇与白鹤灵芝前，较佳是可以先分别碎成粉粒，并以筛网(筛号为30mesh)进行颗粒筛选，以增加其混合效率及后续萃取效率。

其中，牛樟芝又可以分为子实体及菌丝体，较佳是选用摘取自牛樟树椴木上的牛樟芝子实体，因牛樟芝子实体所含三萜类的量较菌丝体高；桑黄菇较佳则选为取自子实体，其含有丰富的天然氨基酸、微量元素等，能促进肝脏新陈代谢和肝细胞再生、降低血液中麸草酸转氨基酶(GOT，或称谷草转氨酶、AST)、血清丙酮转氨基酶(GPT，或称谷丙转氨酶、ALT)值以及减弱肝炎病毒的复制作用；而白鹤灵芝较佳是可以选择其全草，含白鹤灵芝类(rhinacanthin)的化合物，具抑制癌细胞的作用。

续使上述的混合物以重量体积比为1：2的比例与95％乙醇混合(即，每500克的该混合物与1公升的95％乙醇混合)，并于50～80℃进行萃取8～12小时，以获得该中草药萃取液，其中较佳是以50℃隔水加热的方式进行萃取且萃取时间较佳为10小时。此外，上述萃取亦可以重复数次，使牛樟芝、桑黄菇及白鹤灵芝所富含的活性成分可以完整溶出于95％乙醇，此为本领域所属具有通常知识者所广泛应用，在此不加以赘述。

前述的中草药萃取液较佳是使用3号滤纸进行真空过滤、并借助减压浓缩去除至少一半95％乙醇，续于-60℃下冷冻干燥，以获得含水量小于10％的该中草药萃取物，借助此一程序，可以使该中草药萃取物的活性成分更加浓缩，因此仅需使用少量的该中草药萃取物即可以发挥最佳疗效。

本发明的中草药萃取物是借助所富含的三萜类及多醣体等活性成分，使该中草药萃取物可以发挥毒杀肝癌细胞的作用，因此将该中草药萃取物以口服方式投予一所需个体，用以抑制肝癌细胞增生，防止肝肿瘤增大；其中该中草药萃取物是以每天每公斤的该所需个体体重10～30毫克的剂量持续施予该所需个体30天，以缩小肝肿瘤的体积。

为证实本发明的中草药萃取物具有三萜类及多醣体，并可以使该中草药萃取物对于肝癌细胞有抑制效果，遂进行以下测试：

本试验中，是取如表1所示的中草药重量百分比混和至总量500克，以获得各组混合物，续将各该组混合物与1公升的95％乙醇混合，并通过50℃隔水加热方式进行萃取8小时，再经由3号滤纸真空过滤、减压浓缩去除至少一半的溶剂及-60℃的冷冻干燥处理，以获得各组的中草药萃取物。

表1、本试验各组混合物中，牛樟芝、桑黄菇及白鹤灵芝的重量百分比。

(A)产率

本试验是取各该组中草药萃取物进行测试，产率的计算为(中草药萃取物重量/原始总重500克)×100％；其结果如表2所示，以第A3组的产率为最高(12.3±1.5％)。

表2、本试验各组中草药萃取物的产率。

组别	产率(％)
		A1	10.1±1.6％

[0044]

A2	11.4±1.4％
		A3	12.3±1.5％

(B)三萜类含量检测

续秤取0.2克的各该组中草药萃取物至一螺旋试管中，加入5毫升甲醇，以超声波震荡15分钟，3000转离心10分钟，取5毫升上清液置入一干净试管中，再以100℃水浴加热至干燥。

接着选用PurospherSTAR(Merk)RP-18e(5μm)250mm×4mm管柱进行分析，以47：53的体积混合乙腈(Acetonitrile，简称ACN)及0.085％的磷酸溶液作为流动相，流速为1mL/min，侦测波长为254nm的吸光值以进行分析，并分析各组总三萜占总面积的百分比，其结果如表3所示，其中第A3组总三萜含量最高(22.47±1.31％)，第A1组总三萜量为最低(20.12±1.25％)。

表3、各组中草药萃取物的总三萜含量。

组别	总三萜含量(％)
		A1	20.12±1.25
A2	21.19±1.32
		A3	22.47±1.31

牛樟芝三萜类具有六大指标成分，分别为樟芝酸K(antcinK)、樟芝酸C(antcinC)、樟菇酸C(zhankuicacidC)、马偕1号(dehydrosulphurenicacid)、樟菇酸A(zhankuicacidA)与云鹏1号(dehydroeburicoicacid)，各组的分析结果如表4所示，亦请分别参照图1A、图1B及图1C所示，分别为第A1、A2及A3组的六大三萜类指标分析图谱，其中，第A3组表现较高比例的樟芝酸K、樟芝酸C、樟菇酸C与樟菇酸A。

表4、本试验各组中草药萃取物的六大指标三萜类分析结果。

(C)多醣体含量检测

本试验是以半乳糖作为标准品，利用其浓度及吸光值制成标准曲线。续配置各组中草药萃取溶液，取1毫升各该组的中草药萃取溶液加入5％酚类溶液1毫升，再加入5毫升浓硫酸，以获得各组混合溶液，使该各组混合溶液静置10分钟后，震荡使其均匀混合，并利用分光光度计(HitachiU1800Spectrometer)，于490nm测其吸光值，借助标准曲线计算其浓度，其结果如表5所示。

表5、本试验各组中草药萃取物的多醣体含量。

组别	多醣体含量(ppm)
		A1	32.15±1.28
A2	33.41±1.26
		A3	34.92±1.18

多醣体含量分析如表5所示，其中，以第A3组含有最高量的多醣体，为34.92±1.18ppm，而第A1组所含多醣体的量最低，为32.15±1.28ppm。

综合上述试验结果，本发明的中草药萃取物富含三萜类及多醣体，可以抑制肝癌细胞增生。

为证明本发明的中草药萃取物可以有效控制肝癌细胞的增生，续进行以下试验：

(D)中草药萃取物对人类肝癌细胞株存活率的影响

本试验是选用购自食品工业发展研究所的人类肝癌细胞株(HepG2细胞株，BCRC60025)，该肝癌细胞株培养于含有10％胎牛血清(FBS，购自BiologicalIndustries，Kibbutzbeithaemek)、2mmol/LL-麸氨酸(L-glutamine，购自HyClone，USA)、1×非必需氨基酸(购自HyClone，USA)、100μg/mL链霉素(streptomycin)及100U/mL青霉素(penicillin，购自HyClone，USA)的培养液(Dulbecco’sModifiedEagleMedium，简称DMEM)，将该肝癌细胞株置于37℃、5％二氧化碳及95％湿度的培养箱，每隔两天更换一次新鲜培养液。

该肝癌细胞株于继代培养时，可以先将培养液与细胞以1000rpm进行离心5分钟，去除上清液后，再加入新的培养液，并且使10公分培养皿内维持细胞数约1×10⁵～1×10⁶cells/mL。

试验进行时，可以取出已经长8至9分满的该肝癌细胞株的10公分培养皿，去除已变色的培养液，加入8mL的PBS缓冲溶液冲洗细胞，加入胰蛋白酶/乙二胺乙酸(Trypsin/EDTA)，反应1～3分钟后，轻摇培养皿使细胞自壁上脱落，加入已回温的培养液，轻轻将细胞冲散，再将含细胞的培养液分别置入离心管内，使细胞分散均匀，并取出20μL该肝癌细胞株，再加入20μL、0.04％的锥虫蓝(TrypanBlue)进行染色，放入细胞计数器，并于显微镜下计数活细胞数，细胞存活率必须不小于85％才可以进行后续试验。

以含血清的培养液将该肝癌细胞的浓度调整为1×10⁵cells/mL，并取100μL的该肝癌细胞株接种于96孔盘，使每个孔槽含有1×10⁴细胞，并于37℃、含5％二氧化碳的培养箱进行隔夜培养。

经过24小时培养后，分别加入100μL如表6所示的4个浓度的中草药萃取物(4个浓度分别为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL及0.125mg/mL)，并以DMEM作为控制组，混合均匀后，于37℃，含5％的二氧化碳培养箱隔夜培养24小时。

表6、本试验各组肝癌细胞所处理的中草药萃取物。

组别	中草药萃取物
		D0(控制组)	－
D1	第A1组
		D2	第A2组
D3	第A3组

24小时后，移除培养液，以PBS缓冲溶液冲洗后，再加入100μL含有CCK-8的新鲜培养液，置于37℃，含5％的二氧化碳培养箱反应2小时后，震摇5分钟后，侦测每个槽孔于450nm波长下的吸光值。试验结果的细胞存活率换算公式为“各组吸光值”/“未经任何药物处理的控制组吸光值”×100％，细胞存活率结果如表7所示。

表7、本试验各组肝癌细胞于不同作用浓度的中草药萃取物的存活率。

请参照表7所示，第D3组于1mg/mL的作用浓度下，该肝癌细胞存活率仅为58.13±1.16％，明显低于第D0～D2组于1mg/mL的浓度的细胞存活率；因此，本发明的中草药萃取物第D3组具有较佳毒杀肝癌细胞的效果。

本发明的中草药萃取物可以有效控制肝癌细胞的增殖，其中特别是萃取以重量百分比计为60％的牛樟芝、20％的桑黄菇及20％的白鹤灵芝所获得的中草药萃取物效果最佳(即，上述第A3组的中草药萃取物)，以下试验遂仅以第A3组的中草药萃取物进行。

(E)中草药萃取物对肿瘤小鼠的肿瘤抑制效力评估

本试验是选用购自国家动物实验中心的C57BL/6雄性小鼠，该小鼠皆在8周周龄以上，体重20～25克之间。该小鼠是饲养于大仁科技大学的SPF动物中心，维持室温在25±1℃的动物室，光照时间与黑暗时间各为12小时。而且，小鼠可自由的进食与饮水；饲料(购自美国LabDiet,Inc.)及饮水皆由大仁科技大学动物中心供应。

本试验是选用购自食品工业发展研究所的小鼠肝癌细胞(HEPA1-6细胞株，BCRC60051)，该肝癌细胞株培养于含有10％胎牛血清、2mmol/LL-麸氨酸、1×非必需氨基酸、100μg/mL链霉素及100U/mL青霉素的培养液(DMEM)，将该肝癌细胞株置于37℃、5％二氧化碳及95％湿度的培养箱，每隔两天更换一次新鲜培养液。

将小鼠肝癌细胞以生理食盐水稀释至浓度为5×10⁶cell/mL后，将该肝癌细胞株于小鼠腋下部位进行皮下注射，以获得肿瘤小鼠。

接着，以10、20、30mg/kg/day的剂量分别将本发明的中草药萃取物(其牛樟芝、桑黄菇与白鹤灵芝的重量百分比分别为60％、20％及20％，即为前述第A3组)经口喂食至各组肿瘤小鼠(分别为第E1、E2及E3组)，以RO水作为控制组(第E0组)，每天喂食两次，连续投予30天，且每周记录肿瘤体积。各组肿瘤小鼠牺牲后，秤取肿瘤小鼠体重，并秤重切除瘤块、脾脏及肝脏，计算抑瘤率、脾系数和肝脏系数，结果如表8所示；续将各组肿瘤小鼠的瘤块浸泡于10％的甲醛进行固定，切除各组瘤块的同一位置放入包埋盒并进行脱水，以利后续石蜡包埋的进行，形成各组石蜡块；将各该组石蜡块于-20℃下切割成厚度约为5μm的薄片，并放入烘箱内干燥，续进行H&E(hematoxyin-eosin)染色。

表8、各组肿瘤小鼠于30天后的体重、肝脏和脾脏重量与肿瘤体积变化。

组别

体重

肝脏

脾脏

肿瘤体积

肿瘤生长

[0080]

	(g/mouse)	(mg/mouse)	(mg/mouse)	(mm³/mouse)	抑制率(％)
						E0	25.1±1.2	137.1±0.8	75.2±3.2	1512.23±2.77	－
E1	24.9±1.3	136.7±0.4	79.8±2.9	1089.21±1.91^*	27.97±2.81
						E2	25.2±1.8	139.2±0.3	79.6±2.4	932.41±1.89^*	38.34±2.92
E3	25.2±1.5	138.6±0.2	78.1±2.6	432.48±1.78^*	71.40±3.27

每组数据为8只肿瘤小鼠所得平均值，以mean±S.E.M.表示。

^*P＜0.05各组肿瘤小鼠所得数据相较于RO水组别数据的比较

本试验亦抽取各组肿瘤小鼠的血液通过全自动血液分析仪(sysmexF-800，Japan)进行肝肾功能的评估：血液中GOT、GPT、血尿素氮(bloodureanitrogen，简称BUN)及肌酸酐(creatinine)的变化，结果如表9所示。

表9、各组肿瘤小鼠于30天后的肝肾功能相关生化指数。

每组数据为8只肿瘤小鼠所得平均值，以mean±S.E.M.表示。

^*P＜0.05各组肿瘤小鼠所得数据相较于RO水组别数据的比较

请参照图2所示，本发明的中草药萃取物相较于控制组别可以有效缩小肿瘤体积及其扩增速度；续参照表8所示，随着投予中草药萃取物的剂量增加，肿瘤生长的抑制效果亦相对提升，于30mg/kg/day的投予剂量下，肿瘤生长抑制率高达71.40±3.27％(第E3组)，显著高于剂量为10及20mg/kg/day的肿瘤生长抑制率(第E1及E2组)，且不同剂量的中草药萃取物对于体重、肝脏和脾脏重量变化与控制组间均无显著差异，显示本发明的中草药萃取物不会损害其他非肿瘤区域。

请参照表9所示，各组肿瘤小鼠体内肝功能指数GOT与GPT数值，会随着本发明的中草药萃取物的投予剂量增加而减少，而肾功能指数BUN及肌酸酐则无明显差异，显示该中草药萃取物于投予剂量范围内具有保护肝脏的能力，减缓肝脏受损的程度，但不会对肾脏产生任何影响。

请参照图3A所示，为第E0组的H&E染色切片图，可以明显看出由于肿瘤体积过大因而压迫下方的肌肉群，使得肿瘤周边区域有脂肪细胞浸润的现象发生，而内部肿瘤细胞则仍然呈致密且片状排列；请参照图3B～图3D所示，分别为第E1～E3组的H&E染色切片图，与第E0组结果相比，发现肿瘤周边至中央处均有局部至广泛性坏死的现象产生，且肿瘤坏死区使部分肿瘤细胞排列呈岛样，其中特别是第E3组(请参照图3D)中，由于肿瘤坏死区所占的面积较大，使得部分肿瘤细胞受坏死区所分散而呈离散状分布。

综合上述，本发明的中草药萃取物具有三萜类及多醣体等活性成分，可以有效缩小肝肿瘤体积，广泛应用于各种肝癌患者，可以辅助现有肝癌疗法，达到治疗肝癌的功效。

另外，本发明的中草药萃取物可以利用所富含的多醣体，解决牛樟芝单方所造成免疫力下降的问题，强化免疫系统，活化巨噬细胞，达到减轻服用牛樟芝单方引起的副作用的功效。

并且，本发明的一种中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途，是借助萃取牛樟芝、桑黄菇及白鹤灵芝所获得的活性成分毒杀肝癌细胞，促使肝肿瘤内部组织坏死，达到使肝肿瘤无法增生的功效。

Claims

1.一种用以治疗肝癌的中草药萃取物，其特征是包含由以下方法制备获得：

混合以重量百分比计为33.4～60%的牛樟芝、20～33.4%的桑黄菇及20～33.4%的白鹤灵芝，并获得一个混合物；

以95%乙醇于50～80℃下萃取该混合物8～12小时，该混合物与95%乙醇的重量体积比为1：2，获得一个中草药萃取液；及

将该中草药萃取液进行浓缩，以获得该中草药萃取物。

2.如权利要求1所述的用以治疗肝癌的中草药萃取物，其特征在于：该混合物包含以重量百分比计为60%的牛樟芝、20%的桑黄菇及20%的白鹤灵芝。

3.如权利要求1或2所述的用以治疗肝癌的中草药萃取物，其特征在于：以隔水加热的方式萃取该混合物。

4.如权利要求1或2所述的用以治疗肝癌的中草药萃取物，其特征在于：萃取该混合物的时间为10小时。

5.一种中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途，其特征是将该中草药萃取物投予一个所需个体，以抑制肝癌细胞生长，其中，该中草药萃取物是由以下方法制备获得：

以95%乙醇于50～80℃加热萃取该混合物，该混合物与95%乙醇的重量体积比为1：2，获得一个中草药萃取液；及

将该中草药萃取液进行浓缩，以获得该中草药萃取物。

6.如权利要求5所述的中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途，其特征在于：该中草药萃取物以口服方式投予该所需个体。

7.如权利要求5所述的中草药萃取物用于制备肝癌药物的用途，其特征在于：该中草药萃取物的剂量是每天每公斤的该所需个体体重10～30毫克，且该中草药萃取物是持续施予该所需个体30天。