CN105191680B - 一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法 - Google Patents

一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法，首先室内进行喷雾接种，在感病对照丽江新团黑谷发病的情况下，表现感病的品种作好分级记录并结束试验；表现抗病的品种重新育苗，然后进行室内离体叶段点液接种，表现感病的品种作好分级记录并结束试验；表现抗病的品种重新育苗，再进行点液接种，病情稳定后及时记录发病情况。这揉合三种接种方法的一套抗性筛选技术，既避免了单一接种方法的不足，又节约了人为和物力，最终能够真实地表现一份水稻品种的室内抗稻瘟病能力，试验结果可以为大田推广品种、品种抗性基因的挖掘等奠定稳定可靠的基础。

Description

一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体地说，涉及一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法。
背景技术
水稻是全球尤其是亚洲地区重要的粮食作物，而由子囊菌引起的稻瘟病(Magnaporthe oryzae)是影响水稻安全生产的主要病害之一，加上稻瘟病在实际防治上的复杂性、分布的广泛性以及危害的严重性，因此稻瘟病一直受到各地政府和研究者的高度关注。
湖北省地处长江中下游，地貌复杂，省内既有高山又有丘陵、平湖。水稻一直是湖北省种植面积最大、总产最多的农作物，播种面积占全省粮食总播种面积的50％以上，总产占70％左右，商品量占80％，而且湖北水稻在种植面积、总产、单产、优质稻种植面积等方面多年来一直稳居全国各省市水稻生产的前列。稻瘟病在全省各稻区均可发生，发生面积达300～600万亩，占整个水田面积的11％～22％，病害流行的年份造成当地颗粒无收。病情的普遍性和严重性影响着湖北省水稻生产的产量和质量，严重制约了水稻育种产业化进程，严竣的病害现实和惨痛的历史教训，让人们在考察一份水稻材料是否适宜推广应用时不得不把是否抗稻瘟病作为其必备的前置优良品质。利用抗病品种抵抗稻瘟病的流行是行之有效的安全措施，而在实际生产中，单一的抗病品种在长时间大面积种植后抗性表现为丧失，造成稻瘟病的流行和暴发，因此不断地寻找新的抗源材料是水稻育种和抗病研究者长期的科研任务。
抗病品种在大田生产中表现为抗性，其中一个基础前提是鉴定的结果稳定可靠。利用大田自然诱发技术鉴定水稻品种(材料)的抗瘟性是目前一个稳定可靠的鉴定技术，但是大田自然诱发的鉴定结果需历时数月且对当年的天气情况有要求，因此在追求效率的当下，在室内对水稻品种(材料)采用一套操作简单、结果稳定的技术，鉴定其对稻瘟病的抗性、继而将抗病品种(材料)作为抗源材料用于科学研究或生产实践尤其显得重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法，其试验结果可以为大田推广品种、品种(材料)抗性基因的挖掘等奠定稳定可靠的基础。其具体技术方案为：
一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法，包括以下步骤：
1)采用孢子振落法分离稻瘟病菌单孢：先将穗颈瘟标本置于无菌水中浸泡48h，后移至培养皿中保湿培养48h使之产孢，培养皿中预先放有浸有无菌水的吸水纸，吸水纸一端作成纸枕，使标本两端接触吸水纸、病斑部分悬空，温度26℃，光：暗＝12h：12h；当病斑部分出现一层灰绿色细密孢子，用洗耳球将孢子轻轻吹落于事先准备好的清水琼脂培养基上，进行镜检，把视野中的单个孢子打好标记，挑取标记部位的琼脂置于PDA上使之萌发生长；将分离出的单孢菌株转入保存培养基中，并置于4℃冰箱中保存备用；
2)采用涂菌产孢法制备孢子悬浮液：将保存的各单孢菌株活化于PDA斜面上，从边缘挑取1cm大小的菌丝块转接于OTA平板上，待菌盖扩展至培养皿面积70％左右时，用无菌水洗下培养皿上的菌丝，洗下的菌液涂布于另一番茄燕麦培养基平板上，48h后用无菌水打断皿中长出的气生菌丝，自然晾干后以洁净的纱布覆盖，置于光照培养箱中紫光灯48h促其产孢；用无菌水洗下孢子，过滤、搅匀，加入0.025％Tween-20通过血板计数器将孢子悬浮液的孢子浓度调整为5×105个孢子/ml；
3)待秧苗长至三叶一心时，将孢子悬浮液用小型喷雾器均匀喷洒于鉴定品种的叶片上，至叶片上沾有细密菌液而不滴落为止，每处理3次重复；接种完毕后，在育秧盘上盖上塑料薄膜，于26℃黑暗保湿培养36h，去掉薄膜后光照培养6～7d，期间辅以人工喷雾，保持塑料盘中不断水；每天观察病情待病情稳定后调查；按如下标准记录病情：R抗病：叶片上无病斑或产生针头状褐点或大褐点；S感病：:叶片上产生椭圆形或梭形大病斑，中间灰白色，边缘黄褐色；
4)待秧苗长至三叶一心时，剪下心叶留取其中间叶段平铺于培养皿中，皿中预先放有浸有无菌水的滤纸，每皿平铺3个叶段，接种前打开培养皿盖用弥雾喷雾器向皿中的叶段上喷洒一层细密的0.025％Tween-20液体，用移液枪移取菌液点滴于每个叶段之上，每个叶段滴3滴，每滴5μl；盖好培养皿于26℃黑暗保湿培养36h，后光照培养6～7d；每天观察病情待病情稳定后调查；按如下标准记录病情：若接种点中央灰白，有孢子产生，边缘有褪绿，且沿叶脉扩展，记为感病S；接种点无症状或呈黑色，无褪绿且未沿叶脉扩展，记为抗病R；最终反应型以至少出现一处感病病斑为亲和记为1，无病斑或有过敏性坏死症状记为不亲和记为0；每次接种结果成功与否均以丽江新团黑谷表现感病为可靠性指标，试验重复3次；
5)秧苗7-8叶期时，在心叶附近的茎杆部位注射接种孢子悬浮液，接种量100μl，7-10d后调查；试验重复3次；病级调查参照标准：1级：没有病斑；2级：病斑黑褐色，只有针尖大小，不产分生孢子；3级：病斑长度0.5-1.0mm，黑褐色，不产分生孢子；4级：病斑较小，长度略大于2.0mm，中心灰色、边缘黄褐色，产孢；5级：病斑较大，长度2.0mm以上，产孢；6级：产孢，大型病斑相互连接。
进一步，病级统计分析时，1～3级归为抗病反应类型，记为R；4～6级归为感病反应类型，记为S。
进一步，所述PDA为葡萄糖20g，土豆200g，琼脂粉18g，水1000ml。
进一步，所述OTA为番茄汁150ml，燕麦200g，琼脂粉18g，水1000ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明该方法先后利用喷雾接种、点液接种、注射接种这3种稻瘟病人工接种方法，构建了一套室内用于鉴定水稻品种(材料)对稻瘟病抗性情况的成熟技术，应用范围可包括稻瘟病菌生理小种测定、品种抗性鉴定及基因推导、分离群体抗性鉴定等，该方法省工省时且结果稳定，此套技术的鉴定结果必会为有关水稻稻瘟病抗性基因的研究与生产奠定可信的基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
单孢的分离及孢子悬浮液的制备及接种方法
喷雾接种、点液接种、注射接种是目前应用最多的三种稻瘟病接种方法，本研究小组通过多年的试验，揉合上述三套方法用于稻瘟病室内抗性鉴定。
采用孢子振落法分离稻瘟病菌单孢：先将穗颈瘟标本置于无菌水中浸泡48h，后移至培养皿中保湿培养48h使之产孢，培养皿中预先放有浸有无菌水的吸水纸，吸水纸一端作成纸枕，使标本两端接触吸水纸、病斑部分悬空(温度26℃，光：暗＝12h：12h)。当病斑部分出现一层灰绿色细密孢子，用洗耳球将孢子轻轻吹落于事先准备好的清水琼脂培养基上，进行镜检，把视野中的单个孢子打好标记，挑取标记部位的琼脂置于PDA上使之萌发生长。将分离出的单孢菌株转入保存培养基中，并置于4℃冰箱中保存备用。
采用涂菌产孢法制备孢子悬浮液：将保存的各单孢菌株活化于PDA(葡萄糖20g，土豆200g，琼脂粉18g，水1000ml)斜面上，从边缘挑取1cm大小的菌丝块转接于OTA(番茄汁150ml，燕麦200g，琼脂粉18g，水1000ml)平板上，待菌盖扩展至培养皿面积70％左右时，用无菌水洗下培养皿上的菌丝，洗下的菌液涂布于另一番茄燕麦培养基平板上，48h后用无菌水打断皿中长出的气生菌丝，自然晾干后以洁净的纱布覆盖，置于光照培养箱中紫光灯48h促其产孢。用无菌水洗下孢子，过滤、搅匀，加入0.025％Tween-20通过血板计数器将孢子悬浮液的孢子浓度调整为5×105个孢子/ml。
喷雾接种方法
属于活体接种：待秧苗长至三叶一心时，将孢子悬浮液用小型喷雾器均匀喷洒于鉴定品种的叶片上，至叶片上沾有细密菌液而不滴落为止，每处理3次重复。接种完毕后，在育秧盘上盖上塑料薄膜，于26℃黑暗保湿培养36h，去掉薄膜后光照培养6～7d，期间辅以人工喷雾，保持塑料盘中不断水。每天观察病情待病情稳定后调查。按如下标准记录病情：R(抗病)：叶片上无病斑或产生针头状褐点或大褐点。S(感病)：:叶片上产生椭圆形或梭形大病斑，中间灰白色，边缘黄褐色。
点液接种方法
属于离体接种：待秧苗长至三叶一心时，剪下心叶留取其中间叶段平铺于培养皿中，皿中预先放有浸有无菌水的滤纸，每皿平铺3个叶段，接种前打开培养皿盖用弥雾喷雾器向皿中的叶段上喷洒一层细密的0.025％Tween-20液体，用移液枪移取菌液点滴于每个叶段之上，每个叶段滴3滴，每滴5μl。盖好培养皿于26℃黑暗保湿培养36h，后光照培养6～7d。每天观察病情待病情稳定后调查。按如下标准记录病情：若接种点中央灰白(有孢子产生)，边缘有褪绿，且沿叶脉扩展，记为感病(S)；接种点无症状或呈黑色，无褪绿且未沿叶脉扩展，记为抗病(R)。最终反应型以至少出现一处感病病斑为亲和(记为1)，无病斑或有过敏性坏死症状记为不亲和(记为0)。每次接种结果成功与否均以丽江新团黑谷表现感病为可靠性指标，试验重复3次。
注射接种方法
属于活体接种：秧苗7-8叶期时，在心叶附近的茎杆部位注射接种孢子悬浮液，接种量100μl，7-10d后调查。试验重复3次。病级调查参照标准：1级：没有病斑；2级：病斑黑褐色，只有针尖大小，不产分生孢子；3级：病斑长度0.5-1.0mm，黑褐色，不产分生孢子；4级：病斑较小，长度略大于2.0mm，中心灰色、边缘黄褐色，产孢；5级：病斑较大，长度2.0mm以上，产孢；6级：产孢，大型病斑相互连接。
病级统计分析时，1～3级归为抗病反应类型，记为R；4～6级归为感病反应类型，记为S。
稻瘟病菌侵入水稻寄主时对外界的温度、湿度和结水时间有严格的要求：稻瘟病菌分生孢子的萌发时要求相对湿度在90％以上，侵入寄主时需持续结水6～7h以上，最适温度为24℃时，孢子在萌发形成附着胞后产生侵入丝，穿过角质层从机动细胞或长形细胞直接侵入。因此，室内稻瘟病菌接种成功与否，有三个限制因素：1、叶片表面上或茎杆中有足量菌液，且菌液中含有足量的稻瘟病菌分生孢子。2、温度在15～32℃时可萌发并侵入，最适温度为24℃。3、持续结水时间，叶表结水时间越长，侵入率越高。所以，每种接种方法的每次接种试验条件是否足够都必须以一个普感品种(目前以丽江新团黑谷)是否发病作为的依据。
三种室内稻瘟病菌接种方法各有其特点。喷雾接种时，活体叶表喷洒的菌液既容易滴落而使侵入致病的分生孢子量不够，又容易因为保湿不即时不到位而使叶表的结水时间不够，这些都极大地影响了病菌的正常侵入而造成接种结果假阳性(即抗病)现象，但接种过程方便省事。离体叶段点液接种时，正常情况下接种的温度和湿度及结水时间均能充分满足稻瘟病菌分生孢子侵入水稻寄主的条件，但接种时剪取展开的心叶作为接种的叶段，离体叶段的发病与否是否真实地代表水稻活体叶片的发病情况还有待进一步的科研证实。注射接种方法，规避了入侵条件不够的问题，且是活体接种，秧苗接种时的生长情况与大田秧苗的生长情况相似，但接种过程耗工耗时，有时也存在接种不到位而呈现假抗性现象。
综上所述，获得一个品种对稻瘟病的真实抗性情况，不能单纯依据这三种接种方法中的一个结果，必须三种方法协同配合方可。因此，以这三种接种方法的优点和不足为基础，本研究探索出一套室内鉴定品种对稻瘟病抗性的稳定可靠的技术，首先室内进行喷雾接种，在感病对照丽江新团黑谷发病的情况下，表现感病的品种作好分级记录并结束试验；表现抗病的品种(材料)重新育苗，然后进行室内离体叶段点液接种，表现感病的品种(材料)作好分级记录并结束试验；表现抗病的品种(材料)重新育苗，再进行点液接种，病情稳定后及时记录发病情况。这揉合三种接种方法的一套抗性筛选技术，既避免了单一接种方法的不足，又节约了人为和物力，最终能够真实地表现一份水稻品种(材料)的室内抗稻瘟病能力，试验结果可以为大田推广品种、品种(材料)抗性基因的挖掘等奠定稳定可靠的基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用孢子振落法分离稻瘟病菌单孢：先将穗颈瘟标本置于无菌水中浸泡48h，后移至培养皿中保湿培养48h使之产孢，培养皿中预先放有浸有无菌水的吸水纸，吸水纸一端作成纸枕，使标本两端接触吸水纸、病斑部分悬空，温度26℃，光：暗＝12h：12h；当病斑部分出现一层灰绿色细密孢子，用洗耳球将孢子轻轻吹落于事先准备好的清水琼脂培养基上，进行镜检，把视野中的单个孢子打好标记，挑取标记部位的琼脂置于PDA上使之萌发生长；将分离出的单孢菌株转入保存培养基中，并置于4℃冰箱中保存备用；
2)采用涂菌产孢法制备孢子悬浮液：将保存的各单孢菌株活化于PDA斜面上，从边缘挑取1cm大小的菌丝块转接于OTA平板上，待菌盖扩展至培养皿面积70％左右时，用无菌水洗下培养皿上的菌丝，洗下的菌液涂布于另一番茄燕麦培养基平板上，48h后用无菌水打断皿中长出的气生菌丝，自然晾干后以洁净的纱布覆盖，置于光照培养箱中紫光灯48h促其产孢；用无菌水洗下孢子，过滤、搅匀，加入0.025％Tween-20通过血板计数器将孢子悬浮液的孢子浓度调整为5×105个孢子/ml；
3)待秧苗长至三叶一心时，将孢子悬浮液用小型喷雾器均匀喷洒于鉴定品种的叶片上，至叶片上沾有细密菌液而不滴落为止，每处理3次重复；接种完毕后，在育秧盘上盖上塑料薄膜，于26℃黑暗保湿培养36h，去掉薄膜后光照培养6～7d，期间辅以人工喷雾，保持塑料盘中不断水；每天观察病情待病情稳定后调查；按如下标准记录病情：R抗病：叶片上无病斑或产生针头状褐点或大褐点；S感病：叶片上产生椭圆形或梭形大病斑，中间灰白色，边缘黄褐色；
4)待秧苗长至三叶一心时，剪下心叶留取其中间叶段平铺于培养皿中，皿中预先放有浸有无菌水的滤纸，每皿平铺3个叶段，接种前打开培养皿盖用弥雾喷雾器向皿中的叶段上喷洒一层细密的0.025％Tween-20液体，用移液枪移取菌液点滴于每个叶段之上，每个叶段滴3滴，每滴5μl；盖好培养皿于26℃黑暗保湿培养36h，后光照培养6～7d；每天观察病情待病情稳定后调查；按如下标准记录病情：若接种点中央灰白，有孢子产生，边缘有褪绿，且沿叶脉扩展，记为感病S；接种点无症状或呈黑色，无褪绿且未沿叶脉扩展，记为抗病R；最终反应型以至少出现一处感病病斑为亲和记为1，无病斑或有过敏性坏死症状记为不亲和记为0；每次接种结果成功与否均以丽江新团黑谷表现感病为可靠性指标，试验重复3次；
5)秧苗7-8叶期时，在心叶附近的茎杆部位注射接种孢子悬浮液，接种量100μl，7-10d后调查；试验重复3次；病级调查参照标准：1级：没有病斑；2级：病斑黑褐色，只有针尖大小，不产分生孢子；3级：病斑长度0.5-1.0mm，黑褐色，不产分生孢子；4级：病斑较小，长度略大于2.0mm，中心灰色、边缘黄褐色，产孢；5级：病斑较大，长度2.0mm以上，产孢；6级：产孢，大型病斑相互连接；
病级统计分析时，1～3级归为抗病反应类型，记为R；4～6级归为感病反应类型，记为S；
所述PDA为葡萄糖20g，土豆200g，琼脂粉18g，水1000ml；
所述OTA为番茄汁150ml，燕麦200g，琼脂粉18g，水1000ml。
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CN105191680A (zh) 2015-12-30

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