KR20160108358A - 폐 및 다른 질환용 생화학적 마커 - Google Patents

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Abstract

프로티나아제에 의한 엘라스틴의 생체내 절단에 의해 절단 부위에서 형성된 네오-에피토프를 포함하는 COPD, SCC 또는 IPF와 같은 폐 질환에서 상승된 펩티드 절편의 정량화를 위한 생체분석 방법 및 이러한 방법에 사용하기 위한 항체 및 면역분석 키트에 관한 것으로서, 상기 방법은 샘플을 상기 네오-에피토프 아미노산 서열에 대해 특이적인 결합 친화도를 갖는 항체와 접촉시키는 단계 및 결합 레벨을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 항체는 다음의 말단 서열들 중 하나에 결합한다: ……FGPGVV, ……VPGLGV, IKAPKL…….

Description

폐 및 다른 질환용 생화학적 마커{BIOCHEMICAL MARKERS FOR PULMONARY AND OTHER DISEASES}
본 발명은 엘라스틴 절편의 검출 또는 정량화를 위한 면역학적 방법 및 물질에 관한 것이다.
엘라스틴은 세포외 매트릭스의 구조 및 기능을 위해 필수적인 단백질이다. 인간 엘라스틴의 아미노산 서열은 서열번호 1이다. 이것은 많은 기관 및 조직에 탄력(resilience) 및 탄성(elasticity)을 제공한다. 이들은 폐, 피부, 대동맥, 인대, 힘줄 및 연골을 포함한다. 엘라스틴은 전구체인 트로포엘라스틴으로부터 형성되고, 피리디늄, 데스모신 및 이소데스모신 구조에 의해 형성된 가교결합을 포함한다. 엘라스틴은 매우 안정적이지만, 매트릭스 메탈로프로티나아제(matrix metalloproteinase)(MMP) 및 인간 호중구 엘라스타아제(human neutrophil elastase)(HNE)와 같은 세린 프로테아제는 엘라스틴 섬유를 분해할 수 있고, 이후 탄성 및 기능이 소실된다. 폐에서, 상기 탄성의 소실은 폐기종이 공존하는 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD)과 같은 병리학적 특성을 유도할 수 있다(Maclay et al. 2012). 또한, 폐에서의 엘라스틴 유래 펩티드의 "광범위한" 침적은 특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)(IPF)과 같은 간질성(interstitial) 질환을 유도할 수 있다. 연구들은 어떤 엘라스틴 유래 절편이 폐 섬유증 질병을 앓고 있는 환자 유래의 혈청에서 상향조절됨을 보여주었다(Skjot-Arkil et al. 2012).
놀랍게도, 본 발명자들은 다양한 폐 질환의 진단 및 예후를 위한 신뢰가능한 생체마커로서 기능할 수 있는 엘라스틴의 HNE- 또는 MMP7-유래 절편을 확인할 수 있었다.
다른 MMP에 의해 분해된 엘라스틴에 대한 ELISA가 개시되어 있다(Skjot-Arkil, Clausen, Nguyen, Wang, Zheng, Martinez, Hogaboam, Han, Klickstein, Larsen, Nawrocki, Leeming, & Karsdal 2012; Skjot-Arkil et al. 2013). 이것은 MMP9 및 MMP12에 의한 절단에 의해 유래되는 엘라스틴의 절편을 표적화하는 모노클론 항체를 이용한다. 상기 분석법은 또한 폐 질병에 대해서도 적용된다. 본 명세서에 개시된 생체마커는 HNE 및/또는 MMP7에 의해 유래되는 선택된 엘라스틴 절편에 기반하기 때문에 상이하다. 이들은 MMP9 및 MMP12 프로테아제와 비교하여 폐 질병에 대해 보다 특이적이다(Finlay et al. 1997; Rosas et al. 2008; Starcher et al. 1996; Zhang et al. 2005).
온전한 MMP7 및 HNE를 정량하는 ELISA 키트는 알려져 있지만, 이들은 단지 프로테아제의 농도만을 측정할 뿐, 표적 분자에 대한 효과, 즉 엘라스틴 내의 네오-에피토프(neo-epitope)의 생성을 측정하지는 않는다.
온전한 엘라스틴을 정량하는 ELISA 키트가 또한 이용가능하다. 이것은 온전한 엘라스틴을 검출하지 않고 엘라스틴의 분해 동안에 생성된 네오-에피토프를 검출하는 본 발명과 상이하다.
많은 HNE 유래 엘라스틴 절편이 소화된 엘라스틴의 질량 분석법(mass spectrometry)에 의해 검출되었다: 예를 들면, 이들 중 일부가 혈장 및/또는 가래에서도 검출 및 정량화된 [He, Turino, & Lin 2010] 문헌 참조. 그러나, 상기 검출 및 정량화된 펩티드는 본 발명에서 사용된 절편과 상이하다.
CORD 환자 내의 성숙한 엘라스틴(데스모신 가교결합)이 질량 분석법에 의해 정량되었다(Ma, Lin, & Turino 2007). 이들은 온전한 엘라스틴의 생산만을 정량할 뿐, 프로테아제 유래 절편은 정량하지 않았다.
다양한 프로테아제를 이용한 엘라스틴의 절단 부위는 이미 결정 및 공개되어 있다. 이것은 또한 HNE(Barroso, Abello, & Bischoff 2006; He, Turino, & Lin 2010a) 및 MMP7(Heinz et al. 2011) 절단된 엘라스틴을 포함한다. 그러나, 상기 문헌들은 엘라스틴의 단백질분해성(proteolytic) 분해 동안에 생성된 네오-에피토프에 특이적인 항체를 이용한 엘라스틴 절편의 검출은 개시하지 않는다. 이들은 시험관내(in vitro)에서 형성된 엘라스틴의 어느 절편이 진단적 관련성(relevance)이 있는지, 또는 생체내(in vivo)에서 형성되는지, 또는 심지어 생물학적 유체 샘플에서 검출될 수 있는지에 대해 개시하고 있지 않다.
이제 본 발명은 절단 부위에서 프로티나아제에 의한 엘라스틴의 생체내 절단에 의해 상기 절단 부위에서 형성된 네오-에피토프를 포함하는 펩티드 절편의 정량화를 위한 생체분석 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 펩티드 절편을 포함하는 샘플을 상기 네오-에피토프에 대한 특이적인 결합 친화도를 갖는 면역학적 결합 파트너와 접촉시키는 단계 및 상기 샘플 내의 펩티드 절편에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 결합 레벨을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 면역학적 결합 파트너는 다음의 말단 서열들 중 하나에 대한 특이적인 결합 친화도를 갖는다:
……FGPGVV∥'334 (서열번호 2)
……VPGLGV∥'602 (서열번호 3)
208'∥IKAPKL…… (서열번호 4).
상기 기호 "∥"는 C-말단 절단 절편의 경우에는 서열번호 1의 수치화된 지점과 다음 아미노산 사이, N-말단 절단의 경우에는 앞선 아미노산의 엘라스틴 서열의 절단을 나타낸다.
상기 면역학적 결합 파트너는 바람직하게는 서열 FGPGVV과 반응한다면 ……FGPGVVG(서열번호 5)와는 특이적으로 반응하지 않고, ……VPGLGV와 반응한다면 ……VPGLGVG(서열번호 6)와는 특이적으로 반응하지 않고, 또한 IKAPKL……과 반응한다면 PIKAPKL……(서열번호 7)과는 특이적으로 반응하지 않는다.
바람직하게는, 상기 면역학적 결합 파트너는 또한 절단 부위를 넘어 엘라스틴 아미노산 서열의 해당 부분으로 추가로 연장된 펩티드와는 특이적으로 반응하지 않는다.
상기 면역학적 결합 파트너는 특이적 결합 친화도를 갖는 모노클론 항체 또는 모노클론 항체의 절편일 수 있다.
본 발명은 엘라스틴으로부터 유래되는 다음의 말단 서열들 중 하나와 특이적으로 반응하는 면역학적 결합 파트너를 포함한다:
……FGPGVV∥'334
……VPGLGV∥'602
208'∥IKAPKL…….
바람직하게는, 상기 면역학적 결합 파트너는 서열 ……FGPGVV와 반응한다면 ……FGPGVVG와는 특이적으로 반응하지 않고, ……VPGLGV와 반응한다면 ……VPGLGVG와는 특이적으로 반응하지 않고, 또한 IKAPKL……와 반응한다면 PIKAPKL……과는 특이적으로 반응하지 않는다.
상기 면역학적 결합 파트너는 모노클론 항체 또는 그의 결합 절편일 수 있다.
본 발명은 전술한 것과 같은 면역학적 결합 파트너, 및 상기 면역학적 결합 파트너에 결합하는 경쟁 제제, 및 선택적으로 세척 시약, 버퍼, 중단 시약, 효소 표지, 효소 표지 기질, 교정 표준물, 항-마우스 항체 및 키트를 이용한 분석을 수행하기 위한 설명서 중 하나 이상을 포함하는 면역분석 키트를 포함한다.
상기 분석의 결과는 특정 환자에서 COPD, IPF 또는 SCC의 존재 위험의 정도 또는 이러한 증상의 정도 및 증세를 시사하는 지수를 생산할 수 있다. 상기 측정에 대해 역치 레벨 이상의 값을 갖는 환자는 추가적인 조사 또는 치료를 위한 약물의 처방이 권고될 수 있으며, 이러한 후속(follow up) 조사 또는 치료는 본 발명의 방법의 일부를 형성할 수 있다.
전술한 하나 이상의 펩타이드에 대한 분석은 별도로 수행되고 그 결과들이 조합되거나, 전술한 하나 이상의 펩티드가 함께 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 분석의 결과는 하나 이상의 다른 측정된 바이오마커와 조합되어 진단 또는 예후 값의 복합 지수를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 '면역학적 결합 파트너'란 용어는 폴리클론 및 모노클론 항체 및 Fab 또는 F(ab')2와 같은 항체의 특이적 결합 절편도 포함한다. 따라서, 상기 면역학적 결합 파트너는 특이적 결합 친화도를 갖는 모노클론 항체 또는 모노클론 항체의 절편일 수 있다.
일반적으로, 이종성 및 동종성 포맷, 샌드위치 분석, 경쟁 분석, 효소 결합 분석, 방사-면역 분석 등을 포함하는 종래 알려진 모든 면역분석 포맷이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 선택적으로, 상기 방법은 상기 면역학적 결합 파트너 및 경쟁 제제가 상기 샘플의 존재 하에 인큐베이션되고 상기 경쟁 제제가 상기 면역학적 결합 파트너에 결합하기 위해 상기 샘플 내의 펩티드 절편과 경쟁하는 경쟁 면역분석으로 수행된다.
상기 경쟁 제제는 합성 펩티드이거나, 또는 엘라스틴의 절단에 의해 형성된 정제된 자연형 펩티드일 수 있다.
다른 한편으로, 상기 방법은 상기 면역학적 결합 파트너 및 상기 면역학적 결합 파트너에 의해 결합된 펩티드 절편 내에 포함된 펩티드 서열에 대한 특이적인 결합 친화도를 갖는 추가적인 면역학적 결합 파트너가 상기 샘플의 존재 하에 인큐베이션되고 이들 모두가 상기 샘플 내의 상기 펩티드 절편에 함께 결합하는 샌드위치 면역분석으로 수행될 수 있다. 한 적합한 방법은 엘라스틴 절편의 네오-에피토프에 결합하는 모노클론 항체 또는 항체 결합 절편을 이용한 경쟁 면역분석일 수 있다.
미세역가(microtiter) 플레이트의 고체 표면에 코팅된 적절하게 선택된 합성 펩티드는 모노클론 항체 또는 결합 절편에 대한 결합을 위해 상기 샘플과 경쟁할 수 있다. 다른 한편으로, 상기 모노클론 항체 또는 결합 절편에 의해 인식되는 네오-에피토프를 운반하는 하나 이상의 상기 단백질 유래의 정제된 자연형의 절편이 상기 고체 표면에 사용될 수 있다. 또 다른 대안은 상기 고체 표면에 상기 모노클론 항체 또는 결합 절편을 고정화시킨 후, 상기 샘플을 신호 분자, 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다아제 또는 바이오틴에 적절하게 결합된 합성 펩티드와 공동-인큐베이션하는 것이다.
어떤 바람직한 방법에서, 상기 샘플은 환자 유래의 샘플이고, 상기 방법은 상기 펩티드 절편의 상기 결합의 결정된 레벨을 (a) 비교가능한 건강한 개인 및/또는 (b) 해당 병리학적 증상의 특징적인 값과 비교하고, 선택적으로 더 높은 레벨의 상기 측정된 펩티드(보통 더 높은 레벨의 결합에 의해 나타냄)를 보다 심각한 정도의 상기 증상과 연관시키는 것을 추가로 포함한다. 상기 샘플은 예를 들면 소변, 혈청, 혈액, 혈장 또는 타액의 샘플일 수 있다.
본 발명의 한 측면은 전술한 것과 같은 네오-에피토프를 인식하는 모노클론 항체의 개발에 관한 것이다. 이것은 마우스를 엘라스틴의 아미노산 서열(특히 상기 나열된 서열들 또는 그 안에서 종결되는 서열들)로부터 기원하는 합성 펩티드로 면역시키고, 선택된 마우스 유래의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시키고, 모노클론 항체를 해당 합성 펩티드 상의 네오-에피토프에 대한 결합에 대해 테스트함으로써 달성될 수 있다. 네오-에피토프에 대한 특이성은 합성 펩티드와의 반응성은 필요로 하고 상기 면역화 펩티드의 C-말단의 연장된 형태(C-말단 네오-에피토프의 경우) 또는 상기 면역화 펩티드의 N-말단의 연장된 형태(N-말단 네오-에피토프의 경우)와의 반응성은 없게 함으로써 보장될 수 있다. 네오-에피토프에 대한 항체는 또한 온전한 엘라스틴에 대한 결합 능력이 없음을 확립하기 위해 평가될 수 있다. 다른 한편으로, 네오-에피토프에 대한 특이성은 상기 항체의 반응성이 바이오틴 또는 상기 말단 아미노산들 중 하나에 공유적으로 결합된 다른 작용기의 존재에 대해 부정적으로 의존적인(negatively dependent) 것을 필요로 함으로써 보장될 수 있다.
본 발명은 전술한 부분적인 서열들 중 임의의 하나의 말단-부위에서 프로테아제에 의한 엘라스틴의 절단에 의해 형성되는 네오-에피토프와 특이적으로 면역반응성이고, 예를 들면 모노클론 항체 또는 그의 결합 절편일 수 있는 면역학적 결합 파트너를 포함한다.
본 발명은 전술한 부분적인 서열들 중 임의의 하나에서 서열의 말단-부위에서 엘라스틴의 절단에 의해 형성되는 C-말단 또는 N-말단 네오-에피토프에 대한 모노클론 항체를 생산하는 세포주를 포함한다.
본 발명은 전술한 부분적인 서열들 중 임의의 하나에서 엘라스틴의 절단에 의해 형성되는 C-말단 또는 N-말단 네오-에피토프를 포함하는 펩티드를 추가로 제공한다. 이러한 펩티드는 상기 펩티드에 대한 면역 반응을 생성하기 위하여 담체(carrier)에 대한 합텐(hapten)으로서 접합되거나, 고체 표면에 고정되거나, 면역분석에 사용하기 위하여 검출가능한 마커에 접합될 수 있다.
본 발명은 전술한 부분적인 서열들 중 임의의 하나에서 엘라스틴의 절단에 의해 형성되는 C-말단 또는 N-말단 네오-에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 추가로 포함한다.
본 발명은 발현 신호 및 전술한 부분적인 서열들 중 임의의 하나에서 엘라스틴의 절단에 의해 형성되는 C-말단 또는 N-말단 네오-에피토프를 포함하는 펩티드를 발현하기 위해 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 추가로 포함하고, 또한 이러한 벡터로 형질전환되고 상기 펩티드를 발현하는 숙주 세포를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 전술한 방법을 수행하기 위해 편리하게 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 (1) 상기 네오-에피토프의 서열을 운반하는 합성 펩티드로 코팅된 미세역가 플레이트; (2) 상기 합성 펩티드와 반응성인 본 발명의 모노클론 항체 또는 항체 결합 절편; 및 (3) 표지된 항-마우스 IgG 면역글로불린을 포함할 수 있다. 다른 한편으로, 이러한 키트는 (1) 정제된 자연형의 단백질 절편으로 코팅된 미세역가 플레이트; (2) 상기 단백질 중 임의의 하나의 절편 상의 네오-에피토프를 인식하고 상기 정제된 절편과 반응성인 모노클론 항체; 및 (3) 표지된 항-마우스 IgG 면역글로불린을 포함할 수 있다. 다른 한편으로, 이러한 키트는 (1) 스트렙트아비딘으로 코팅된 미세역가 플레이트; (2) 바이오틴에 결합되고 네오-에피토프의 서열을 운반하는 합성 펩티드; (3) 상기 단백질 절편 상의 네오-에피토프를 인식하고 상기 합성 펩티드와 반응성인 모노클론 항체; 및 (4) 표지된 항-마우스 IgG 면역글로불린을 포함할 수 있다. 또 다른 대안물은 (1) 스트렙트아비딘으로 코팅된 미세역가 플레이트; (2) 바이오틴에 결합되고 네오-에피토프의 서열을 운반하는 합성 펩티드; (3) 상기 단백질 절편 상의 네오-에피토프를 인식하고 (상기 합성 펩티드와 반응성이며) 서양고추냉이 퍼옥시다아제에 접합된 모노클론 항체를 포함하는 키트일 수 있다. 또 다른 대안물은 (1) 상기 단백질 절편 상의 네오-에피토프를 인식하는 모노클론 항체 또는 그의 절편으로 (직간접적으로) 코팅된 미세역가 플레이트; (2) 네오-에피토프의 서열을 운반하는 HRP 표지된 합성 펩티드를 포함하는 키트이거나, 또는 대안적으로 (1) 상기 단백질 절편 상의 네오-에피토프를 인식하는 모노클론 항체 또는 그의 절편으로 (직간접적으로) 코팅된 미세역가 플레이트; (2) 네오-에피토프의 서열을 운반하는 바이오틴-표지된 합성 펩티드; (3) HRP-표지된 스트렙트아비딘을 포함하는 키트일 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 것과 같은 면역학적 결합 파트너, 및 상기 면역학적 결합 파트너에 결합하는 경쟁 제제, 및 선택적으로 세척 시약, 버퍼, 중단 시약, 효소 표지, 효소 표지 기질, 교정 표준물, 항-마우스 항체 및 면역분석을 수행하기 위한 설명서 중 하나 이상을 포함하는 면역분석 키트를 포함한다.
본 명세서에 개시된 분석법은 일반적으로 환자에서 상기 개시된 질환 및 엘라스틴 연관성 병리의 진단에 유용하다. 또한, 상기 테스트는 질환 진행의 평가 및 치료에 대한 반응의 모니터링에 유용하다. 본 발명의 면역학적 결합 파트너는 또한 본 명세서에 개시된 엘라스틴의 절단 생성물의 존재 또는 위치를 보여주기 위한 면역염색에 사용될 수 있다.
본 발명은 바람직한 구현예의 원리 및 실행을 예시하는 다음의 실시예를 참고하여 추가로 개시 및 예시될 것이다. 상기 실시예는 부속하는 도면에서 제공되는 결과를 참고한다.
도 1은 실시예 3의 ELISA에서 얻어진 결과를 보여주며, NB590 모노클론 항체와 인큐베이션한 후 자유 펩티드 및 연장된 펩티드(NB590)의 농도와 비교하여 측정된 B/B0 비를 보여준다. 상기 연장된 펩티드를 향해서는 반응성이 거의 없다.
도 2는 실시예 3에서 얻어진 NB590 모노클론 항체를 특성분석한 결과를 보여준다.
도 3은 실시예 3에서 얻어진 COPD, IPF 및 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma)(SCC) 환자뿐만 아니라 대조군 유래의 혈청에서 NB590 자유 펩티드의 농도를 보여준다. *는 p 값 ≤ 0.05를 나타내고, **는 p 값 ≤ 0.05를 나타낸다. 평균의 표준 오차가 또한 나타나 있다.
도 4는 실시예 4의 ELISA에서 얻어진 결과를 보여주며, NB592 모노클론 항체와 인큐베이션한 후 자유 펩티드 및 연장된 펩티드(NB592)의 농도와 비교하여 측정된 B/B0 비를 보여준다. 상기 연장된 펩티드를 향해서는 반응성이 거의 없다.
도 5는 실시예 4에서 얻어진 NB592 모노클론 항체를 특성분석한 결과를 보여준다.
도 6은 실시예 4에서 얻어진 COPD, IPF 및 편평 세포 암종(SCC) 환자뿐만 아니라 대조군 유래의 혈청에서 NB592 자유 펩티드의 농도를 보여준다. 평균의 표준 오차가 나타나 있다. 자유 펩티드 농도는 참고로서 적용되었다.
도 7은 실시예 5의 ELISA에서 얻어진 결과를 보여주며, NB593 모노클론 항체와 인큐베이션한 후 자유 펩티드(NB593)(서열번호 11) 및 연장된 펩티드(서열번호 13)의 농도와 비교하여 측정된 B/B0 비를 보여준다. 상기 연장된 펩티드를 향해서는 반응성이 거의 없다.
도 8은 실시예 5에서 얻어진 NB593 모노클론 항체를 특성분석한 결과를 보여준다.
도 9는 환자뿐만 아니라 건강한 대조군 유래의 다양한 질환 샘플에 대해 NB593 항체를 테스트한 결과를 보여준다. 상기 NB593 절편은 혈청에서 검출불가능하였다.
도 10은 실시예 6에서 수행된 ELISA의 결과를 보여주며, NB595 모노클론 항체의 자유 펩티드(NB595)(서열번호 12) 및 연장된 펩티드(서열번호 14)에 의한 신호의 억제 백분율을 보여준다. 상기 연장된 펩티드에 의해서는 거의 억제되지 않는다.
도 11은 실시예 6에서 얻어진 NB595 모노클론 항체를 특성분석한 결과를 보여준다.
도 12는 COPD 환자뿐만 아니라 건강한 대조군 유래의 혈청에서 NB595 절편의 농도를 보여준다. 상기 NB595 절편은 COPD에서 상승되지 않는다.
도 13은 실시예 7에서 수행된 ELISA의 결과를 보여주며, NB599 모노클론 항체의 자유 펩티드(NB599)(서열번호 10) 및 연장된 펩티드(서열번호 15)에 의한 신호의 억제 백분율을 보여준다. 상기 자유 펩티드와 비교하여 상기 연장된 펩티드를 향해서는 항체의 반응성이 낮다.
도 14는 실시예 7에서 얻어진 NB599 모노클론 항체를 특성분석한 결과를 보여준다.
도 15는 대조군, 편평 세포 암종(SCC), COPD 및 IPF 환자 유래의 혈청에서 NB599 엘라스틴 절편의 농도를 보여준다. 대조군 및 SCC와 COPD 및 대조군 사이에는 현저한 차이가 있다. 또한, IPF 및 대조군 사이에는 통계적인 차이가 있다.
실시예 1. 면역화용 펩티드의 선택
다음의 펩티드를 면역화를 위해 선택하였다:
· NB590: 아미노산 #325'GGPGFGPGVV∥'334 (서열번호 8)(HNE 유래)
· NB592: 아미노산 #593'VGAGVPGLGV∥'602 (서열번호 9)(HNE 유래)
· NB599: 아미노산 #208'∥IKAPKLPGGY'217 (서열번호 10)(MMP7 유래)
· NB593: 아미노산 #743'∥GLGGVLGGA'752 (서열번호 11)(HNE 유래)
· NB595: 아미노산 #41'∥VFYPGAGLGA'50 (서열번호 12)(MMP7 유래).
포함되는 절단 부위들은 타인(He, Turino, & Lin 2010d; Heinz et al. 2011a)에 의해 종래 결정된 것들이다. 본 발명자들은 상기 절단 부위들의 하류 또는 상류의 첫 번째 10개 아미노산을 면역화 펩티드로 선택하였다.
실시예 2. 모노클론 항체의 개발
6마리의 4-6주령 Balb/C 마우스를 C-말단 에피토프의 경우에는 그 N-말단에서, 그리고 N-말단 에피토프의 경우에는 그 C-말단에서 KLH에 접합된 전술한 면역원성 펩티드를 이용하여 200 ㎕의 현탁된 항원(면역화 당 50 ㎍)으로 표준 절차에 따라 복부에 피하 면역시켰다. 안정한 역가 레벨이 얻어질 때까지 면역화를 계속하였다.
가장 높은 역가를 갖는 마우스를 융합을 위해 선택하였고, 세포 융합을 위해 비장을 단리하기 3일 전에 100 ㎕의 0.9% 염화나트륨 용액 내의 50 ㎍의 면역원으로 정맥내 부스팅(boosting)하였다.
공지된 절차(Gefter, Margulies, & Scharff 1977)에 의해 융합 절차를 수행하였다. 상등액을 수집하였고, 모노클론 항체를 제조사(GE Healthcare Life Science)의 설명서에 따라 단백질 G 컬럼을 이용하여 정제하였다.
네오 - 에피토프 특이적 모노클론 항체의 선택:
면역화를 위해 사용된 비-접합된 형태의 상동성 펩티드(선택 펩티드)를 이용하여 그 펩티드-특이성에 대해 항체를 선택하였고, 절단 범위를 넘어 엘라스틴 서열의 1개의 아미노산에 의해 연장된 펩티드의 연장된 버전에 대해 탈-선택하였으며, 이로 인해 네오-에피토프 특이성을 갖는 항체만을 추가적인 분석을 위해 선택함을 보장하였다.
이어서, 온전한, 자연형의 및 절단된 엘라스틴에 대한 항체의 반응성을 테스트하였다.
그리고, 마지막으로 건강한 및 질환 대상체 유래의 혈청 샘플을 전술한 분석 프로토콜에서 테스트하였다.
분석 프로토콜:
96-웰 스트렙트아비딘 플레이트를 코터 버퍼에 용해된 스크리닝 펩티드로 코팅하였고, 20℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 플레이트를 세척 버퍼(20 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.2)로 5회 세척하였다. 20 ㎕의 펩티드(선택, 탈-선택 또는 난센스) 또는 인간 샘플을 적절한 웰에 이중으로 첨가한 후, 100 ㎕의 POD-접합된 모노클론 항체를 첨가하였고, 이후 상기 플레이트를 교반기에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 100 ㎕의 테트라메틸벤지딘(TMB)(Kem-En-Tec)을 첨가하였고, 상기 플레이트를 암실에서 20℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
상기 모든 인큐베이션 단계는 300 rpm에서의 교반을 포함하였다.
100 ㎕의 중단 용액(1% H2SO4)을 첨가함으로써 상기 TMB 반응을 중단시켰다. 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 650 ㎚를 참고로 하였다. 상기 선택된 펩티드로부터 제조된 마스터 교정기(master calibrator)를 교정 커브로 사용하였고, 4-파라미터성 수학적 맞춤 모델을 이용하여 좌표를 나타내었다.
측정 전에 모든 혈청 샘플을 인큐베이션 버퍼 내에서 1:2로 희석하였다.
실시예 3. 모노클론 항체 NB590
도 1은 NB590 항체를 향한 자유 및 연장된 펩티드의 반응성을 보여준다. 자유 펩티드 농도에서의 증가와 함께 흡광도에서의 감소가 보인다. 이것은 웰 내에서 스크리닝 펩티드 대신에 자유 펩티드와의 증가된 반응으로 인한 것이다. 이것은, 안정한 B/B0 레벨이 상기 NB590-01 항체 및 연장된 펩티드 사이에는 반응이 매우 낮거나 없음을 나타내었기 때문에, 상기 연장된 펩티드의 경우에는 해당하지 않았다.
이어서, 상기 NB590 항체를 엘라스틴(ELN), MMP2, MMP7, MMP9 및 HNE로 시험관내에서 절단된 엘라스틴 및 해당 버퍼 내의 프로테아제를 향해 테스트하였다(도 2). 그 버퍼 내의 선택된 프로테아제 단독만의 반응성도 또한 포함된다. 상기 NB590 모노클론 항체는 HNE에 의해 유래되는 엘라스틴 절편을 명확하게 측정한다. 자유 펩티드 농도를 참고로서 적용하였다. 상기 NB590 항체는 HNE로 절단된 엘라스틴을 향해 매우 높은 반응성을 가졌다. 상기 NB590 항체 및 온전한 엘라스틴 또는 다른 프로테아제로 절단된 엘라스틴의 반응성은 상기 분석법의 검출 하한에 가깝다.
마지막으로, 상기 NB590 항체를 COPD, IPF 또는 편평 세포 암종을 갖는 환자 유래의 혈청 샘플에서 테스트하였고, 건강한 대조군과 비교하였다(도 3). 건강한 대조군과 비교하여 COPD 및 편평 세포 암종 환자에서는 상기 NB590 절편의 농도에서 현저한 차이가 있다. 레벨이 더 높은 경향이 관찰되었지만, 대조군과 IPF를 갖는 환자 사이에는 통계적으로 현저한 차이가 없었다. 이는 이것은 횡단적 연구(cross-sectional study)였지만 IPF 환자의 종단적 연구(longitudinal study)는 보다 현저한 차이를 보여줄 수 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다.
실시예 4. 모노클론 항체 NB592
도 4는 NB592 항체를 향한 자유 및 연장된 펩티드의 반응성을 보여준다. 자유 펩티드 농도에서의 증가와 함께 흡광도에서의 감소가 보인다. 이것은 웰 내에서 스크리닝 펩티드 대신에 자유 펩티드와의 증가된 반응으로 인한 것이다. 이것은, 안정한 B/B0 레벨이 상기 연장된 항체 및 NB592 항체 사이에는 반응이 매우 낮거나 없음을 나타내었기 때문에, 상기 연장된 펩티드의 경우에는 해당하지 않았다.
이어서, 상기 NB592 항체를 엘라스틴, MMP2, MMP7, MMP9 및 HNE로 시험관내에서 절단된 엘라스틴 및 해당 버퍼 내의 프로테아제를 향해 테스트하였다(도 5). 그 버퍼 내의 선택된 프로테아제 단독만의 반응성도 또한 포함된다. 상기 NB592 모노클론 항체는 HNE에 의해 유래되는 엘라스틴 절편을 명확하게 측정한다. 자유 펩티드 농도를 참고로서 적용하였다. 상기 NB592 항체는 HNE로 절단된 엘라스틴을 향해 매우 높은 반응성을 가졌다. 상기 NB592 항체 및 온전한 엘라스틴 또는 다른 프로테아제로 절단된 엘라스틴의 반응성은 상기 분석법의 검출 하한에 가깝다. 작은 신호가 상기 HNE 및 그 버퍼 단독에 대해 보이지만, 상기 신호는 HNE로 절단된 엘라스틴에 대한 신호보다 100배 이상 더 작다.
마지막으로, 상기 NB592 항체를 COPD, IPF 또는 편평 세포 암종을 갖는 환자 유래의 혈청 샘플에서 테스트하였고, 건강한 대조군과 비교하였다(도 6). 레벨이 증가하는 경향이 높았지만, 건강한 대조군과 비교하여 COPD 및 편평 세포 암종 환자에서의 NB592 절편의 농도에서는 현저한 차이(p<0.05)가 없었다. 대조군과 IPF를 갖는 환자 사이에는 차이가 없었다. 이는 이것은 횡단적 연구였지만 IPF 환자의 종단적 연구는 차이를 보여줄 수 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다.
실시예 5. (비교적) 모노클론 항체 NB593
도 7은 NB593 항체를 향한 자유 및 연장된 펩티드의 반응성을 보여준다. 자유 펩티드 농도에서의 증가와 함께 흡광도에서의 감소가 보인다. 이것은 웰 내에서 스크리닝 펩티드 대신에 자유 펩티드와의 증가된 반응으로 인한 것이다. 이것은, 안정한 B/B0 레벨이 상기 NB593 항체와의 반응이 매우 낮거나 없음을 나타내었기 때문에, 상기 연장된 펩티드의 경우에는 해당하지 않았다.
이어서, 상기 NB593 항체의 반응성을 엘라스틴, 시험관내에서 HNE로 절단된 엘라스틴 및 HNE 버퍼를 향해 테스트하였다. 상기 593 모노클론 항체는 온전한 엘라스틴 및 이러한 절편들의 측정값과 비교하여 HNE에 의해 유래되는 엘라스틴 절편을 향해 매우 높은 반응성을 갖는다. 자유 펩티드 농도를 참고로서 적용하였다. 온전한 엘라스틴 또는 HNE 버퍼를 향한 상기 NB593 항체의 반응성은 매우 낮다.
그리고, 마지막으로 도 9는 상기 NB593 항체 및 COPD 환자 및 건강한 대조군 유래의 인간 혈청 샘플의 반응성을 보여준다. 상기 데이터는 건강한 대조군 및 환자의 혈청에서 항체 NB593에 의해 인식되는 절편이 없거나, 또는 검출불가능한 양으로만 존재함을 보여준다.
실시예 6. (비교적) 모노클론 항체 NB595
도 10은 NB595 항체를 향한 자유 및 연장된 펩티드의 반응성을 보여준다. 자유 펩티드 농도에서의 증가와 함께 흡광도에서의 감소가 보인다. 이것은 웰 내에서 스크리닝 펩티드 대신에 자유 펩티드와의 증가된 반응으로 인한 것이다. 이것은, 안정한 B/B0 레벨이 상기 NB5955 항체와의 반응이 매우 낮거나 없음을 나타내었기 때문에, 상기 연장된 펩티드의 경우에는 해당하지 않았다.
이어서(도 11), 상기 NB595 항체의 반응성을 엘라스틴, 시험관내에서 MMP2, MMP7, MMP9 및 HNE로 절단된 엘라스틴 및 해당 버퍼 내의 프로테아제를 향해 테스트하였다. 상기 595 모노클론 항체는 MMP7에 의해 유래되는 엘라스틴 절편을 명확하게 측정하고, MMP7로 절단된 엘라스틴을 향해 높은 반응성을 갖는다. 자유 펩티드 농도를 참고로서 적용하였다. 온전한 엘라스틴 또는 다른 프로테아제로 절단된 엘라스틴을 향한 상기 NB595 항체의 반응성은 상기 분석법의 검출 하한에 가깝다.
마지막으로, 도 12는 상기 NB595 항체 및 COPD 환자 및 건강한 대조군 유래의 모은(pooled) 인간 혈청 샘플의 반응성을 보여준다. 상기 데이터는 상기 NB595 절편이 COPD 환자에서 상승되지 않음을 보여준다. 따라서, 상기 항체에 대해서는 생물학적 관련성이 제한적이다.
실시예 7. NB599
도 13은 NB599 항체를 향한 자유 및 연장된 펩티드의 반응성을 보여준다. 자유 펩티드 농도에서의 증가와 함께 흡광도에서의 감소가 보인다. 이것은 웰 내에서 스크리닝 펩티드 대신에 자유 펩티드와의 증가된 반응으로 인한 것이다. B/B0 레벨이 상기 펩티드와 NB599 항체 사이의 반응이 약함을 나타내었기 때문에, 흡광도에서의 감소는 연장된 펩티드의 경우 현저하게 낮았다.
이어서, 엘라스틴, 시험관내에서 MMP2, MMP7, MMP9 및 HNE로 절단된 엘라스틴 및 해당 버퍼 내의 프로테아제를 향한 상기 NB599 항체의 반응성을 결정하였다(도 14). 상기 NB599 모노클론 항체는 MMP7에 의해 유래되는 엘라스틴 절편을 명확하게 측정한다. 상기 NB599 항체는 다른 프로테아제로 절단된 엘라스틴보다 MMP7로 절단된 엘라스틴을 향해 훨씬 더 높은 반응성을 갖는다. HNE+HNE 버퍼를 향해서도 일부 반응성이 있지만, 이것은 여전히 HNE로 절단된 엘라스틴보다 훨씬 더 낮다.
그리고, 마지막으로 엘라스틴 절편의 존재를 상기 NB599 테스트를 이용하여 COPD, IPF 또는 편평 세포 암종을 갖는 환자 유래의 혈청 샘플에서 테스트하였고, 건강한 대조군과 비교하였다(도 15). 건강한 대조군과 비교하여 COPD, IPF 및 편평 세포 암종 환자에서의 NB599 절편의 농도는 현저한 차이가 있다. 특히, 상기 편평 세포 암종 및 COPD 환자는 증가된 레벨의 NB599 엘라스틴 절편을 가졌다.
본 명세서에 있어서, 달리 명확하게 나타내지 않는 한, '또는'이란 단어는 언급한 조건들 중 어느 하나 또는 양쪽 모두가 충족될 때 참값을 되돌리는 연산자의 의미로 사용되며, 어느 하나의 조건만이 충족되는 것을 필요로 하는 '배타적으로 또는'이란 연산자와 대조된다. '포함하는'이란 단어는 '이루어지는'이란 의미보다는 '함유하는'의 의미로 사용된다. 상기에서 인정된(acknowledged) 모든 종래 기술들은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 명세서 내의 임의의 종래 공개 문헌은 그 내용이 호주 또는 다른 국가에서 그 날에 보통의 일반적인 지식임을 승인하거나 대표하는 것으로 간주되어야 함을 인정하는 것은 아니다.
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Phe 145 150 155 160 Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro Thr Gly Ala Gly Val Lys 165 170 175 Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe Ala Gly Ile Pro Gly Val 180 185 190 Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile 195 200 205 Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly 210 215 220 Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly 225 230 235 240 Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly 260 265 270 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala 275 280 285 Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala 290 295 300 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala 305 310 315 320 Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val 325 330 335 Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro 340 345 350 Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Val 355 360 365 Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly 370 375 380 Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Thr Tyr Gly Val Gly 385 390 395 400 Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Gly 405 410 415 Val Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val 420 425 430 Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Lys 435 440 445 Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Val Leu Gly Gly Leu Val 450 455 460 Pro Gly Pro Gln Ala Ala Val Pro Gly Val Pro Gly Thr Gly Gly Val 465 470 475 480 Pro Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys 485 490 495 Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val 500 505 510 Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Leu Ala Pro 515 520 525 Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val 530 535 540 Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala 545 550 555 560 Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly 565 570 575 Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val Gly Val Pro Gly Leu Gly 580 585 590 Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly 595 600 605 Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu Ser Pro Glu 610 615 620 Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro Ser Thr Pro 625 630 635 640 Ser Ser Pro Arg Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys 645 650 655 Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Gly 660 665 670 Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Ala Ala 675 680 685 Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val 690 695 700 Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Pro 705 710 715 720 Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Lys Ala 725 730 735 Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala Gly 740 745 750 Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gly Leu Ser 755 760 765 Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys Gly Arg Lys 770 775 780 Arg Lys 785 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(5) <223> elastin cleavage fragment <400> 2 Phe Pro Gly Val Val 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(6) <223> Elastin cleavage fragment <400> 3 Val Pro Gly Leu Gly Val 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(6) <223> Elastin cleavage fragment <400> 4 Ile Lys Ala Pro Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(7) <223> extended cleavage fragment <400> 5 Phe Gly Pro Gly Val Val Gly 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(7) <223> extended cleavage fragment <400> 6 Val Pro Gly Leu Gly Val Gly 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(7) <223> extended cleavage sequence <400> 7 Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> immunisation peptide <400> 8 Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val Val 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> immunisation peptide <400> 9 Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> immunisation peptide <400> 10 Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> immunisation peptide <400> 11 Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> immunisation peptide <400> 12 Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Ile Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr 1 5 10

Claims (13)

  1. 절단 부위에서 프로티나아제에 의한 엘라스틴의 생체내 절단에 의해 상기 절단 부위에서 형성된 네오-에피토프를 포함하는 펩티드 절편의 정량화를 위한 생체분석 방법으로서, 상기 방법은 상기 펩티드 절편을 포함하는 샘플을 상기 네오-에피토프에 대한 특이적인 결합 친화도를 갖는 면역학적 결합 파트너와 접촉시키는 단계 및 상기 샘플 내의 펩티드 절편에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 결합 레벨을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 면역학적 결합 파트너는 다음의 말단 서열들 중 하나에 대한 특이적인 결합 친화도를 갖는 생체분석 방법:
    ……FGPGVV∥'334 (서열번호 2)
    ……VPGLGV∥'602 (서열번호 3)
    208'∥IKAPKL…… (서열번호 4).
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 면역학적 결합 파트너는 서열 ……FGPGVV과 반응한다면 ……FGPGVVG(서열번호 5)와는 특이적으로 반응하지 않고, ……VPGLGV와 반응한다면 ……VPGLGVG(서열번호 6)와는 특이적으로 반응하지 않으며, 또한 IKAPKL……과 반응한다면 PIKAPKL……(서열번호 7)과는 특이적으로 반응하지 않는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 면역학적 결합 파트너는 특이적 결합 친화도를 갖는 모노클론 항체 또는 모노클론 항체의 절편인 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 면역학적 결합 파트너 및 경쟁 제제가 상기 샘플의 존재 하에 인큐베이션되고 상기 경쟁 제제가 상기 면역학적 결합 파트너에 결합하기 위해 상기 샘플 내의 상기 펩티드 절편과 경쟁하는 경쟁 면역분석으로 수행되는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 경쟁 제제는 합성 펩티드이거나 또는 상기 네오-에피토프를 드러내기 위해 엘라스틴의 절단에 의해 형성된 정제된 자연형 펩티드인 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 면역학적 결합 파트너 및 상기 면역학적 결합 파트너에 의해 결합된 펩티드 절편 내에 포함된 펩티드 서열에 대한 특이적인 결합 친화도를 갖는 추가적인 면역학적 결합 파트너가 상기 샘플의 존재하에 인큐베이션되고 이들 모두가 상기 샘플 내의 상기 펩티드 절편에 함께 결합하는 샌드위치 면역분석으로 수행되는 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플은 소변, 혈청, 혈액, 혈장 또는 타액의 샘플인 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플은 환자 유래의 샘플이고, 상기 방법은 상기 펩티드 절편의 상기 결합의 결정된 레벨을 (a) 비교가능한 건강한 개인 및/또는 (b) 병리학적 증상의 특징적인 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 엘라스틴으로부터 유래되는 다음의 말단 서열들 중 하나와 특이적으로 반응하는 면역학적 결합 파트너:
    ……FGPGVV∥'334 (서열번호 2)
    ……VPGLGV∥'602 (서열번호 3)
    208'∥IKAPKL…… (서열번호 4).
  10. 청구항 9에 있어서,
    서열 ……FGPGVV와 반응한다면 ……FGPGVVG(서열번호 5)와는 특이적으로 반응하지 않고, ……VPGLGV와 반응한다면 ……VPGLGVG(서열번호 6)와는 특이적으로 반응하지 않으며, 또한 IKAPKL……와 반응한다면 PIKAPKL……(서열번호 5)과는 특이적으로 반응하지 않는 면역학적 결합 파트너.
  11. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    모노클론 항체 또는 그의 결합 절편인 면역학적 결합 파트너.
  12. 청구항 9의 모노클론 항체를 생산하는 세포주.
  13. 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 면역학적 결합 파트너, 및
    상기 면역학적 결합 파트너에 결합하는 경쟁 제제, 및 선택적으로 세척 시약, 버퍼, 중단 시약, 효소 표지, 효소 표지 기질, 교정 표준물, 항-마우스 항체 및 키트를 이용한 분석을 수행하기 위한 설명서 중 하나 이상을 포함하는 면역분석 키트.
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