ES2900363T3 - Ensayo de colágeno tipo VII alfa 1 - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal reactivo con un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende un neoepítopo N- o C-terminal formado por escisión por proteasa del colágeno tipo VII alfa 1: en el que dicho anticuerpo monoclonal se une al neoepítopo N-terminal, en el que el neoepítopo N-terminal está comprendido en la secuencia de aminoácidos H2N-EAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 4), y no se une a la secuencia de aminoácidos alargada H2N-XEAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 6), en la que X es uno o más aminoácidos de la secuencia de colágeno tipo VII alfa 1; o en el que dicho anticuerpo monoclonal se une al neoepítopo C-terminal, en el que el neoepítopo C-terminal está comprendido en la secuencia de aminoácidos GPPGPPGRLV-COOH (SEQ ID NO: 1), y no se une a la secuencia de aminoácidos alargada GPPGPPGRLVX-COOH (SEQ ID NO: 3), en la que X es uno o más aminoácidos de la secuencia del colágeno tipo VII alfa 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayo de colágeno tipo VII alfa 1
Campo técnico
La presente invención se refiere a anticuerpos que son reactivos con fragmentos de colágeno tipo VII alfa 1 que comprenden un neoepítopo N- o C-terminal, el uso de dichos anticuerpos en un ensayo para detectar y cuantificar dichos fragmentos de colágeno tipo VII alfa 1, y el uso de dicho ensayo para evaluar la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o la esclerosis sistémica.
Técnica Antecedente
El colágeno tipo VII es el componente principal de las fibrillas de anclaje que conectan la membrana basal con la matriz intersticial subyacente. Consiste en tres cadenas alfa-1 idénticas con dos dominios no colagenosos (NC) y un dominio central triple helicoidal de colágeno. Se ha identificado en las membranas basales de la piel y las membranas mucosas [1].
El colágeno tipo VII se ha investigado principalmente por su papel en la epidermólisis ampollosa distrófica, una enfermedad grave de la piel. Las mutaciones en la cadena alfa-1 del colágeno tipo VII conducen a la formación de fibrillas de anclaje anormales, disminuidas o ausentes, lo que provoca la separación de la epidermis de la dermis y, por tanto, la formación de ampollas en la piel [1]. El colágeno tipo VII también se ha identificado como la proteína responsable de la epidermólisis ampollosa adquirida, una enfermedad autoinmune que causa ampollas en la piel y en las membranas mucosas. Es causada por autoanticuerpos IgG dirigidos al dominio NC1 del colágeno tipo VII [2]. La autoinmunidad al colágeno tipo VII también se ha asociado con la enfermedad inflamatoria intestinal y el lupus eritematoso sistémico ampolloso [3-4].
Se ha identificado una sobrerregulación del nivel de colágeno tipo VII en la piel de pacientes que padecen esclerosis sistémica [5]. Los pacientes con esclerosis sistémica tienen fibrosis cutánea y pueden presentar fibrosis de órganos internos, incluidos los pulmones. Un estudio también ha identificado un nivel reducido de proteína de colágeno tipo VII en las fibrillas de anclaje en las vías respiratorias en un modelo de asma de mono [6].
Para evaluar una afección patógena vinculada con el colágeno tipo VII es necesario producir ensayos capaces de detectar y cuantificar especies relacionadas con la afección patógena.
Chen y otros, Saleh y otros y Kim y otros desarrollaron independientemente varios ELISA para la detección de autoanticuerpos contra el dominio nC1 o NC2 del colágeno tipo VII [7-9]. Los métodos comprenden recubrir una placa de microtitulación con el dominio NC1 y/o NC2 recombinante del colágeno tipo VII alfa-1, añadir muestras de suero de interés y usar anticuerpos anti-IgG humanos para detectar los autoanticuerpos presentes en la muestra de suero.
Recke y otros describe la generación de autoanticuerpos contra el dominio NC1 del colágeno tipo VII e investigó el potencial patógeno en modelos humanos ex vivo de epidermólisis ampollosa adquirida [10]. Propusieron el uso de esto como herramienta de diagnóstico.
Sakai y otros creó un anticuerpo monoclonal contra el colágeno tipo VII [11]. El mAb fue reactivo sólo con colágeno de tipo VII intacto.
Los anticuerpos monoclonales y policlonales que se dirigen al colágeno de tipo VII se pueden obtener comercialmente de varios proveedores.
El documento WO2010/115749 enseña métodos para diagnosticar o cuantificar la fibrosis que comprenden: realizar un inmunoensayo para medir fragmentos de proteína que contienen neoepítopos presentes de forma natural en una muestra de biofluido; y asociar una elevación de dicha medida en dicho paciente por encima de un nivel normal con la presencia o extensión de fibrosis. Los fragmentos de proteína presentes de forma natural en dicha muestra se ponen en contacto con un ligando de unión inmunológico reactivo con un neoepítopo formado por escisión de una proteína por una proteinasa, y se mide el grado de unión de los fragmentos de péptido a dicho ligando de unión inmunológico, en donde dicha proteína es colágeno tipo III, colágeno tipo I, colágeno tipo IV, colágeno tipo V o colágeno tipo VI, elastina, biglicano, decorina, lumicano, versicano, perlecano, neurocano, brevicano, fibromodulina, serglicina, sindecano, betaglicano, vimentina o proteína C reactiva.
Ahora se ha encontrado que los fragmentos de colágeno tipo VII alfa 1 son detectables en circulación y podrían servir como biomarcadores potenciales para evaluar afecciones patológicas relacionadas con el colágeno tipo VII. Específicamente, se ha identificado un vínculo entre los fragmentos de colágeno tipo VII alfa 1 y las afecciones patológicas EPOC y esclerosis sistémica.
Resumen de la invención
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo reactivo con un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende un neoepítopo N- o C-terminal, en el que dicho anticuerpo se une al neoepítopo N- o C-terminal como se define en la reivindicación 1.
El anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y no reconoce ni se une al colágeno tipo VII alfa 1 intacto.
En una realización, el anticuerpo monoclonal reactivo con un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 se une al neoepítopo C-terminal, en el que el neoepítopo C-terminal está comprendido en la secuencia de aminoácidos GPpGp Pg RLV-COOH (SEQ ID NO: 1), y no se une a la secuencia de aminoácidos alargada GPPGPPGRLVX-COOH (SEQ ID NO: 3), en la que X es uno o más aminoácidos de la secuencia de colágeno tipo VII alfa 1.
Preferiblemente, el anticuerpo se une a un neoepítopo C-terminal que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos PPGRLV-COOh (SEQ ID NO: 2). Este neoepítopo C-terminal puede formarse por escisión del colágeno humano tipo VII alfa 1 en el enlace Val-Asp entre los aminoácidos V1709-D1710 en el dominio colagenoso central del colágeno tipo VII alfa 1.
En otra realización, el anticuerpo se une al neoepítopo N-terminal, en el que el neoepítopo N-terminal está comprendido en la secuencia de aminoácidos H2N-EAPRVRAQHR (SEQID NO: 4), y no se une a la secuencia de aminoácido alargada H2N-XEAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 6), en la que X es uno o más aminoácidos de la secuencia de colágeno tipo VII alfa 1. Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal se une a un neoepítopo N-terminal que comprende la secuencia de aminoácidos H2N-EAPRVR (SEQ ID NO: 5). Este neoepítopo N-terminal puede formarse por escisión del colágeno humano tipo VII alfa 1 en el enlace Ala-Glu entre los aminoácidos A16-E17 en el dominio amino-terminal no colagenoso del colágeno tipo VII alfa 1.
Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden producirse contra un péptido sintético correspondiente a la secuencia de aminoácidos del neoepítopo N- o C-terminal.
En un segundo aspecto la presente invención se refiere a un método de inmunoensayo para detectar en una muestra biológica un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende un neoepítopo N- o C-terminal, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra biológica que comprende dicho fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende dicho neoepítopo N- o C-terminal con un anticuerpo como se describe en la presente descripción, y determinar la cantidad de unión de dicho anticuerpo.
El método puede usarse para cuantificar la cantidad del fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende dicho neoepítopo N- o C-terminal en biofluidos. El biofluido puede ser, pero no se limita a, suero, plasma, líquido de lavado broncoalveolar, esputo, saliva u orina.
El inmunoensayo puede ser, pero no se limita a, un ensayo de competición o un ensayo sándwich. El inmunoensayo puede ser, pero no se limita a, un radioinmunoensayo o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima.
El método puede comprender, además, la etapa de correlacionar la cantidad del fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende un neoepítopo N- o C-terminal determinado por dicho método con muestras estándar de enfermedades relacionadas con el colágeno tipo VII de gravedad de la enfermedad conocida, para evaluar la gravedad de una enfermedad relacionada con el colágeno tipo VII.
Dichas enfermedades relacionadas con el colágeno de tipo VII pueden ser, pero no se limitan a, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o esclerosis sistémica.
Se prevé que el método de la invención pueda utilizarse en la cuantificación, diagnóstico y/o pronóstico de tales enfermedades relacionadas con el colágeno de tipo VII.
Se describe un péptido, en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal correspondiente a una secuencia de aminoácidos de un neoepítopo N-terminal de un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende dicho neoepítopo N-terminal, o en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos C-terminal correspondiente a una secuencia de aminoácidos de un neoepítopo C-terminal de un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende dicho neoepítopo C-terminal. Preferiblemente, el péptido tiene diez residuos de aminoácidos de longitud, más preferiblemente nueve residuos de aminoácidos, más preferiblemente ocho residuos de aminoácidos, más preferiblemente siete residuos de aminoácidos y lo más preferido seis residuos de aminoácidos de longitud. El péptido puede estar biotinilado.
Dicho péptido puede tener la secuencia de aminoácidos EAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 4) o EAPRVR (SEQ ID NO: 5).
Alternativamente, dicho péptido puede tener la secuencia de aminoácidos GPPGPPGRLV (SEQ ID NO: 1) o PPGRLV (SEQ ID NO: 2).
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit de ensayo para determinar la cantidad de un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende un neoepítopo N- o C-terminal en una muestra biológica, el kit comprende un anticuerpo como se describe en la presente descripción y al menos uno de:
- una placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina
- un péptido biotinilado correspondiente a la secuencia de aminoácidos del neoepítopo N- o C-terminal, con un enlazador opcional ubicado entre el residuo de biotina y el péptido
- un anticuerpo secundario biotinilado para su uso en un inmunoensayo tipo sándwich
- un péptido calibrador correspondiente a la secuencia de aminoácidos del neoepítopo N- o C-terminal
- un kit de etiquetado de anticuerpos HRP
- un kit de radioetiquetado de anticuerpos
- un kit de visualización del ensayo
Preferiblemente, el kit de ensayo comprende un péptido biotinilado Biotina-L-GPPGPPGRLV (SEQ ID NO: 7), en el que L es un enlazador opcional, y un péptido calibrador que comprende la secuencia C-terminal GPPGPPGRLV-COOH (SEQ ID NO: 1).
Preferiblemente, el kit de ensayo comprende un péptido biotinilado EAPRVRAQHR-L-Biotina (SEQ ID NO: 8), en el que L es un enlazador opcional, y un péptido calibrador que comprende la secuencia N-terminal H2N-EAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 4).
Definiciones
El término "anticuerpo" se usa de acuerdo con la invención en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada.
Los "fragmentos de anticuerpo" de acuerdo con la invención comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la región variable o de unión al antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv y Fc.
"Un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1" de acuerdo con la invención significa un fragmento de péptido producido por escisión por proteasa del colágeno tipo VII.
"Neoepítopo N- o C-terminal" de acuerdo con la invención significa un epítopo N- o C-terminal formado en un sitio de escisión por proteasa del colágeno tipo VII alfa 1. Por ejemplo, la siguiente secuencia de colágeno tipo VII alfa 1 ...PGPPGPPGRLV | DTGPGAREKGE...
produciría el neoepítopo N-terminal H2N-DTGPGAREKGE... y el neoepítopo C-terminal ... PGPPGPPGRLV-COOH cuando se escinde por una proteasa en el sitio entre el enlace peptídico v 1709-D1710 denotado por el símbolo "4". "C7", como se usa en la presente descripción, se refiere a fragmentos de colágeno tipo VII alfa 1 que comprenden el neoepítopo C-terminal GPPGPPGRLV-COOH (SEQ ID NO: 1).
"NB677", como se usa en la presente descripción, se refiere a fragmentos de colágeno tipo VII alfa 1 que comprenden el neoepítopo N-terminal H2N-EAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 4).
Figuras
La Figura 1 muestra una curva de calibración para el ensayo de "C7".
La Figura 2 muestra la correlación entre "C7" y EPOC.
La Figura 3 muestra la correlación entre "C7" y la esclerosis sistémica.
La Figura 4 muestra una curva de calibración para el ensayo "NB677".
Figura 5. Evaluación clínica de C7 sérico en la esclerosis sistémica. Se evaluaron los niveles séricos de C7 en donantes sanos (n = 70) y una cohorte de pacientes con esclerosis sistémica (SSc; n = 119). Los datos se presentan como diagramas de caja de Tukey. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney. ***p <0,0001.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Biomarcador de EPOC (ensayo "C7")
Razón fundamental
Se realizó espectrometría de masas en muestras de suero de un paciente con EPOC, un paciente con fibrosis pulmonar idiopática (FPI) y un donante sano.
Los análisis de espectrometría de masas iniciales identificaron péptidos derivados del colágeno tipo VII en suero. Los péptidos se aislaron del suero usando perlas IMAC Cu. El umbral de significación de identidad para péptidos individuales fue 51. Las muestras de suero se analizaron usando un instrumento orbitrap (OrbiB).
Se encontraron fragmentos de colágeno tipo VII alfa 1 que comprenden el neoepítopo C-terminal GPPGPPGRLV-COOH ("C7") (SEQ ID NO: 1) en la muestra de EPOC pero no en las muestras de FPI o de donantes sanos. El neoepítopo corresponde al sitio de escisión ubicado entre los aminoácidos Val-Asp en las posiciones 1709-1710 del colágeno humano de tipo VII. La proteasa responsable de esta escisión aún se desconoce. La secuencia se analizó usando BLAST y se encontró que era única para la cadena alfa-1 de colágeno tipo VII.
Anticuerpo
Se generó un anticuerpo monoclonal contra la secuencia de aminoácidos del neoepítopo C-terminal GPPGPPGRLV-COOH (SEQ ID NO: 1).
En resumen, se inmunizaron por vía subcutánea ratones Balb/C de cuatro a seis semanas con 200 pL de antígeno emulsionado y 50 pg de un péptido sintético C7 (KLH-CGG-GPPGPPGRLV, SEQ ID NO: 9) usando adyuvante incompleto de Freund. Las inmunizaciones se realizaron cada 2 semanas hasta que se alcanzaron niveles estables de títulos en suero. El ratón con el título de suero más alto se seleccionó para la fusión. El ratón se dejó en reposo durante un mes y luego se reforzó por vía intravenosa con 50 pg de péptido C7 en 100 pL de solución de cloruro de sodio al 0,9 % tres días antes del aislamiento del bazo para la fusión celular. Las células del bazo de ratón se fusionaron con células compañeras de fusión de mieloma SP2/0. Las células de hibridoma resultantes se clonaron usando un método de medio semisólido, se transfirieron a placas de microtitulación de 96 pocillos para un crecimiento adicional y se incubaron en un incubador de CO2. Se usó una dilución limitada estándar para promover el crecimiento monoclonal.
ELISA
Se realizó un ELISA competitivo usando el anticuerpo monoclonal generado contra C7 usando el siguiente procedimiento:
Las placas recubiertas con estreptavidina se recubrieron con 100 pL/pocillo de 2,5 ng/mL de péptido etiquetado con biotina (Biotina-KKGPPGPPGRLV, SEQ ID NO: 10) diluido en tampón de ensayo (TBS-BTB 50 mM, NaCl 2 g/L, pH 8,0) e incubados a 20 °C, 300 rpm agitando durante 30 minutos. Las placas se lavaron cinco veces en tampón de lavado (TRIS 20 nM, NaCl 50 mM, pH 7,2). Se añadió una muestra o péptido estándar (20 pL) en determinaciones dobles y, a continuación, inmediatamente se añadió 100 pL/pocillo de 200 ng/mL de anticuerpo monoclonal etiquetado con HRP diluido en tampón de ensayo y las placas se incubaron a 20 °C, agitando a 300 rpm durante 3 horas. El péptido estándar era un péptido sintético (GPPGPPGRLV, SEQ ID NO: 1) con una concentración inicial de 125 ng/mL y se diluyó 2 veces para crear una curva de calibración de 11 puntos (Figura 1). Después de la incubación, las placas se lavaron cinco veces en tampón de lavado. Se añadió un volumen de 100 pL de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y se incubaron durante 15 min a 20 °C en la oscuridad. Para detener la reacción enzimática de TMB, se añadieron 100 mL de ácido sulfúrico al 0,1 % y se midió la absorbancia a 450 nm con 650 nm como referencia usando un lector ELISA. Se trazó una curva de calibración usando un modelo de ajuste matemático de 4 parámetros. Cada placa ELISA incluía las muestras de control del kit como las de control de calidad internas para monitorear la variación interensayos. Todas las muestras se midieron dentro del intervalo del ensayo. A todas las muestras por debajo del límite inferior de detección (LLOD) se les asignó el valor de LLOD.
Las características técnicas del ELISA C7 son las siguientes:
Características técnicas Resultados
Matriz biológica Suero humano
(mediciones sin diluir)
Intervalo de medición 1,5 -105,6 ng/mL
Intervalo normal de suero saludable 3,5 ng/mL
Variación interensayo 13 % (aceptado si <15 %)
Variación intraensayo 9 % (aceptado si <10 %)
Recuperación por dilución Aceptado
(sin diluir a 1:8)
Recuperación por adición 166 % (péptido en
131 % (suer suero)
o en suero)
Aceptado
Estabilidad del analito (congelación/descongelación y
almacenamiento)
Se demostró que el ELISA era específico para el sitio de escisión ya que se observó reactividad hacia el péptido estándar pero no hacia un péptido alargado (GPPGPPGRLVD, SEQ ID NO: 11), lo que indica que el ensayo no reconoce la proteína de colágeno tipo VII intacta (Figura 1).
Utilidad clínica
EPOC
Los niveles séricos de C7 fueron significativamente elevados en una cohorte de 68 pacientes con EPOC en comparación con donantes sanos (Figura 2).
Estos resultados muestran la utilidad del ensayo C7 para identificar la EPOC y pueden resultar útiles para evaluar la EPOC, por ejemplo, como herramienta de diagnóstico o pronóstico.
Esclerosis sistémica
Los niveles séricos de C7 se elevaron significativamente en 20 pacientes con esclerosis sistémica difusa temprana en comparación con el control sano (p = 0,022) (Figura 3). La etapa temprana de la esclerosis sistémica se asocia con una alta actividad de la enfermedad, mientras que los pacientes en etapa tardía progresan lentamente. En el grupo de pacientes con enfermedad difusa temprana, una subpoblación con una tasa de progresión intermedia (definida por la tasa de progresión del grosor de la piel) tenía niveles significativamente elevados en comparación con los controles (p = 0,016).
El nivel elevado de C7 en la esclerosis sistémica en etapa temprana en comparación con la esclerosis sistémica en etapa tardía sugiere que el ensayo C7 puede ser capaz de diferenciar entre las etapas temprana y tardía de la esclerosis sistémica, proporcionando así una herramienta de diagnóstico y/o pronóstico potencialmente útil para evaluar la esclerosis sistémica.
Ejemplo 2 (ensayo "NB677")
El péptido señal en el colágeno tipo VII alfa-1 se encuentra en los aminoácidos 1-16 [12]. La secuencia del neoepítopo N-terminal que se forma por escisión del péptido señal (17'.EAPRVRAQHR'26) se analizó usando BLASt y se encontró que era única para la cadena alfa-1 de colágeno de tipo VII.
Tras el éxito del ensayo "C7" para la EPOC, se postula que este neoepítopo de colágeno de tipo VII alfa-1 único también puede ser útil en la identificación y/o evaluación de la EPOC y/o la esclerosis sistémica.
Anticuerpo
Por consiguiente, se generó un anticuerpo monoclonal contra la secuencia de aminoácidos del neoepítopo N-terminal H2N-EAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 4).
En resumen, se inmunizaron subcutáneamente ratones Balb/C de cuatro a seis semanas de edad con 200 pL de antígeno emulsionado y 50 pg de un péptido sintético NB677 (EAPRVRAQHR-GGC-KLH, SEQ ID NO: 12) usando adyuvante incompleto de Freund. Las inmunizaciones se realizaron cada 2 semanas hasta que se alcanzaron niveles estables de títulos en suero. El ratón con el título de suero más alto se seleccionó para la fusión. El ratón se dejó en reposo durante un mes y luego se reforzó por vía intravenosa con 50 pg de péptido NB677 en 100 pL de solución de cloruro de sodio al 0,9 % tres días antes del aislamiento del bazo para la fusión celular. Las células del bazo de ratón se fusionaron con células compañeras de fusión de mieloma SP2/0. Las células de hibridoma resultantes se clonaron usando un método de medio semisólido, se transfirieron a placas de microtitulación de 96 pocilios para un crecimiento adicional y se incubaron en un incubador de CO2. Se usó una dilución limitada estándar para promover el crecimiento monoclonal.
ELISA
Se realizó un ELISA competitivo usando el anticuerpo monoclonal usando el siguiente procedimiento:
Las placas recubiertas con estreptavidina se recubrieron con 100 pL/pocillo de 2,0 ng/mL de péptido etiquetado con biotina (EAPRVRAQHR-Lys-Biotina, SEQ ID NO: 13) diluido en tampón de recubrimiento (50 mM PBS-BTE, NaCl 8 g/L, sorbitol 10 %) y se incubó a 20 °C, 300 rpm agitando durante 30 minutos. Las placas se lavaron cinco veces en tampón de lavado (TRIS 20 nM, NaCl 50 mM, pH 7,2). Se añadió péptido estándar (20 pL) en determinaciones dobles y, a continuación, inmediatamente se añadió 100 pL/pocillo de l20 ng/mL de anticuerpo monoclonal diluido en tampón de ensayo (PBS-BTB 25 mM, NaCl 8 g/L) y las placas se incubaron a 4 °C, 300 rpm agitando durante 20 horas. El péptido estándar era un péptido sintético (EAPRVRAQHR, SEQ ID NO: 4) con una concentración inicial de 100 ng/mL y se diluyó 2 veces para crear una curva de calibración (Figura 4). Después de la incubación, las placas se lavaron cinco veces en tampón de lavado. Se añadieron 100 pL/pocillo de anticuerpo secundario etiquetado con HRP (IgG anti-ratón de conejo) diluido 1: 3000 en tampón de ensayo y las placas se incubaron a 20 °C, agitando a 300 rpm durante 1 hora. Se añadió un volumen de 100 pL de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y se incubó durante 15 min a 20 °C en la oscuridad. Para detener la reacción enzimática de TMB, se añadieron 100 mL de ácido sulfúrico al 0,1 % y se midió la absorbancia a 450 nm con 650 nm como referencia usando un lector ELISA. Se trazó una curva de calibración usando un modelo de ajuste matemático de 4 parámetros. Se confirmó que el anticuerpo monoclonal dirigido al neoepítopo N-terminal de colágeno tipo VII alfa 1 reconoce la secuencia deseada, evaluada por la reactividad con el péptido estándar.
Ejemplo 3
El ELISA C7 se evaluó en una segunda cohorte más grande de pacientes con esclerosis sistémica (SSc). El ELISA C7 se recalibró (en comparación con el ejemplo anterior) para mejorar la precisión de las evaluaciones en suero humano.
Resultados: La relevancia biológica del ELISA C7 se evaluó comparando los niveles séricos en donantes sanos (n = 70) con pacientes con SSc (n = 119). Los datos se muestran en la Figura 5. La mediana del nivel sérico de C7 se elevó significativamente en pacientes con SSc (9,3 ng/mL [IQR 6,7-13,2]) en comparación con donantes sanos (3,9 ng/mL [IQR 2,3-8,3 ng/mL]; p <0,0001).
Los datos clínicos apoyan que los niveles séricos de C7 están elevados en pacientes con SSc.
En conclusión, los nuevos ensayos descritos en la presente descripción utilizan anticuerpos específicos para un neoepítopo N- o C-terminal del colágeno VII alfa 1. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que el colágeno tipo VII se asocia con la EPOC. Por consiguiente, se prevé que estos ensayos puedan usarse para evaluar la EPOC así como la esclerosis sistémica.
En esta descripción, a menos que se indique expresamente de cualquier otra manera, la palabra 'o' se usa en el sentido de un operador que devuelve un valor verdadero cuando se cumple una o ambas de las condiciones establecidas, en oposición al operador 'exclusivo o' que requiere que solo se cumpla una de las condiciones. La palabra 'que comprende' se usa en el sentido de 'incluir' en lugar de significar que consiste en'.
Referencias
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal reactivo con un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende un neoepítopo N- o C-terminal formado por escisión por proteasa del colágeno tipo VII alfa 1:
en el que dicho anticuerpo monoclonal se une al neoepítopo N-terminal, en el que el neoepítopo N-terminal está comprendido en la secuencia de aminoácidos H2N-EAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 4), y no se une a la secuencia de aminoácidos alargada H2N-XEAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 6), en la que X es uno o más aminoácidos de la secuencia de colágeno tipo VII alfa 1; o
en el que dicho anticuerpo monoclonal se une al neoepítopo C-terminal, en el que el neoepítopo C-terminal está comprendido en la secuencia de aminoácidos GPPGPPGRLV-COOH (SEQ ID NO: 1), y no se une a la secuencia de aminoácidos alargada GPPGPPGRLVX-COOH (SEQ ID NO: 3), en la que X es uno o más aminoácidos de la secuencia del colágeno tipo VII alfa 1.
2. Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se une a un neoepítopo C-terminal que comprende la secuencia de aminoácidos PPGRLV-COOH (SEQ ID NO: 2).
3. Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se une a un neoepítopo N-terminal que comprende la secuencia de aminoácidos H2N-EAPRVR (SEQ ID NO: 5).
4. Un método de inmunoensayo para detectar en una muestra biológica un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende un neoepítopo N- o C-terminal, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra biológica que comprende dicho fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende dicho neoepítopo N- o C-terminal con un anticuerpo monoclonal como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, y determinar la cantidad de unión de dicho anticuerpo.
5. Un método según la reivindicación 4, en el que dicho método se usa para cuantificar la cantidad del fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende dicho neoepítopo N- o C-terminal en biofluidos.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que dicho biofluido es suero, plasma, líquido de lavado broncoalveolar, esputo u orina.
7. Un método según la reivindicación 4, en el que dicho inmunoensayo es un ensayo de competición o un ensayo sándwich.
8. Un método según la reivindicación 4, en el que dicho inmunoensayo es un radioinmunoensayo o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima.
9. Un método según la reivindicación 5, que comprende además correlacionar la cantidad del fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende un neoepítopo N- o C-terminal determinado por dicho método con muestras estándar de enfermedades relacionadas con el colágeno tipo VII de gravedad de la enfermedad conocida, para evaluar la gravedad de una enfermedad relacionada con el colágeno tipo VII en la que la enfermedad relacionada con el colágeno tipo VII es enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o esclerosis sistémica.
10. Un kit de ensayo para determinar la cantidad de un fragmento de colágeno tipo VII alfa 1 que comprende un neoepítopo N- o C-terminal en una muestra biológica, el kit comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y al menos uno de:
- una placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina
- un péptido biotinilado correspondiente a la secuencia de aminoácidos del neoepítopo N- o C-terminal, con un enlazador opcional ubicado entre el residuo de biotina y el péptido
- un anticuerpo secundario biotinilado adecuado para su uso en un inmunoensayo sándwich
- un péptido calibrador correspondiente a la secuencia de aminoácidos del neoepítopo N- o C-terminal - un kit de etiquetado de anticuerpos HRP
- un kit de radioetiquetado de anticuerpos
- un kit de visualización del ensayo
11. Un kit de ensayo según la reivindicación 10, que comprende un péptido biotinilado Biotina-L-GPPGPPGRLV (SEQ ID NO: 7), en el que L es un enlazador opcional, y un péptido calibrador que comprende la secuencia C-terminal GPPGPPGRLV-COOH (SEQ ID NO: 1); o
que comprende un péptido biotinilado EAPRVRAQHR-L-Biotina (SEQ ID NO: 8), en el que L es un enlazador opcional, y un péptido calibrador que comprende la secuencia N-terminal H2N-EAPRVRAQHR (SEQ ID NO: 4).
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