ES2821884T3 - Marcadores bioquímicos de enfermedades pulmonares y otras - Google Patents

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Abstract

Un método de diagnóstico de enfermedades pulmonares que comprende realizar un bioensayo para cuantificar fragmentos de péptidos que comprenden un neoepítopo que se forma en un sitio de escisión por la escisión in vivo de la elastina por una proteinasa en dicho sitio, dicho método que comprende poner en contacto una muestra que comprende dichos fragmentos de péptido con un anticuerpo monoclonal o un fragmento de este que tiene afinidad de unión específica por dicho neoepítopo y determinar el nivel de unión de dicho anticuerpo monoclonal o un fragmento de este a fragmentos de péptidos en dicha muestra, en donde dicho anticuerpo monoclonal o un fragmento de este tiene afinidad de unión específica por una de las siguientes secuencias C- terminales: **(Ver fórmula)** o tiene afinidad de unión específica por la siguiente secuencia N-terminal: 208' | |IKAPKL......(SEQ ID NO:4) y en donde el anticuerpo monoclonal o un fragmento de este no es reactivo específicamente con la secuencia .........FGPGVVG (SEQ ID NO:5) si es reactivo con.........FGPGVV, y no es reactivo específicamente con.........VPGLGVG (SEQ ID NO:6) si es reactivo con .........VPGLGV, y no es reactivo específicamente con PIKAPKL...... (SEQ ID NO:7) si es reactivo con IKAPKL......

Description

DESCRIPCIÓN
Marcadores bioquímicos de enfermedades pulmonares y otras
La presente invención se refiere a métodos y materiales inmunológicos para la detección o cuantificación de fragmentos de elastina.
La elastina es una proteína esencial para la estructura y función de la matriz extracelular. La secuencia de aminoácidos de la elastina humana es la SEQ ID NO:1. Proporciona resistencia y elasticidad a muchos órganos y tejidos. Estos incluyen pulmón, piel, aorta, ligamentos, tendones y cartílago. La elastina se forma a partir de una tropoelastina precursora e implica enlaces cruzados que se forman por estructuras de piridinio, desmosina e isodesmosina. Aunque la elastina es muy estable, las metaloproteinasas de la matriz (MMP) y las serino proteasas, como la elastasa de neutrófilos humanos (HNE), pueden degradar las fibras de elastina, seguido de una pérdida de elasticidad y función. En los pulmones, esta pérdida de elasticidad puede dar lugar a características patológicas como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) con enfisema coexistente (Maclay y otros 2012). Además, la "gran" deposición de péptidos derivados de elastina en el pulmón puede conducir a enfermedades intersticiales tales como la fibrosis pulmonar idiopática (IPF). Los estudios demuestran que ciertos fragmentos derivados de elastina se regulan positivamente en el suero de pacientes que padecen trastornos fibróticos pulmonares (Skjot-Arkil y otros 2012).
Sorprendentemente, hemos podido identificar ciertos fragmentos de elastina derivados de HNE o MMP7, que pueden servir como biomarcadores fiables para el diagnóstico y pronóstico de diversas enfermedades pulmonares.
Se describe un ELISA contra la elastina degradada por otras MMP (Skjot-Arkil, Clausen, Nguyen, Wang, Zheng, Martinez, Hogaboam, Han, Klickstein, Larsen, Nawrocki, Leeming y Karsdal 2012; Skjot-Arkil y otros 2013). Este usa un anticuerpo monoclonal que se dirige a un fragmento de elastina que se obtiene por escisión por las MMP9 y MMP12. Este ensayo también se aplica a los trastornos pulmonares. Los biomarcadores que se describen en la presente descripción son diferentes ya que se basan en fragmentos de elastina seleccionados que se derivan de la HNE y/o MMP7. Estos son más específicos de los trastornos pulmonares (Finlay y otros 1997; Rosas y otros 2008; Starcher y otros 1996; Zhang y otros 2005) en comparación con las proteasas MMP9 y MMP12.
Se conocen kits de ELISA que cuantifican las MMP7 y HNE intactas, pero estos solo miden la concentración de las proteasas y no su efecto sobre una molécula diana, es decir, su generación de neoepítopos en la elastina.
También se encuentran disponibles kits de ELISA que cuantifican la elastina intacta. Esto es diferente de la presente invención, que no detecta elastina intacta sino más bien neoepítopos que se generan durante la degradación de la elastina.
Se han detectado muchos fragmentos de elastina derivados de la HNE mediante espectrometría de masas de elastina digerida, véase, por ejemplo, He, Turino y Lin 2010, donde algunos de estos también se detectan y cuantifican en plasma y/o esputo. Sin embargo, estos péptidos detectados y cuantificados son diferentes de los fragmentos que se usan en la presente invención.
La elastina madura (entrecruzamiento de desmosina) en pacientes con COPD se ha cuantificado mediante espectrometría de masas (Ma, Lin y Turino 2007). Solo cuantificaron la producción de elastina intacta y no fragmentos derivados de proteasa.
Los sitios de escisión de la elastina con diversas proteasas ya se han determinado y publicado. Esto también incluye la elastina escindida por la HNE (Barroso, Abello y Bischoff 2006; He, Turino y Lin 2010a) y la MMP7 (Heinz y otros 2011). Sin embargo, estas divulgaciones no describen la detección de fragmentos de elastina mediante el uso de anticuerpos que sean específicos para los neoepítopos que se generan durante la degradación proteolítica de la elastina. Tampoco describen qué fragmentos de elastina formados in vitro tienen relevancia diagnóstica o se forman in vivo o incluso pueden detectarse en muestras de fluidos biológicos.
La presente invención ahora proporciona un método de bioensayo para la cuantificación de fragmentos de péptidos que comprenden un neoepítopo formado en un sitio de escisión por la escisión in vivo de la elastina por una proteinasa en dicho sitio, dicho método que comprende poner en contacto una muestra que comprende dichos fragmentos de péptidos con una pareja de unión inmunológica que tiene afinidad de unión específica por dicho neoepítopo y determinar el nivel de unión de dicha pareja de unión inmunológica a los fragmentos de péptidos en dicha muestra, en donde dicha pareja de unión inmunológica tiene afinidad de unión específica por una de las siguientes secuencias terminales:
...... FGPGWII' 334 (SEQ ID NO:2)
...... VPGLGVII' 602 (SEQ ID NO:3)
208' IIIKAPKL..... (SEQ ID NO:4)
El símbolo || indica la escisión de la secuencia de elastina entre el punto numerado de SEQ ID NO:1 y el siguiente aminoácido en el caso de fragmentos de escisión C-terminal y el aminoácido precedente en el caso de una escisión N-terminal.
La pareja de unión inmunológica no es específicamente reactiva con la secuencia........ FGPGVVG (SEQ ID NO:5) si es reactiva co n ........ FGPGVV, y no es específicamente reactiva c o n ......... VPGLGVG (SEQ ID NO:6) si es reactiva co n ........ VPGLGV, y no es específicamente reactiva con PIKAPKL......(SEQ ID NO:7) si es reactiva con IKAPKL....... Preferentemente, la pareja de unión inmunológica tampoco es específicamente reactiva con péptidos que se extienden adicionalmente con la parte relevante de la secuencia de aminoácidos de elastina más allá del sitio de escisión.
Dicha pareja de unión inmunológica es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica.
La invención incluye una pareja de unión inmunológica específicamente reactiva con una de las siguientes secuencias terminales derivadas de elastina:
........ FGPGVV| |'334
........ VPGLGV| |'602
208'| |IKAPKL.....
La pareja de unión inmunológica no es específicamente reactiva con la secuencia........ FGPGVVG si es reactiva con ........ FGPGVV, y no es específicamente reactiva con ........... VPGLGVG si es reactiva con .........VPGLGV, y no es específicamente reactiva con PIKAPKL..... si es reactiva con IKAPKL.......
La pareja de unión inmunológica es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de este.
La invención incluye un kit de inmunoensayo que comprende una pareja de unión inmunológica como se describió, y un agente de competencia que se une a dicha pareja de unión inmunológica, y opcionalmente uno o más de un reactivo de lavado, un tampón, un reactivo de parada, un marcador enzimático, un sustrato marcador enzimático, estándares de calibración, un anticuerpo anti-ratón y las instrucciones para realizar un ensayo mediante el uso de dicho kit.
El resultado de dicho ensayo puede producir un índice indicativo del grado de riesgo en un paciente particular de la presencia de la COPD, la IPF o el SCC o la extensión o gravedad de tal condición. Los pacientes que tengan un valor para dicha medición por encima de un nivel umbral pueden recomendarse para una investigación adicional o para la prescripción de medicación para el tratamiento de estos y tales investigaciones de seguimiento o tratamiento pueden formar parte del método de la invención.
Los ensayos para más de uno de los péptidos que se describen anteriormente pueden realizarse por separado y sus resultados combinarse o más de uno de los péptidos que se describen anteriormente pueden medirse juntos.
El resultado de un ensayo de acuerdo con la invención puede combinarse con uno o más de otros biomarcadores que se midieron para formar un índice compuesto de valor diagnóstico o pronóstico.
El término "pareja de unión inmunológica" como se usa en la presente descripción incluye un anticuerpo monoclonal o un fragmento de un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica.
Generalmente, todos los formatos de inmunoensayos que se conocen previamente pueden usarse de acuerdo con esta invención lo que incluye los formatos heterogéneos y homogéneos, los ensayos tipo sándwich, los ensayos de competencia, los ensayos ligados a enzimas, los radioinmunoensayos y similares. Así, opcionalmente, dicho método se realiza como un inmunoensayo de competencia en donde dicha pareja de unión inmunológica y un agente de competencia se incuban en presencia de dicha muestra y el agente de competencia compite con los fragmentos de péptidos en la muestra para unirse a la pareja de unión inmunológica.
Dicho agente de competencia puede ser un péptido sintético o un péptido nativo purificado que se forma por escisión de la elastina.
Alternativamente, dicho método se realiza como un inmunoensayo tipo sándwich en donde dicha pareja de unión inmunológica y una pareja de unión inmunológica adicional que tiene afinidad de unión específica por una secuencia peptídica contenida en los fragmentos de péptidos que se unen por dicha pareja de unión inmunológica se incuban en presencia de dicha muestra y ambos se unen a dichos fragmentos de péptidos en la muestra. Un método adecuado puede ser un inmunoensayo de competencia mediante el uso de anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión de anticuerpos que se unan a los neoepítopos de fragmentos de la elastina.
Los péptidos sintéticos que se seleccionen adecuadamente recubiertos sobre la superficie sólida de una placa de microtitulación pueden competir con la muestra por la unión a los anticuerpos monoclonales o a los fragmentos de unión. Alternativamente, los fragmentos nativos, purificados, a partir de una o más de estas proteínas que portan el neoepítopo que se reconoce por el anticuerpo monoclonal o por el fragmento de unión se pueden usar en la superficie sólida. Aún otra alternativa es inmovilizar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión en la superficie sólida y después coincubar la muestra con un péptido sintético que se unió apropiadamente a una molécula de señal, por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante o la biotina.
En ciertos métodos que se prefieren la muestra es una muestra que se deriva de un paciente, y el método que comprende además comparar el nivel que se determinó de dicha unión de dichos fragmentos de péptidos con los valores característicos de (a) individuos sanos comparables y/o (b) una condición patológica relevante y asociar opcionalmente un nivel más alto del péptido que se midió (normalmente indicado por un mayor nivel de unión) con un grado más grave de dicha condición. La muestra puede ser una muestra de orina, suero, sangre, plasma o saliva, a manera de ejemplo.
Un aspecto de la presente invención se refiere al desarrollo de anticuerpos monoclonales que reconocen neoepítopos como se describió anteriormente. Esto puede lograrse mediante la inmunización de ratones con péptidos sintéticos procedentes de la secuencia de aminoácidos de la elastina (particularmente las secuencias de la lista anterior o las secuencias que terminan en estas), por la fusión de las células del bazo de los ratones que se seleccionaron a las células de mieloma, y mediante la comprobación de los anticuerpos monoclonales para la unión a neoepítopos en los péptidos sintéticos relevantes. La especificidad por los neoepítopos puede asegurarse al exigir la reactividad con un péptido sintético y una falta de reactividad con ya sea una forma del péptido inmunizante prolongada del C-terminal (para un neoepítopo C-terminal) o una forma del péptido inmunizante prolongada del N-terminal (para un neoepítopo N-terminal). Los anticuerpos para los neoepítopos también pueden evaluarse para establecer una falta de capacidad de unión a la elastina intacta. Alternativamente, la especificidad por un neoepítopo puede asegurarse al exigir que la reactividad del anticuerpo dependa negativamente de la presencia de biotina o de otros grupos funcionales que se unen covalentemente a uno de los aminoácidos terminales.
La invención incluye una pareja de unión inmunológica que es específicamente inmunorreactiva con un neoepítopo que se forma por la escisión de la elastina por una proteasa en un sitio terminal en cualquiera de las secuencias parciales expuestas anteriormente, y es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de este.
La invención incluye una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal contra un neoepítopo C-terminal o N-terminal que se forma por la escisión de la elastina en los sitios terminales de las secuencias en cualquiera de las secuencias parciales que se exponen anteriormente.
La presente descripción describe además un péptido que comprende un neoepítopo C-terminal o N-terminal que se forma por la escisión de la elastina en cualquiera de las secuencias parciales que se exponen anteriormente. Tal péptido puede conjugarse como un hapteno a un portador para producir una respuesta inmune a dicho péptido, o inmovilizarse a una superficie sólida o conjugarse con un marcador detectable para su uso en un inmunoensayo.
La presente descripción comprende además una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para un péptido que comprende un neoepítopo C-terminal o N-terminal que se forma por la escisión de la elastina en cualquiera de las secuencias parciales que se exponen anteriormente.
La presente descripción comprende además un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una señal de expresión y una secuencia codificante que codifica para la expresión de un péptido que comprende un neoepítopo C-terminal o N-terminal que se forma por la escisión de la elastina en cualquiera de las secuencias parciales que se exponen anteriormente y además incluye una célula huésped que se transforma con un vector tal y expresar dicho péptido.
Aún otro aspecto de la invención se refiere a kits, que pueden usarse convenientemente para realizar los métodos que se describen anteriormente. Tales kits pueden incluir (1) una placa de microtitulación recubierta con el péptido sintético que lleva la secuencia del neoepítopo; (2) un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del anticuerpo de la invención reactivo con dicho péptido sintético; y (3) una inmunoglobulina IgG anti-ratón marcada. Alternativamente, tales kits pueden incluir (1) una placa de microtitulación recubierta con fragmentos de proteína nativa purificada; (2) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neoepítopo en los fragmentos de cualquiera de dichas proteínas, y reactivo con dichos fragmentos purificados; y (3) una inmunoglobulina IgG anti-ratón marcada. Alternativamente, tales kits pueden incluir (1) una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina; (2) un péptido sintético que se une a biotina, dicho péptido sintético que lleva la secuencia de un neoepítopo; (3) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neoepítopo en los fragmentos de dicha proteína y reactivo con dicho péptido sintético; y (4) una inmunoglobulina IgG anti-ratón marcada. Aún otra alternativa pueden ser kits que incluyen (1) una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina; (2) un péptido sintético que se une a biotina, dicho péptido que lleva la secuencia de un neoepítopo; (3) un anticuerpo monoclonal que reconoce un neoepítopo en dichos fragmentos de proteína (y reactivo con dicho péptido sintético) y conjugado con peroxidasa de rábano picante. Otra alternativa más puede ser un kit que incluye (1) una placa de microtitulación recubierta (directa o indirectamente) con un anticuerpo monoclonal o un fragmento de este, dicho anticuerpo que reconoce un neoepítopo en dicho fragmento de proteína; (2) un péptido sintético marcado con HRP que lleva la secuencia de un neoepítopo, o alternativamente, un kit que incluye (1) una placa de microtitulación recubierta (directa o indirectamente) con un anticuerpo monoclonal o un fragmento de este, dicho anticuerpo que reconoce un neo- epítopo en dicho fragmento de proteína; (2) un péptido sintético marcado con biotina que lleva la secuencia de un neoepítopo; (3) estreptavidina marcada con HRP.
Así, la invención incluye un kit de inmunoensayo que comprende una pareja de unión inmunológica como se describe en la presente descripción, y un agente de competencia que se une a dicha pareja de unión inmunológica, y opcionalmente uno o más de un reactivo de lavado, un tampón, un reactivo de parada, un marcador enzimático, un sustrato marcador enzimático, estándares de calibración, un anticuerpo anti-ratón y las instrucciones para realizar dicho inmunoensayo.
Los ensayos que se describen en la presente descripción son útiles en el diagnóstico de las enfermedades que se describen y en las patologías relacionadas con la elastina en general en pacientes. Adicionalmente, las pruebas son útiles para la evaluación de la progresión de la enfermedad, y el monitoreo de la respuesta a la terapia. Las parejas de unión inmunológica de la invención pueden también usarse en la inmunotinción para mostrar la presencia o localización de los productos de escisión de la elastina que se describe en la presente descripción.
La invención se describirá e ilustrará adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos que ilustran los principios y la práctica de las modalidades preferidas. Los ejemplos hacen referencia a los resultados que se presentan en los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 muestra los resultados que se obtuvieron en el Ejemplo 3 de un ELISA y muestra una relación B/B0 medida en comparación con la concentración de péptido libre y péptido alargado (NB590) después de la incubación con el anticuerpo monoclonal NB590. Casi no hay reactividad hacia el péptido alargado.
La Figura 2 muestra los resultados que caracterizan el anticuerpo monoclonal NB590 que se obtuvo en el Ejemplo 3.
La Figura 3 muestra las concentraciones de los péptidos libres NB590 en el suero de la COPD, la IPF y el carcinoma de células escamosas (SCC) de pacientes así como también los controles que se obtuvieron en el Ejemplo 3. * denota un valor p s0,05 y ** denota un valor p s0,05. También se muestra el error estándar de la media.
La Figura 4 muestra los resultados que se obtuvieron en el Ejemplo 4 de un ELISA y muestra una relación B/B0medida en comparación con la concentración de péptido libre y péptido alargado (NB592) después de la incubación con el anticuerpo monoclonal NB592. Casi no hay reactividad hacia el péptido alargado.
La Figura 5 muestra los resultados que caracterizan el anticuerpo monoclonal NB592 que se obtuvo en el Ejemplo 4.
La Figura 6 muestra las concentraciones de los péptidos libres NB592 en el suero de la COPD, la IPF y el carcinoma de células escamosas (SCC) de pacientes así como también los controles que se obtuvieron en el Ejemplo 4. Se muestra el error estándar de la media. Las concentraciones de péptidos libres se aplicaron como referencia.
La Figura 7 muestra los resultados que se obtuvieron en el Ejemplo 5 de un ELISA y muestra una relación B/B0 medida comparada con la concentración de péptido libre (NB593) (SEQ ID NO:11) y de péptido alargado (SEQ ID NO:13) después de la incubación con el anticuerpo monoclonal NB593. Casi no hay reactividad hacia el péptido alargado.
La Figura 8 muestra los resultados que caracterizan el anticuerpo monoclonal NB593 que se obtuvo en el Ejemplo 5.
La Figura 9 muestra los resultados de la prueba del anticuerpo NB593 en varias muestras de enfermedades de pacientes así como también de controles sanos. Los fragmentos de NB593 fueron indetectables en el suero.
La Figura 10 muestra los resultados de un ELISA que se realizó en el Ejemplo 6 y muestra el por ciento de inhibición de la señal por el péptido libre (NB595) (SEQ iD NO:12) y el péptido alargado (SEQ ID NO:14) del anticuerpo monoclonal NB595. Casi no hay inhibición por el péptido alargado.
La Figura 11: muestra los resultados que caracterizan el anticuerpo monoclonal NB595 que se obtuvo en el Ejemplo 6.
La Figura 12 muestra las concentraciones de los fragmentos NB595 en el suero de los pacientes con COPD y los controles sanos. El fragmento NB595 no está elevado en la COPD.
La Figura 13 muestra los resultados de un ELISA que se realizó en el Ejemplo 7 y muestra el por ciento de inhibición de la señal por el péptido libre (NB599) (SEQ iD NO:10) y el péptido alargado (SEQ ID NO:15) del anticuerpo monoclonal NB599. Existe una baja reactividad con el anticuerpo hacia el péptido alargado en comparación con el péptido libre.
La Figura 14 muestra los resultados que caracterizan el anticuerpo monoclonal NB599 que se obtuvo en el Ejemplo 7.
La Figura 15 muestra la concentración de los fragmentos de elastina NB599 en el suero de los controles, de los pacientes con carcinoma de células escamosas (SCC), COPD y IPF. Existe una diferencia significativa entre el control y el SCC y entre la COPD y los controles. También hay una diferencia estadística entre la IPF y el control.
Ejemplo 1
Selección de los péptidos para las inmunizaciones.
Se seleccionaron los siguientes péptidos para la inmunización:
• NB590: Aminoácido # 325'GGPGFGPGWIf 334 (SEQ ID NO:8) (derivado de HNE)
• NB592: Aminoácido #593'VGAGVPGLGV||'602 (SEQ ID NO:9) (derivado de HNE)
• NB599: Aminoácido #208'||IKAPKLPGGY'217 (SEQ ID NO:10) (derivado de MMP7)
• NB593: Aminoácido #743'||GLGGVLGGA'752 (SEQ ID NO:11) (derivado de HNE)
• NB595: Aminoácido #41'IIVFYPGAGLGA'50 (SEQ ID NO:12) (derivado de MMP7)
Los sitios de escisión involucrados se encuentran entre los previamente determinados por otros (He, Turino y Lin 2010d; Heinz y otros 2011a). Elegimos los péptidos de inmunización como los primeros 10 aminoácidos, ya sea aguas abajo o aguas arriba de los sitios de escisión.
Ejemplo 2
Desarrollo de los anticuerpos monoclonales
Se inmunizaron subcutáneamente en el abdomen seis ratones Balb/C de 4-6 semanas de edad con 200 pl del antígeno emulsionado (50 pg por inmunización) mediante el uso del péptido inmunógeno que se menciona conjugado con KLH en su extremo N-terminal para los epítopos C-terminales y en su extremo C-terminal para epítopos N-terminales de acuerdo con un procedimiento estándar. Se continuaron las inmunizaciones hasta que se obtuvieron niveles de título estables.
El ratón con el título más alto se seleccionó para la fusión y se estimuló por vía intravenosa con 50 pg del inmunógeno en 100 pl de disolución de cloruro de sodio al 0,9 % tres días antes del aislamiento del bazo para la fusión celular. El procedimiento de fusión se siguió por procedimientos conocidos (Gefter, Margulies y Scharff 1977). Se recogieron los sobrenadantes y se purificaron los anticuerpos monoclonales mediante el uso de columnas de Proteína G de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare Life Science).
Selección de los anticuerpos monoclonales específicos de neoepítopo:
Los anticuerpos se seleccionaron en base a su especificidad al péptido mediante el uso del péptido homólogo que se usó para la inmunización (péptido de selección) en forma no conjugada y se deseleccionaron contra una versión alargada del péptido extendido por un aminoácido de la secuencia de elastina más allá del sitio de escisión, y asegurar de esta manera que solo se seleccionaron los anticuerpos con una especificidad al neoepítopo para análisis adicionales.
Subsecuentemente, se ensayó la reactividad de los anticuerpos contra la elastina intacta, nativa y escindida.
Y finalmente, se probaron las muestras de suero de sujetos sanos y enfermos en el protocolo de ensayo que se menciona anteriormente.
Protocolo de ensayo:
Se recubrió una placa de estreptavidina de 96 pocillos con el péptido de selección disuelto en tampón de recubrimiento y se incubó durante 30 minutos a 20 °C. Después de la incubación, la placa se lavó cinco veces en tampón de lavado (Tris 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2). Se añadieron 20 pl del péptido (de selección, deselección o sin sentido) o una muestra humana por duplicado a los pocillos apropiados, seguidos de 100 pl de anticuerpo monoclonal conjugado con POD, y luego la placa se incubó durante 1 hora en un agitador. Después del lavado, se añadieron 100 pL de tetrametilbencidina (TMB) (Kem-En-Tec) y la placa se incubó durante 15 minutos a 20 °C en la oscuridad.
Todas las etapas de incubación anteriores incluyeron agitación a 300 rpm.
La reacción de TMB se detuvo al añadir 100 |jL de solución de parada (1 % de H2SO4). La absorbancia se midió a 450 nm con 650 nm como referencia. Se usó un calibrador maestro que se preparó a partir del péptido de selección como curva de calibración y se trazó mediante el uso de un modelo de ajuste matemático 4-paramétrico.
Todas las muestras de suero se diluyeron 1:2 en tampón de incubación antes de las mediciones.
Ejemplo 3 Anticuerpo monoclonal NB590
La Figura 1 muestra la reactividad del péptido libre y alargado hacia el anticuerpo NB590. Se observa una disminución en la absorbancia junto con un aumento en la concentración de péptido libre. Esto se debe a una reacción aumentada con el péptido libre en lugar del péptido de detección en los pocillos. Este no fue el caso para el péptido alargado como los niveles estables de B/B0 indicaron una reacción muy baja o nula entre el anticuerpo NB590-01 y el péptido alargado.
Subsecuentemente, se probó el anticuerpo NB590 contra la elastina (ELN), la elastina escindida in vitro con las MMP2, MMP7, MMP9 y HNE y las proteasas en sus respectivos tampones (Figura 2). También se incluye la reactividad de las proteasas seleccionadas en sus tampones solamente. El anticuerpo monoclonal NB590 mide claramente los fragmentos de elastina derivados por HNE. Las concentraciones de péptidos libres se aplicaron como referencia. El anticuerpo NB590 tiene una reactividad muy alta hacia la elastina escindida con HNE. La reactividad del anticuerpo NB590 y la elastina intacta o la elastina escindida con otras proteasas está cerca del límite inferior de detección del ensayo.
Finalmente, el anticuerpo NB590 se probó en muestras de suero de pacientes con COPD, IPF o carcinoma de células escamosas y se comparó con los controles sanos (Figura 3). Existe una diferencia significativa en la concentración de los fragmentos NB590 en pacientes con COPD y carcinoma de células escamosas en comparación con los controles sanos. Aunque se observó una tendencia a niveles más altos, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los controles y los pacientes con IPF. Esto podría explicarse por el hecho de que se trata de un estudio de sección transversal, mientras que un estudio longitudinal de pacientes con IPF puede mostrar una diferencia más significativa.
Ejemplo 4 Anticuerpo monoclonal NB592
La Figura 4 muestra la reactividad del péptido libre y alargado hacia el anticuerpo NB592. Se observa una disminución en la absorbancia junto con un aumento en la concentración de péptido libre. Esto se debe a una reacción aumentada con el péptido libre en lugar del péptido de detección en los pocillos. Este no fue el caso para el péptido alargado como los niveles estables de B/B0 indicaron una reacción muy baja o nula entre el péptido alargado y el anticuerpo NB592.
Subsecuentemente, se probó la reactividad del anticuerpo NB592 frente a la elastina, la elastina escindida in vitro con las MMP2, MMP7, MMP9 y HNE y las proteasas en sus respectivos tampones (Figura 5). También se incluye la reactividad de las proteasas seleccionadas en sus tampones solamente. El anticuerpo monoclonal NB592 mide claramente los fragmentos de elastina derivados por HNE. Las concentraciones de péptidos libres se aplicaron como referencia. El anticuerpo NB592 tiene una reactividad muy alta hacia la elastina escindida con HNE. La reactividad del anticuerpo NB592 y la elastina intacta o la elastina escindida con otras proteasas está cerca del límite inferior de detección del ensayo. Se muestra una señal menor para el HNE y su tampón solo, pero la señal es 100 veces más pequeña que la señal para la elastina escindida con HNE.
Finalmente, el anticuerpo NB592 se probó en muestras de suero de pacientes con COPD, IPF o carcinoma de células escamosas y se comparó con los controles sanos (Figura 6). Aunque hubo una alta tendencia a aumentos en los niveles, no hubo diferencias significativas (p <0,05) en la concentración de los fragmentos NB592 en pacientes con COPD y carcinoma de células escamosas en comparación con los controles sanos. No hubo diferencias entre los controles y los pacientes con IPF. Esto podría explicarse por el hecho de que este fue un estudio de sección transversal, mientras que un estudio longitudinal de pacientes con IPF puede mostrar una diferencia.
Ejemplo 5 (Comparativo) Anticuerpo monoclonal NB593
La Figura 7 muestra la reactividad del péptido libre y alargado hacia el anticuerpo NB593. Se observa una disminución en la absorbancia junto con un aumento en la concentración de péptido libre. Esto se debe a una reacción aumentada con el péptido libre en lugar del péptido de detección en los pocillos. Este no fue el caso para el péptido alargado como los niveles estables de B/B0 indicaron una reacción muy baja o nula entre el anticuerpo NB593.
Subsecuentemente, se probó la reactividad del anticuerpo NB593 frente a la elastina, la elastina escindida in vitro con HNE y el tampón HNE. El anticuerpo monoclonal 593 tiene claramente una reactividad muy alta hacia los fragmentos de elastina derivados por HNE en comparación con la elastina intacta y mide tales fragmentos. Las concentraciones de péptidos libres se aplicaron como referencia. La reactividad del anticuerpo NB593 hacia la elastina intacta o el tampón HNE es muy baja.
Y finalmente, la Figura 9 muestra la reactividad del anticuerpo NB593 y las muestras de suero humano de pacientes con COPD y los controles sanos. Los datos muestran que el fragmento que reconoce el anticuerpo NB593 está ausente, o solo está presente en cantidades indetectables, en el suero de controles sanos y enfermos.
Ejemplo 6 (Comparativo) Anticuerpo monoclonal NB 595
La Figura 10 muestra la reactividad del péptido libre y alargado hacia el anticuerpo NB595. Se observa una disminución en la absorbancia junto con un aumento en la concentración de péptido libre. Esto se debe a una reacción aumentada con el péptido libre en lugar del péptido de detección en los pocillos. Este no fue el caso para el péptido alargado como los niveles estables de B/B0 indicaron una reacción muy baja o nula con el anticuerpo NB595.
Subsecuentemente (Figura 11), se probó la reactividad del anticuerpo NB595 frente a la elastina, la elastina escindida in vitro con MMP2, MMP7, MMP9 y HNE y las proteasas en sus respectivos tampones. El anticuerpo monoclonal 595 mide claramente los fragmentos de elastina derivados de MMP7 y tiene una alta reactividad hacia la elastina escindida con MMP7. Las concentraciones de péptidos libres se aplicaron como referencia. La reactividad del anticuerpo NB595 hacia la elastina intacta o la elastina escindida con otras proteasas está cerca del límite inferior de detección del ensayo.
Finalmente, la Figura 12 muestra la reactividad de los anticuerpos NB595 y las muestras de suero humano agrupadas de los pacientes con COPD y los controles sanos. Los datos muestran que el fragmento NB595 no está elevado en pacientes con COPD. Por tanto, existe una relevancia biológica limitada para este anticuerpo.
Ejemplo 7 NB599
La Figura 13 muestra la reactividad del péptido libre y alargado hacia el anticuerpo NB599. Se observa una disminución en la absorbancia junto con un aumento en la concentración de péptido libre. Esto se debe a una reacción aumentada con el péptido libre en lugar del péptido de detección en los pocillos. La disminución de la absorbancia fue significativamente menor para el péptido alargado como los niveles estables de B/B0 indicaron reacciones débiles entre el péptido y el anticuerpo NB599.
Subsecuentemente, se determinó la reactividad del anticuerpo NB599 hacia la elastina, la elastina que escindida in vitro con MMP2, MMP7, MMP9 y HNE y las proteasas en sus respectivos tampones (Figura 14). El anticuerpo monoclonal NB599 mide claramente los fragmentos de elastina derivados de MMP7. El anticuerpo NB599 tiene una reactividad mucho mayor hacia la elastina escindida con MMP7 que la elastina escindida con otras proteasas. Existe cierta reactividad hacia el tampón HNE HNE, pero todavía es mucho menor que la elastina escindida con HNE.
Y finalmente, se probó la presencia de los fragmentos de elastina en muestras de suero de pacientes con COPD, IPF o carcinoma de células escamosas y se comparó con los controles sanos (Figura 15) mediante el uso de la prueba NB599. Existe una diferencia significativa en la concentración de los fragmentos NB599 en los pacientes con COPD, IPF y carcinoma de células escamosas en comparación con los controles sanos. Especialmente los pacientes con carcinoma de células escamosas y con COPD tenían niveles aumentados del fragmento de elastina NB599.
En esta descripción, a menos que expresamente se indique de cualquier otra manera, la palabra "o" se usa en el sentido de un operador que devuelve un valor verdadero cuando una o ambas de las condiciones indicadas se cumple, en oposición con el operador "exclusivo o" que requiere que sólo una de las condiciones se cumpla. La palabra "comprende" se usa en el sentido de "que incluye" y no en el sentido de "que consiste en".
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Gefter, M. L., Margulies, D. H., & Scharff, M. D. 1977, "A simple method for polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells", Somatic.Cell Genet., vol. 3, no. 2, pp. 231-236.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un método de diagnóstico de enfermedades pulmonares que comprende realizar un bioensayo para cuantificar fragmentos de péptidos que comprenden un neoepítopo que se forma en un sitio de escisión por la escisión in vivo de la elastina por una proteinasa en dicho sitio, dicho método que comprende poner en contacto una muestra que comprende dichos fragmentos de péptido con un anticuerpo monoclonal o un fragmento de este que tiene afinidad de unión específica por dicho neoepítopo y determinar el nivel de unión de dicho anticuerpo monoclonal o un fragmento de este a fragmentos de péptidos en dicha muestra, en donde dicho anticuerpo monoclonal o un fragmento de este tiene afinidad de unión específica por una de las siguientes secuencias C-terminales:
    .FGPGW||'334 (SEQ ID NO:2)
    .VPGLGW602 (SEQ ID NO:3)
    o tiene afinidad de unión específica por la siguiente secuencia N-terminal:
    208' | |IKAPKL..... (SEQ ID NO:4)
    y en donde el anticuerpo monoclonal o un fragmento de este no es reactivo específicamente con la secuencia ........ FGPGVVG (SEQ ID NO:5) si es reactivo con.........FGPGVV, y no es reactivo específicamente con........ VPGLGVG (SEQ ID NO:6) si es reactivo con .........VPGLGV, y no es reactivo específicamente con PIKAPKL..... (SEQ ID NO:7) si es reactivo con IKAPKL.......
  2. 2 Un método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde dicho método se realiza como un inmunoensayo de competencia en el que dicho anticuerpo monoclonal o un fragmento de este y un agente de competencia se incuban en presencia de dicha muestra y el agente de competencia compite con los fragmentos de péptidos en la muestra para unirse al anticuerpo monoclonal o un fragmento de este.
  3. 3 Un método como se reivindicó en la reivindicación 2, en donde dicho agente de competencia es un péptido sintético o es un péptido nativo purificado que se forma por escisión de la elastina para revelar dicho neoepítopo.
  4. 4 Un método como se reivindicó en una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho método se realiza como un inmunoensayo sándwich en el que dicho anticuerpo monoclonal o un fragmento de este y un anticuerpo monoclonal adicional o un fragmento de este que tienen afinidad de unión específica por una secuencia peptídica contenida en los fragmentos de péptidos unidos por dicho anticuerpo monoclonal o un fragmento de este se incuban en presencia de dicha muestra y ambos se unen a dichos fragmentos de péptidos en la muestra.
  5. 5. Un método como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra es una muestra de orina, suero, sangre, plasma o saliva.
  6. 6 Un método como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra es una muestra que se deriva del paciente, dicho método que comprende además comparar el nivel determinado de dicha unión de dichos fragmentos de péptidos con valores característicos de (a) individuos sanos comparables y/o (b) una enfermedad pulmonar.
  7. 7 Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de este adecuado para usar en el método de la reivindicación 1 y reactivo específicamente con una de las siguientes secuencias C-terminales derivadas de elastina:
    .FGPGVV| |'334 (SEQ ID NO:2)
    .VPGLGV| | '602 (SEQ ID NO:3)
    o reactivo específicamente con la siguiente secuencia N-terminal:
    208'| | IKAPKL. (SEQ ID NO:4)
    y en donde el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de este no es reactivo específicamente con la secuencia........ FGPGVVG (SEQ ID NO:5) si es reactivo con ......... FGPGVV, y no es reactivo específicamente c o n ........ VPGLGVG (SEQ ID NO:6) si es reactivo c o n .........VPGLGV, y no es reactivo específicamente con PIKAPKL..... (SEQ ID NO:7) si es reactivo con IKAPKL.......
  8. 8. Una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal como se reivindicó en la reivindicación 7.
  9. 9. Un kit de inmunoensayo adecuado para usar en el método de la reivindicación 1, el kit que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de este como se reivindicó en la reivindicación 7, y un agente de competencia que se une a dicho anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de este, y opcionalmente uno o más de un reactivo de lavado, un tampón, un reactivo de parada, un marcador enzimático, un sustrato marcador enzimático, estándares de calibración, un anticuerpo anti-ratón e instrucciones para realizar un ensayo mediante el uso de dicho kit.
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