CN105229033B - 针对与肝素复合的抗凝血酶β的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本专利文件涉及针对与肝素和/或肝素样结构复合的人抗凝血酶β（ATβH）的抗体、抗原结合抗体片段（Fab）及其他蛋白质支架。这些ATβH结合蛋白可以阻断ATβ的抗凝活性，以诱导凝血。这些抗体和结合剂的治疗用途在本文中描述为淘选和筛选特异性抗体的方法。

Description

针对与肝素复合的抗凝血酶β的单克隆抗体
与相关申请的交叉参考
本申请作为PCT国际专利申请于2014年3月14日提交，并且要求于2014年3月14日提交的美国临时专利申请号61/784,590的优先权，所述专利申请的整个公开内容在此整体引入作为参考。
序列表提交
本申请包括作为txt文件以电子形式的序列表，所述txt文件名称为“SEQUENCE-LISTING-17207.0006WOU2”，于2014年3月14日创建，并且具有65.1千字节（KB）的大小。txt文件“SEQUENCE-LISTING-17207.0006WOU2”的内容引入本文作为参考。
背景
血友病领域中的目前未满足的医学需要主要是：（1）具有抑制剂的血友病患者（~30%的血友病患者）的治疗；和（2）长效和有效的凝血因子（FVIII/FIX）和/或其替代（旁路药物）（WFH报道2012，Paris）。用于治疗具有抑制剂的血友病患者的最广泛使用的旁路药物是rFVII，其具有重大缺点例如致血栓性的危险、血浆中的短半衰期和高生产成本。针对抗凝因子例如组织因子蛋白质抑制剂（TFPI）、APC（活化蛋白C）和抗凝血酶（AT）的抗体代表新的治疗范例。这些抗体不仅绕过或降低具有抑制剂的血友病患者中关于FVIII或FIX凝血因子的需要，还显示出更长的血浆半衰期（其降低给药频率），并且因此增加患者依从性。迄今为止，存在处于临床前开发或研究阶段的几种基于抗体的促凝药物，例如抗TFPI和抗APC。
AT是人血浆中的主要抗凝剂。它抑制在凝血途径中起作用的凝血酶、FXa及其他丝氨酸蛋白酶。它由432个氨基酸组成，由肝脏肝细胞产生，并且具有三天的长血浆半衰期（Collen，Schetz等人1977）。AT的氨基酸序列是非常保守的，并且在牛、绵羊、兔、小鼠和人中的同源性是84%-89%（Olson和Bjork 1994）。尽管AT的主要生理学靶是凝血酶和FXa，但AT还将FIXa、FXIa、FXIIa以及FVIIa抑制至更少程度。AT连同肝素一起发挥其抑制。在肝素的存在下，凝血酶和FXa被AT的抑制速率增加3至4个数量级，分别为7–11 x 103 M-1s-1至1.5 –4 X 107 M-1s-1，以及2.5 x 10−3 M−1 s−1至1.25 -2.5 M-1s-1（Olson，Swanson等人2004）。
与分别在初始阶段和放大阶段单独抑制凝血的TFPI和APC不同，AT在初始和放大阶段两者都对凝血发挥其抑制。因此，阻断AT可以具有比阻断单独的TFPI或APC更有力的促凝效应。减少的AT水平和活性已显示与人中增加的血栓形成关联。具有AT缺乏的患者趋于显示复发性静脉血栓形成和肺栓塞（van Boven和Lane 1997）。此外，纯合AT敲除小鼠死于胚胎期，具有极端高凝状态（Ishiguro，Kojima等人2000）。近期研究显示在尾夹出血模型中，其中AT显著降低50%的杂合AT敲除hema小鼠具有更少的失血和增强的凝血酶生成（Bolliger，Szlam等人2010）。
AT是具有基于在Asn135上的差异糖基化的两种同种型ATα和ATβ的糖蛋白（Bjork1997）。ATβ缺乏在Asn135处的糖基化，并且是代表10%的人血浆AT的次要糖同种型。Asn135定位在与初始肝素附着位点毗邻，并且构成在别构活化和D螺旋延伸后的延伸肝素结合位点的部分（dela Cruz，Jairajpuri等人2006）。在Asn135处的大尺寸聚糖的缺乏以两种方式显著影响ATβ活化：1）在肝素结合后抑制FXa和FIXa所需的更快速的别构活化；和2）关于通过桥连机制抑制FXa和凝血酶的更高亲和力的肝素结合的额外可接近的结合位点。事实上，在生理学盐浓度下，血浆衍生的ATβ以36+/- 3nm的KD与肝素结合，而ATα以500+/- 50nm的KD与肝素结合（Turk IV.等人，1993）。ATβ对于肝素的更高亲和力导致其优先分布至内皮下层，其富含肝素样结构–糖胺聚糖。因此，ATβ提议在血管损伤部位处的FXa和凝血酶抑制中起主要和有力作用（Carlson和Atencio 1982；McCoy AJ，Pei XY.等人2003；Turk B，Brieditis I.等人1997；Witmer MR，Hatton MW. 1991；Frebelius S,等人1996）。ATβ相对于ATα的重要性和更强的效力也在临床研究中得到报道。在患者中，在肝素结合中缺陷的AT纯合突变的严重性通过AT的β形式得到改善（Martinez-Martinez，Navarro-Fernandez等人2012）。在另一项研究中，AT的界线水平（~70%的正常AT抗原和活性）被血浆中的20% ~ 30%ATβ补偿（Bayston，Tripodi等人1999）。
概述
提供了针对人ATβH（与肝素和/或肝素样结构复合的ATβ）的单克隆抗体。在至少一个实施方案中，抗ATβH单克隆抗体显示出结合与肝素复合的ATβ。
在其他实施方案中，针对人ATβH的单克隆抗体可以进行优化，例如以具有增加的亲和力或增加的功能活性。还提供的是特异性表位，其可以在人ATβH上，并且由经分离的单克隆抗体结合。进一步提供的是编码其的经分离的核酸分子。
还提供的是包含抗ATβH单克隆抗体的药物组合物，以及遗传性和获得性凝血缺乏或缺陷例如血友病A和B的治疗方法。
还提供的是通过给有此需要的患者施用抗ATβH单克隆抗体，用于缩短出血时间的方法。还提供的是用于产生结合人ATβH的单克隆抗体的方法。
附图简述
技术人员应当理解下文描述的附图仅用于举例说明性目的。附图不预期以任何方式限制本文教导或权利要求的范围。
图1显示了与肝素结合的ATβ和ATβ的各种结合结构域的图示。
图2A-2C显示了ATβ如何通过一个N聚糖的缺乏与ATα区别。
图3A-3D显示了ATβ比ATα与肝素更快速的结合和更有力的抑制。
图4A显示了生物素化的hAT和rAT在Fxa生成的抑制中起作用（图4A）。图4B-4C显示了通过噬菌体展示的抗体发现的各种策略。
图5显示了用于鉴定能够功能抑制ATβ::肝素的抗体的筛选方法。
图6A和6B分别显示了抗体TPP-2009（分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2）、TPP-2015（分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4）、TPP-2016（分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6）、TPP-2019（分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8）和TPP-2803（分别为SEQ ID NO:9和SEQID NO:10）的轻链结构域和重链结构域的氨基酸序列比对。
图7A-7C显示了通过Biacore（图7A）和ELISA（图7B）测试测定的抗体结合特异性，以及与人AtβH的抗体结合亲和力（图7C）。
图8A是TPP抗体对人HEM-A血浆中的凝血酶生成的作用的图解表示，并且举例说明抗体存在增加人HEM-A血浆中的峰凝血酶生成。
图8B是显示抗体缩短人Hem-A血浆以及掺入Atβ或Atα的人AT缺乏血浆中的凝血时间的表。
图9是在HEM-A小鼠中的抗体TPP 2009的PK的图解表示，使用以0.3、3和30mg/kg的IV给药，三只小鼠/时间点（经过21天10个时间点），以及相关PK参数。
图10A和10B显示了关于HemA中的尾静脉横切（TVT）模型的实验方案，以及HemA小鼠中的TVT模型中的抗体TPP-2009的功效。图10B显示了抗体TPP-2009在HemA小鼠的尾静脉横切（TVT）模型中具有有力功效。
图11A和11B显示了用/不用肝素复合的天然ATβ（图11A）、以及与肝素结合的完全活化的抗体TPP2009（图11B）及其预测的表位结构的三维结构的分子模型。螺旋D在肝素结合B后延伸。
图12显示了使用FXa活化凝血测定，TPP2803显示出在正常人血浆和血友病患者血浆中的凝血时间的剂量依赖性缩短。CT：凝血时间，HEM-A：血友病A血浆。
图13显示了肝素化兔出血模型的实验设计；实验组：媒介物，PBS；阳性对照，硫酸鱼精蛋白（28mg/kg IV）；阴性对照，M14 IgG2；处理：30mg/kg；TPP2803，3mg/kg；TPP2803，30mg/kg。
图14. 显示了在肝素化兔出血模型中，在LMWH和化合物施用前和后，对照和TPP2803对出血时间的作用。
图15. 显示了对照和TPP2803对δ出血时间的作用显著不同于PBS（p< 0.05；T检验）。
图16. 显示了在LMWH和抗体施用前和后，对照和TPP2803对失血的作用。（显著性通过T检验）。
详述
本公开内容提供了抗体包括单克隆抗体及其他结合蛋白，其与活化形式的ATβ特异性结合，但显示出针对幼稚的（naïve）或活化的ATα形式相当少的反应性或无反应性，。
定义
为了解释本说明书的目的，应用下述定义。在下文阐述的任何定义与该单词在任何其他文件，包括引入本文作为参考的任何文件中的使用冲突的情况下，下文阐述的定义应始终为准，用于解释本说明书及其相关权利要求的目的，除非明确意图相反含义（例如在其中该术语最初使用的文件中）。
适当时，以单数使用的术语还包括复数，并且反之亦然。“一个/种”在本文中的使用意指“一个或多个/一种或多种”，除非另有说明或当“一个或多个/一种或多种”的使用明确不适当时。“或”的使用意指“和/或”，除非另有说明。“包含（comprise）”、“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“包括（include）”、“包括（includes）”和“包括（including）”的使用是可互换的，并且是非限制性的。术语“例如（such as）”、“例如（forexample）”和“例如（e.g.）”也不预期是限制性的。例如，术语“包括”应意指“包括但不限于”。
如本文使用的，术语“约”指提供的单位值的+/- 10%。如本文使用的，术语“基本上”指显示出目的特征或特性的总计或近似程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员应当理解生物学和化学现象很少（如果有的话）达到或避免决定结果，由于影响生物学和化学组合物和材料的测试、生产和贮存的许多变量，以及由于在生物学和化学组合物和材料的测试、生产和贮存中使用的仪器和设备中的固有误差。术语基本上因此在本文中用于捕获在许多生物学和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
如本文使用的，术语“ATβ”或“ATβH”指AT的任何变体、同种型和/或物种同系物，其形式由细胞天然表达并且存在于血浆中，并且不同于ATα。进一步地，如本文使用的，术语“ATβ”或“ATβH”还可以指与肝素或肝素样结构复合的ATβ的活化形式。
如本文使用的，术语“抗体”指完整抗体及其任何抗原结合片段（即，“抗原结合部分”）或其单链。该术语包括全长免疫球蛋白分子（例如IgG抗体），其是天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的，或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如抗体片段，其保留特异性结合活性。与结构无关，抗体片段结合由全长抗体识别的相同抗原。例如，抗ATβH单克隆抗体片段与ATβH的表位结合。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的例子包括：（i）Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii）F（ab'）2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，（v）由VH结构域组成的dAb片段（Ward等人，（1989）Nature 341:544-546）；（vi）经分离的互补决定区（CDR）；（vii）微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体和κ体（参见例如Ill等人，Protein Eng 1997；10:949-57）；（viii）骆驼IgG；和（ix）IgNAR。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子（称为单链Fv（scFv）；参见例如，Bird等人（1988）Science 242:423-426；和Huston等人（1988）Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883）。此类单链抗体也涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式分析片段的效用。
此外，考虑抗原结合片段可以涵盖在抗体模拟物中。如本文使用的，术语“抗体模拟物”或“模拟物”指这样的蛋白质，其显示出与特定抗体相似的结合活性，但为更小的替代抗体或非抗体蛋白质。此类抗体模拟物可以包含在支架中。术语“支架”指用于改造具有定制功能和特征的新产物的多肽平台。
如本文使用的，术语“抗ATβ抗体”指特异性结合与肝素或肝素样相关的ATβ的表位的抗体。当在体内与ATβH的表位结合时，本文公开的抗ATβ抗体增强凝血级联的一个或多个方面。
如本文使用的，术语“抑制结合”和“阻断结合”（例如（提及ATβ底物与ATβH的结合的抑制/阻断）可互换使用，并且涵盖蛋白质与其底物的部分和完全抑制或阻断两者，例如至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、或约100%的抑制或阻断。
提及ATβ底物与ATβ的结合的抑制和/或阻断，术语抑制和阻断还包括与不和抗ATβ抗体接触的ATβ相比较，当与抗ATβ抗体接触时，ATβ和/或ATβH与生理学底物的结合亲和力中的任何可测量减少，例如ATβ与其底物的相互作用至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、或约100%的阻断。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单分子组合物的抗体分子。单克隆抗体组合物展示关于特定表位的单一结合特异性和亲和力。相应地，如本文使用的，术语“人单克隆抗体”指展示单一结合特异性的抗体，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变）。
如本文使用的，术语“经分离的抗体”意指基本上不含其他生物学分子，包括具有不同抗原特异性的抗体的抗体（例如与ATβH结合的经分离的抗体基本上不含结合除ATβH外的抗原的抗体）。在一些实施方案中，经分离的抗体为按干重计至少约75%、约80%、约90%、约95%、约97%、约99%、约99.9%或约100%纯的。在一些实施方案中，纯度可以通过诸如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析的方法进行测量。然而，与人ATβH的表位、同种型或变体结合的经分离的抗体可以与例如来自其他物种的其他相关抗原（例如ATβH物种同系物）具有交叉反应性。此外，经分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
如本文使用的，术语“特异性结合”指与预定抗原结合的抗体。显示出特异性结合的抗体通常以至少约105M -1的亲和力与抗原结合，并且与该抗原结合的亲和力比其对于无关抗原（例如BSA、酪蛋白）的结合亲和力高，例如至少两倍高。短语“识别抗原的抗体”和“对于抗原特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。如本文使用的，术语“最低限度结合”指不与指定抗原结合和/或显示出与指定抗原的低亲和力的抗体。通常，与抗原具有最低限度结合的抗体以低于约102 M-1的亲和力与该抗原结合，并且不以比它与无关抗原结合更高的亲和力与预定抗原结合。
当在本文中用于抗体例如IgG抗体时，术语“高亲和力”指至少约107 M-1的结合亲和力，在至少一个实施方案中，至少约108 M-1，在一些实施方案中，至少约109 M-1、约1010 M-1、约1011 M-1或更大，例如最高达约1013 M-1或更大。然而，“高亲和力”结合可以对于其他抗体同种型改变。例如，关于IgM同种型的“高亲和力”结合指至少约107 M-1的结合亲和力。
如本文使用的，术语“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别（例如IgM或IgG1）。
如本文使用的，术语“互补决定区”或“CDR”指在抗体分子的重链可变区或轻链可变区内的三个高变区之一，其构成与所结合抗原的三维结构互补的N末端抗原结合表面。从重链和轻链的N末端开始，这些互补决定区分别指定为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3” [Wu TT，Kabat EA，Bilofsky H，Proc Natl Acad Sci U S A. 1975 Dec；72（12）:5107和Wu TT，Kabat EA，J Exp Med. 1970 Aug 1；132（2）:211]。CDR涉及抗原抗体结合，并且CDR3包含对于抗原抗体结合特异性的独特区域。因此，抗原结合位点可以包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区各自的CDR区。术语“表位”指抗体与之特异性结合或相互作用的区域或区，在一些实施方案中，所述区域或区指示抗原在其中与抗体处于物理接触。相反，术语“互补位”指抗原在其上特异性结合的抗体区域或区。如果相应抗体的结合是相互排斥的，即一种抗体的结合排除另一种抗体的同时结合，则通过竞争结合表征的表位被说成重叠的。如果抗原能够同时容纳两种相应抗体的结合，则表位被说成是分开的（独特的）。
如本文使用的，术语“竞争抗体”指与如本文描述的针对ATβH的抗体结合大约相同、基本上相同、基本相同或甚至相同表位的抗体。竞争抗体包括具有重叠表位特异性的抗体。竞争抗体因此能够与如本文描述的抗体有效竞争结合ATβH。在一些实施方案中，竞争抗体可以与本文描述的抗体结合相同的表位。换言之，竞争抗体具有与本文描述的抗体相同的表位特异性。
如本文使用的，术语“保守置换”指涉及一个或多个氨基酸置换具有相似生物化学特性的氨基酸的多肽修饰，其不导致多肽的生物学或生物化学功能的丧失。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中得到限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸（例如天冬氨酸、谷氨酸）、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非极性侧链的氨基酸（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、具有β-分支侧链的氨基酸（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳族侧链的氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。本公开内容的抗体可以具有一个或多个保守氨基酸置换，仍保留抗原结合活性。
对于核酸和多肽，如本文使用的，术语“基本同源性”指示，在至少约80%的核苷酸或氨基酸中，通常为至少约85%，在一些实施方案中，约90%、约91%、约92%、约93%、约94%或约95%，在至少一个实施方案中，至少约96%、约97%、约98%、约99%、约99.1%、约99.2%、约99.3%、约99.4%或约99.5%的核苷酸或氨基酸中，当最佳比对且比较时，两种核酸或两种多肽或其指定序列是相同的，伴随适当的核苷酸或氨基酸插入或缺失。可替代地，当区段在选择性杂交条件下与链的互补体杂交时，存在关于核酸的基本同源性。还包括的是与本文所述的特异性核酸序列和氨基酸序列具有基本同源性的核酸序列和多肽序列。两个序列之间的同一性百分比是由序列共享的相同位置数目的函数（即同源性% = 相同位置#/位置总# x100），考虑到为了两个序列的最佳比对需要引入的缺口数目和每个缺口的长度。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的测定可以使用数学算法来完成，所述数学算法例如但不限于VectorNTI™（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）的AlignX™模块。对于AlignX™，多重比对的缺省参数是：缺口开放罚分：10；缺口延伸罚分：0.05；缺口分开罚分范围：8；比对延迟的同一性%：40。
两个序列之间的同一性百分比是由序列共享的相同位置数目的函数（即同源性%= 相同位置#/位置总# x 100），考虑到为了两个序列的最佳比对需要引入的缺口数目和每个缺口的长度。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的测定可以使用数学算法来完成，所述数学算法例如但不限于VectorNTI™（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）的AlignX™模块。对于AlignX™，多重比对的缺省参数是：缺口开放罚分：10；缺口延伸罚分：0.05；缺口分开罚分范围：8；比对延迟的同一性%：40。（进一步的细节在http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEACommunities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for- PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html处发现）。
用于测定查询序列（本公开内容的序列）和主题序列之间的总体匹配的另一种方法，也称为总体序列比对，可以使用CLUSTALW计算机程序（Thompson等人，Nucleic AcidsResearch，1994，2（22）: 4673-4680）进行测定，所述CLUSTALW计算机程序基于Higgins等人，Computer Applications in the Biosciences（CABIOS），1992，8（2）: 189-191的算法。在序列比对中，查询和主题序列均为DNA序列。所述总体序列比对的结果以同一性百分比表示。可以在DNA序列的CLUSTALW比对中用于经由配对比对计算同一性百分比的参数是：矩阵= IUB，k-元组 = 1，顶部对角线数= 5，缺口罚分 = 3，缺口开放罚分 = 10，缺口延伸罚分= 0.1。对于多重比对，可以使用下述CLUSTALW参数：缺口开放罚分 = 10，缺口延伸参数=0.05；缺口分开罚分范围= 8；比对延迟的同一性%：40。
核酸可以存在于全细胞、细胞裂解产物中、或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当从它在天然环境中通常与之结合的其他细胞组分中纯化出来时，核酸是“经分离的”或“致使基本上纯的”。为了分离核酸，可以使用标准技术例如下述：碱/ SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳及其他本领域众所周知的其他技术。
针对ATβH的单克隆抗体
其中稳态在血友病或其中伤口导致暂时性止血丧失的创伤患者中失调的出血障碍可以通过AT抑制剂进行治疗。抗体、其抗原结合片段及其他AT特异性蛋白质支架可以用于提供靶向特异性，以抑制AT蛋白质功能子集，同时保存剩余部分。考虑到ATβ的血浆浓度（<12 ug/ml）相对于ATα（120 ug/ml）中的至少10倍差异，在高度循环过量ATα的存在下，任何潜在ATβ抑制剂治疗剂的特异性增加帮助阻断ATβ功能。阻断ATβ的抗凝功能的ATβ特异性抗体可以用作患有出血障碍的患者的治疗剂。出血障碍的例子包括血友病、具有抑制剂的血友病患者、创伤诱导的凝血病、在通过AT的败血症治疗过程中严重出血的患者、起因于选择性手术（例如移植、心脏手术、矫形外科手术）的出血、和由于月经过多的过量出血。具有长循环半衰期的抗ATβH抗体可以用于治疗慢性疾病如血友病。具有更短半衰期的ATβH抗体片段或ATβH结合蛋白支架可以对于急性用途（例如创伤中的治疗用途）更有效。ATβH结合抗体通过淘选且筛选针对与肝素复合的人ATβ的人抗体文库进行鉴定。所鉴定的抗体显示出与人ATβH的结合。将经分离的每种单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区测序，并且鉴定其CDR区。对应于ATβH特异性单克隆抗体的重链和轻链可变区的序列标识号（“SEQ ID NO”）概括于表1A中。
表1A - 人抗ATβH（肝素复合的ATβ）抗体
在至少一些可能的实施方案中，经分离的单克隆抗体与人ATβH结合，并且抑制抗凝活性，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO: 2、4、6、8和10的氨基酸序列的重链可变区。
在至少一些可能的实施方案中，经分离的单克隆抗体与人ATβH结合，并且抑制抗凝活性，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO: 1、3、5、7和9的氨基酸序列的轻链可变区。
在至少一些可能的实施方案中，经分离的单克隆抗体与人ATβH结合，并且抑制抗凝活性，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO: 2、4、6、8和10的氨基酸序列的重链可变区，以及含有选自SEQ ID NO: 1、3、5、7和9的氨基酸序列的轻链可变区。
在至少一些可能的实施方案中，抗体包含重链和轻链可变区，其包含：
（a）包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的轻链可变区；
（b）包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的轻链可变区；
（c）包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的轻链可变区；或
（d）包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的轻链可变区；或
（e）包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的轻链可变区。
表1B显示了关于人源化IgG mAb的重链和轻链氨基酸序列。
表1B - 关于人源化IgG mAb的重链和轻链氨基酸序列。
表1C – 显示了TPP2803 IgG2，种系的且转换为IgG2。表1C中所示的TPP2803 IgG2轻链G2，λ，氨基酸序列是SEQ ID NO:59，并且表1C中所示的TPP2803重链氨基酸序列是SEQID NO: 60。
表1C - TPP2803 IgG2，种系的且转换为IgG2
表2A提供了关于与人ATβH结合的单克隆抗体的重链和轻链的CDR区（“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”）的SEQ ID NO:概括。
表2A - 关于人抗ATβH抗体的CDR区的序列标识符
表2B提供了关于与人ATβH结合的单克隆抗体的重链和轻链的CDR区（“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”）的SEQ ID NO:序列。
表2B – 关于人抗ATβH抗体的CDR区的序列
在至少一些可能的实施方案中，提供了与人ATβH结合的经分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO: 46-50中任何一个的氨基酸序列的CDR3。这些CDR3来自在淘选和筛选过程中鉴定的抗体的重链。
在一个进一步的实施方案中，该抗体进一步包含：（a）含有选自SEQ ID NO: 36-40的氨基酸序列的CDR1；（b）含有选自SEQ ID NO: 41-45的氨基酸序列的CDR2；或（c）含有选自SEQ ID NO: 36-40的氨基酸序列的CDR1，以及含有选自SEQ ID NO: 41-45的氨基酸序列的CDR2两者。
在至少一些可能的实施方案中，抗体共享来自在淘选和筛选过程中鉴定的抗体轻链之一的CDR3。因此，还提供的是经分离的单克隆抗体，其中所述抗体与ATβH结合且抑制抗凝活性，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO: 31-35的氨基酸序列的CDR3。在进一步的实施方案中，抗体进一步包含（a）含有选自SEQ ID NO: 21-25的氨基酸序列的CDR1；（b）含有选自SEQ ID NO: 26-30的氨基酸序列的CDR2；或（c）含有选自SEQ ID NO: 21-25的氨基酸序列的CDR1，以及含有选自SEQ ID NO: 26-30的氨基酸序列的CDR2两者。
在至少一些可能的实施方案中，抗体包含来自由筛选和淘选鉴定的抗体的重链和轻链的CDR3。提供的是经分离的单克隆抗体，其中所述抗体与ATβH结合且抑制抗凝活性，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO: 46-50的氨基酸序列的CDR3，以及含有选自SEQ IDNO: 31-35的氨基酸序列的CDR3。在一个进一步的实施方案中，抗体进一步包含（a）含有选自SEQ ID NO: 36-40的氨基酸序列的CDR1；（b）含有选自SEQ ID NO: 41-45的氨基酸序列的CDR2；（c）含有选自SEQ ID NO: 21-25的氨基酸序列的CDR1；和/或（d）含有选自SEQ IDNO: 26-30的氨基酸序列的CDR2。
在一些实施方案中，抗体包含含有下述的重链和轻链可变区：
（a）包含含有SEQ ID NO: 21、26和31的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含含有SEQ ID NO: 36、41和46的氨基酸序列的重链可变区；
（b）包含含有SEQ ID NO: 22、27和32的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含含有SEQ ID NO: 37、42和47的氨基酸序列的重链可变区；
（c）包含含有SEQ ID NO: 23、28和33的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含含有SEQ ID NO: 38、43和48的氨基酸序列的重链可变区；
（d）包含含有SEQ ID NO: 24、29和34的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含含有SEQ ID NO: 39、44和49的氨基酸序列的重链可变区；
（e）包含含有SEQ ID NO: 25、30和35的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含含有SEQ ID NO: 40、45和50的氨基酸序列的重链可变区。
还提供的是与AtβH结合且抑制抗凝活性的经分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO: 1-10中所示的氨基酸序列的氨基酸序列具有至少约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约99.5%同一性。
抗体可以是物种特异性的，或可以与多个物种交叉反应。在一些实施方案中，抗体可以与人、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、猪、狗、猫或其他哺乳动物物种的ATβH特异性反应或交叉反应。
抗体可以是各种抗体类别中的任一个，例如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA和IgD和IgE抗体。
在一个实施方案中，提供的是针对人ATIII的经分离的全人单克隆抗体。
抗ATβH抗体的优化变体
在一些实施方案中，抗体可以进行淘选、筛选且优化，例如以增加对ATβH的亲和力、进一步减少对ATα的任何亲和力、改善对不同物种的交叉反应性、或改善ATβH的阻断活性。例如，通过利用CDR或与CDR紧密接近的氨基酸残基，即与抗体的CDR毗邻的约3或4个残基的位点饱和诱变，可以执行此类优化。
还提供的是可以具有针对ATβH增加的或高亲和力的单克隆抗体。在一些实施方案中，抗ATβH抗体可以具有至少约108M-1的结合亲和力，在一些其他实施方案中，可以具有至少约109M-1、约1010M-1、约1011M-1或更大，例如最高达约1013M-1或更大的结合亲和力。
在一些实施方案中，可以引入另外的氨基酸修饰，以降低与种系序列的分歧。在其他实施方案中，可以引入氨基酸修饰，以促进用于大规模生产过程的抗体生产。
在一些实施方案中，提供的是与人ATβ特异性结合的经分离的抗ATβH的单克隆抗体，所述抗体可以包含一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，抗体可以包含约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个或更多个修饰。
表位
还提供的是可以与人ATβH的预测表位结合的经分离的单克隆抗体，其中所述表位包含来自人ATβH的一个或多个残基，如图11中所示。
在一些实施方案中，表位包含人ATβH的N135位点。在其他实施方案中，位点可以包含人ATβH的RCL环的氨基酸残基序列的一部分。
还提供的是可以与本文描述的抗体中的任一种竞争结合人ATβH的抗体。例如，此类竞争抗体可以与上文描述的一个或多个表位结合。
核酸、载体和宿主细胞
还提供的是编码本文描述的单克隆抗体中任一种的经分离的核酸分子。因此，提供的是编码与人ATβH结合的抗体的经分离的核酸分子。表3显示了一些抗ATβH抗体的核苷酸序列。
表3 - 抗ATβH抗体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，经分离的核酸分子编码与ATβH结合且抑制抗凝活性、但与ATα具有最低限度结合的抗体，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO: 2、4、6、8和10的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中，经分离的核酸分子编码与ATβH结合且抑制抗凝活性、但与ATα具有最低限度结合的抗体，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO: 1、3、5、7和9的氨基酸序列的轻链可变区。
在其他实施方案中，经分离的核酸分子编码与ATβ结合且抑制ATβ的抗凝活性的抗体，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO: 2、4、6、8和10的氨基酸序列的重链可变区，或含有选自SEQ ID NO: 1、3、5、7和9的氨基酸序列的轻链可变区，以及重链可变区或轻链可变区中的一个或多个氨基酸修饰。
进一步地，还提供的是包含编码上文描述的单克隆抗体中任一种的经分离的核酸分子的载体，以及包含此类载体的宿主细胞。
制备针对ATβH的抗体的方法
单克隆抗体可以通过在宿主细胞中表达核苷酸序列重组产生，所述核苷酸序列编码根据本发明实施方案之一的单克隆抗体的可变区。借助于表达载体，含有核苷酸序列的核酸可以在适合于生产的宿主细胞中转染且表达。相应地，用于产生与人ATβH结合的单克隆抗体的示例性方法可以包括：（a）将编码单克隆抗体的核酸分子转染到宿主细胞内；（b）培养宿主细胞，以便在宿主细胞中表达单克隆抗体，和（c）任选分离且纯化所产生的单克隆抗体，其中所述核酸分子包含编码单克隆抗体的核苷酸序列。
在一个例子中，为了表达抗体或其抗体片段，将通过标准分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体内，使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在该上下文中，术语“可操作地连接的”指抗体基因这样连接到载体内，使得在载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因的转录和翻译的意图功能。表达载体和表达控制序列选择为与所使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入分开的载体内，或可替代地，两种基因插入相同表达载体内。抗体基因通过标准方法（例如在抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，则平端连接）插入表达载体内。本文描述的抗体的轻链和重链可变区可以通过下述用于制备任何抗体同种型的全长抗体基因：将其插入已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内，使得VH区段与载体内的一个或多个CH区段可操作地连接，并且VL区段与载体内的CL区段可操作地连接。
另外或可替代地，重组表达载体可以编码促进从宿主细胞的抗体链分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体内，使得信号肽与抗体链基因的氨基末端框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽（即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽）。除抗体链编码基因之外，重组表达载体携带控制宿主细胞中的抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子及其他表达控制元件（例如多腺苷酸化信号），其控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列例如在Goeddel；Gene Expression Technology. Methodsin Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.（1990）中得到描述。本领域技术人员应当理解表达载体的设计，包括调节序列的选择可以取决于诸如下述的因素：待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列的例子包括指导在哺乳动物细胞中的高水平的蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒（CMV）、猴病毒40（SV40）、腺病毒（例如腺病毒主要晚期启动子（AdMLP））和多瘤的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，例如遍在蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。
除抗体链基因和调节序列之外，重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节宿主细胞中的载体复制的序列（例如复制起点）和可选标记物基因。可选标记物基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择（参见例如全部为Axel等人的美国专利号4,399,216；4,634,665；和5,179,017）。例如，通常可选标记物基因对载体已引入其内的宿主细胞赋予针对药物（例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤）的抗性。可选标记物基因的例子包括二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（连同氨甲蝶呤选择/扩增一起在dhfr-宿主细胞中使用）和neo基因（用于G418选择）。
对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的一个或多个表达载体转染到宿主细胞内。各种形式的术语“转染”涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在理论上能够在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但在真核细胞包括哺乳动物宿主细胞中的抗体表达是典型的，因为此类真核细胞且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配且分泌适当折叠且免疫活性的抗体。用于表达重组抗体的哺乳动物宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（包括在Urlaub和Chasin,（1980）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中描述的dhfr- CHO细胞，与DHFR可选标记物一起使用，例如如R. J. Kaufman和P. A.Sharp（1982）Mol. Biol. 159:601-621中所述）、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、HKB11细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，抗体通过将宿主细胞培养一段时间进行生产，所述时间段足以允许抗体在宿主细胞中表达，或抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。使用标准蛋白质纯化方法，例如超滤、大小排阻层析、离子交换色谱和离心，可以从培养基中回收抗体。
部分抗体序列表达完整抗体的用途
抗体占优势地通过氨基酸残基与靶抗原相互作用，所述氨基酸残基位于六个重链和轻链CDR中。为此，在CDR内的氨基酸序列在个别抗体之间比CDR外的序列更多样化。因为CDR序列负责大多数抗体抗原相互作用，所以能够通过构建表达载体来表达模拟特异性天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上、来自特异性天然存在的抗体的CDR序列（参见例如Riechmann，L.等人，1998，Nature 332:323-327；Jones，P.等人,1986，Nature 321:522-525；和Queen，C.等人，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033）。此类构架序列可以得自公开的DNA数据库，其包括种系抗体基因序列。这些种系序列不同于成熟抗体基因序列，因为它们不包括完全装配的可变基因，其通过B细胞成熟过程中的V（D）J连接形成。不必获得特定抗体的整个DNA序列，以便重新制备具有与原始抗体的那些相似的结合特性的完整重组抗体（参见WO99/45962）。
跨越CDR区的部分重链和轻链序列通常对于这个目的是足够的。部分序列用于测定哪个种系可变和连接基因区段促成重组抗体可变基因。种系序列随后用于填充可变区的缺失部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中被切割，并且不促成最终抗体的特性。为此，相应的种系前导序列用于表达构建体。为了添加缺失序列，克隆的cDNA序列可以通过连接或PCR扩增与合成寡核苷酸组合。可替代地，整个可变区可以作为一组短的重叠寡核苷酸合成，并且通过PCR扩增组合以制备整个合成可变区克隆。该过程具有诸如消除或包括特定限制位点、或者特定密码子优化的优点。重链和轻链转录物的核苷酸序列用于设计合成寡核苷酸的重叠组，以制备具有与天然序列相同的氨基酸编码能力的合成V序列。合成重链和轻链序列可以不同于天然序列。例如，重复核苷酸碱基串被中断，以促进寡核苷酸合成和PCR扩增；并且优化翻译起始位点根据Kozak的规则（Kozak，1991，J. Biol. Chem. 266:19867-19870）掺入；并且限制位点被改造到翻译起始位点上游或下游。对于重链和轻链可变区，在相应的非编码寡核苷酸的大约中点处，优化的克隆和相应的非克隆链序列被分解成30-50个核苷酸部分。对于每条链，寡核苷酸可以装配成重叠双链组，其跨越150-400个核苷酸的区段。库随后用作模板以产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。
通常，单个可变区寡核苷酸组将分解成两个库，其分开扩增以生成两个重叠PCR产物。这些重叠产物随后通过PCR扩增组合，以形成完全可变区。还可希望在PCR扩增中包括重链或轻链恒定区的重叠片段，以生成可以容易地克隆到表达载体构建体内的片段。重构的重链和轻链可变区随后与克隆的启动子、翻译起始、恒定区、3'非翻译、多聚腺苷酸化和转录终止序列组合，以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可以组合成单一载体，共转染，系列转染或分开转染到宿主细胞内，所述宿主细胞随后融合以形成表达两条链的宿主细胞。在另一个方面，人抗ATβH抗体的结构特点用于制备结构上相关的人抗ATβH抗体，其保留与ATβ结合的功能。例如，单克隆抗体的特异性鉴定的重链和轻链区的一个或多个CDR可以与已知的人构架区和CDR重组组合，以制备另外的重组改造的人抗ATβH抗体。
抗ATβH mAb的促凝功效
抗ATβH mAb的促凝功效使用各种测定进行研究。
表4显示了在FXa活化凝血测定中，抗ATβH mAb TPP2009和TPP2803在来自各个动物物种的血浆中的促凝功效。
表4 - TPP2009和TPP2803在来自各个动物物种的血浆中的促凝功效。
NDR：无剂量应答，ND：未测定，dPT：稀释的凝血酶原时间，HEM-A：血友病A血浆。
在FXa活化凝血测定中，抗ATβH mAb TPP2009和TPP2803两者均显示出在人正常血浆和血友病A血浆中的促凝功效。具体地，在FXa活化凝血测定中，TPP2009显示出在人正常血浆和血友病A血浆中的促凝功效，分别具有10.5 nM和4.7 nM的EC50。在FXa活化凝血测定中，TPP2803显示出在人正常血浆和血友病A血浆中的促凝功效，分别具有2.4和2.7 nM的EC50。
另外，使用FXa活化凝血测定，抗ATβH mAb TPP2803显示出在正常人血浆和血友病患者血浆两者中的凝血时间的剂量依赖性缩短，如图12所示。CT：凝血时间，HEM-A：血友病A血浆。
图13中概述的肝素化兔出血模型用于证实抗ATβH mAb TPP2803的体内促凝功效。在肝素化兔出血模型中，在LMWH和化合物施用前和后，对照和TPP2803对出血时间的作用显示于图14中。与PBS中的LMWH后的出血时间相比较，在LMWH和测试物品（3mg/kg或30 mg/kgTPP2803）施用后的出血时间显著降低。如图15中所示，在测试物品（3mg/kg或30 mg/kgTPP2803）或阳性对照硫酸鱼精蛋白施用后，δ出血时间显著不同于PBS（p< 0.05；*通过T检验的显著性）。图16中显示了在LMWH和抗体施用前和后，对照和TPP2803对失血的作用。TPP2803（3 mg/kg）和阳性对照硫酸鱼精蛋白均显示出在LMWH施用后的失血中的显著变化（*通过T检验的显著性）。
药物组合物
还提供的是药物组合物，其包含治疗有效量的抗ATβH单克隆抗体和药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”指这样的物质，其可以加入活性成分中以帮助配制或稳定制剂，并且不引起对患者的显著不利毒理学效应。此类载体的例子是本领域技术人员众所周知的，并且包括水，糖例如麦芽糖或蔗糖，白蛋白，盐例如氯化钠等。其他载体例如在E. W. Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences中描述。此类组合物将含有治疗有效量的至少一种单克隆抗体。
药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域已知的。组合物在一些实施方案中配制用于肠胃外注射。组合物可以配制为溶液、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）及其合适混合物的溶剂或分散介质。在一些情况下，载体的组合物包括等渗剂例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。
无菌可注射溶液可以通过下述进行制备：需要时，将活性化合物以所需量连同上文列举的成分之一或组合一起掺入适当溶剂中，随后为无菌微量过滤。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介物内进行制备，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，一些制备方法是真空干燥和冷冻干燥（冻干），其获得来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。
药学用途
单克隆抗体可以用于治疗目的，用于治疗遗传性和获得性凝血缺乏或缺陷。例如，上文描述的实施方案中的单克隆抗体可以用于阻断ATβH与其底物的相互作用，所述底物可以包括因子Xa或因子IIa。单克隆抗体具有在止血障碍的治疗中的治疗用途，所述止血障碍例如血小板减少症、血小板障碍和出血障碍（例如血友病A、血友病B和血友病C）。此类障碍可以通过给有此需要的患者施用治疗有效量的抗ATβH单克隆抗体进行治疗。单克隆抗体还在适应症例如创伤和出血性中风中不受控制的出血治疗中具有治疗用途。因此，还提供的是用于缩短出血时间的方法，其包括给有此需要的患者施用治疗有效量的抗ATβH单克隆抗体。
在另一个实施方案中，抗ATβH抗体可以用作AT治疗的患者的解毒剂，包括例如其中AT用于治疗败血症或出血障碍。
抗体可以用作单一疗法或与其他疗法组合以解决止血障碍。例如，一种或多种抗体与凝血因子例如因子VIIa、因子VIII或因子IX的共同施用被认为对于治疗血友病是有用的。在至少一些实施方案中，用于治疗遗传性和获得性凝血缺乏或缺陷的方法包括施用：（a）第一量的与人组织因子途径抑制剂结合的单克隆抗体；和（b）第二量的因子VIII或因子IX，其中所述第一和第二量一起有效用于治疗所述缺乏或缺陷。在至少一些实施方案中，用于治疗遗传性和获得性凝血缺乏或缺陷的方法包括施用：（a）第一量的与人组织因子途径抑制剂结合的单克隆抗体；和（b）第二量的因子VIII或因子IX，其中所述第一和第二量一起有效用于治疗所述缺乏或缺陷，并且进一步地其中不共同施用因子VII。还提供的是包含治疗有效量的单克隆抗体和因子VIII或因子IX的组合的药物组合物，其中所述组合物不含因子VII。“因子VII”包括因子VII和因子VIIa。这些组合疗法可能降低凝血因子的必需输注频率。共同施用或组合疗法意指两种治疗药物的施用，所述两种治疗药物各自分开配制或在一种组合物中配制在一起，并且当分开配制时，在大约相同时间或不同时间但在相同治疗期施用。
在一些实施方案中，本文描述的一种或多种抗体可以组合使用，以解决止血障碍。例如，本文描述的抗体中的两种或更多种的共同施用被认为对于治疗血友病或其他止血障碍是有用的。
药物组合物可以肠胃外施用于患有血友病A或B的对象，其剂量和频率可以随着出血发作的严重性而改变，或在预防疗法的情况下，可以随着患者的凝血缺乏的严重性而改变。
组合物可以作为推注剂或通过连续输注施用于需要的患者。例如，作为Fab片段的抗体的推注施用可以为约0.0025至约100 mg/kg体重、约0.025至约0.25 mg/kg、约0.010至约0.10 mg/kg或约0.10至约0.50 mg/kg的量。对于连续输注，作为Fab片段存在的本发明抗体可以以约0.001至约100 mg/kg体重/分钟、约0.0125至约1.25 mg/kg/分钟、约0.010至约0.75 mg/kg/分钟、约0.010至约1.0 mg/kg/分钟、或约0.10至约0.50 mg/kg/分钟施用约1-24小时、约1-12小时、约2-12小时、约6-12小时、约2-8小时、或约1-2小时的时期。对于作为全长抗体（具有完全恒定区）存在的本发明抗体的施用，剂量可以为约1-10 mg/kg体重、约2-8 mg/kg、或约5-6 mg/kg。此类全长抗体通常通过从三十分钟延伸到三小时的时期的输注进行施用。施用频率取决于状况的严重性。频率可以为每周三次到每两周至六个月一次的范围。
另外，组合物可以经由皮下注射施用于患者。例如，约10至约100 mg抗ATβH抗体的剂量可以经由皮下注射每周一次、每两周一次或每月一次施用于患者。如本文使用的，“治疗有效量”意指抗ATβH单克隆抗体或此类抗体和因子VIII或因子IX的组合的量，其是有效增加体内的凝血时间或以其他方式引起有此需要的患者中的体内可测量利益所需的量。精确量取决于众多因素，包括治疗组合物的组分和物理特征、意图患者群体、个别患者考虑等，并且可以通过本领域技术人员容易地测定。
本公开内容的方面可以根据下述实施例进一步得到理解，所述实施例不应解释为以任何方式限制本发明教导的范围。
实施例1 - 人和兔ATα和ATβ纯化
在Enzyme Research实验室（South Bend，IN），根据先前描述的方法（Carlson和Atencio 1982；Peterson和Blackburn 1985），通过在肝素-琼脂糖上的亲和层析从人和兔血浆中纯化ATα和ATβ。简言之，将来自硫酸葡聚糖/氯化钙沉淀的上清液应用于肝素-琼脂糖亲和柱（Pharmacia）。用NaCl梯度分开ATα和ATβ：ATα和ATβ分别以0.8 M和1.3 M NaCl进行洗脱。阴离子交换层析（HiTrap-Q，Pharmacia）用于ATβ的进一步纯化。ATα和ATβ的纯度和聚糖概况通过蛋白质SDS-PAGE和LC-MS进行评价。
实施例2 - 通过质谱法分析测定在ATα和ATβ上的聚糖数目和位置
由于聚糖的不同数目，通过配备duo-ESI（或nano ChipCube）来源、MassHunter采集软件和定量分析软件包括Bioconfirm的Agilent 6520 LC-MS系统，基于其质量区别ATα和ATβ。通过自底向上（bottom-up）方法测定糖基化位点，在所述方法中蛋白质通过胰蛋白酶和Arg-c进行消化，随后为靶MSMS，以鉴定糖基化和单糖基化肽序列。数据在两个实验中进行收集：Fragmentor电压175v和430v。
实施例3 - AT抗原生物素化
人和兔ATα和ATβ通过NHS-生物素在表面赖氨酸残基上用生物素进行标记。对于赖氨酸生物素化，蛋白质首先脱盐到PBS/Ca++缓冲液（Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA）内，以去除可能对于生物素化反应有抑制性的任何胺。脱盐蛋白质的浓度通过在NanoDrop上的OD280进行测定。蛋白质随后在室温（RT）下与磺基-NHS-生物素（PierceThermo Scientific，Rockford，IL）一起温育1小时，以AT:NHS-生物素的1:5和/或1:3摩尔比（即过量的生物素）。游离生物素通过过夜透析到PBS/Ca++缓冲液内进行去除。使用生物素定量试剂盒（Pierce Thermo Scientific，Rockford，IL），定量生物素化蛋白质中的生物素量。通过SDS-PAGE分析生物素化的ATα和ATβ，并且使用链霉抗生物素蛋白-HRP（PierceThermo Scientific，Rockford，IL）作为探针，通过蛋白质印迹分析证实生物素化。生物素化的AT的功能活性通过FXa抑制测定进行评估。通过生物素化的ATα和ATβ与未生物素化的ATα和ATβ的比较，在生物素化后仅观察到AT抑制活性中的轻微降低，指示以这种方式制备的生物素化的ATβ和ATα将是代表性的，并且可以作为选择性抗凝阻断剂用于ATβH结合剂的淘选中。
实施例4 - 通过噬菌体展示和淘选的人单克隆抗体发现
四臂淘选策略设计为从人Fab文库（Dyax Fab310）中发现特异性针对ATβH形式的Fab。文库首先用生物素化的肝素/ Fondaparinux结合的ATα和生物素化的ATα进行耗尽，并且随后在链霉抗生物素蛋白珠上，分别针对肝素/Fondaparinux结合的ATβ和生物素化的ATβ进行淘选。对于每轮淘选，肝素结合的ATα（ATαH）作为竞争物包括在结合缓冲液中。为了使hATβ保持在活性构象（肝素结合形式），在所有三轮淘选中，将肝素加入洗涤缓冲液中。在淘选后，合并的克隆就hATβ和hATβH特异性结合进行筛选，并且通过ELISA就hATα进行反筛选。这些克隆还就与兔ATβ相对于兔ATα的差异结合进行检查。对显示与hATβH和rATβH两者相对于hATα和rATα的差异结合的克隆进一步实施伴随hATβ掺入的FXa–去抑制测定。将阳性命中（Fab）重排成IgG1，在HEK293细胞中表达且通过蛋白A柱进行纯化。这些纯化的IgG1在AT耗尽的人血浆和hemA患者血浆中进行广泛测试，用于TGA测定（凝血酶生成测定）和dPT（稀释凝血酶原时间）测定，以测量凝血时间。
实施例5 - ELISA（酶联免疫吸附测定法）
将2 µg/ml生物素化的AT抗原的PBS溶液包被到含或不含肝素（50ug/ml，肝素-Natrium-5000，Apotheke，Fa. Ratiopharm）的链霉抗生物素蛋白微板（Greiner，781997）上。在4℃下的过夜抗原包被后，将板用PBST +/-肝素洗涤，并且用在PBST +/-肝素中的5%乳在37℃下封闭一小时。在封闭缓冲液去除后，随后将在封闭缓冲液（在PBST +/-肝素中的5%乳）中的20ug/ml Fab或4ug/ml IgG加入板中，并且使板在室温下温育1小时。随后将板洗涤三次。将在封闭缓冲液中的抗人IgG POD（Sigma，A0170）加入板中，并且使板在室温下温育30分钟。Amplex红（In vitrogen，目录#A22170）用于连同H2O2以1:1000的检测。在30分钟温育后，板在荧光板阅读器中在Ex535，Em 590处进行读数。
实施例6 - FXa去抑制测定 – 含肝素的AT
使肝素与ATβ或ATα一起温育，以形成稳定的ATH复合物。随后将抗体加入ATβH或ATαH复合物中。同时，在分开的板中混合10µl 200ng/ml FXa（HTI）和20µl 50µg/ml FluophenFXa荧光底物（Hyphen Biomed）。将抗体-ATH混合物快速加入FXa/底物溶液中，并且在Ex360nm和Em465nm处立即起始荧光动力学测量。所有必需稀释均在100mM NaCl、20mMTris、2.5mM CaCl2、0,1% BSA、0,1% PEG8000中进行。
实施例7 - 在FVIII缺乏人血浆中的凝血酶生成测定（TGA）
ATβH抗体的1:2系列稀释在HemA人血浆中制备，从1uM的最终浓度起始到0.015uM。肝素在每种抗体溶液中以50nM的最终浓度加入。随后将80ul抗体-肝素-血浆混合物加入96孔TGA板中的每个孔中，所述孔含有20ul重构PPP试剂或校准物。将板置于TGA仪器中，并且机器将20ul FluCa（Fluo底物+ CaCl2）自动分配到每个孔内。允许反应运行60分钟。单独的血浆用作阴性对照。
实施例8 - 在分别掺入ATα和ATβ的AT耗尽人血浆中的凝血酶生成测定（TGA）
将抗体加入掺入15nm ATα或ATβ的人AT缺乏血浆中。随后将肝素以50nM的最终浓度吸取到每个反应内。将80ul含有ATH特异性抗体、肝素和ATα或ATβ的血浆样品加入96孔TGA板的孔内，所述孔具有20ul PPP试剂或校准物。将板置于TGA仪器中，并且随后将20ulFluCa（Fluo底物+ CaCl2）分配到每个孔内。允许反应持续60分钟。
实施例9 - 在人hemA血浆和AT耗尽血浆中的稀释凝血酶原时间测定（dPT）
在hemA血浆中制备抗ATβH hmAb的系列稀释，以具有0.1 U/mL肝素的250 nM起始。抗体、血浆和肝素的混合物在室温下温育20-30分钟。随后，将50 uL这种混合物加入50 uL稀释的Innovin（1/2000）（Dade Behring）中，在37℃下温育4分钟，随后添加50 uL 25 mMCaCl2（HemSil）。dPT测试程序在ACL Top凝血计上进行设置，伴随360秒的采集时间。对于在AT缺乏血浆中的dTP，AT-DP掺入含0.1 U/ml肝素的最终浓度为0.2 uM的ATα或ATβ。将抗ATβH mAb以0.25 uM的最终浓度加入AT-DP/肝素/ATα或AT-DP/肝素/ATβ混合物中，并且在室温下温育20-30分钟。对于每种反应，如上将50 uL血浆/抗体/肝素混合物加入50 uL稀释的Innovin（1/4000）中，在37℃下温育4分钟，随后添加50 uL 25 mM CaCl2（HemSil）。
实施例10 - 抗体纯化
预洗涤的蛋白A琼脂糖珠与抗体一起在结合缓冲液（体积比：1:1）中伴随旋转在4℃下温育过夜。随后将珠填充到柱内，并且用1 X PBS洗涤，直至O.D.280 < 0.05。排出残留溶液。将抗体用洗脱缓冲液洗脱，并且收集到含有中和缓冲液的管内。洗脱级分针对1 xPBS在4℃下透析过夜，伴随至少两次缓冲液更换。IgG浓度通过nanodrop在280nm处进行测量。抗体纯度通过ELISA、SDS-PAGE或SSC进行检查。
实施例11 - 通过Biacore的抗体结合亲和力研究
在Biacore T100或T200处理单元上执行抗体亲和力测量。将抗人Fc抗体或链霉抗生物素蛋白固定到CM5芯片上。在芯片上注射且捕获hATβH或生物素化的hmAb抗体。注射含/不含肝素的以不同浓度的ATβ或ATα。仅与抗体结合的AT和ATH生成结合常数。结合结果报道为以纳摩尔表示的平衡解离常数（KD）。当分析AT/肝素复合物时，以1 uM的肝素包括在运行缓冲液中。
实施例12 - 肝素化的兔出血模型
肝素化的兔出血模型的实验设计在图13中概述。在兔颈静脉（右侧静脉：静脉淤滞；左侧静脉：套管插入）准备后，在时间0时，将在PBS媒介物中的低分子量肝素（LMWH）IV施用于兔（1800U/kg ）。在10分钟后，施用测试物品。实验组包括媒介物，PBS；阳性对照，硫酸鱼精蛋白（28mg/kg IV）；阴性对照，M14 IgG2；处理：30mg/kg；TPP2803，3mg/kg；TPP2803，30mg/kg。在测试物品施用后五分钟，执行耳穿刺（3-5 mm），并且经过30分钟时期监控原位血栓形成（淤滞）。用滤纸每15秒回收来自切口的血液，直至出血停止。
前述公开内容和实施例不预期以任何方式缩小权利要求的范围。应当理解可以作出各种修饰和变化，并且等价物可以取代前述实施方案和教导，而不背离所附的权利要求的真实精神和范围。相应地，说明书和实施例应以举例说明性含义而不是限制性含义加以考虑。此外，本文提及的所有论文、书本、专利申请、专利及其他材料的公开内容整体引入本文作为参考。

Claims (13)

1.一种能够结合抗凝血酶（β）肝素复合物（ATβH）的单克隆抗体，其中所述抗体的重链包含：SEQ ID NO: 2的氨基酸31 - 35（AYRMG）的CDR1序列，SEQ ID NO: 2的氨基酸50 - 66（RIYSSGGRTRYADSVKG）的CDR2序列，以及SEQ ID NO: 2的氨基酸97 - 114（AREKASDLSGSFSEALDY）的CDR3序列；和
其中所述抗体的轻链包含：SEQ ID NO: 1的氨基酸24 - 34（QGDSLRSYYAS）的CDR1序列，SEQ ID NO: 1的氨基酸50 - 56（GKNNRPS）的CDR2序列，以及SEQ ID NO: 1的氨基酸89- 99（NSRDSSGNHLV）的CDR3序列。
2.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD、IgE抗体，以及抗体片段。
3.权利要求1的单克隆抗体，其中在所述抗体存在下的凝血时间是缩短的。
4.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1的单克隆抗体和药学可接受的载体。
5.权利要求1的单克隆抗体在制备用于治疗凝血病的药物中的应用。
6.权利要求4的药物组合物在制备用于治疗凝血病的药物中的应用。
7.权利要求5或6的应用，其中所述凝血病是血友病A、血友病B或血友病C。
8.权利要求5或6的应用，其中所述凝血病选自创伤诱导的凝血病和严重出血。
9.权利要求4的药物组合物和凝血因子在制备用于治疗凝血病的药物中的应用。
10.权利要求9的应用，其中所述凝血因子选自因子VIIa、因子VIII和因子IX。
11.权利要求4的药物组合物在制备用于缩短出血时间的药物中的应用。
12.一种经分离的核酸分子，其编码权利要求1的单克隆抗体。
13.权利要求5的应用，其中所述凝血病是血友病A、血友病B或血友病C。
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