ES2346618B1 - Anticuerpo monoclonal anti antitrombina citrulinada humana y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Anticuerpo monoclonal anti antitrombina
citrulinada humana y sus usos.
Comprende un anticuerpo monoclonal que fija
específicamente la antitrombina citrulinada humana, la línea de
hibridoma productora de dicho anticuerpo monoclonal y el uso del
anticuerpo para la detección cualitativa o cuantitativa la
antitrombina citrulinada humana en una muestra biológica aislada del
cuerpo. Se encuentra aplicación en el diagnóstico y pronóstico de
distintas enfermedades en el que esta modificación
post-traduccional forma parte del mecanismo
patológico.
Description
Anticuerpo monoclonal anti antitrombina
citrulinada humana y sus usos.
La presente invención se encuadra principalmente
en el área de la Inmunología, y el sector de aplicación sería el
sanitario con fines diagnósticos y pronósticos en hemostasia y
trombosis, reumatología, neurología y enfermedades
inflamatorias.
La antitrombina es el anticoagulante endógeno
más relevante en la hemostasia, de forma que su deficiencia completa
es letal, y la deficiencia parcial incrementa de forma muy
significativa el riesgo trombótico (Ishiguro y col. J Clin Invest.
2000; 106: 873-8).
Como el resto de las proteínas de la
superfamilia de las serpinas a la que pertenece, la antitrombina se
caracteriza por una gran flexibilidad estructural, crucial para su
correcta funcionalidad, pero que la hace extremadamente sensible a
diferentes factores tanto genéticos como ambientales
(Hernández-Espinosa y col. Thromb Haemost. 2007; 98:
557-63).
Un de los factores que provocan la pérdida
completa de la funcionalidad anticoagulante de la antitrombina es la
citrulinación (Chang y col. Rheumatology. 2005; 44:
293-8; Píke y col. J Biol Chem. 1997; 272:
19652-5). Este proceso puede producirse en
situaciones fisiopatológicas cuando las enzimas PAD, responsables de
esta modificación post-traduccional, se liberan al
plasma (György y col. Int J Biochem Cell Biol. 2006; 38:
1662-77). La cuantificación de la cantidad de
antitrombina citrulinada en muestras biológicas humanas puede servir
de marcador de riesgo trombótico y definir estrategias terapéuticas
eficaces, especialmente en pacientes con elevada tasa de
citrulinación descrita (Marini y col. Archivos de Alergia e
Inmunología Clínica (AAIC). 2004; 35: 39-45).
Además, la detección y cuantificación de antitrombina citrulinada
podría tener implicaciones adicionales tanto diagnósticas como
pronosticas en enfermedades en las que la citrulinación forma parte
del mecanismo patológico (artritis reumatoide, esclerosis múltiple,
alzheimer, psoriasis, etc) (György y col. Int J Biochem Cell Biol.
2006; 38: 1662-77).
El desarrollo de anticuerpos monoclonales
dirigidos específicamente contra modificaciones
post-traduccionales de una proteína es complejo y no
siempre se logra diferenciar la forma modificada.
En general, la citrulinación, como modificación
post-traduccional, ha sido muy poco estudiada pese a
jugar un papel relevante en diferentes patologías (artritis
reumatoide, esclerosis múltiple, alzheimer, psoriasis). Hasta la
fecha, su estudio en hemostasia ha sido anecdótico, a pesar de la
relevancia funcional que causa en el principal anticoagulante, la
antitrombina.
Hasta la fecha, en el contexto de esta
modificación post-traduccional, se han
desarrollado:
- i)
- anticuerpos anti-citrulina (Upstate, USA; Pike y col. J Biol Chem. 1997; 272: 19652-5);
- ii)
- anticuerpos monoclonales frente a determinadas proteínas citrulinadas como las histonas (Senshu y col. Anal Biochem. 1992; 203: 94-100) o la queratina K1 (Senshu y col. J Dermatol Sci. 1999; 21: 113-26);
- iii)
- kits comerciales con péptidos cíclicos citrulinados de primera (CCP-1) segunda (CCP-2) y tercera generación (CCP-3) usados en el campo de la clínica para detectar anticuerpos anti-citrulina en enfermedades en las que la citrulinación forma parte del mecanismo patológico (Van Boekel y col. Arthritis Res. 2002; 4: 87-93; Mimori y col. Intern Med. 2005; 44: 1122-6, Lutteri y col. Clin Chim Acta. 2007; 386: 76-81).
\vskip1.000000\baselineskip
Pese a la existencia de anticuerpos policlonales
dirigidos contra la antitrombina (Dako, A0296), anticuerpos
generados frente a posibles modificaciones
post-traduccionales de esta molécula son nulos.
Existe por tanto una necesidad de disponer de
anticuerpos monoclonales específicos frente a antitrombina
citrulinada humana.
Son objeto de la presente invención un
anticuerpo monoclonal anti antitrombina citrulinada humana, así como
la línea de hibridoma empleada en su preparación, y el uso de dicho
anticuerpo.
La presente invención describe la generación, en
ratones Balb/c, de un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer
específicamente moléculas de antitrombina humana portadoras de una
modificación post-traduccional, la
citrulinación.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a
la línea de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales anti
antitrombina citrulinada humana. Dicha línea de hibridoma ha sido
depositada el día 06 de Junio de 2008 en la European Collection of
Cell Cultures (ECACC) de acuerdo con las condiciones del Tratado de
Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos para Procedimientos de Patente, y ha recibido el
número de depósito 08060601.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, ésta se refiere al uso del anticuerpo monoclonal de la
invención en la detección y cuantificación de moléculas de
antitrombina citrulinada humana en muestras biológicas aisladas del
cuerpo. En dicho procedimiento se utiliza un anticuerpo monoclonal
específico que reconoce la antitrombina humana citrulinada aplicado
a diferentes métodos de detección (western-blott de
geles en condiciones nativas, o ELISA).
Así, la invención proporciona un método para
detectar antitrombina citrulinada humana en un fluido corporal o
preparación aislado del cuerpo conteniendo dicha antitrombina
citrulinada humana, caracterizado porque dicho método comprende:
i) poner en contacto dicho fluido corporal o
preparación aislado del cuerpo con el anticuerpo monoclonal de la
invención; y
ii) detectar la cantidad de anticuerpo
monoclonal unido, la cantidad de anticuerpo monoclonal libre, o
ambos.
La determinación de la cantidad de anticuerpo
monoclonal unido, la cantidad de anticuerpo monoclonal libre o ambas
se puede realizar, de manera preferida, mediante ELISA o
western-blott de geles en condiciones nativas.
Según otro aspecto de la presente invención,
ésta proporciona el uso del anticuerpo monoclonal de la invención en
el diagnóstico y pronóstico de distintas enfermedades en el que esta
modificación post-traduccional forma parte del
mecanismo patológico. Preferentemente, dicha enfermedad se
selecciona entre el grupo formado por una enfermedad hemostásica,
trombótica, reumatológica, neurológica e inflamatoria.
Así, según una realización preferida de la
presente invención, ésta proporciona el uso del anticuerpo
monoclonal de la invención en el diagnóstico y/o pronóstico de una
enfermedad que se selecciona entre artritis reumatoide, esclerosis
múltiple, alzheimer y psoriasis.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos.
Figura 1: La figura 1 muestra el
wester-blott del gel que separa, en condiciones
nativas, la antitrombina normal no modificada (ATn) y antitrombina
citrulinada (ATc) empleando el anticuerpo monoclonal
anti-antitrombína citrulinada.
Figura 2: Variación de la absorbancia medida a
una longitud de onda de 492 nm en muestras biológicas en función de
la concentración de antitrombina citrulinada (ng/ml).
Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se
pretende que sean limitativos de la presente invención.
La antitrombina humana se citrulinó in
vitro siguiendo el procedimiento indicado previamente (Pike y
col. J Biol Chem. 1997; 272: 19652-5). Brevemente,
la antitrombina se incubó con la enzima peptidilarginina deiminasa
procedente de músculo esquelético de conejo en una relación 50:1
(antitrombina:PAD) durante 24 horas a 37ºC en 100 mM
Tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 7.4. La reacción fue
frenada con EDTA 50 mM.
La citrulinación de la antitrombina fue
verificada por tres métodos:
- 1)
- Confirmación de la pérdida de la actividad anti-Xa de la antitrombina asociada a la citrulinación (Chang y col. Rheumatology. 2005; 44: 293-8; Pike y col. J Biol Chem. 1997; 272: 19652-5). Para ello, empleamos un sistema cromogénico con FXa bovino y sustrato cromogénico de factor Xa (Instrumentation Laboratory; Milano, Italy).
- 2)
- Cambios electroforéticos de la proteína citrulinada discriminados en geles de poliacrilamida tanto en condiciones desnaturalizantes (SDS) como no desnaturalizantes.
- 3)
- Detección directa de citrulinas (argininas citrulinadas) en la proteína por métodos proteómicos (espectrometría de masas, masas/masas en tándem).
Para comprobar la especificidad del anticuerpo
monoclonal anti-antitrombina humana citrulinada
generado, se citrulinó albúmina bovina in vitro siguiendo el
mismo procedimiento descrito para la citrulinación de la
antitrombina. Brevemente, albúmina bovina, proteína similar a la
antitrombina tanto en porcentaje de residuos arginina como en
tamaño, se incubó con la enzima peptidilarginina deiminasa en una
relación 50:1 (albumina:PAD) durante 24 horas a 37ºC siendo la
reacción frenada con EDTA 50 mM.
Un total de tres ratones fueron inmunizados con
tres inyecciones intraperitoneales cada 15 días con 50 \mug de
antitrombina citrulinada (antígeno). El antígeno se emulsionó con
adyuvante completo de Freund (CCF, Sigma F-5881) en
la primera inyección, y con adyuvante incompleto de Freund (CIF.
Sigma F-5506) en las dos siguientes inyecciones
intraperitoneales. La inmunización final consistió en una inyección
intravenosa o intraesplénica de 50 \mug de antígeno sin el
adyuvante. Para la emulsión se realizó una mezcla de antígeno y
adyuvante siguiendo una proporción del 1:1.2. El volumen final de
cada inyección fue de 300 a 500 \mul.
Tres días después, se extrajo el bazo de los
ratones y las células se fusionaron con la línea celular de míeloma
murino X63, desarrollada a partir de ratones Balb/c no secretores de
inmunoglobulinas (Kearney y col. J Immunol. 1979; 123:
1548-50) utilizando polietilenglicol en solución al
50% (Sigma) (5). Los hibridomas fueron seleccionados mediante su
crecimiento en medio RPMI 1640 (Biowhitaker) que contiene
hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT), que complementó con
suero fetal bovino al 10% (Gibco), glutamina 2 mM (Gibco), piruvato
1 mM (Sigma), y penicilina/streptomicina 1% (Gibco). En medio HAT,
sólo crecen las células híbridas, aquellas formadas por linfocitos B
y células de mieloma ya que en medio con aminopterina sólo crecen
los híbridos que gracias a los linfocitos B. poseen todo el panel de
enzimas de las vías de rescate de síntesis del DNA y que por lo
tanto utilizan la Hipoxantina y Timidina del medio. Finalmente, los
sobrenadantes de los hibridomas se analizaron mediante ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) para comprobar
la presencia de hibridomas secretores de inmunoglobulinas
anti-antitrombina citrulinada. Los hibridomas
positivos se clonaron mediante dilución límite y fueron expandidos y
congelados en nitrógeno líquido.
La selección del anticuerpo específico
anti-antitrombina humana citrulinada se realizó
analizando los sobrenadante de los hibridomas generados mediante
ELISA indirecto empleando tanto la proteína no modificada como la
citrulinada. Para ello, microplacas de 96 pocillos de fondo plano
Greiner (Bio-one, 650001), se incubaron con 50
\mul de antitrombina citrulinada y antitrombina no citrulinada
(580 ng/ml) en buffer salino (PBS) pH 7,4 durante toda la noche, a
4ºC, para permitir la correcta adhesión de las proteínas a la placa.
Posteriormente las placas fueron lavadas con 100 \mul de PBS/Tween
20 al 0.05% y bloqueadas durante 30 minutos a 37ºC con 100 \mul de
buffer de bloqueo (KH_{2}PO_{4} 2 mM, NaHPO_{4} 10 mM, BSA
0.15 mM y 0.05% de Tween-20). A continuación, las
placas se incubaron durante toda la noche a 4ºC, con 50 \mul por
pocillo de cada sobrenadante procedente de los hibridomas.
Seguidamente, se realizaron tres lavados con PBS/Tween 20 al 0.05%.
Entonces, se añadió 100 \mul por pocillo de un anticuerpo
anti-lgG de ratón conjugado con Horseadish
Peroxidase (Amersham, Biosciences, UK) a una dilución 1:8000 y se
incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de 6 lavados
con PBS/Tween 20 al 0.05% para eliminar todas las moléculas marcadas
no fijadas en forma de inmunocomplejos se añadió el sustrato
enzimático en solución (OPD 10 mg/25 mL de tampón citrato sódico
0.15 M pH 5; con peróxido de hidrógeno 30%). Se dejó reaccionar
durante 20 min a temperatura ambiente y en oscuridad. La reacción
fue finalmente frenada con 50 \mul H_{2}SO_{4} 4N, midiendo la
absorbancia (OD) en un espectrofotómetro (BioTek) a una longitud de
onda de 492 nm.
Como control de especificidad adicional,
empleamos BSA no citrulinada y BSA citrulinada. Para ello pocillos
de microplacas de 96 pocillos de fondo plano Greiner, fueron
incubados con 50 \mul de proteína BSA, no modificada y
citrulinada, a la misma concentración que la usada para la
antitrombina. Posteriormente se siguió el mismo procedimiento de
ELISA indirecto descrito anteriormente para la antitrombina no
citrulinada/citrulinada.
Esta técnica permitió seleccionar el hibridoma
3B6, B4ii (número de depósito 08060601) por ser productor de un
anticuerpo monoclonal que detecta específicamente la antitrombina
citrulinada, pero no reconoce ni la antitrombina no citrulinada ni
otras proteínas citrulinadas.
A continuación confirmamos mediante
inmunoblotting de geles nativos, tanto la especificidad del mismo
por la antitrombina citrulinada como la utilidad del anticuerpo para
ser empleado con esta metodología (Figura 1). Utilizamos geles de
acrilamida al 8% en condiciones no desnaturalizantes
(native-PAGE) de acuerdo a trabajos previos (Bruce y
col. J Clin Invest. 1994; 94: 2265-74).
Posteriormente las proteínas, 335 ng de antitrombina no citrulinada
(control negativo ATn) y 335 ng de antitrombina citrulinada (ATc),
fueron separadas por electroforesis del gel, transferidas a una
membrana de PVDF y reveladas utilizando el anticuerpo monoclonal
específico para la antitrombina citrulinada (3B6, B4ii). Tras tres
lavados con PBS/Tween 20 la membrana, fue incubada con un anticuerpo
anti-lgG de ratón conjugado con Horseadish
Peroxidase (Amersham, Biosciences, UK). Finalmente, la actividad
peroxidasa fue detectada utilizando el kit ECL de revelado (Amersham
Biosciences Ltd, Little Chalfont, UK). Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 1.
El anticuerpo monoclonal
anti-antitrombina citrulinada, generado para la
detección específica de esta modificación
post-traduccional en la antitrombina nos permitió,
mediante la técnica de ELISA Sándwich, cuantificar el grado de
citrulinación de la antitrombina en muestras biológicas.
En primer lugar, microplacas de 96 pocillos de
fondo plano Greiner (Bio-one, 650001) se
sensibilizaron con 50 \mul del anticuerpo de captura del antígeno
problema (anticuerpo policlonal de conejo
anti-antittrombina; A0296, Dako) diluido 700 veces
en buffer bicarbonato 0.05M pH: 9.2 durante toda la noche, a 4ºC.
Transcurrido este tiempo, y para eliminar los anticuerpos de captura
no absorbidos a los pocillos, las placas se lavaron 3 veces con 100
\mul de PBS/Tween 20 al 0.05% y bloqueadas durante 30 minutos a
37ºC con 100 \mul de buffer de bloqueo (KH_{2}PO_{4} 2 mM,
NaHPO_{4} 10 mM, BSA 0.15 mM y 0.05% de Tween-20).
A continuación, las placas se incubaron durante toda la noche a 4ºC,
con 50 \mul por pocillo de cada muestra biológica (plasma o
líquido sinovial) a una dilución 1:200 en PBS pH: 7.4. El antígeno
(antitrombina no citrulinada y citrulinada) no capturado por el
anticuerpo se eliminó lavando la placa de nuevo con 100 \mul de
PBS/Tween 20 al 0.05%. A continuación las placas se incubaron con 50
\mul del anticuerpo monoclonal específico
anti-antitrombina citrulinada, a una dilución 1:800
en buffer de bloqueo, durante toda la noche a 4ºC. Seguidamente, se
realizaron tres lavados con PBS/Tween 20 al 0.05% y se añadió 100
\mul por pocillo de un anticuerpo anti-IgG de
ratón conjugado con Horseadísh Peroxidase (Amersham, Biosciences,
UK) a una dilución 1:8000 y se incubó durante 1 hora a temperatura
ambiente. Después de 6 lavados con PBS/Tween 20 al 0.05% para
eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de
inmunocomplejos se añadió el sustrato enzimático en solución (OPD 10
mg/25 mL de tampón citrato sódico 0.15 M pH 5; con peróxido de
hidrógeno 30%). Se dejó reaccionar durante 20 minutos a temperatura
ambiente y en oscuridad.
La reacción fue finalmente frenada con 50 \mul
H_{2}SO_{4} 4N, midiendo la absorbancia (OD) en un
espectrofotómetro (BioTek, Synergy HT) a una longitud de onda de 492
nm. El control negativo consistió en una serie de pocillos con
buffer PBS en lugar de la muestra biológica (unión no específica del
anticuerpo).
Para poder determinar la concentración de
antitrombina citrulinada en las muestras biológicas realizamos una
recta patrón (Figura 2) a partir de concentraciones conocidas de
antitrombina purificada humana citrulinada.
En la Tabla 1 se recogen los valores observados
de absorbancia a 492 nm de las distintas muestras analizadas cuando
se realiza el ELISA con el anticuerpo
anti-antitrombina citrulinada. La tabla también
recoge los valores de las concentraciones de AT citrulinada en ng/ml
calculados a partir de la curva patrón (Figura 2) en la cual se
correlaciona concentraciones conocidas de antitrombina purificada
citrulinada con una absorbancia concreta obtenida en el ELISA. Así
se calculó la ecuación de la recta
(Y=0,1488*x-14,064) y se calculó la concentración de
proteína citrulinada en cada muestra problema en base a la
absorbancia obtenida en el ELISA.
La cantidad de antitrombina citrulinada, BSA
citrulinado y BSA no citrulinado añadido, así como la cantidad de
antitrombina que se añade en la muestra de plasma es la
siguiente:
Muestra del plasma A: 150 ng
Suplemento de AT citrulinada: 135 ng
Suplemento de BSA citrulinado: 113 ng
Suplemento de BSA no citrulinado: 113 ng.
Por otro lado, los valores de absorbancia a
concentración creciente de antitrombina purificada citrulinada de la
Figura 2 se recogen en la Tabla 2.
Claims (9)
1. Anticuerpo monoclonal, caracterizado
porque fija específicamente la antitrombina citrulinada humana.
2. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque es formado por el
linaje celular de hibridoma 3B6 depositado de acuerdo con el Tratado
de Budapest el día 06 de Junio de 2008 en la European Collection of
Cell Cultures (ECACC) con el número de depósito 08060601.
3. La línea de hibridoma depositado de acuerdo
con el Tratado de Budapest el día 06 de Junio de 2008 en la European
Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número de depósito
08060601.
4. Uso de un anticuerpo monoclonal según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado
porque éste se emplea para la detección cualitativa o cuantitativa
de la antitrombina citrulinada humana en una muestra biológica
aislada del cuerpo.
5. Método de obtención del anticuerpo monoclonal
de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque
comprende las etapas:
i) inmunización de ratones con antitrombina
citrulinada;
ii) fusionar células del bazo de los ratones con
la línea celular de mieloma murino X63;
iii) hacer crecer las células de hibridoma
resultantes;
iv) identificación y clonación de los hibridomas
secretores de inmunoglobulinas anti-antitrombina
citrulinada; y
v) uso de los hibridomas clonados para la
producción de los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la
reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un método para detectar antitrombina
citrulinada humana en un fluido corporal o preparación aislado del
cuerpo conteniendo dicha antitrombina citrulinada humana,
caracterizado porque dicho método comprende:
i) poner en contacto dicho fluido corporal o
preparación aislado del cuerpo con el anticuerpo monoclonal de la
reivindicación 1; y
ii) detectar la cantidad de anticuerpo
monoclonal unido, la cantidad de anticuerpo monoclonal libre, o
ambos.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
caracterizado porque comprende determinar la cantidad de
anticuerpo monoclonal unido, la cantidad de anticuerpo monoclonal
libre o ambas mediante ELISA o western-blot de
geles.
8. Uso del anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, en el diagnóstico y pronóstico de una enfermedad
que se selecciona entre el grupo formado por una enfermedad
hemostásica, trombótica, reumatológica, neurológica e
inflamatoria.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8,
caracterizado porque la enfermedad se selecciona entre
artritis reumatoide, esclerosis múltiple, alzheimer y psoriasis.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006133177A (ja) * | 2004-11-09 | 2006-05-25 | Institute Of Physical & Chemical Research | 関節リウマチの診断および治療におけるシトルリン化アンチトロンビン３の利用 |
-
2008
- 2008-08-14 ES ES200802436A patent/ES2346618B1/es active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2346618A1 (es) | 2010-10-18 |
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